MACROMOLÉCULAS MACROMOLÉCULAS BIOMOLÉCULAS BIOMOLÉCULAS

Proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y Proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos.lípidos.

EnlacesEnlaces

La presencia de moléculas a base de C, N, O y H, La presencia de moléculas a base de C, N, O y H, permite que estas exhiban características químicas permite que estas exhiban características químicas como los diferentes tipos de enlace o interacciones como los diferentes tipos de enlace o interacciones moleculares, que condicionan tanto las propiedades moleculares, que condicionan tanto las propiedades físicas, químicas, funcionales y estructurales. Estas físicas, químicas, funcionales y estructurales. Estas características son el punto de partida para el estudio, características son el punto de partida para el estudio, análisis e identificación de las diferentes análisis e identificación de las diferentes macromoléculas en el laboratorio.macromoléculas en el laboratorio.

SEPARACIÓN DESEPARACIÓN DE MACROMOLÉCULAS MACROMOLÉCULAS

Centrifugación Centrifugación Decantación Decantación

(Tamaño molecular y diferente solubilidad)(Tamaño molecular y diferente solubilidad)

CENTRIFUGACIÓNCENTRIFUGACIÓN

Una de las propiedades físicas de las macromoléculas es que por su alta densidad tienden a sedimentarse en medio acuoso, lo que permite que se formen diminutos gránulos. Esta característica física hace posible separar macromoléculas con alto peso molecular mediante la centrifugación.

DECANTACIÓNDECANTACIÓN

LaLa decantacióndecantación es un método físico de separación de es un método físico de separación de mezclas especial para separar mezclas heterogéneas, mezclas especial para separar mezclas heterogéneas, estas pueden ser exclusivamente líquido - líquido ó estas pueden ser exclusivamente líquido - líquido ó sólido - líquido. La decantación se basa en la diferencia sólido - líquido. La decantación se basa en la diferencia de densidad (física)|densidad entre los dos de densidad (física)|densidad entre los dos componentes, que hace que dejados en reposo, ambos componentes, que hace que dejados en reposo, ambos se separen hasta situarse el más denso en la parte se separen hasta situarse el más denso en la parte inferior del envase que los contiene. De esta forma, inferior del envase que los contiene. De esta forma, podemos vaciar el contenido por arriba.podemos vaciar el contenido por arriba.

SolubilidadSolubilidad

Modificadas por:Modificadas por:

Cambios de pHCambios de pH Carga eléctricaCarga eléctrica

Sales

solventes orgánicos

Separadas Pruebas químicas específicas

OBJETIVOSOBJETIVOS

Extraer y reconocer macromoléculas presentes Extraer y reconocer macromoléculas presentes en la célula de levadura en la célula de levadura Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae

DISCUSIÓNDISCUSIÓN

Maceración: Maceración: Material abrasivo, arena.Material abrasivo, arena. Ácido tricloroacéticoÁcido tricloroacético: (cambios en el solvente – pH y : (cambios en el solvente – pH y

carga eléctrica – acentúa la diferencia de solubilidad - carga eléctrica – acentúa la diferencia de solubilidad - precipitación) precipitación)

Decantación: Decantación: (método de separación, diferencias de (método de separación, diferencias de solubilidad)solubilidad)

CentrifugaciónCentrifugación: Masa (tamaño molecular) y la densidad : Masa (tamaño molecular) y la densidad (determinada por su estructura).(determinada por su estructura).

Esta separación se hace en orden ascendente de masa Esta separación se hace en orden ascendente de masa y densidad. Primero se purifica la de menor masa y y densidad. Primero se purifica la de menor masa y densidad: densidad: Glucogéno.Glucogéno.

DISCUSIÓNDISCUSIÓN

Después de sedimentar? Precipitado? Sobrenadante?Después de sedimentar? Precipitado? Sobrenadante? Glucógeno + etanol: Disminuir la constante dieléctrica?Glucógeno + etanol: Disminuir la constante dieléctrica? Constante dieléctrica del etanol oscila entre 1 -10. Constante dieléctrica del etanol oscila entre 1 -10. ¿Por qué el etanol frío? Por que se quiere evitar que la ¿Por qué el etanol frío? Por que se quiere evitar que la

constante dieléctrica aumente con el aumento de la constante dieléctrica aumente con el aumento de la temperatura y a temperaturas bajas la energía cinética temperatura y a temperaturas bajas la energía cinética es menor y es más fácil precipitarla.es menor y es más fácil precipitarla.

