DIVISIÓN: CIENCIAS DE LA SALUD, BIOLÓGICAS Y

AMBIENTALES (CSBA)

INVESTIGACIÓN DOCUMENTAL Y DE CAMPO

INFORME FINAL

TEMA “ CRISPR/Cas9 Una nueva herramienta en la

biotecnología”

ASPIRANTE: VARGAZ GUADARRAMA VERÓNICA AJELET

12 DE JUNIO DEL 2018

ContenidoIntroducción y Fundamentos......................................................................................3

Delimitación del problema..........................................................................................3

Objetivo General........................................................................................................3

Objetivos particulares.................................................................................................3

Metodología................................................................................................................4

Plan de trabajo...........................................................................................................4

Investigación documental...........................................................................................4

Marco teórico..............................................................................................................5

Antecedentes..........................................................................................................5

Bases teóricas.........................................................................................................6

Investigación de Campo.............................................................................................8

Elaboración y aplicación de encuesta y Resultados.................................................11

Conclusiones............................................................................................................13

Referencias..............................................................................................................14

Introducción y FundamentosEn la actualidad, una de las áreas de mayor desarrollo en la biología molecular y terapia génica es la edición genómica dirigida. Ésta emplea proteínas con dominios de unión a secuencias específicas de ADN y actividad nucleasa para su escisión. Estas técnicas se usan desde el desarrollo de modelos experimentales de estudio hasta la implementación de la terapia génica. Los inicios de la edición genómica dirigida datan de 1970 con el método de reparación por recombinación homóloga (HDR, por sus siglas en inglés). Dicho método, aunque permite la manipulación precisa de genes, posee un proceso largo y complicado que no garantiza un resultado efectivo en todos los casos. Por ello, a partir de la necesidad de confiabilidad y eficiencia en la edición del genoma, recientemente se desarrollaron tecnologías más precisas como las nucleasas con dedos de zinc y la tecnología de TALENs (transcription activator-like effector nucleases). Por un lado, las nucleasas unidas a dedos de zinc se basan en un dominio Cys2His2, que reconoce un triplete específico según los residuos de la α hélice que se hayan elegido.1 A su vez, la tecnología TALENs utiliza motivos de unión de ADN para dirigir a una nucleasa.2 Mientras que los dedos de zinc reconocen tripletes de ADN, cada dominio de TALEN reconoce un solo nucleótido. Estas herramientas actualmente son de las más confiables y empleadas. Aunque ambas herramientas presentan ventajas considerables (facilidad de localizar secuencias, diseño rápido y precisión al escindir), también son métodos costosos y, en ocasiones, su construcción resulta complicada. Por ello, el sistema CRISPR surge como una alternativa factible para lograr la edición del genoma: es de fácil diseño e introducción, más económico, rápido y eficiente al momento de localizar y modificar una secuencia. Por estos factores, CRISPR se ha convertido en uno de los sistemas con mayor potencial en la edición genómica y actualmente se estudian sus posibles aplicaciones en diversos ámbitos.

Delimitación del problemaDefinición, importancia, aspectos éticos y empleo como terapia génica de

CRISPR/Cas9.

Objetivo GeneralRedactar una revisión bibliográfica acerca de CRISPR/Cas9

Objetivos particularesDefinir qué es CRISPR/Cas9

Conocer la historia de CRISPR/Cas9

Explicar las aplicaciones potenciales en terapia celular y génica.

Dar a conocer los aspectos éticos que engloban utilizar CRISPR/cas9 como

herramienta biotecnológica.

Metodología Primero fue necesario determinar cuáles eran las actividades que debían llevarse a

cabo y como se iban a lograr. Así pues de elaboró un plan de trabajo en donde se

enlistaron las actividades y se determinaron las fechas en que debían ser

realizadas. Figura 1. Plan de trabajo. Investigación documental La investigación

Plan de trabajofig.1

Investigación documentalLa investigación documental para la realización del marco teórico fue enfocada a recabar información sobre generalidades de la herramienta CRISPR/Cas9, así como los debates éticos y su empleo como terapia para enfermedades.