CentrifugarCentrifugar Precipitado se le agrega LUGOL.Precipitado se le agrega LUGOL.

PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL GLUCOGENOGLUCOGENO

MOLÉCULA DE GLUCOGENOMOLÉCULA DE GLUCOGENO

DISCUSIÓNDISCUSIÓN

Sedimento inicial:Sedimento inicial:

NaCl 10% NaCl 10% calentamientocalentamiento CentrifugaciónCentrifugación

Las proteínas se precipitan o muestran mínimo de Las proteínas se precipitan o muestran mínimo de solubilidad cuando su pH corresponde al pH isoeléctrico, solubilidad cuando su pH corresponde al pH isoeléctrico, al que la molécula no posee carga eléctrica?al que la molécula no posee carga eléctrica?

DISCUSIÓNDISCUSIÓN

pH isoeléctrico:pH isoeléctrico: La salLa sal: Aporta aniones y cationes que producen la : Aporta aniones y cationes que producen la

ionización de los grupos R disociables, equilibrando las ionización de los grupos R disociables, equilibrando las cargas eléctricas, en estas condiciones no existe cargas eléctricas, en estas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas de proteínas repulsión electrostática entre moléculas de proteínas vecinas y tienden aglomerarse y precipitar (vecinas y tienden aglomerarse y precipitar (Lehninger 1987Lehninger 1987).).

DiscusiónDiscusión

Calentamiento: Calentamiento: Contribuye con el proceso de Contribuye con el proceso de precipitación, las proteínas pierden su estructura precipitación, las proteínas pierden su estructura terciaria y secundaria, conservando intacta la primaria. terciaria y secundaria, conservando intacta la primaria.

El calor incrementa la cinética de las moléculas El calor incrementa la cinética de las moléculas individuales, los enlaces que les confieren su individuales, los enlaces que les confieren su ESTRUCTURA se rompen, haciéndolas más solubles, ESTRUCTURA se rompen, haciéndolas más solubles, fenómeno conocido como DESNATURALIZACIÓN. fenómeno conocido como DESNATURALIZACIÓN. ((Lehninger 1987Lehninger 1987).).

DiscusiónDiscusión

Después de la centrifugación: Sedimento de Después de la centrifugación: Sedimento de proteínas y un sobrenadante de ácidos proteínas y un sobrenadante de ácidos nucleicos y solución de NaCl.nucleicos y solución de NaCl.

Porqué no precipita primero el ADN que tiene Porqué no precipita primero el ADN que tiene mayor masa?mayor masa?

DiscusiónDiscusión

Los ácido nucleicos no se sedimenta, por que al Los ácido nucleicos no se sedimenta, por que al desnaturalizarse no se rompen los enlaces desnaturalizarse no se rompen los enlaces covalentes entre el azúcar y la base covalentes entre el azúcar y la base nitrogenada, pero si se abre la estructura nitrogenada, pero si se abre la estructura duplohelicoidalduplohelicoidal((Lehninger 1987Lehninger 1987).).

DiscusiónDiscusión

Al sobrenadante con los ácidos nucleicos y la Al sobrenadante con los ácidos nucleicos y la solución de NaCl se le agrega el etanol frío.solución de NaCl se le agrega el etanol frío.

CentrífugaCentrífuga Sedimento estén los ácidos nucleicos.Sedimento estén los ácidos nucleicos. Adiciona amortiguador salino pH 7: regule el pH Adiciona amortiguador salino pH 7: regule el pH

y mantenga un estado iónico óptimo de las y mantenga un estado iónico óptimo de las moléculas.moléculas.

Se adiciona reactivo de ORCINOL (reacción de Se adiciona reactivo de ORCINOL (reacción de color verde es positiva): ARN.color verde es positiva): ARN.