Para ello se realizó lo siguiente:

1. Se obtuvieron distintos artículos relacionados con el tema, mediante la tipificación de palabras cable en distintos buscadores que en su base de datos cuentan con una gran cantidad de revistas relacionadas a las ciencias biológicas y de la salud. Los buscadores utilizados fueron: a. Redalyc b. Google académico c. Pubmed d. RefSeek

Plan de Trabajo Ajelet

MIS LOGROSSESIÓN NOMBRE DE LAS ACTIVIDADES PRIORIDAD FECHA DE INICIO FECHA DE FIN

ACTIVIDADES REALIZADAS

# DE ACTIVIDADES% DE ACTIVIDADESCOMPLETADO

U2 4.- INDAGAR E INVESTIGAR

Tipos de investigación/Delimitación del tema y plan de investigación

ALTA 09/05/2018 13/05/2018 2 2 100%

U2 5.- INVESTIGACIÓN DOCUMENTAL

Selección y recopilación de información/Análisis y abstracción de

informaciónALTA 14/05/2018 20/05/2018 0 2 0%

U2 6.-INVESTIGACIÓN DE CAMPO

Bitácora de investigación/Planeación y aplicación de entrevista

ALTA 21/05/2018 27/05/2018 0 2 0%

U3 7.- ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LA

INFROMACIÓN

Análisis de datos relacionados/Aplicación de encuesta y

análisis de resultadosALTA 30/05/2018 08/06/2018 0 2 0%

U3 8.- COMUNICACIÓN ORAL Y ESCRITA

Integración y redacción de informe/Presentación multimedia y

exposición de resultadosALTA 04/06/2018 12/06/2018 0 2 0%

2. Se organizó la información separándolas según los temas y subtemas que trataban así como identificando su idea principal y se realizó la lista de referencias utilizando la metodología del sistema APA.

3. Se revisó y analizó la información de forma detallada para lograr obtener los datos más importantes y poder redactar el marco teórico.

Marco teóricoAntecedentesEn la actualidad, una de las áreas de mayor desarrollo en la biología molecular y

terapia génica es la edición genómica dirigida. Ésta emplea proteínas con dominios

de unión a secuencias específicas de ADN y actividad nucleasa para su escisión.

Estas técnicas se usan desde el desarrollo de modelos experimentales de estudio

hasta la implementación de la terapia génica. Los inicios de la edición genómica

dirigida datan de 1970 con el método de reparación por recombinación homóloga

(HDR, por sus siglas en inglés). Dicho método, aunque permite la manipulación

precisa de genes, posee un proceso largo y complicado que no garantiza un

resultado efectivo en todos los casos. Por ello, a partir de la necesidad de

confiabilidad y eficiencia en la edición del genoma, recientemente se desarrollaron

tecnologías más precisas como las nucleasas con dedos de zinc y la tecnología de

TALENs (transcription activator-like effector nucleases). Por un lado, las nucleasas

unidas a dedos de zinc se basan en un dominio Cys2His2, que reconoce un triplete

específico según los residuos de la α hélice que se hayan elegido. (Urnov FD.,

2010)

A su vez, la tecnología TALENs utiliza motivos de unión de ADN para dirigir a una

nucleasa. (Christian M., 2010)

Mientras que los dedos de zinc reconocen tripletes de ADN, cada dominio de

TALEN reconoce un solo nucleótido. Estas herramientas actualmente son de las

más confiables y empleadas. Aunque ambas herramientas presentan ventajas

considerables (facilidad de localizar secuencias, diseño rápido y precisión al

escindir), también son métodos costosos y, en ocasiones, su construcción resulta

complicada. Por ello, el sistema CRISPR surge como una alternativa factible para

lograr la edición del genoma: es de fácil diseño e introducción, más económico,

rápido y eficiente al momento de localizar y modificar una secuencia. Por estos

factores, CRISPR se ha convertido en uno de los sistemas con mayor potencial en

la edición genómica y actualmente se estudian sus posibles aplicaciones en

diversos ámbitos. (Lammoglia-Cobo., 2016)

Bases teóricasCRISPR/Cas es un mecanismo de defensa en bacterias y arqueas análogo al

silenciamiento con ARN interferente en eucariontes, que identifica y degrada

secuencias de ácidos nucleicos exógenos. Se compone de dos elementos: un ARN

proveniente de la secuencia CRISPR, llamado «ARNcr», y la endonucleasa Cas. El

ARNcr es el encargado de dirigir a Cas hacia su secuencia complementaria,

(Lammoglia-Cobo., 2016)

Debido a la precisión en cortes sitio-específicos, el sistema CRISPR/Cas es una

gran alternativa para los métodos clásicos de la edición genómica dirigida. Aunque

el objetivo original del sistema es el silenciamiento de secuencias, ciertas

modificaciones han permitido adaptarlo para insertar, eliminar o generar mutaciones

en las secuencias. Actualmente, existen plásmidos que incluyen tanto las

secuencias de Cas como un análogo al complejo ARNcr/tracrARN, el ARN guía

(ARNg). De esta forma, puede elegirse la secuencia complementaria y ensamblar el

complejo completo dentro de una célula. (Bellver C., 2016)

Las numerosas aplicaciones potenciales de la tecnología CRISPR plantean

interrogantes sobre los méritos éticos y las consecuencias de la manipulación de

los genomas.

En el artículo de Science en 2014, Oye y sus colegas señalan el posible impacto

ecológico del uso del gene drive. Un rasgo introducido podría extenderse más allá

de la población objetivo a otros organismos a través de cruzamientos. El gene drive

también podría reducir la diversidad genética de la población objetivo.

Hacer modificaciones genéticas a los embriones humanos y las células

reproductoras como el esperma y los óvulos se conoce como edición de la línea

germinal. Dado que los cambios en estas células se pueden transmitir a las

generaciones posteriores, el uso de la tecnología CRISPR para hacer ediciones

germinales ha planteado una serie de preocupaciones éticas.

La eficacia variable, los efectos fuera de la secuencia objetivo y las ediciones

imprecisas plantean todos riesgos de seguridad que deben pasar por una

evaluación. Además, hay mucho que todavía es desconocido para la comunidad

científica. En un estudio publicado en Science en 2015, David Baltimore y un grupo

de científicos, especialistas en ética y expertos legales señalan que la edición de la

línea germinal plantea la posibilidad de consecuencias no deseadas para las futuras

generaciones “porque hay límites para nuestro conocimiento de la genética

humana, interacción gen-ambiente, y las vías de la enfermedad (incluyendo la

interacción entre una enfermedad y otras condiciones o enfermedades en el mismo

paciente)”.

Otras preocupaciones éticas son más matizadas. ¿Debemos hacer cambios que

podrían afectar fundamentalmente a generaciones futuras sin tener su

consentimiento? ¿Qué pasa si el uso de la edición de la línea germinal cambia de

ser una herramienta terapéutica a una herramienta de mejora para diversas

características humanas?

El sistema CRISPR, al igual que TALEN y los dedos de zinc, tiene una gran

cantidad de aplicaciones en la edición genómica. Es por ello que representa una

gran promesa para las enfermedades degenerativas al producir mejores modelos

celulares o de organismos completos, permitir el diseño de terapias génicas o

auxiliar en la edición de células madre pluripotentes inducidas (iPSC, por sus siglas

en inglés). Sin embargo, la tecnología de CRISPR debe disminuir su tasa de

mutaciones fuera del objetivo para poder ser considerada por las entidades

regulatorias (como la FDA) una alternativa de terapia viable. (Li M., 2014)

A pesar de los pocos años que tiene su descubrimiento, el sistema CRISPR/Cas se

está posicionando como una herramienta confiable para regular o modificar genes.

Cada vez es mayor el número de investigaciones donde se emplean las

propiedades del sistema CRISPR/Cas como herramienta para la biología molecular.

(Lammoglia-Cobo., 2016)

Investigación de Campo

Entrevista “CRISPR/CAS9 Una nueva herramienta en la biotecnología”

Buenos días mi nombre es Verónica Ajelet Vargaz Guadarrama tengo 22 años y soy aspirante para ingresar a la licenciatura abierta y a distancia en biotecnología ¿Me permite realizarle una entrevista?

1. ¿Cuál es su nombre y su profesión?Mi nombre es Patricia Gómez Beristaín y soy biomédica de profesión

2. ¿Dónde estudió la maestría y porqué decidió hacerla allí?Fui alumna del posgrado internacional de maestría de Bioingeniería Molecular en el Centro de Biotecnología de la Universidad Tecnológica de Dresden.

3. ¿Cuál fue su tema de investigación? Me centré es investigar las aplicaciones del CRISPR/Cas9 a la investigación genómica de enfermedades raras.

4. ¿Qué es CRISPR y cuál es su importancia? Es una herramienta que permite editar el genoma de cualquier célula. Funciona como una tijera molecular, que al entrar al núcleo de las células localiza una región específica y corta la hebra de ácido desoxirribonucleico (ADN), que después será reparada gracias a los mecanismos naturales de las células. Esto da a los científicos la capacidad de inactivar, modificar o añadir genes a las células.

5. ¿Cómo puede ayudar el uso de esta herramienta a mejorar el estilo de vida de las personas?La tecnología de CRISPR/Cas9 tendrá un impacto muy importante en nuestra vida diaria y en la cultura del futuro. La medicina, la agricultura, la investigación o la fabricación de productos químicos “verdes” son algunas de las áreas que mejorarán gracias a estas herramientas.

6. ¿Existen laboratorios en México que utilicen esta herramienta? En México, la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (Cinvestav) del Instituto Politécnico Nacional (IPN) y el Inmegen realizan investigaciones donde CRISPR/Cas9 es utilizado como apoyo en la investigación básica para mejorar la calidad de plantas de interés alimenticio y para desarrollar una nueva medicina genómica, respectivamente.

7. ¿Cuáles son las aplicaciones directas de CRISPR que podremos observar en un futuro a largo plazo? Sí, de hecho ya estamos viendo algunos resultados de la tecnología CRISPR-Cas9 en la edición del genoma.

8. ¿Qué aspectos éticos le parecen cruciales para el uso de esta herramienta? Bueno, fueron precisamente estas preocupaciones las que me llevaron a convocar un encuentro para debatir las consideraciones éticas de la ingeniería genómica. Algunas de sus conclusiones se resumieron en un artículo publicado en Science en marzo. Pero seguimos siendo conscientes de estas implicaciones, por lo que ahora estoy trabajando junto a un grupo más amplio de investigadores para organizar un congreso que se centre en estos aspectos.

9. ¿Qué consejos le daría a los jóvenes que comienzan su carrera científica?Creo fervientemente en la persistencia, y en que cada uno pueda buscar sus propios intereses. No debemos dejar que el miedo al fracaso frene la experimentación creativa.

Elaboración y aplicación de encuesta y Resultados

Conclusiones

ReferenciasBellver Capella, v. (2016). la revolución de la edición genética mediante CRISPR-cas 9 y los desafíos éticos y regulatorios que comporta. cuadernos de bioética, xxvii (2), 223-239.

Lammoglia-Cobo y cols. 2016. “La revolución en ingeniería genética: sistema CRISPR/Cas”. Investigación en Discapacidad. Vol.5, Núm. 2 p.116-128

Cribbs, A. P., & Perera, S. M. W. (2017). Science and Bioethics of CRISPR-Cas9 Gene Editing: An Analysis Towards Separating Facts and Fiction. The Yale Journal of Biology and Medicine, 90(4), 625–634.

Feng Zhang. (2018). WHAT IS CRISPR. 21/05/2018, de BROAD INSTITUTE Sitio web: https://www.broadinstitute.org/research-highlights-crispr

Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD. Genome editing with engineered zinc fi nger nucleases. Nat Rev Genet. 2010; 11 (9): 636-646.

Christian M, Cermak T, Doyle EL, Schmidt C, Zhang F, Hummel A et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 2010; 186 (2): 757-761.

Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identifi cation of the gene product. J Bacteriol. 1987; 169 (12): 5429-5433.

Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct. 2006; 1: 7.

Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007; 315 (5819): 1709-1712.

Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011; 471 (7340): 602-607. 7. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM. Identi- fi cation of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 2002; 43 (6): 1565-1575.