Prueba de orcinol o prueba de BialPrueba de orcinol o prueba de Bial

OH

H3C OH

3FeCl3

3HCl

OH

H3C OH

Cl Cl

Cl

DiscusiónDiscusión

Sedimento de proteínas: se agrega una Sedimento de proteínas: se agrega una solución de NaCl para redisolverlas.solución de NaCl para redisolverlas.

Agrega NaOH y solución de sulfato cúprico: Agrega NaOH y solución de sulfato cúprico: BIURET.BIURET.

La prueba de Biuret detecta la presencia de La prueba de Biuret detecta la presencia de enlaces peptídicos y es positiva cuando están enlaces peptídicos y es positiva cuando están presentes dos o más. presentes dos o más.

El alcalí sirve para convertir el complejo El alcalí sirve para convertir el complejo en una solución de sodio soluble. El color en una solución de sodio soluble. El color se debe a la presencia de un complejo de se debe a la presencia de un complejo de coordinación con Cucoordinación con Cu+2 +2 en el cual el enlace en el cual el enlace peptídico de las proteínas conduce al peptídico de las proteínas conduce al complejo estable en el cual se forman de complejo estable en el cual se forman de dos a cinco miembros (dos a cinco miembros (Plummer, 1981Plummer, 1981))

DiscusiónDiscusión

BIURETBIURET

REACCIÓN DE BIURETREACCIÓN DE BIURET

N

CH

R

C

O

N

CH

R

C

O

N

CH

R

C

O

N

CH

R

C

OH H H H

N

C

R

C

O

N

C

R

C

O

N

C

R

C

O

N

C

R

C

OCu Cu Cu Cu

Complejo Purpura

Parte de cadena peptídica de proteínas

BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA Caicedo, L.D. Guía de Laboratorio de Bioquímica GeneralCaicedo, L.D. Guía de Laboratorio de Bioquímica General11, Práctica de laboratorio 2. , Práctica de laboratorio 2.

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264-7264-7 LehningerLehninger33. . Páginas: 165-176Páginas: 165-176 MATHEWSMATHEWS44, C. K, VAN HOLDE, AHERN, K.G. , C. K, VAN HOLDE, AHERN, K.G. Bioquímica.Bioquímica. Tercera Edición, Prentice Hall, Tercera Edición, Prentice Hall,

Madrid, 2003. Páginas. 202-3, Madrid, 2003. Páginas. 202-3, SKOOG, D, West D. SKOOG, D, West D. Química AnalíticaQuímica Analítica. . 4 ed, Mc Graw-Hill, Mexico, 1994. Páginas: 333.4 ed, Mc Graw-Hill, Mexico, 1994. Páginas: 333. BROCK. BROCK. Biología de los Microorganismos. Biología de los Microorganismos. 10ª Edición, Prentice Hall, Madrid, Paginas: 52.10ª Edición, Prentice Hall, Madrid, Paginas: 52.   Microsoft® Encarta® 2007 [DVD]. Microsoft Corporation, 2006. "Hongos.", “Levadura”, Microsoft® Encarta® 2007 [DVD]. Microsoft Corporation, 2006. "Hongos.", “Levadura”,

”Hidratos de carbono”, “ARN”, ”Proteínas”, “Carbohidratos”, “Ácidos nucléicos”.”Hidratos de carbono”, “ARN”, ”Proteínas”, “Carbohidratos”, “Ácidos nucléicos”.

http://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3genohttp://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3geno

La estructura y la polaridad de la molécula de agua hacen que esta sea un La estructura y la polaridad de la molécula de agua hacen que esta sea un disolvente capaz de reducir las fuerzas de atracción que existen entre disolvente capaz de reducir las fuerzas de atracción que existen entre partículas de cargas opuestas (o de reducir la repulsión entre partículas de partículas de cargas opuestas (o de reducir la repulsión entre partículas de cargas iguales). La constante dieléctrica no tiene unidades, pero es una cargas iguales). La constante dieléctrica no tiene unidades, pero es una medida de esa reducción y se define como:medida de esa reducción y se define como:

El El punto isoeléctricopunto isoeléctrico es el es el pH al que una al que una sustancia anfótera tiene carga neta tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula.

Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico.prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico.