MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA

HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS

ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS

KATHERIN SOCHA HIGUERA.

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al titulo de Microbiólogo industrial

Microbióloga Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Bogotá, D.C.

17 DE AGOSTO DE 2006

NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan

ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo

de buscar la verdad y la justicia”.

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA

HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS

ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS

KATHERIN SOCHA HIGUERA

APROBADO

________________________ ________________________ Marco Quijano Rico Christian Suárez Dipl.Chem.,Ph.D Microbiólogo Industrial Director Codirector ________________________ ________________________ David Gomez M.Sc. Andrea Aguirre M.Sc. Jurado 1 Jurado 2

MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA

HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS

ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS

KATHERIN SOCHA HIGUERA

APROBADO

________________________ ________________________ ANGELA UMAÑA M.Phil David Gomez M.Sc. Decano académico Director de Carrera

Dedico este trabajo a DIOS por su enorme ayuda en todos los momentos de mi

vida, por hacer que de los tiempos difíciles

tomemos las enseñanzas para poder construir tiempos mejores, por poner

siempre en mi camino personas que hacen mejor mi existir,

por darme la oportunidad de aprender de cada segundo que vivo y de darme

las herramientas para poder culminar esta etapa tan importante en mi vida.

A mi mamá: Ana Edilma Higuera, por darme su inmenso amor, que ha sido el

principal instrumento para poder cumplir todas mis metas, por brindarme su

apoyo y seguridad, por enseñarme a ser todo lo que soy y por que siempre ha

estado en todos lo momentos de mi vida dándome lo mejor de ella.

A mi amigo: Ronald Rojas, por su apoyo incondicional y su gran ayuda para

que este sueño se hiciera realidad.

A todos los que han estado a mi lado,

Katherin Socha Higuera

vii

Agradezco especialmente a mi director, Dr. Marco Antonio Quijano Rico,

por darme la oportunidad de aprender de sus grandes conocimientos, por su

hospitalidad y su apoyo incondicional, así como también al equipo de trabajo

del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga, por su gran colaboración y acogida.

A mi codirector, Christian Suárez por su cooperación,

y tiempo dedicado a este proyecto.

A la Dr. Adriana Morantes Higuera por su atención, asesoria y contribución.

A el Dr. Rodolfo Gamboa Jefe del laboratorio de biología y Microbiología de la

Universidad de Boyacá, por su colaboración y ayuda desinteresada.

Y a todos los que me colaboraron para poder realizar este proyecto.

ABSTRACT

Aim of this work was the evaluation of carbon dioxyde under hyperbaric

pressure for controlling microbiological off-odor producers: indigenous yeast

and lactic acid bacteria, in crushed local Pinot noir grapes, prior selected yeast

alcoholic fermentation. The procedure is equivalent to a carbonic maceration

under pressure. Crushed grapes were subjected to a CO2 atmosphere at

costant temperature and pressure of 15°C and 35 bar, during 360 minutes.

Population changes were monitored by plate counting. Population reductions

attained 97.8% in yeasts and 95.7% in lactid acid bacteria. Higher inhibition

rates could possibly be expected in the absence of baroprotective effects,

probably due to the 28°Brix grape juice reducing sugars ( fructose and glucose).

Sensory characteristics of wines were scored by trained people, following OIV

wine tasting protocols. Obtained results show that carbonic maceration under

pressure, could ameliorate microbiological and sensory characteristics of wine.

RESUMEN

En esta investigación, se evaluó el potencial del dióxido de carbono bajo

presión hiperbárica, para el control de poblaciones de microorganismos

generadores de olores desagradables en el vino: levaduras y bacterias ácido

lácticas indígenas, en estrujados de uvas locales de Pinot noir, antes de la

fermentación alcohólica, con levaduras seleccionadas. La operación equivale a

una maceración carbónica bajo presión. Los estrujados de uvas fueron tratados

a presión y temperatura constantes: 35 bar y 15°C durante 360 minutos. Los

cambios en las poblaciones se siguieron por recuento en placa. Se alcanzaron

reducciones del 97.8% en las levaduras y del 95.7% en las bacterias ácido

lácticas. Parece que la inhibición podría ser mayor, si no se presentara un

efecto baroprotector atribuible al contenido relativamente elevado de los

estrujados en ázucares reductores (glucosa y fructosa), 28°Brix. Las

características sensoriales de los vinos obtenidos, se calificaron por personas

previamente entrenadas, siguiendo la metodología de L’Office Internationale de

la Vigne et du Vin (OIV). Los resultados obtenidos indican que el tratamiento

propuesto posiblemente puede contribuir a mejorar las características

microbiológicas y sensoriales del vino.

viii

TABLA DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN 18

2 MARCO TEÓRICO Y REVISION DE LITERATURA 20

2.1 Descripción de la uva 20

2.1.1 El raspón 20

2.1.2 Los hollejos 20

2.1.3 Las semillas 21

2.2 Maduración de la uva 21

2.2.1 Periodo herbáceo 21

2.2.2 Envero 21

2.2.3 Periodo de maduración 22

2.2.4 Sobremaduración 22

2.3 Composición de las uvas 22

2.3.1 Agua y sales minerales 22

2.3.2 Hidratos de carbono 22

2.3.3 Ácidos 23

2.3.4 Fenoles 23

2.3.4.1 Ácidos fenólicos 23

2.3.4.2 Flavonoides 24

2.3.5 Compuestos nitrogenados 24

2.3.6 Lípidos y compuestos relacionados 24

2.3.7 Terpenoides 25

2.3.8 Compuestos volátiles de aroma 25

2.3.9 Vitaminas 25

2.4 Estrujado 26

2.5 El mosto 26

2.5.1 Obtención y tratamiento del mosto de uva 26

2.5.2 Componentes de uvas y mosto 27

ix

2.6 Bacterias ácido lácticas 27

2.7 Levaduras 29

2.7.1 Brettanomyces sp 30

2.8 Defectos del vino 31

2.8.1 Bacterias ácido lácticas 32

2.8.2 Levaduras

2.8.2.1 Brettanomyces sp.

34

36

2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de

vino tinto 38

2.9.1 Contaminación en el vino por Brettanomyces 38

2.10 Métodos empleados para el control de Bacterias

ácido lácticas y Brettanomyces sp 41

2.11 Potencial de CO2 bajo presiones hiperbaricas para

el control de bacterias ácido lácticas y levaduras

( Brettanomyces sp ) 42

2.12 Cinética de muerte microbiana 44

2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas

presiones 45

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 46

3.1. Formulación del problema 46

3.2. Justificación 46

4. OBJETIVOS 48

4.1. General 48

4.2. Específicos 48

5. MATERIALES Y MÉTODOS 49

5.1 Sitio de estudio 49

5.2 Muestreo 50

5.2.1 Preparación de muestras 50

5.3 Parámetros de operación del tratamiento

hiperbárico de CO2 50

5.4 Tratamiento de estrujados bajo presión 51

5.4.1 Biorreactor, partes y sus funciones 51

x

5.4.2 Procedimiento 53

5.5 Recuento de bacterias acido lácticas 54

5.6. Recuento de levaduras 55

5.7 Fermentación alcohólica 55

5.8 Análisis microbiológico de los vinos 56

5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas 56

5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes 56

5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp 56

5.9 Parámetros físico-químicos 57

5.9.1 Determinación del contenido

alcohólico por el método de Roessner 58

5.9.2 Determinación refractométrica del extracto

del vino 58

5.9.3 Determinación potenciométrica del pH 58

5.9.4 Color comparativo 58

5.10 Evaluación sensorial 59

5.11 Análisis estadístico 59

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 60

6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2

sobre células de levaduras y bacterias ácido

lácticas. 60

6.2 Parámetros Físico-Químicos de los vinos 69

6.3 Análisis microbiológico de los vinos 70

6.4 Análisis sensorial 71

7 CONCLUSIONES 77

8 RECOMENDACIONES 79

9 BIBLIOGRAFIA

10 ANEXOS

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Fermentaciones heterolácticas y homolácticas. 29

Figura 2 Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino. 38

Figura 3 Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y

levaduras (Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración

de vino tinto, 2 y 3 riego extremo, 4 riesgo interno. 40

Figura 4 Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá. 49

Figura 5 Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2 51

Figura 6 Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera

hiperbárica de CO2 de muestras de estrujados de uvas 53

Figura 7 Salida de muestra al ciclón de muestreo 54

Figura 8 Toma de muestra en el ciclón de muestreo 54

Figura 9 Equipo de filtración 57

Figura 10 Medio DBDM 57

Figura 11 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras,

promedio de los tres montajes 61

Figura 12 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias

ácido lácticas, promedio de los tres montajes 62

Figura 13 Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la

sobrevivencia de suspensión celular de R. rubra en medio de

Aw=0.94 67

Figura 14 Comparación del efecto del CO2 bajo presión.

Bacterias acido lácticas y levaduras. 68

Figura 15: Panel de catadores 72

Figura 16 Claridez de los vinos Pinot noir evaluados 73

Figura 17 Color de los vinos Pinot noir evaluados 73

Figura 18 Olor de los vinos Pinot noir evaluados 74

Figura 19 Sabor de los vinos Pinot noir evaluados 75

Figura 20: Impresión global de los vinos Pinot noir evaluados 76

xii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Estimación aproximada de los porcentajes normales, en

peso, de los componentes de las uvas y del mosto, en el momento

de la vendimia. 27

Tabla 2 Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias

ácido lácticas 32

Tabla 3 Características de las levaduras causantes de la flor del

vino. 35

Tabla 4 Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp 36

Tabla 5 Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y

Brettanomyces sp. 41

Tabla 6 Partes del biorreactor y su función. 52

Tabla 7 Promedio de los resultados del recuento de levaduras en

los tres montajes 60

Tabla 8 Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido

lácticas en los tres montajes 60

Tabla 9 Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias

acido lácticas y levaduras. 67

Tabla 10 Resultado del análisis físico Químico de los vinos 69

xiii

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 Equipos

ANEXO 2 Reactivos

ANEXO 3 Composición de medios de cultivo

3.1 Agar MRS

3.2 Agar YGC

3.3 Agar WL

3.4 Medio DBDM

3.5 Medio YNB

ANEXO 4 protocolo de procedimiento para tratamiento de

estrujados de uvas en atmósfera hiperbárica de CO2

ANEXO 5 Tablas de resultados

5.1 Resultados del recuento de levaduras en el Primer Montaje

5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Segundo Montaje

5.3 Resultados del recuento de levaduras en el tercer montaje

5.4 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Primer

Montaje

5.5 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el

Segundo Montaje

5.6 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Tercer

Montaje

5.7 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de

reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de levaduras

5.8 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de

reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de bacterias ácido

lácticas

ANEXO 6 Graficas

6.1 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 1

6.2 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 2

xiv

6.3 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 3

6.4 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido

lácticas, Montaje 1

6.5 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido

lácticas, Montaje 2

6.6 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido

lácticas, Montaje 3

6.7 Grafica comparativa del recuento de levaduras de los tres

montajes

6.8 Grafica comparativa del recuento de bacterias acido lácticas de

los tres montajes

ANEXO 7 Evaluación de características sensoriales

ANEXO 8 Tabla normalizada de la OIV para la evaluación de

características sensoriales

ANEXO 9 Guía de catación

ANEXO 10 Análisis Estadístico

10.1 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de levaduras en el Montaje Numero 1

10.2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de levaduras en el Montaje Numero 2

10.3 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de levaduras en el Montaje Numero 3

10.4 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

promedios de los recuentos de levaduras

10.5 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 1

10.6 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 2

10.7 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 3

10.8 Análisis estadístico de los resultados obtenidos del promedio

de los recuentos de bacterias ácido lácticas

xv

ANEXO 11 Interpretación del análisis estadístico

18

INTRODUCCIÓN

En la elaboración de vinos tintos de la variedad Pinot noir en la Loma de

Puntalarga, ha sido cada vez más frecuente la aparición de defectos del

perfil sensorial como: arratonado, sudor de caballo, pesebrera, tono de

alquitrán, medicina, cuero, los cuales se atribuyen generalmente a la

acción de levaduras del género Brettanomyces sp y/o a bacterias ácido

lácticas del género Lactobacillus. Este problema parece estar asociado a

los cambios en el proceso de vinificación que se han hecho para poder

desarrollar una fermentación maloláctica con cepas seleccionadas de

Oenococcus oeni, después de la fermentación alcohólica. Debido a la

gran sensibilidad de Oenococcus oeni al dióxido de azufre, SO2, es

necesario limitar la concentración de este en la masa estrujada alrededor

de 20ppm. Bajo estas condiciones el riesgo de desarrollo de

Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas indeseables es muy alto. En

efecto, para el control de Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas, en

general, se necesitan concentraciones de dióxido de azufre al menos de

40ppm.

Como la fermentación maloláctica con Oenococcus oeni le da a los vinos

de Pinot noir características sensoriales muy apreciadas, se requiere

evitar el daño causado por levaduras y bacterias lácticas indeseables. Es

decir, es necesario reducir considerablemente las poblaciones de esos

microorganismos y con ello los daños que pueden introducir en el perfil

sensorial.

Investigaciones precedentes realizadas en el Viñedo de Puntalarga

llevadas a cabo por Montaña, Ortegón (1997) y Álvarez, García (1998)

muestran que en las condiciones usuales de vinificación, el gas carbónico

a temperatura ambiente y bajo presiones hiperbáricas (10 a 50 bar)

puede ser empleado con el fin mencionado. La utilización de gas

carbónico es particularmente atractiva debido a que no es tóxico,

abandona fácilmente el producto, no es demasiado costoso, hace parte

19

de la ecología de la vinificación y las presiones a las cuales se ha utilizado

en Puntalarga son tecnológicamente accesibles con facilidad. La presente investigación busca establecer el tiempo de residencia

necesario para controlar bacterias lácticas y levaduras contaminantes en

estrujados de uvas operando a una temperatura de 15°C bajo una presión

de 35 bar (25 Kg/cm2) y una concentración en SO2 de 20mg/l.

20

2. MARCO TEORICO Y REVISION DE LITERATURA 2.1 Descripción de la uva.

Es un fruto procedente de una planta fanerógama sarmentosa y

caducifoliar de ciclo anual en climas templados (Matiz y Prieto 1993).

El racimo de la uva comprende una parte leñosa o raspón y los granos

también llamados bayas que están constituidos por la piel, las semillas, y

la pulpa que proporciona el zumo o mosto. El grano de uva esta

compuesto por un epicarpio, la piel, película o pellejo, un mesocarpio

carnoso, la pulpa y un endocarpio, el cual tapiza los lóculos que contienen

las semillas (Galet 2000).

2.1.1. El raspón.

Los tallos, también llamados raspón o escobajo, constan del vástago

principal, que por lo común sale de la axila de una hoja, y de los tallitos

ramificados, en los que se asientan los granos. Constituyen a la vez las

vías de conducción de las sustancias nutricias, que se forman

preferentemente en las hojas y durante la etapa de crecimiento y

maduración se acumulan en la carne de las uvas como ácidos, azúcar,

etc. (Galet 2000).

Las uvas que se consideran bien maduras exhiben por lo general los

tallos de color castaño y completamente lignificados (Riberéau et al.

1989).

2.1.2. Los hollejos.

Las pieles u hollejos de las uvas están cubiertos por lo regular por una

fina capa cérea llamada pruina que protege las células de la piel de la

acción de la humedad atmosférica e impide la penetración de gérmenes

patógenos en el interior de los granos. El componente más importante del

21

hollejo es el pigmento contenido en las capas de células y cuya cantidad e

intensidad cromática desempeñan un papel relevante en la elaboración

del vino tinto (Vogt et al.1986, Reynier 1991).

2.1.3. Las semillas.

En todos los granos de la uva normalmente desarrollados existen semillas

cuyo número oscila entre 2 y 4, cuyo peso constituye el 3 o 4% del de los

granos, contienen 10-20% de aceite y 5-9% de taninos, pequeñas

cuantías de ácidos volátiles y una sustancia resinosa muy amarga que

presta al vino un desagradable sabor astringente cuando se disuelve a

partir de las semillas (Riberéau et al. 1989, Navarre 1991).

2.2 Maduración de la uva.

El estado de maduración de la uva condiciona la calidad e incluso el tipo

de vino, es por tanto, uno de los principales factores de la vinificación. En

la mayoría de las regiones vinícolas no se puede obtener vino de

excelente calidad, si la uva no esta bien madura. La evolución de la uva

se divide en cuatro periodos (Reyner 1991):

2.2.1. Periodo herbáceo. Durante este periodo se forma el grano, la uva

es verde, coloreada por la clorofila, y presenta una consistencia dura

(Riberéau et al. 1989, Galet 2000).

2.2.2. Envero. Corresponde a la época fisiológica de la coloración de la

uva, al mismo tiempo engorda y adquiere elasticidad. La uva blanca pasa

del verde al amarillo, la uva tinta pasa del verde al rojo claro y después al

rojo oscuro. Este fenómeno es muy brusco, durante este periodo el

azúcar de las uvas aumenta de modo repentino (Galet 2000).

22

2.2.3. Periodo de maduración. Es el periodo comprendido entre el

envero y la madurez de la uva en donde, la pulpa acumula rápidamente

azúcar y al mismo tiempo disminuye la acidez, se presenta engrosamiento

del grano de uva, formación de taninos, coloración del fruto y formación

de aromas. Este periodo es irregular y depende de las condiciones

meteorológicas (Ribéreau et al. 1989, Galet 2000).

2.2.4. Sobremaduración. Se presenta cuando la uva se deja en la vid

después de la madurez normal. Durante este periodo el fruto no recibe

nada más de la planta, vive de sus reservas y pierde agua (Vogt et al.

1986 y Galet 2000).

2.3 Composición de las uvas. 2.3.1. Agua y sales minerales. Por medio del agua las raíces de la vid toman también sales minerales del

suelo necesarias para la constitución de la cepa, principalmente se trata

de fosfatos de potasio, calcio y magnesio, pero también de pequeñas

cuantías de sulfatos, cloruros y silicatos. De acuerdo con la variedad de

la uva y el grado de maduración de esta, el contenido de agua oscila entre

780 y 850 g/l (Vogt et al. 1986, Boulton et al. 2002). 2.3.2. Hidratos de carbono.

El azúcar se forma como resultado de la fotosíntesis en la que hay

asimilación del anhídrido carbónico (CO2) del aire por las hojas verdes de

la cepa bajo la acción de la luz, desde allí se transporta el azúcar hasta

los granos de uvas, donde se acumula en grandes cantidades en el curso

de la maduración. El azúcar presente en los racimos maduros se

compone, aproximadamente en partes iguales de glucosa (azúcar de

uva) y fructosa. También se encuentra sacarosa pero en escasa

23

concentración, y otros azúcares, que se sabe están presentes debido a la

biosíntesis, entre ellos están: arabinosa, ribosa, xilosa, mucosa, maltosa,

manosa, melobiosa, rafinosa y estaquiosa (Blouin et al. 2000, Boulton et

al. 2002).

2.3.3. Ácidos La cantidad de ácidos en las uvas o en los productos derivados de ellas

es pequeña. La acidez de las uvas sanas esta constituida, por 95%, de

los ácidos tartárico y málico, se encuentran igualmente pequeñas

cantidades de cítrico, isocítrico, aconitico, glutárico, fumárico, pirrolidin-

carboxilico, 2-cetoglutárico y sikímico, que también se encuentran en

mostos. En uvas y vinos dañados aparecen los ácidos propionico y

butírico (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002).

2.3.4. Fenoles Las sustancias fenólicas son muy importantes para las características de

la uva y del vino, así como para su calidad. En ellas se incluyen los

pigmentos colorantes, los compuestos que forman compuestos de color

marrón, los aromas, los gustos astringentes y las conocidas sustancias

amargas de las uvas y del vino (Boulton et al. 2002).

2.3.4.1. Ácidos fenólicos

Los ácidos fenólicos encontrados se incluyen en dos grupos. El primer

grupo son los hidroxibenzoatos considerados derivados del ácido p-

hidroxibenzóico, como lo son el ácido p-hidroxibenzoico, ácido

protocatetico, ácido gálico, ácido vainillínico, ácido siríngico, ácido

salicílico y el ácido gentísico. El segundo grupo los hidroxicinamatos se

consideran derivados del ácido p- cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico.

Entre los contenidos más elevados se encuentran al ácido siríngico y al

24

ácido P-cumárico (30mg/l), después el ácido vainillínico y el cafeico

(15mg/l) (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002).

2.3.4.2. Flavonoides Los antocianinos, son las sustancias que esencialmente caracterizan las

uvas. En la piel de las uvas, incluso de las blancas, hay una mezcla de

pigmentos verdes y amarillos. En las uvas rojas y azules se encuentra al

iniciarse la maduración un pigmento rojo azulado (enina, enocianina), este

corresponde a las sustancias colorantes vegetales rojas y azules

comprendidas bajo la denominación común de “antocianina“(Blouin et al.

2000).

La sustancia tánica (enotanino) esta contenida en el escobajo, pieles y

semillas y tiene un marcado sabor astringente (Ribéreau et al. 1989).

2.3.5. Compuestos nitrogenados Los compuestos nitrogenados contenidos en la uva son principalmente las

sales amonicas, aminoácidos , péptidos, proteínas y derivados de ácidos

nucleicos, resultan de gran interés para la elaboración del vino por ser

sustancias nutricias imprescindibles para las levaduras (Blouin et al.

2000).

2.3.6. Lípidos y compuestos relacionados El contenido de extracto graso en las semillas de la baya esta constituido

en un 90% por triglicéridos con alrededor del 75% de ácido linoleico y

10% de ácido oleico; en otras partes de la baya, como en la pruina del

hollejo, también hay materiales lipoides extraíbles, incluyendo

glucolipidos, fosfolipidos y ácidos grasos (Vogt et al. 1986, Boulton et al.

2002).

25

2.3.7. Terpenoides Los grupos de mayor interés en la elaboración del vino, son los

monoterpenos y sus derivados. Los monoterpenos son compuestos de 10

átomos de carbono, mucho de los cuales son volátiles y poseedores de

aroma (Boulton et al. 2002).

2.3.8. Compuestos volátiles del aroma En las uvas están presentes muchos compuestos volátiles de aroma y sus

precursores, cantidades importantes de estos compuestos, especialmente

etanol, alcoholes amílicos, acetato de etilo y derivados del acetaldehído,

se producen en todas las fermentaciones por levaduras (Boulton et al.

2002).

Las diversas clases de uvas se diferencian, únicamente en los valores

cuantitativos de las sustancias que la componen, así, las variedades de

“bouquet “se caracterizan por un elevado contenido en alcoholes y óxidos

terpénicos (Ribéreau et al. 1989).

2.3.9. Vitaminas Las vitaminas solubles en grasas y sus precursores, con la excepción de

la vitamina E en el aceite de semilla de uva, son muy escasas o están

ausentes en las uvas y en el vino. Las vitaminas B, solubles en agua,

aparecen normalmente, pero no en niveles suficientes para hacer de ellas

una fuente especialmente atractiva para la nutrición de los seres

humanos. La vitamina C, ácido ascórbico, esta normalmente presente en

cifras de alrededor de 100 mg/kg de uvas frescas. Esta cantidad es mas o

menos la décima parte de la que hay en frutos cítricos, pero puede ser

importante (Boulton et al. 2002).

26

2.4 Estrujado

Consiste en romper el hollejo de la uva de modo que libere la pulpa y el

zumo, el estrujado puede ser más o menos intenso según el hollejo sea

simplemente aplastado o triturado. La estructura de la pulpa puede

permanecer casi intacta o por el contrario las gruesas vacuolas de las

células ceden todo su zumo (Ochoa et al. 1991, Bryce 2000).

2.5 El mosto El zumo de uva que fluye al prensar los granos “machacados “es un

líquido turbio y dulce que exhibe color entre amarillento claro y rojizo, si se

deja en reposo, se clarifica dejando un pozo compuesto principalmente

por restos celulares de las uvas. El mosto de uva contiene numerosas

sustancias disueltas, entre las que prevalecen por su cantidad e

importancia, azúcares como glucosa y fructosa y ácidos como tartárico,

málico y cítrico. El “peso” del mosto, su contenido en azúcar, ácidos y

otros componentes, dependen de la clase de uva, del tipo de suelo del

que procede, de las condiciones atmosféricas que imperaron durante el

desarrollo y maduración de los racimos (Matiz et al. 1993, Ribéreau et al.

1989).

2.5.1. Obtención y tratamiento del mosto de uva Los racimos cortados cuidadosamente de la cepa, con tijeras especiales

para vendimiar, se limpian de uvas resecas y podridas, se eliminan con la

mayor rapidez posible de los escobajos, luego se estrujan en molinos de

uva sin romper los granos (semillas), y a continuación se prensan en

prensas mecánicas, hidráulicas o neumáticas, en cuya operación se

separa el jugo (mosto) de la masa de uvas (bagazo). Una parte del mosto

fluye sin ejercer presión (mosto, flor) pero la mayor parte del mismo se

obtiene prensando (mosto de prensado) y todavía se obtiene una fracción

27

residual esponjando el bagazo y volviendo a prensar (mosto de

extracción, post extracto). En los vinos tintos la uva se fermenta sin

eliminar el hollejo y el color es extraído durante la fermentación (Lizarazo

y Martínez 1996).

2.5.2. Componentes de uvas y mosto Tabla 1: Estimación aproximada de los porcentajes normales, en peso, de los

componentes de las uvas y del mosto, en el momento de la vendimia.

COMPUESTOS BAYAS MOSTO

Agua 74 76

Sales inorgánicas 0.5 0.4

Hidratos de carbono 24 23

Alcoholes 0 0

Ácidos 0.6 0.7

Fenoles 0.2 0.01

Compuestos nitrogenados 0.2 0.1

Lípidos 0.2 0.01

Terpenoides 0.02 0.01

Otros compuestos volátiles 0.01 0.01

Varios 0.1 0.01

Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino

2.6 Bacterias ácido lácticas

Las bacterias ácido lácticas forman un grupo heterogéneo, que presenta

características generales como ser, Gram positivas, catalasa negativas,

no esporuladas, microaerofilas, no presentan motilidad, no tienen

actividad citocromo oxidasa, ni reducen los nitratos, no producen

pigmentos y algunas presentan gránulos metacromáticos. Anaerobias

facultativas y fermentadoras de azúcares en condiciones diversas,

respondiendo a diversos tipos morfológicos, se distinguen los cocos de

forma redondeada u oval y los bacilos o bastones en forma de trazos mas

o menos largos. Los cocos tienen de 0.4 a 1.0ų de diámetro, los bacilos

28

pueden tener 0.5ų de espesor y de 2 a 5ų de longitud (Zambonelli 1988,

Álvarez et al. 1998).

Según el catabolismo de los azúcares, las bacterias ácido lácticas tienen

carácter homo y heterofermentativo. Las homofermentativas originan

ácido láctico (80-90%) utilizando la vía glicolitica de Embden-Meyerhof; y

las heterofermentativas metabolizan la glucosa siguiendo la ruta de

Warburg-Dickens ( figura 1 ), originando además de ácido láctico,

importantes cantidades de anhídrido carbónico, ácido acético,

acetaldehído, etanol, acetoina, diacetilo, etc. ( Hernández 1995 )

El manual de Bergeys las ha dividido en cuatro grupos considerando un

amplio número de elementos como son: la taxonomía molecular, la

determinación de peptidoglicano de la pared celular, la definición de los

grupos antigénicos y el isómero de ácido láctico obtenido. Se dividen en

los Géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Pediococcus

(Krieg 1994, Zambonelli 1988).

29

Figura 1: Fermentaciones heterolacticas y homolacticas

Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino

2.7 Levaduras

Las levaduras se definen como hongos unicelulares, que se diferencian

de otros eucariotas, protozoos y algas, porque tienen paredes celulares

rígidas y no tienen pigmentos fotosintéticos y de las bacterias, porque

tienen núcleos con membrana. Las levaduras por su interés enológico se

clasifican en tres grupos : los agentes de fermentación alcohólica , los de

refermentación, las cuales causan la fermentación de los restos de azúcar

30

de los vinos dulces y pueden enturbiar o dar sedimentos en los vinos

secos; y las de contaminación, que se encuentran en gran cantidad en

bodegas de conservación destacándose los géneros Pichia, Hansenulla y

Candida , causantes de velos que se forman en la superficie de los vinos

o en paredes empapadas de vino y en contacto con el aire ( Dittrich 1987,

Loureiro et al. 2003).

2.7.1. Brettanomyces sp.

Brettanomyces es una levadura que pertenece a los ascomycetos y es la

responsable de olores y sabores desagradables principalmente en vinos

tintos de la variedad Pinot noir (Gerbaux et al. 2000).

Dekkera es la forma esporulada de la levadura Brettanomyces. El género

Brettanomyces, presenta 5 especies: B. nanus, B. anomalus, B.

custersianus y B. naardenensis y B. bruxellensis, siendo ésta última la

que interesa desde el punto de vista enológico (Egli and Kling 2001).

Brettanomyces es un microorganismo fermentador relativamente lento,

por esta razón es raramente el organismo dominante durante la

fermentación primaria y puede encontrarse al final de la fermentación

alcohólica y maloláctica (FML), puede fermentar cantidades pequeñas de

azúcares residuales, es frecuentemente encontrada en vinos y puede

fermentar bajo condiciones aerobias y anaeróbicas. Es una levadura

fuertemente acidogénica, que produce grandes cantidades de ácido

acético de la oxidación del etanol (Parish et al. 2003, Chatonnet, 2002).

Brettanomyces puede usar varios sustratos y crecer rápidamente sobre

cualquier residuo de azúcar, como glucosa, fructosa, arabinosa y

trehalosa encontrada en el vino. La celobiosa, un componente de la

celulosa es otro sustrato que puede ser utilizado por Brettanomyces

(Licker et al. 1998).

Un amplio espectro de sabores y aromas han sido asociados con el

carácter de Brettanomyces incluyendo los clavos de olor, corral, cuero,

31

medicinal, pelo del caballo, sudor del caballo, antiséptico, plástico, ratón, y

metálico (Chassagne 2005, Ibeas et al. 1996).

2.8 Defectos del vino

No siempre se consigue que un vino fermente y madure de manera que

satisfaga las expectativas de los conocedores. Desde el prensado hasta

el embotellado el vino esta expuesto al peligro de sufrir daños que pueden

llegar a motivar su completo deterioro, los microorganismos responsables

de esto son todos aquellos indeseables en un lugar y tiempo particular.

Obviamente, incluyen los microorganismos que producen aromas y

gustos extraños, olores, colores o precipitados, además de sustancias

indeseables que pueden incluso afectar a la aptitud del vino para el

consumo, es decir, que no solo afectan a los caracteres sensoriales

(ejemplo: producción de aminas biogenas), estos compuestos pueden

progresar- lo que resulta especialmente característico- y hacer al vino

incomestible (Suárez et al. 1990, Boulton et al. 2002).

La reproducción de los microorganismos se ve influenciada de manera

determinante por la composición del vino, pero, el crecimiento de estos

se puede frenar mediante la utilización de temperaturas suficientemente

bajas, altos contenidos en dióxido de azufre (H2SO3) libre sobre todo

eficaz frente a bacterias y levaduras, cuando se cuenta con elevados

grados de acidez. Sin embargo, grandes poblaciones de microorganismos

hacen que incluso cuando se utilizan las dosis mas altas de sustancias

antimicrobianas, la estabilidad no sea garantizable. El llenado de botellas

con las dosis mas altas de dióxido de azufre libre (50mg/l) tampoco

garantiza la estabilidad microbiológica del vino. La aparición de

enfermedades en el vino pueden prevenirse solo creando condiciones que

inhiban el crecimiento de microorganismos indeseables, partiendo del

principio que es más fácil prevenir los defectos y enfermedades que

corregirlos o curarlos (Vogt et al. 1984, Ditrrich 1987).

32

2.8.1. Bacterias ácido lácticas

Tabla 2: Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias ácido lácticas

DEFECTO

AGENTE

CARACTERISTICAS

SUSTANCIAS

RESPONSABLES

PICADO LACTICO

Bacterias

heterolácticas

pertenecientes al

género

Lactobacillus

(Guillaume 2001).

Se reconoce por el

penetrante sabor

ácido dulce y olor de

coles fermentadas

frescas (Guillaume

2001).

Ácido láctico, acético,

glicerina, etanol y

diacetilo. Formados

por la transformación

de azúcares

residuales presentes

en el vino (Suárez et

al. 1990) (Pardo

2004).

AHILADO O

ENFERMEDAD

DE LA GRASA

Streptococcus

mucilaginus var.

vini, bacterias

heterofermentativas

del género

Lactobacillus.

Especies del

género

Leuconostoc

(Suárez et al. 1990).

Se caracteriza por el

aspecto aceitoso o

filante (Suárez,

1990).

Cambio de la

consistencia fluida,

normal en vinos

sanos, en otra mas

viscosa (Pardo

2004).

Polisacáridos exentos

de nitrógeno,

integrados por

glucanos,

glucomananos, y

polímeros

compuestos de

galactosa, manosa,

arabinosa y ácido

galacturónico (Suárez

et al. 1990)

VUELTA O REBOTE

Bacterias del

género

Lactobacillus

(plantarum, brevis)

(Guillaume 2001).

Los vinos presentan

enturbiamiento,

cambio de color,

aspecto

achocolatado

negruzco en tintos y

oscurecimiento en

los blanco, en la

Ácido láctico o

succínico, acético y

CO2. Formados por la

degradación del

ácido tartárico

(Guillaume 2001).

33

superficie burbujas

de gas (Guillaume

2001).Se observan

irisaciones

coloreadas como

islotes flotantes de

grasa. El sabor y el

olor llegan a ser

repugnantes, siendo

este relacionado con

el olor a chucroutte

(Guillaume 2001).

ENFERMEDAD

DEL AMARGOR

Lactobacillus casei,

Lactobacillus

fructivorans,

Lactobacillus

hilgardii,

Leuconostoc

gracile,

Leuconostoc oenos

(Suárez et al. 1990)

Color del vino rancio,

presenta

enturbiamiento y se

genera un sedimento

castaño.

Sabor amargo

elevado (Suárez et

al. 1990).

Acroleína en

combinación con los

polifenoles

(Guillaume 2001).

AMINAS

BIOGENICAS

Pediococcus,

Oenococcus oeni,

Bacterias

heterolácticas

pertenecientes al

género

Lactobacillus

(Moreno et al.

2003).

Efectos sobre la

salud humana,

absorbidas en alta

concentración

producen dolores de

cabeza, alteraciones

respiratorias, hiper o

hipotensión y

fenómenos de

alergia. El carbamato

de etilo es

considerado como

un compuesto

Formación de aminas

biogénicas,

histamina, tiramina,

feniletilamina,

cadaverina,

putrescina y

agmanita, por

descarboxilación de

los aminoácidos

(Guillaume 2001).

Formación de

carbamato de etilo,

por la degradación de

34

cancerigeno (Orduña

2000).

la arginina ( Orduña

2000)

VINOS CON

OLOR A RATON

Bacterias

heterofermentativas

del género

Lactobacillus como

Lactobacillus brevis

y Lactobacillus

hilgardii.

( Heresztyn 1986,

Boulton et al.

2002).

El olor de estos vinos

recuerda el olor de

los nidos de ratones

o la orina de raton

(Boulton et al.

2002).

Formación de

piperidinas,

2-acetil-3, 4, 5,6-

tetrahidropiridina

(Boulton et al. 2002).

DETERIORO PRODUCIDO

POR MANITOL

Bacterias lácticas

heterofermentativas

(Boulton et al.

2002).

Gusto a vinagre y a

ester. Producción de

viscosidad (Boulton

et al. 2002).

Formación de

manitol, butanol,

propanol y ácido

acético (Boulton et al.

2002).

2.8.2. Levaduras Las levaduras salvajes podrían no tomarse como contaminantes en vinos,

es decir, los géneros que se encuentran en concentraciones mas bien

altas sobre las uvas, y que logran fermentaciones alcohólicas limitadas:

Kloeckera, Hansenulla y Hanseniaspora; la influencia de estos

microorganismos sobre la fermentación alcohólica depende de las

condiciones de elaboración, el uso de dióxido de azufre y/o los cultivos

iniciadores de levaduras vínicas, pero en cualquier caso llegaran a ser

inactivas cuando la concentración de etanol alcanza el 5%

aproximadamente(Boulton et al. 2002, Pina et al. 2004).

Otras levaduras silvestres como Pichia y Candida son contaminantes en

vinos jóvenes, especialmente si no se conservan adecuadamente con

SO2 y evitando el oxígeno; Metschnikowia, Torulospora, y Debaryomyces

35

pueden estar en concentraciones bajas en el vino joven, pero nunca crean

problemas durante la conservación (Dittrich 1987, Boulton et al. 2002)

Tabla 3: Características de las levaduras causantes de la flor del vino

MICROORGANISMO

CARACTERISTICAS PRINCIPALES

Pichia membranefaciens

• Se desarrolla en mostos de uva

(Suárez et al. 1990).

• A veces puede iniciar una

levísima fermentación sobre estos

(Montaña et al. 1997, Loureiro et

al. 2003).

• En mostos de uva forma un velo

muy tenue, liso o con rugosidad,

muy fino (Flor del vino) (Suárez et

al. 1990).

• Fermentan únicamente glucosa y

fructosa (Dittrich 1987).

• Son células de forma oval,

alargadas o cilíndricas (Dittrich

1987).

Candida mycoderma

• Fermenta débilmente la glucosa

(Suárez et al. 1990).

• Asimila el etanol como única

fuente de carbono (Montaña et al. 1997).

• Produce la enfermedad de flor del

vino (Suárez et al. 1990).

• Son células de forma oval,

alargadas, cilíndricas (Suárez et

al. 1990).

Hansenula anomala

• Presenta células redondeadas y

alargadas (Dittrich 1987).

36

• Esporas con forma típica de

sombrero de hongo (Suárez et al. 1990).

• Fermenta débilmente los

azucares: glucosa, rafinosa,

sacarosa (Montaña et al. 1997).

• Forma velo sobre el mosto antes

de fermentar (Suárez et al. 1990).

Zygosaccharomyces acidifaciens

• Células ovales-alargadas de gran

tamaño (Dittrich 1987).

• Presenta poder fermentativo

medio (Suárez et al. 1990).

• Forma velo sobre vinos de baja

graduación alcohólica (Suárez et

al. 1990).

• Se desarrolla en medios con alta

concentración de azúcar (Dittrich

1987).

2.8.2.1 Brettanomyces sp. Tabla 4: Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp.

CARACTERÍSTICAS

COMPUESTOS RESPONSABLES

Perdida de los sabores frutales,

producidos por los esteres.

Se pierde parcialmente el carácter

varietal de un vino contaminado por

Brettanomyces (Eder 2003).

ESTERASAS.

Secretadas por Brettanomyces, estas

enzimas promueven la perdida de esteres

(Eder 2003).

Aroma desagradable, relacionado con

el aroma del chucroutte (Berger

2003) (Guillaume 2001).

ACETATO DE ETILO Y ACIDO ACETICO. El

acetato es formado por oxidación del etanol.

(Berger 2003).

37

El aroma específico depende de la

concentración de los compuestos

responsables. En concentraciones

bajas huele como a pan o palomitas

de maíz. En grandes concentraciones

como ratón o pelo y sudor de caballo

(Heresztyn 1986).

TETRAHIDROPIRIDINAS. Para la síntesis de

estas se requiere de los sustratos lisina,

etanol o propanol

(Heresztyn 1986).

Aroma y sabor a analgésico y

medicina gracias a la presencia del 4

etil fenol, picante y humeante por el 4

etil guaiacol (Eder 2003, Chassagne

2005).

4 etil fenol y 4-etil guaiacol, son fenoles

volátiles, formados por la degradación del 4-

vinil fenol y 4-vinil guaiacol , respectivamente

( Chatonnet 1992, Gerbeaux et al. 2000,

Stender et al. 2001, Dias et al. 2003,

Loureiro et al, 2003).

Los compuestos fenólicos sólo se producen por Brettanomyces , su

presencia en el vino puede servir como una indicación absoluta de

contaminación por este microorganismo, en tanto los ácidos grasos

volátiles no confirman una directa contaminación por parte de

Brettanomyces , ya que estos compuestos son producidos también por

muchas bacterias ácido lácticas y ácido acéticas, así como las

tetrahidropidridinas producidas también por lactobacilos

heterofermentativos (Heresztyn 1986 , Peyron 1998 , Berger, 2003).

Los vinos tintos tienen un nivel alto de taninos como el ácido ferúlico y

cumárico que son extraídos de los hollejos de las uvas durante la

fermentación. La levadura del vino Saccharomyces y algunas bacterias

ácido lácticas tienen enzimas las cuales degradan estos ácidos a

intermediarios débiles llamados 4 vinil fenol y 4 vinil guaiacol (paso 1,

figura 2). Estos compuestos son enzimáticamente degradados por

Brettanomyces a 4 etil fenol y 4 etil guaiacol respectivamente (paso 2,

figura 2) (Chatonnet et al. 1992).

38

Figura 2: Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino

Fuente: Gawel, 2004. Brettanomyces character in wine

2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de vino tinto. 2.9.1. Contaminación en el vino por Brettanomyces. La relación de Brettanomyces con el vino comienza en la vid. Se ha

hallado en el hollejo de la uva de todo tipo de cepas de Vitis vinifera y en

casi todas aquellas regiones donde se ha estudiado con las técnicas

apropiadas, pero no causa ningún tipo de enfermedad ni al fruto ni a la

planta, simplemente se aprovecha de las soluciones azucaradas

secretadas. Cuando llega la época de la vendimia la levadura llega al

lugar adherida a la uva, por lo que es la propia materia prima la que

constituye la principal fuente de contaminación (Licker et al. 1998).

Las operaciones de previnificación que van desde la recolección de la

materia prima (uva) hasta el estrujado de la misma, es una fase de

moderado riesgo en cuanto a la contaminación se refiere; las operaciones

de vinificación que van desde la masa estrujada hasta el embotellado es

una fase en la que las condiciones pueden ser reguladas y controladas

dentro del proceso, la fermentación tampoco es una fase en la que suela

causar dificultades. Si los mostos se encuentran poco sulfitados puede

comenzar a desarrollarse al comienzo de la fermentación, pero muy

39

pronto es eclipsada por la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Posteriormente, tras la fermentación, es muy posible que entre la flora

microbiana presente en el vino comience a sobresalir Brettanomyces,

sobre todo si las condiciones higiénicas durante la fermentación no han

sido adecuadas (Figura 3) (Caridi et al. 1993).

Las principales habilidades que tiene Brettanomyces para desarrollarse

en un vino son la gran capacidad para fermentar azúcares residuales y

una extraordinaria adaptación a condiciones ambientales adversas como

las que presenta el vino (alta concentración de alcohol, pH ácido, falta de

oxígeno, etcétera) Después de la fermentación del mosto aún

permanecen trazas de azúcares que pueden ser utilizadas por este tipo

de levaduras para su desarrollo, su crecimiento es lento y su metabolismo

es complejo. En muchos casos la presencia de este contaminante no

implica que el vino vaya a enfermar ni siquiera en un período prolongado.

En otros, una barrica o una botella pueden pasar de tener un vino

excelente a otro con una alta acidez volátil y unos aromas desagradables

en cuestión de semanas. El ácido acético contribuye a aumentar la acidez

volátil, el olor a vinagre, también producido por muchas bacterias

indeseables, normalmente el aumento en ácido acético conlleva a la

aparición de acetato de etilo, que da olores a acetona (Chatonnet 2002,

Chatonnet et al. 1992).

Un vector de contaminación es la mosca de la fruta Drosophila

melanogaster, que es muy abundante en la época de la vendimia, y se

encarga de llevar Brettanomyces a todos los rincones de la cava. Si las

condiciones de desinfección no han sido apropiadas, en los instrumentos

e instalaciones de la cava pueden existir células que se pueden propagar

y contaminar los vinos (Berger 2003).

40

1. Entorno 2. Cepa + uvas. Alto riesgo de contaminación por Bacterias lácticas y

Levaduras (Brettanomyces sp.) 3. Uvas, operaciones de previnificación. Moderado riesgo de

contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces

sp.) 4. Uvas, operaciones de vinificación y acondicionamiento. Bajo riesgo

de contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces sp.)

Figura 3: Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras

(Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego

externo, 4 riesgo interno

Fuente: Quijano-Rico 2005.

41

2.10 Métodos empleados para el control de bacterias ácido lácticas y

Brettanomyces sp. Tabla 5: Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp.

METODO

Bacterias ácido lácticas

Brettanomyces sp

SO2

Son muy sensibles a este,

comienzan a verse

afectadas a

concentraciones bajas de

20ppm (Suárez y Leal

1990).

La adición de 20ppm no

tiene ningún efecto en las

poblaciones de

Brettanomyces sp, la

inhibición del crecimiento

de esta levadura se da

adicionando 40ppm

(Fevillat 1997).

REDUCCION DE LA

ACIDEZ

Un pH mas básico

disminuye la eficacia del

anhídrido sulfuroso como

antiséptico. Permitiendo así

un mejor desarrollo de las

bacterias lácticas

indeseables (Gerbeaux

et al. 2002)

Se crea un ambiente mas

favorable para el desarrollo,

habría que utilizar el triple

de anhídrido sulfuroso para

conseguir la misma

protección frente a los

microorganismos

( Gerbeaux et al. 2002)

NATAMICINA

No inhibe el crecimiento

estos microorganismos

( Gerbeaux et al. 2002)

Es un fungicida, actúa

sobre Brettanomyces

cuando se utiliza a una

concentración de 20mg/l,

su eficacia decrece con el

tiempo ( Gerbeaux et

al. 2000)

LISOZIMA

Inhibe el crecimiento de

bacterias lácticas a una

concentración de 10g/l

(Gerbeaux et al. 2000).

Su crecimiento no se ve

inhibido por esta (Gerbeaux

et al. 2000).

42

FILTRACION ESTERIL

Estas células se ven

atrapadas en filtros de

membrana con un tamaño

de poro de 0.65 micras.

Se utilizan filtros de

membrana con tamaño de

poro de 0.45 micras. La

filtración despoja del

carácter frutal, reduciendo

la viscosidad, y creando un

tanino más fuerte en el vino

tinto (Chatonnet et al.

1999).

DIMETIL

DICARBONATO ( DMDC )

Inhibe el crecimiento de

estas bacterias. (Egli y

Kling 2001).

Su crecimiento se ve

inhibido, ya que, el DMDC

es esterilizante (Egli y Kling

2001).

2.11 Potencial del CO2 bajo presiones hiperbáricas para el control de bacterias ácido lácticas y levaduras.

Los efectos inhibitorios de gases bajo presión sobre células microbianas

han sido extensivamente estudiados. Sin embargo, el mecanismo general

de inhibición de microorganismos no es todavía bien entendido, aunque

existe la posibilidad de que se ejerza la absorción de gas por las células,

así, cuando las células microbianas son presurizadas, el gas

gradualmente penetra dentro de las ellas. Este fenómeno de gas puede

causar la inactivación de enzimas claves relacionadas con los procesos

metabólicos esenciales por cambios en el pH de las células y/o

solubilización de sustancias intracelulares tales como fosfolípidos de las

paredes de la célula y membrana citoplasmática (Haas et al. 1989).

Se ha observado que después del tratamiento con gas bajo presión, hay

presencia de hoyos y arrugas en las células de levadura. Algunas células

se encontraron totalmente estalladas, mientras las células no tratadas

aparecen como esferas, con superficie lisa. Las observaciones de los

cambios morfológicos sugieren que las células de levadura o al menos

algunas de ellas, son rotas mecánicamente o desgarradas por el

43

tratamiento con gas comprimido (Haas et al. 1989, Nakamura et al.

1994).

El efecto del dióxido de carbono comprimido sobre diferentes tipos de

microorganismos ha sido estudiado por diversos investigadores. La

inactivación microbiana por CO2 es dependiente de muchos parámetros.

Algunas de las condiciones experimentales como temperatura, presión,

humedad, contribuye a un efectivo tratamiento por incremento de la

difusibilidad de CO2. Dentro de ciertos límites, una prolongada duración

de exposición al dióxido de carbono puede permitir la esterilización (Wei.,

et al. 1991) (Lin et al. 1993).

La resistencia microbiana al dióxido de carbono también depende de el

tipo de microorganismo, la fase de crecimiento, y el medio de suspensión,

este último puede inhibir el efecto bactericida de CO2 comprimido,

especialmente en sustratos ricos en proteínas .Varias hipótesis han sido

propuestas para explicar la actividad microbicida del dióxido de carbono

Lin et al (1993), ha observado que a alta presión, el dióxido de carbono

penetra las células haciendo que estás se rompan de repente. Los

autores pudieron mejorar la velocidad de ruptura disminuyendo

súbitamente la presión de CO2. Nakamura et al (1994) y Kumagai et al

(1997) observaron que el mejor resultado de destrucción microbiana fue

obtenido cuando la presión de CO2 fue reducida muy rápido. En alimentos

con alto contenido de agua, el CO2 disuelto produce ácido carbónico, de

acuerdo a la siguiente reacción de equilibrio:

H2O + CO2 ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3- ↔ 2H+ + CO3

2-

Ecuación 1: Producción de acido carbónico

Fuente: Louka, 1999. Effect of compressed carbon dioxide on microbial cell viability

Así el CO2 disuelto actúa bajando el pH del medio, y el resultado de la

acidez permite interferir con algunos sistemas biológicos dentro de las

44

células. Esto sugiere que la inhibición microbiana puede resultar de

alteración en las propiedades de la célula (membrana, citoplasma,

enzimas, etc.). Por tanto una reducción en el pH del medio no es

suficiente para explicar la acción antimicrobiana con CO2, la cual muestra

un efecto inhibitorio específico, mayor que el de otros ácidos usados para

bajar la acidez del medio (ácido hidroclórico, ácido fosfórico), estos ácidos

no penetran en las células microbianas tan fácilmente como el dióxido de

carbono (Louka et al. 1999).

2.12 Cinética de muerte microbiana La cinética de muerte celular es un factor importante que debe tenerse en

cuenta a la hora de diseñar procesos de esterilización. En un

medioambiente letal, las células de una población no mueren todas a la

vez sino que la desactivación del cultivo se produce durante un periodo

finito de tiempo que depende del número inicial de células viables y de la

severidad de las condiciones impuestas (Doran 1995).

La muerte de una población, al igual que su crecimiento, es generalmente

exponencial o logarítmica, es decir, la población se reduce en niveles

iguales a intervalos constantes. Si se representa el logaritmo del número

de microorganismos de la población que sobrevive, frente al tiempo de

exposición a un agente determinado, resulta en una línea recta. Cuando

la población se ha reducido notablemente, la velocidad de destrucción

puede disminuir debido a la supervivencia de las cepas microbianas mas

resistentes (Mañas et al. 2005).

45

2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas presiones La aplicación de cualquier nueva tecnología en la preservación de

alimentos requiere un modelo fiable que describa con presición la tasa de

inactivación. El modelo debe poder establecer las condiciones de

tratamiento apropiadas para lograr los niveles de inactivación microbiana,

permitiendo la producción de estabilidad y seguridad en los alimentos

(Mañas et al. 2005).

Los parámetros del proceso térmico generalmente han sido calculados a

través del modelo cinético de primer orden. Como resultado una curva de

supervivencia recta (gráfico de Log de células sobrevivientes vs tiempo

de tratamiento) es obtenida, un tiempo de reducción decimal (valor D) y

valor Z son usados para calcular los parámetros del proceso (Smelt et al.

2002).

Los primeros experimentos para dilucidar la cinética de destrucción de los

microorganismos por las altas presiones se hicieron imitando los modelos

muy bien conocidos de los tratamientos térmicos, es decir, representando,

a presión constante, el logaritmo de supervivientes frente al tiempo de

tratamiento (Mañas et al. 2005).

Sin embargo, en los últimos 10 años la conveniencia de la cinética de

primer orden para modelos de inactivación por calor, así como para las

nuevas tecnologías esta revisándose. Esto es debido a la ocurrente

frecuencia de desviaciones (Chen et al. 2003).

Algunos autores admiten que la naturaleza de la cinética de desactivación

por las altas presiones difiere de la de la muerte térmica y otros tipos de

tratamientos pudiendo variar incluso entre cepas de la misma especie y

de la presión que se aplique (Simpson y Gilmour 1997).

46

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION. 3.1. Formulación del problema. Para la realización de la fermentación maloláctica bajo condiciones

controladas es necesario reducir considerablemente las dosis usuales de

SO2. En estas condiciones diversos microorganismos perjudiciales para

las características sensoriales del vino tales como: bacterias ácido lácticas

y levaduras por ejemplo del género Brettanomyces, pueden multiplicarse

sin grandes limitaciones y causar daños importantes e irremediables en el

perfil sensorial de los vinos. La utilización del CO2 hiperbárico para el

tratamiento de los estrujados de uvas debe permitir una reducción

suficiente de las poblaciones de estos microorganismos para evitar las

mencionadas alteraciones del perfil sensorial del vino, o por lo menos

reducirlas a niveles aceptables.

3.2. Justificación. La elaboración de vinos tintos de calidad superior consta de cuatro etapas

en el proceso de vinificación: 1. maceración de la masa estrujada de la

vendimia, 2. fermentación alcohólica en la cual se transforman los

principales azúcares de la uva, glucosa y fructosa, en etanol y dióxido de

carbono, 3. fermentación maloláctica que tiene por objeto transformar el

ácido málico relativamente áspero en ácido láctico mucho más suave, y 4.

en el caso de los vinos Pinot noir una etapa ulterior a la fermentación

maloláctica, que se ha observado incide sobre la estabilidad del color, que

es el reposo del vino sobre el deposito de células no viables de levadura.

En estas cuatro etapas el riesgo de daño del perfil sensorial del vino por la

acción de bacterias ácido lácticas y/o levaduras como las pertenecientes

al género Brettanomyces sp es muy alto. Probablemente la eliminación de

una parte importante de las poblaciones de los microorganismos

mencionados, puede permitir la reducción del riesgo. Por las

47

características químicas, toxicológicas, tecnológicas, el dióxido de

carbono bajo presión parece ser promisorio para alcanzar este objetivo, ya

que el uso del dióxido de azufre como antiséptico es limitado en el

presente caso por la sensibilidad a este de Oenococcus oeni (agente de

la fermentación maloláctica controlada). El tratamiento con dióxido de

carbono bajo presión no produce alteraciones en el perfil sensorial. En

cambio la pasteurización y la termovinificación que vienen a ser una

alternativa, introducen cambios notables en el perfil sensorial de los vinos.

No sobra anotar que actualmente cerca de setenta viticultores están

asociados al proyecto vitivinícola de Puntalarga y por lo tanto su ingreso

depende en gran medida del éxito de los vinos regionales en el mercado.

48

4. OBJETIVOS

4.1. GENERAL Evaluar el potencial del CO2 bajo presión hiperbárica, para el control de

poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas, en uvas estrujadas

de la variedad Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga.

4.2. ESPECIFICOS

• Establecer el tiempo necesario para reducir en mas de 95% las

poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras bajo las siguientes

condiciones: Presión: 35 bar, pH: 3.2-3.3, temperatura 15°C y

concentración de azúcares 28°Brix.

• Evaluar la respuesta al tratamiento hiperbárico de CO2 de poblaciones

de bacterias ácido lácticas y levaduras por medio de la técnica de

“recuento en placa”.

• Evaluar la presencia de Brettanomyces sp. en medio DBDM después

de la fermentación alcohólica.

• Comparar los perfiles sensoriales de vinos obtenidos a partir de

estrujados tratados y no tratados con CO2 bajo presión hiperbárica.

49

5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Sitio de estudio El trabajo se llevó a cabo en el viñedo “Loma de Puntalarga” Nobsa,

Boyacá (Figura 4), situado a 5°46'47.1” latitud norte y 72°58'36.5” longitud

oeste, altitud de 2618 m.s.n.m. la loma esta localizada al borde del

denominado Valle del Sol, Valle de Sogamoso en la proximidad del curso

del rió Chicamocha en la vertiente occidental de la cordillera oriental de

los Andes. En el año se tienen promedios de temperatura y precipitación

de 16.5°C y 830mm respectivamente (Chaparro 2001).

Figura 4: Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá

Fuente: Quijano-Rico 2005

50

5.2 Muestreo

Se escogió aleatoriamente una parcela dentro del viñedo, cultivada con

cepas de Pinot noir. Posteriormente se tomaron 100 uvas de diferentes

plantas, con el fin de determinar el grado de maduración de la uva, por

medio del contenido en azúcar grados Brix (gramos de azúcar en 100 ml

de solución: 1° Brix equivale a 10g de azúcar/ L), el cual aumenta con el

grado de maduración (Matiz et al. 1993, Bryce 2000).

Una vez conocido el grado de maduración de las uvas se llevo a cabo la

vendimia o cosecha, de plantas seleccionadas aleatoriatoriamente. Se

procedió con precaución al momento de cortar el racimo de la mata. Los

racimos fueron recolectados y depositados en baldes (Matiz et al. 1993,

Paipilla et al. 1997,).

5.2.1 Preparación de muestras

Se realizó un despalillado manual de los racimos seleccionando las uvas

por color y sanidad. Se pesaron 8Kg de uvas. Y se procedió a realizar un

estrujado manual de los granos de uva, se adicionó 0.35g de metabisulfito

de sodio, y se procedió a almacenarlo en bolsas de polietileno con 250g

de estrujado c/u. Se sellaron y se almacenaron a -18°C. (Gutiérrez et al.

1993, Steild et al. 2001, Archer 2004, Zdenek 2003).

5.3 Parámetros de operación del tratamiento hiperbárico de CO2

En este estudio se empleo el CO2 para probar su poder de inactivación

sobre el crecimiento de células microbianas. En los estrujados de uvas.

Se experimentó con un método de control de CO2 a una presión de

operación de 35 bar, temperatura 15°C, 28°Brix y pH: 3.3.

Para cada montaje se tomaron muestras a los 0, 30, 60, 90, 120, 150,

180, 210, 240, 300 y 360 minutos de tratamiento, a cada muestra se le

51

realizó recuento en placa de bacterias ácido lácticas y levaduras (Anexo

5) (Montaña et al. 1997, Álvarez et al. 1998, Quijano 2005).

Con el fin de obtener una mayor exactitud en los resultados, el

procedimiento se realizó por triplicado (montaje 1,2 y 3)

5.4 Tratamiento de estrujados bajo presión 5.4.1 Biorreactor, partes y sus funciones

Figura 5: Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2

Fuente: Montaña 1997, Quijano-Rico 2005.

52

Tabla 6: Partes del biorreactor y su función

PARTES DEL BIOREACTOR

FUNCIÓN

A. Válvula Abre el cilindro que contiene el CO2.

B. Válvula Regula el paso de CO2.

C. Válvula Permite el paso de CO2 del cilindro al autoclave.

D. Válvula Se utiliza para la extracción de la muestra desde la cámara de

presión.

E. Manómetro Un medidor de presión (manómetro de 0-100 bar).

F. Válvula de alivio

Permite regular la presión del biorreactor.

G. Tapones y uniones “T”

Para sellar y conectar tramos de tubería de ¼ de pulgada

respectivamente.

H. Conectores Al cilindro de CO2.

J. Conducto central

Paso del CO2, del cilindro al recipiente de la muestra.

K. Filtro Para salida de muestra, en tela de acero inoxidable.

L. Recipiente contenedor del liquido

Fabricado en acero inoxidable 316.

M. Ciclón de muestreo

Para toma de muestras.

N. Cilindro de CO2 Contiene CO2.

O. Doble pared Para la regulación de temperatura, mediante la circulación de un

líquido caloportador.

P. Abrazadera Ajusta herméticamente el biorreactor.

El biorreactor, esta conectado a un sistema de refrigeración para

mantener constante la temperatura del biorreactor a un valor de 15°C,

compuesto por: un recipiente de doble camisa, uno en acero inoxidable

316, y otro en icopor, una bomba de recirculación de agua, compresor,

radiador y ventilador (Sanabria y Zarate 2005).

53

5.4.2 Procedimiento

Figura 6: Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de

muestras de estrujados de uvas

Descongelación de muestras 15°C por 15 h

Carga del biorreactor con 750g de estrujado

Cierre hermético del equipo

Expulsión de aire por corriente de CO2 durante 5 minutos

Toma de muestras (minutos) (Figuras 7 y 8)

30 60 90 120 150 180 210 240 300

Recuento

Bacterias ácido lácticas

Levaduras

Lavado y desinfección del ciclón de muestreo

Después de cada toma de muestra

Presurización con CO2 35 bar, 15°C

0 360

54

Figura 7: Salida de muestra al ciclón de muestreo

Figura 8: Toma de muestra en el ciclón de muestreo

5.5 Recuento de bacterias ácido lácticas

Para realizar el conteo de bacterias ácido lácticas, se realizaron diluciones

seriadas decimales desde 10-1 hasta 10-6 en agua peptonada al 0.1%p/v

Se sembraron en superficie 0.1ml de estas diluciones en agar MRS

(Anexo 3.1) y se incubaron a 30ºC por 72 horas, en microaerofília. La

aparición de colonias blancas, Gram positivas y catalasa negativas se

considero indicativo de bacterias ácido lácticas (Álvarez et al. 1998 y

Carrascal et al. 2002).

Para la lectura se escogieron placas con 30 a 300 colonias y el número

final de bacterias se calculó de acuerdo a la dilución escogida (UFC/ ml).

55

5.6 Recuento de levaduras

Para realizar el conteo de levaduras, se realizaron diluciones seriadas

decimales desde 10-1 hasta 10-6 en agua peptonada al 0.1%p/v.

Se sembraron en superficie 0.1ml de las diluciones en agar YGC (Anexo

3.2) y se llevaron a incubar a 25°C por 3 días, adicionalmente se realizo

coloración de Gram (Lizarazo et al. 1996, Zagorc et al. 2001, Carrascal et

al. 2002).

Para la lectura se escogieron placas con 15 a 150 colonias y el número

final de levaduras se calculó de acuerdo a la dilución escogida (UFC/ ml)

5.7 Fermentación alcohólica

Una vez establecido el tiempo de tratamiento en el cual se redujeron las

poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas a más de un 95 por

ciento, se realizó la fermentación alcohólica. Para realizar la fermentación se procedió a descongelar 1500g de estrujado de uvas (15°C por 15

horas), de los cuales 750g fueron sometidos a tratamiento hiperbárico con

CO2 a 35bar, 15°C y 360 minutos, esta muestra llevó el nombre de

muestra con tratamiento hiperbárico de CO2. Los 750g restantes, no tuvieron ningún tratamiento con dióxido de

carbono, esta muestra llevó el nombre de “muestra control”.

La muestra con tratamiento hiperbárico de CO2, y la muestra control

fueron sometidas a fermentación alcohólica bajo condiciones controladas,

utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae, cepa ATCC procedente

de Lallemand, Canadá, selección comercial en forma de levadura

liofilizada (Rojas 1991 y Quijano 2005).

56

5.8 Análisis microbiológico de los vinos 5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas Para determinar la presencia o ausencia de bacterias ácido lácticas, se

realizaron siembras en superficie del producto final (vino con tratamiento

hiperbárico de CO2 y vino control) en medio MRS (Anexo 3.1), selectivo

para bacterias ácido lácticas, se incubaron a 30°C por 72h en

microaerofília. La aparición de colonias blancas, Gram positivas y

catalasa negativas se considero indicativo de presencia de bacterias

acido lácticas (Álvarez et al.1998; Carrascal et al. 2002, Sanabria et al.

2005).

5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes Para verificar la presencia o ausencia de levaduras salvajes, se realizo

una siembra en superficie de las muestras de vino en agar WL (Anexo

3.3), luego se llevaron a incubar a 25°C por tres días, adicionalmente se

realizo coloración de Gram (Carrascal et al. 2002, Sanabria et al. 2005).

5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp

Para determinar la presencia de Brettanomyces sp se realizaron siembras

en superficie de los vinos obtenidos, en agar DBDM (anexo 3.4).

El medio sembrado se llevó a incubar a 25°C por 14 días (Mitrakul et al.

1999, Gerbeaux et al.2000, Rodríguez et al. 2001, Días et al. 2003, Silva

et al. 2004).

Este medio de cultivo es parcialmente selectivo y completamente

diferencial para Brettanomyces sp. en vinos, la aparición de colonias

amarillo crema como puntos de alfiler, el cambio de color del medio de

azul a amarillo y la detección de olores fenólicos (olor a ratón, sudor de

caballo, establo, analgésico y/o ahumado) es indicativo de la presencia

57

de Brettanomyces sp. (Gerbeaux et al. 2000, Rodríguez et al. 2001, Días

et al. 2003).

Figura 9: Equipo de filtración

Figura 10: Medio DBDM

5.9 Parámetros físico-químicos Para el análisis físico-químico se utilizaron muestras del vino con

tratamiento hiperbárico de CO2 y vino control.

58

5.9.1 Determinación del contenido alcohólico por el método de Roessner Para la determinación del grado alcohólico de los vinos se utilizó un

areómetro, con escala entre 980 y 1020 g/l, y un refractómetro calibrado,

con escala en °Brix (Quijano 2005).

Seguido a esto se aplicó la formula de Roessner:

CETL = [(CRFT°Brix.4,17) + (1000-d)] X 0,365

5.9.2 Determinación refractométrica del extracto del vino

Se utilizó una muestra de 25 ml de vino, y se redujo el volumen en un

dispositivo evaporador en corriente de aire caliente a 90°C, hasta

aproximadamente 15 ml. Se completó con agua destilada a 25 ml, se

mezcló bien, seguido a esto se leyó en el refractómetro el valor en °Brix

de la solución. Se expresó el resultado en g/100g (Quijano 2005).

5.9.3 Determinación potenciométrica del pH

Para realizar esta medida se utilizó pH-metro metrohm , pH 0,0-14,0 ±0,1

(Quijano 2005).

5.9.4 Color comparativo Se utilizaron copas blancas especiales para evaluar el color del vino, esta

evaluación también se llevó a cabo en el vino con tratamiento hiperbárico

de CO2 y el vino control (Quijano 2005).

59

5.10 Evaluación sensorial El análisis sensorial se llevó a cabo por 4 jueces entrenados de acuerdo

con la metodología establecida en el viñedo & Cava Loma de Puntalarga

por un tiempo aproximado de 1-20 años, incluyendo a la autora del

presente trabajo. Se evaluaron las características sensoriales de tres

muestras correspondientes a vino Pinot noir del Viñedo de Puntalarga,

vino con tratamiento hiperbárico con CO2 y vino control. Las pruebas de

análisis sensorial se realizaron en un salón ventilado e iluminado, se sirvió

aproximadamente 30ml de las muestras a temperatura ambiente en copas

de degustación transparentes e incoloras, codificadas con un digito (1,

2,3) (Anexo 8 y 9) (Porras et al 2003, Quijano 2005, Sanabria et al. 2005).

5.11 Análisis estadístico Los resultados de los recuentos realizados a las muestras con tratamiento

hiperbárico de CO2 se analizaron usando el programa statistiXL versión

1.4; con el cual se trabajo a un nivel de significancía de α=0.05. Para el

análisis de los datos se aplicó el modelo estadístico de Regresión Lineal

Simple, el cual explica la variación en los recuentos en UFC/mL que es la

variable dependiente numérica (y) en términos de una variable numérica

independiente (x), en este caso el tiempo (Anexo 10 y 11) (Walpole et al.

1992, Morantes 2006)

60

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2 sobre células de

levaduras y bacterias ácido lácticas.

En este trabajo de investigación se evaluó el efecto de la presión de CO2

sobre bacterias ácido lácticas y levaduras como metodología alternativa

de tratamiento para mejorar la calidad de vinos de la variedad Pinot noir.

Los resultados obtenidos se muestran en las tablas 7 y 8.

Tabla 7: Promedio de los resultados del recuento de levaduras en los tres montajes.

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje(%) de inhibición

0 42x104 5,619789 12,940042 0

30 25x104 5,392110 12,4157932 40.48

60 88x103 4.942834 11,381297 79.05

90 75x103 4,873126 11,220789 82.14

120 62x103 4,790050 11,0294988 85.24

150 53x103 4,721536 10,871738 87.38

180 39x103 4,587337 10,5627332 90.71

210 37x103 4,552262 10,4819718 91.19

240 30x103 4,472268 10,2977794 92.86

300 20x103 4,308208 9,92001685 95.24

360 9x103 3,3970037 9,1413475 97.86

Tabla 8: Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en los tres

montajes.

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje de inhibición

0 28x104 5,44715803 12,5425449 0

30 15x104 5,18563658 11,9403695 46.43

60 91x103 4,95744765 11,4149451 67.5

90 85x103 4,92771246 11,3464773 69.64

120 77x103 4,88460658 11,2472223 72.5

61

150 69x103 4,83674597 11,1370192 75.36

180 52x103 4,71321044 10,8525681 81.43

210 37x103 4,56427143 10,5096234 86.79

240 23x103 4,4366926 10,2158622 91.79

300 17x103 4,23044892 9,74096862 93.93

360 12x103 4,09108047 9,4200609 95.71

Estos resultados mostraron que con un tiempo de residencia de 360

minutos bajo presión de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujados de

uvas, se obtuvó una reducción de la población de levaduras del 97.9 por

ciento correspondiente a una población final de 9X103 UFC/mL y de 95.7

por ciento de bacterias ácido lácticas con una biomasa final de 12X103

UFC/mL, datos obtenidos del promedio de los tres montajes realizados.

Las figuras 11 y 12 muestran que la disminución de la viabilidad celular

depende no solo de la presión sino también del tiempo de exposición, se

ha reportado que el tiempo requerido para la inactivación completa,

depende de factores tales como: tipo de microorganismo (bacteria,

hongo), estado en que se encuentra (vegetativa, espora), fase de

crecimiento, composición del medio y condiciones del tratamiento (Louka

et al. 1999, Karama et al. 2001 y Spilimbergo et al. 2003).

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/mL

Figura 11: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres

montajes

62

Figura 12: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio

de los tres montajes

Con el fin de comprobar la acción del dióxido de carbono bajo presión

sobre las poblaciones de microorganismos evaluadas, se calcularon los

valores D y K. El valor K definido como la velocidad de muerte constante

o tasa de inactivación, fue calculado del reciproco de la pendiente de la

curva de sobrevivencia siguiendo un análisis cinético tradicional, los

resultados de este presentaron un valor de 0.0133 min –1 para levaduras y

para bacterias ácido lácticas de 0.0097 min –1. Los valores K obtenidos en

el tratamiento bajo presiones hiperbáricas de CO2 indican que este

tratamiento afecta significativamente la respuesta microbiana, como fue

reportado previamente por Shimoda et al. 2001 (Erkmen et al. 2000 y

Karaman et al. 2001 ).

El tiempo de reducción decimal, valor D para levaduras y bacterias ácido

lácticas hallados a partir del promedio de los montajes, señaló que se

necesitan 173 y 238 minutos respectivamente, para reducir una población

a su décima parte a una presión de CO2 de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH

3.3, en estrujado de uvas de la variedad Pinot noir, es decir disminuir una

unidad logarítmica, lo cual comprueba que las levaduras son menos

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/mL

63

resistentes a la presión de CO2 que las bacterias ácido lácticas quienes

necesitan mayor tiempo de exposición (Anexo 5.7 y 5.8).

Los resultados señalaron que la cinética de inactivación por presión para

los dos tipos de microorganismos evaluados sigue un modelo cinético de

primer orden debido a la baja dispersión de los datos (Ver anexo 10)

demostrado en sus altos coeficientes de correlación (r2>0.9); resultados

similares fueron obtenidos por Shimoda et al. 2001, Erkmene et al. (2000)

y Karaman et al. (2001).

A pesar que los efectos inactivantes del CO2 sobre los microorganismos

son utilizados en la industria alimenticia, el mecanismo de inactivación no

ha sido claramente definido. A continuación se presentan algunos

posibles mecanismos basados en la información obtenida en la literatura

consultada.

Karaman et al. (2001) atribuyeron el poder inactivante de este proceso a

la alteración de las proteínas responsables para la replicación, integridad

y metabolismo. La alta presión al parecer no rompe enlaces covalentes,

pero si altera uniones tipo puentes de hidrógeno y uniones iónicas

responsables para mantener a las proteínas en su forma biológicamente

activas.

Erkemen 2000 , piensa que se origina en la difusión del dióxido de

carbono dentro de la membrana celular, acumulandose dentro de las

células. A presión suficiente es posible que un gran número de moléculas

de CO2 pasen continuamente la membrana celular y reduzcan el pH

interno copando la capacidad buffer del citoplasma. Cuando el pH

intracelular cae por debajo de 3, procesos vitales biológicos como la

glicólisis son inhibidos . Según Louka et al. 1999, Erkmen 2000 y

Karaman et al. 2001, el dióxido de carbono se disuelve en solución

acuosa formando ácido carbónico, lo cual baja el pH del medio, aunque

64

es difícil esperar que este sea el único mecanismo responsable del efecto

letal en las células.

Hass et al. 1989 y Nakamura et al. 1994, observaron que después del

tratamiento con gas bajo presión, hay presencia de hoyos y arrugas en

las células, esto sugiere que las células o al menos algunas de ellas, son

rotas mecánicamente o desgarradas por el tratamiento con gas

comprimido.

En estudios realizados anteriormente en el Viñedo & Cava Loma de

Puntalarga se utilizó el tratamiento con CO2 para inactivar células de

levadura (Montaña y Ortegón 1997), y bacterias ácido lácticas en vinos

por Álvarez y García 1998. En mostos de uvas a 30 bar se observó una

reducción del 96 por ciento de la población de levaduras a los 120 min en

mostos de uvas con 14°Brix, mientras en vino de 11.5 volúmenes% en

alcohol y menos de 1g/L de azúcar residual se logro inactivación de

bacterias ácido lácticas a 30 bar por 30 minutos. Comparando estos

resultados con la presente investigación, deduce la importancia que tiene

el medio en el cual se encuentran suspendidas las células microbianas,

ya que la eliminación de las poblaciones evaluadas en este proyecto fue

menos rápida, debido talvez en parte a la naturaleza del medio (estrujado

de uvas), esta diferencia podría atribuirse también al contenido en

sustancias disueltas en las muestras evaluadas. Se trabajó con una

concentración de azúcares de 28°Brix, mayor a la utilizada en mostos de

uva (14ºBrix). Según Mohio (1993) cuanto más alta sea la presión de CO2

y más bajo el contenido de azúcar, será mas rápida la inactivación,

demostrando así que la inhibición de los microorganismos por alta presión

de CO2 esta sujeta a gran variedad de parámetros, que hacen que las

condiciones de operación se limiten a un caso específico (Karama et al.

2001).

65

Montaña y Ortegón (1997), utilizando la misma técnica que la aquí

descrita, pero nitrógeno en cambio de dióxido de carbono, no observaron

reducciones significativas en poblaciones naturales de levaduras de

mostos de uvas. Los autores aplicaron presiones de 40 y 100 bar hasta

por 120 minutos, a una temperatura promedio de 17°C. Estos resultados

pueden atribuirse a la inercia química del nitrógeno, frente a la actividad

química del dióxido de carbono, en las condiciones experimentales. Dillow

et al. (1999) ya anotaron que la toxicidad del CO2 para microorganismos,

en un medio acuoso, esta relacionada esencialmente con la formación de

acido carbónico en solución acuosa, que resume la reacción:

H2O + CO2 ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3- ↔ 2H+ + CO3

2-

El equilibrio de esta reacción, es desplazado por incremento de la presión,

en la dirección de la formación de ácido carbónico, de acuerdo con el

principio de Le Chatelier.

La concentración de H2CO3 en un sistema acuoso es directamente

proporcional a la solubilidad del CO2 en el sistema. A su turno, esta

dimensión es directamente proporcional a la presión ejercida por el gas

sobre el sistema. Además aumenta con el contenido del sistema en

etanol, pero disminuye con la temperatura y con la concentración de otras

sustancias en solución (glucosa, fructosa, glicerol, taninos) Cavazzani

(1985).

Aunque los mecanismos de inhibición de microorganismos por medio de

altas presiones hidrostáticas (1000 a 10000 bar), difieren

considerablemente de los que operan en presencia de un gas con

actividad química, bajo presiones relativamente bajas (10 a 50 bar), como

el aquí estudiado ( Quijano 2006 ), es interesante tener presentes los

fenómenos de baroprotección y baropromoción de la inhibición de

microorganismos por presión, debidos a sustancias disueltas en sistemas

acuosos hidrostáticos, descritos por Knoor (1995). En la figura 13 tomada

66

de dicho autor, se observan los efectos baroprotector de la fructosa y

glucosa y baropromotor de NaCl, en la inhibición de poblaciones de

Rhodotorula rubra, bajo una presión de 4000 bar. La sacarosa, en las

condiciones experimentales, es un baroprotector más eficaz que la

fructosa, mientras que NaCl al 10% es un baropromotor muy eficaz.

Guardando todas las proporciones del caso, el análisis del

comportamiento de poblaciones de bacterias acido lácticas y levaduras en

estrujados de uvas y vinos tratados con dióxido de carbono bajo presión,

puede dar algunas luces sobre manifestaciones similares a las que se

acaban de describir, Figura 14. El efecto baroprotector, en principio es

atribuible al contenido en glucosa y fructosa (28°Brix) de los estrujados de

uvas, es notorio, mas en el caso de las bacterias ácido lácticas, que en el

de las levaduras. En cambio, la curva referente a un vino (contenido en

etanol 11,5 vol%, en azúcar residual <1g/l) muestran un efecto

baropromotor que recuerda al del NaCl. En primera aproximación estos

fenómenos pueden ser atribuidos al contenido relativamente elevado, en

sólidos solubles ( glucosa, fructosa 28°Brix) de los estrujados de uvas y al

del etanol (11.5 vol%), en el caso del vino. Parece que el método, de

inhibición de microorganismos por CO2 bajo presión, se encuentra, como

los sistemas de inhibición hidrostáticos, con barreras y ventajas asociadas

respectivamente con los fenómenos de baroprotección y baropromoción,

pese a las diferencias del orden de un factor de 100 en los valores de las

presiones aplicadas.

67

Figura 13: Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la sobrevivencia de suspensión celular de R. rubra en medio de Aw=0.94.

Fuente: Knoor, R.1995. Food process design and evaluation

Tabla 9: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias ácido lácticas y

levaduras.

Tiempo % de células vivas de bacterias acido

lácticas en estrujados de uvas

a 35bar(este trabajo)

% de células vivas de

levaduras en estrujados de

uvas a 35bar(este trabajo

%de células vivas de bacterias ácido lácticas en vino a 30bar(Álvarez et

al.,1998)

0 100 100 100 30 53.57 59.5 0 60 32.5 20.9 0 90 30.3 17.8 0 120 27.5 14.8 0 150 24.64 12.61 - 180 18.57 9.29 0 210 13.21 8.81 - 240 8.21 7.14 - 300 6.07 4.76 - 360 4.29 2.14 -

68

0102030405060708090

100

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Porc

enta

je d

e ce

lula

s vi

vas

Bacterias acido lacticas enestrujados de uvas a 35bar

Levaduras en estrujados deuvas a 35bar

Bacterias acido lacticas envino 30bar

Figura 14: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras.

Finalmente, el análisis estadístico de la reducción de poblaciones

microbianas por presiones hiperbáricas de CO2 realizado por la técnica de

recuento en placa, a través del modelo de regresión lineal simple,

demostró que existe una fuerte correlación lineal negativa entre los datos,

ya que a medida que aumenta el tiempo, el número de Unidades

Formadoras de Colonia disminuye en forma lineal, tal como se verifica por

el Coeficiente de Correlación de Pearson obtenido(> -0.95), el hecho de

que el valor de significancía del coeficiente obtenido, sea muy pequeño

(0.000001), indica la fuerte relación existente entre las variables. El

análisis de varianza ANOVA ( One way AOV) dentro de los resultados de

la regresión evaluó la hipótesis de si existía relación entre la variable

dependiente para este caso las UFC/mL y la independiente el tiempo de

tratamiento, los valores obtenidos del estadístico F: 257.0777 para

bacterias ácido lácticas y 103.2667 para levaduras ( F(0.05,1,9) = 5.12) ,

reveló que existía una innegable relación entre las variables, y sugirió que

la variable independiente es un indicador significativo de la variable

dependiente. El modelo de regresión lineal se ajusto al tipo de datos

manejado, mostrando obviamente una disminución en la población tanto

69

de levaduras como de bacterias ácido lácticas, siendo dicha disminución

debida al efecto del tratamiento sobre las poblaciones, en relación con el

tiempo de tratamiento (ver anexo 10 y 11).

6.5 Parámetros Físico-Químicos de los vinos Al vino obtenido de los estrujados de uvas sometidos a 35 bar de presión

de CO2 y al vino control (sin tratamiento), se les determinó porcentaje de

alcohol, extracto seco (g/L) y pH; para saber si el tratamiento con

presiones hiperbáricas de CO2 afectaba algunos parámetros. En la

composición química del vino influyen factores como el manejo de las

vides, del mosto y del vino, así como el clima y las condiciones

atmosféricas (Porras y Santos 2003).

Tabla 10: Resultado del análisis físico Químico de los vinos

VINO % Alcohol Extracto seco g/L

pH

Control 15.27% 32.0 3.56

Tratamiento de CO2

15.27% 32.0 3.58

El pH es una medida del equilibrio de la concentración del ion hidrógeno y

se ve afectado por la medida en que se neutralizan los ácidos de la

solución. Se mide fácilmente usando un pH-metro, pero los factores que

determinan su valor son más complicados y menos evidentes. Este

parámetro es importante ya que el grado de ionización de diversos

compuestos químicos, la velocidad de numerosas reacciones químicas,

las propiedades físicas y la estabilidad microbiológica de mostos y vinos,

son función del pH (Boulton et al. 2002).

Como se observa en la tabla 10 en relación con el valor de pH en el vino

obtenido con estrujados de uvas tratadas con presión respecto al vino

control, este parámetro no presenta una variación significativa, lo que

muestra que el pH del vino no es alterado por el tratamiento del estrujado.

70

El porcentaje de alcohol se encuentra relacionado con la concentración

de azúcares que están disponibles para ser convertidos en etanol por la

acción de las levaduras. El resultado de este análisis en los dos vinos no

presentó variación alguna (Tabla 10), en consecuencia el tratamiento

hiperbárico de CO2 no afecta los azúcares presentes en los estrujados de

uvas, además de esto las muestras con las cuales se realizó la

vinificación tenían el mismo contenido de azúcar (28°Brix), lo que explica

la no diferencia en los resultados de este análisis (Boulton et al. 2002).

El extracto seco de un vino se refiere a los sólidos solubles libres de

alcohol, corresponde a los componentes naturales del vino, es importante

en la expresión sensorial de los vinos, ya que un bajo contenido en estas

materias los hace flojos y ligeros al paladar (Porras y Santos 2003).

El resultado de este análisis fue igual tanto para el vino de estrujado

tratado como para el vino control, mostrando que el proceso al que fueron

sometidos, no modificó el contenido en extracto seco, como era de

esperar.

La comparación de color deja ver que la intensidad del rojo en el vino con

tratamiento de CO2 y el vino control era la misma. En cuanto a la

tonalidad, el vino con tratamiento de CO2 presentaba un mayor

desplazamiento hacia el naranja que el control. Estos resultados indican

que el tratamiento con CO2 bajo presión podrían tener efecto perceptible

sobre el color del vino.

6.6 Análisis microbiológico de los vinos

En esta investigación se pretendía lograr una disminución de las

poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras presentes en

estrujados de uvas de la variedad Pinot noir, para reducir la población de

microorganismos indeseables en el vino y con esto, defectos en el perfil

sensorial de los mismos. A pesar de haber usado tiempos de exposición

relativamente prolongados al tratamiento hiperbárico de CO2, no logró

eliminar el total de las poblaciones evaluadas, pero si una alta proporción.

71

El resultado obtenido en el recuento de bacterias ácido lácticas en el vino

control fue de 1,2x103 UFC/mL y en el vino con tratamiento hiperbárico de

CO2 fue de 3,0x102 UFC/mL, lo que indica que las disminución de la

población de bacterias ácido lácticas por el método de alta presión con

CO2 sirvió para disminuir el contenido de células presentes en el vino.

Además este vino se encontró por debajo del valor máximo permitido que

es 1x103 UFC/mL, contrario a lo que sucedió con el vino control (Boulton

2002).

Por otro lado el valor obtenido el recuento de levaduras salvajes en el vino

control fue de 2x101 UFC/ml, por debajo del valor límite permitido que es

1x103UFC/ml. En el vino con tratamiento hiperbárico de CO2 no hubo

crecimiento de levaduras salvajes (Zarzoso et al. 2002).

En el medio DBDM no hubo crecimiento, lo que indica, que dentro de las

levaduras salvajes presentes en el vino control no se encontraban

levaduras del genero Brettanomyces sp. , causantes de los denominados

olor a sudor de caballo, pesebrera, medicina y cuero (Chatonnet et al.

1992, Gerbeaux et al. 2000, Stender et al. 2001, Días et al. 2003).

El bajo recuento de los vinos obtenidos de estrujados de uvas tratados

con dióxido de carbono bajo presiones hiperbáricas muestra la utilidad del

proceso para la aplicación industrial. En cuanto a la diferencia conseguida

en el recuento de levaduras salvajes, se podría sugerir que estas

levaduras que podrían estar como contaminantes en el vino fueron

eliminadas por el tratamiento hiperbárico de CO2 (Chassagne 2005; Pina

et al. 2004; Días et al. 2003, Romano et al, 2003, Graham et al, 2003).

6.7 Análisis sensorial Para este análisis, se utilizo el vino producido con estrujado de uvas

sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2, vino control realizado con

muestras sin tratamiento hiperbárico de CO2 y un vino Pinot noir

tradicional del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga (figura 15).

72

Color, olor, claridez y sabor son los parámetros que dan las

características típicas a cada clase de vino. Los vinos obtenidos fueron

sometidos a una evaluación sensorial a cargo de cuatro catadores, Se

calificaron los caracteres organolépticos utilizando la tabla normalizada de

la OIV (anexo 8 y 9) (Paipilla et al. 1997 y Quijano 2005).

Figura 15: Panel de catadores

La figura 16 muestra la claridez de los vinos evaluados. Se observa que el

vino producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico

de CO2 y el vino control fueron claros a diferencia del vino Pinot noir del

Viñedo & Cava Loma de Puntalarga, el cual presento alguna turbidez.

Esto indica que el tratamiento hiperbárico de CO2 no altera la claridez del

vino, como era de esperar (Anexo 7).

73

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Puntaje

Control

Tratamientohiperbarico de CO2

Pinot noir

Figura 16: Claridez de los vinos Pinot noir evaluados

Por otra parte, en la figura 17 se observa que el vino producido con

estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino

control se caracterizan por presentar un color típico correspondiente a los

vinos de la variedad Pinot noir, mientras que el vino Pinot noir del Viñedo

& Cava Loma de Puntalarga presenta un color atípico. Estos resultados

demuestran también que el tratamiento con CO2 no afecta el pígmento

(taninos) que se encuentra en las capas de las células del hollejo de la

uva cuya cantidad e intensidad cromática desempeñan un papel

especialmente importante en la elaboración del vino tinto (Anexo 7) (Vogt,

et al., 1986).

0 1 2 3 4

Puntaje

Control

Tratamientohiperbarico de

CO2

Pinot noir

Figura 17: Color de los vinos Pinot noir evaluados

74

En cuanto a el olor, se observa en la figura 18 que el vino producido con

estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino

control no presentan notas extrañas. El vino Pinot noir del Viñedo & Cava

Loma de Puntalarga presentó notas finas (Anexo 7). Así el tratamiento

hiperbárico de CO2 no presenta ningún efecto en el olor del vino, su

similaridad con el vino control tal vez se deba al corto período de

maduración que presentaban. El vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma

de Puntalarga presentó leves notas extrañas relacionadas con fenoles

volátiles, esto podría ser atribuido a la producción de ácido p-cumárico y

ácido-ferúlico por parte de Brettanomyces sp. Los resultados obtenidos

anteriormente muestran que la ausencia de Brettanomyces sp en el vino

control pudo se debida al buen manejo de las prácticas higiénicas en el

proceso de elaboración ya que como sugiere Cocolin en el 2004, esta

especie de levadura puede sobrevivir, multiplicarse y contaminar vinos

trasladados a sitios que no han tenido un óptimo proceso de limpieza y

desinfección después del uso.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Puntaje

Control

Tratamientohiperbarico de

CO2

Pinot noir

Figura 18: Olor de los vinos Pinot noir evaluados

El sabor del vino (figura 19) producido con estrujado de uvas sometidas a

tratamiento hiperbárico de CO2 se caracterizo por ser armónico con una

calificación de 6.75 y el vino control con un puntaje inferior de 5.75 lo cual

lo clasifica como liviano con carácter. El vino Pinot noir del Viñedo &

75

Cava Loma de Puntalarga obtuvo un puntaje de 7.5 el cual también esta

dentro del rango para vinos armónicos. La mayor calificación fue obtenida

por este vino debido posiblemente al mayor tiempo de maduración en el

momento de la catación (Anexo 7).

0 2 4 6 8

Puntaje

Control

Tratamientohiperbarico de CO2

Pinot noir

Figura 19: Sabor de los vinos Pinot noir evaluados

En la figura 20 se observa la impresión global de los vinos, la cual permite

considerar que el vino control y el vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma

de Puntalarga usados para la catación fueron los adecuados. El vino

producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de

CO2, obtuvo un puntaje de 13.75 que lo clasifica como un vino de calidad

media, mientras que los otros dos vinos alcanzaron un menor nivel. Los

resultados señalaron que el vino con mayor puntaje fue el vino con

tratamiento de dióxido de carbono, esto debido posiblemente a la

disminución de poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas en los

estrujados de uvas tratados con CO2 a altas presiones, pues los

microorganismos tienen un papel prominente en la determinación de la

composición química del vino, ya que durante la fermentación

metabolizan los azúcares de la uva y otros componentes en etanol,

dióxido de carbono y cientos de productos finales y secundarios que,

colectivamente contribuyen a la sutileza e individualidad del carácter del

76

vino. Esto hace que el uso de altas presiones de dióxido de carbono

originen un vino de mejor calidad, pues en la industria vinícola cuando las

fermentaciones ocurren en presencia de muchas especies de levaduras y

bacterias es difícil señalar las actividades fermentativas benéficas y

dañinas que se llevan a cabo, por lo tanto cuando se trabaja bajo

condiciones controladas se evita la producción de compuestos

indeseables por parte de los microorganismos que llevan a la perdida de

atributos en el producto final (Graham 2003, Loureiro et al. 2003).

12 12,5 13 13,5 14

Puntaje

Control

Tratamientohiperbarico de

CO2

Pinot noir

Figura 20: Impresión global de los vinos Pinot noir evaluados

77

7. CONCLUSIONES

• Se determinó que a los 360 minutos evaluados a una presión de CO2

de 35 bar se obtiene una reducción de la población de levaduras de

97.9% y de 95.7% para bacterias ácido lácticas, sobre estrujados de

uvas de la variedad Pinot noir.

• El tiempo de reducción decimal (valor D) fue de 173 minutos para

levaduras y 238 minutos para bacterias ácido lácticas, lo cual indica el

tiempo necesario para reducir las poblaciones a su décima parte a una

presión de CO2 de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujado de

uvas de la variedad Pinot noir.

• Los resultados obtenidos en los recuentos muestran que las bacterias

ácido lácticas son mas resistentes a la presión hiperbárica de CO2 que

las levaduras, según lo señalado por el valor D y los porcentajes de

inhibición.

• La velocidad de muerte constante (valor K) para levaduras fue de

0.0133 min –1 y para bacterias ácido lácticas de 0.0097 min –1

siguiendo un análisis tradicional cinético de primer orden.

• Los análisis físico-químicos medidos en el vino (control y tratamiento)

señalaron que la presión de dióxido de carbono no tiene efecto alguno

sobre: pH, extracto seco y % de alcohol.

• Los resultados microbiológicos de los vinos evaluados, señalan que el

uso de altas presiones mejora la calidad microbiológica de los vinos.

• La no detección de Brettanomyces sp. en los vinos puede ser debida

al buen manejo de prácticas higiénicas en el proceso de vinificación.

78

• El análisis sensorial mostró que la utilización de presiones hiperbáricas

de CO2 como tratamiento esterilizante no afecta las cualidades

organolépticos del vino Pinot noir, proponiendo este tratamiento como

una nueva alternativa para ser implementada en la producción de

vinos.

79

RECOMENDACIONES

• Se recomienda realizar investigaciones encaminadas al uso de

técnicas moleculares para la identificación de Brettanomyces sp.

• Con el fin de evaluar cuales son los microorganismos mas

resistentes al tratamiento, se debería realizar identificación de las

especies presentes en estrujados de uvas, seguido de un análisis

individual para cada una de las especies encontradas.

• Implementar el sistema de tratamiento por presión a escala

industrial para estrujados de uva utilizados en la elaboración de

vinos de la variedad Pinot noir para disminuir así, el riesgo de

contaminaciones microbiológicas.

• Encaminar estudios hacia la evaluación de mayores presiones con

menores tiempos de exposición en búsqueda de la optimización del

proceso.

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ANEXO 1

EQUIPOS

• Biorreactor bajo presión Viñedo & Cava Loma de Puntalarga

• Medidor de pH ( pH-metro) Metrohm, Suiza

• Incubadora a 37°C Arthur Tomas Co Philadelphia USA

• Incubadora a 25°C Memmert, Alemania

• Equipo de filtración Millipore, California

• Termostato y termómetro digital Jhonson’s controls MR12

• Manómetro Linde, Mainz-Alemania

• Refractómetro Zeiss, Oberkochem-Alemania

• Microscopio Olympus, España

• Balanza analítica BOECO

ANEXO 2

REACTIVOS

Reactivos N° de catalogo Casa comercial

Agar-Agar 1.01614 Merck

Acido ferúlico 128708-56 Aldrich

Aceite de inmersión 1.04699 Merck

Acido p-cumárico C9008-16 Sigma

Agar MRS 01-135 Scharlau

Agar YGC 1.16000 Merck

Agar WL 1.10866 Merck

Alcohol etílico 1.00983 Merck

Campygen® 1.13682 Merck

Ciclohexamida 1.09228CASE Merck

Cristal violeta 1.09228 Merck

Filtro 0.2µm C020 Millipore

Fucsina de Gram 1.09217 Merck

Hidróxido de sodio 1.06462 Merck

Medio YNB 239210 DifcoTM

Peptona A1070431000 Merck

Verde de bromocresol VE00700001 Scharlau

ANEXO 3

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

3.1 Agar MRS

• Peptona proteasa 10g/L

• Extracto de carne 8g/L

• Extracto de levadura 4g/L

• Glucosa 20g/L

• Acetato de sodio 5g/L

• Citrato triamonico 2g/L

• Sulfato de magnesio 0.2g/L

• Sulfato de manganeso 0.05g/L

• Fosfato dipotásico 2g/L

• Polisorbato 80 1g/L

• Agar-Agar 14g/L

• Ciclohexamida 4mg/L

• pH 6.2 ( +/-0.2 )

3.2 Agar YGC

• Glucosa 20g/L

• Extracto de levadura 5g/L

• Cloranfenicol 0.1g/L

• Agar-Agar 15g/L

• pH 6.6 ( +/- 0.2 )

3.3 Agar WL

• Extracto de levadura 4g/L

• Hidrolizado de caseína 5g/L

• D (+) glucosa 50g/L

• Fosfato diácido de potasio 0.005g/L

• Cloruro de potasio 0.425g/L

• Cloruro de calcio 0.125g/L

• Sulfato de magnesio 0.0025g/L

• Verde de bromocresol 0.022g/L

• Agar-Agar 15g/L

• Cloruro de hierro (III) 0.125g/L

• Ciclohexamida 0.01g/L

• Sulfato de manganeso 0.125g/L

• pH 5 ( +/-0.2 )

3.4 Medio DBDM

• Medio YNB 6.7 g/L

• Etanol 6%v/v

• Acido p-cumárico 100mg/L

• Acido ferúlico 100mg/L

• Verde de bromocresol 22mg/L

• Agar-agar 2g/L

• Ciclohexamida 10mg/L

El agar-agar fue adicionado después de su esterilización en autoclave a

una temperatura de 50°C, los demás componentes del medio de cultivo

fueron esterilizados por filtración, utilizando filtros de membrana de 0.2µm

de diámetro, a excepción de la ciclohexamida que se adicionó al final. El

pH del medio fue ajustado a 5.4 con hidróxido de sodio 0.1N.

3.5 Medio YNB

• Sulfato de amonio 5.0g

• Fosfato monopotásico 1.0g

• Sulfato de magnesio 0.5g

• Cloruro de sodio 0.1g

• Cloruro de calcio 0.1g

• L-histidina monohidroclorada 10.0mg

• LD metionina 20mg

• LD triptofano 20mg

• Inositol 2000µg

• Acido bórico 500µg

• Niacina 400µg

• Sulfato de manganeso 400µg

• HCL piridoxina 400µg

• Sulfato de zinc 400µg

• HCL tiamina 400µg

• Pantetonato de calcio 400µg

• Cloruro ferrico 200µg

• Molibdato de sodio 200µg

• Riboflavina 200µg

• Acido p-aminobenzoico 200µg

• Yoduro de potasio 100µg

• Acido fólico 2µg

• Biotina 2µg

ANEXO 4

PROTOCOLO DE PROCEDIMIENTO PARA TRATAMIENTO DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA HIPERBARICA DE CO2

1. Descongelación de las muestras a 15°C por 15 horas.

2. Lavado del autoclave

3. Desinfección del biorreactor con 200ppm de Hipoclorito de sodio

4. Lavado con agua destilada estéril 5. Carga del recipiente contenedor con 750g de estrujado de uva (3

muestras), el cual se dispuso en el interior del biorreactor.

3. Cierre hermético del equipo con el cierre de la abrazadera.

4. Purga del biorreactor, abriendo la válvula A, B, C, F y manteniendo

cerrada la válvula D. Durante 5 minutos.

5. Lograda la saturación del estrujado con el gas se cierra la válvula F.

6. Alcanzada la presión deseada (35 bar) en el manómetro se cerrara la

válvula C para mantener la presión constante en el interior del autoclave.

7. Toma de muestras a los 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300 y

360 minutos, abriendo la válvula D, esta válvula se cerró después de la

salida de la muestra.

8. La muestra se deposito en el ciclón de muestreo, de donde se tomaron

alícuotas de 4ml en jeringas estériles.

9. Se realizo recuento de levaduras y bacterias acido lácticas, a cada una

de las muestras tomadas.

10. Después de haber tomado la muestra correspondiente a cada tiempo

de tratamiento, el ciclón de muestreo se enjuago con agua destilada

estéril, se desinfecto con 200ppm de hipoclorito de sodio durante 15

minutos, y finalmente se volvió a enjuagar con agua destilada estéril.

12. Finalizado el último tiempo de tratamiento (360min), se despresurizo

el biorreactor, abriendo lentamente la válvula F.

13. Se retiro la abrazadera y se saco el recipiente contendor.

14. Lavado y desinfección del equipo.

11. Los pasos descritos anteriormente (1-14) se repitieron dos veces mas

(Ossa 1992, Montaña et al. 1997, Álvarez et al. 1998,Quijano 2005, Arias

2004).

ANEXO 5

TABLAS DE RESULTADOS 5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Primer Montaje

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje(%) de

inhibición

0 38x104 5,579783 5,579784 0

30 22x104 5,342422 5,342423 42.11

60 84x103 4,924279 4,924279 77.9

90 72x103 4,857332 4,857333 81.05

120 62x103 4,792392 4,792391 83.69

150 52x103 4,716003 4,716003 86.32

180 37x103 4,568201 4,568202 90.26

210 35x103 4,544068 4,544068 90.79

240 30x103 4,477121 4,477121 92.11

300 18x103 4,255273 4,255273 95.26

360 8x103 3,903089 3,903089 97.9

5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Segundo Montaje

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje(%) de

inhibición 0 45x104 5,653212 13,01700 0

30 28x104 5,447158 13,01700 37.78

60 92x103 4,963788 11,42954 79.56

90 77x103 4,886491 11,25156 82.89

120 65x103 4,812913 11,08214 85.56

150 55x103 4,740363 10,91509 87.78

180 40x103 4,602059 10,59663 91.11

210 38x103 4,579783 10,54534 91.56

240 30x103 4,477121 10,30895 93.33

300 23x103 4,361728 10,04325 94.89

360 11x103 4,041393 9,30565 97.56

5.3 Resultados del recuento de levaduras en el tercer montaje

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje(%) de

inhibición 0 42x104 5,623249 12,94801 0

30 24x104 5,380211 12,38832 42.86

60 87x103 4,939519 11,37366 79.29

90 75x103 4,875061 11,22524 82.14

120 58x103 4,763428 10,96819 86.19

150 51x103 4,707570 10,83958 87.86

180 39x103 4,591065 10,57132 90.71

210 34x103 4,531479 10,43412 91.90

240 29x103 4,462398 10,27505 93.09

300 20x103 4,30103 9,90349 95.24

360 9x103 3,954242 9,10498 97.86

5.4 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Primer Montaje

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje de inhibición

0 26x104 5,414973 12,468436 0

30 13x104 5,113943 11,775289 50

60 89x103 4,949390 11,396391 65.77

90 82x103 4,913813 11,314474 68.46

120 75x103 4,875061 11,225243 71.15

150 66x103 4,819543 11,09741 74.62

180 51x103 4,707570 10,839580 80.38

210 34x103 4,531478 10,434115 86.92

240 24x103 4,380211 10,085809 90.77

300 16x103 4,204119 9,680344 93.85

360 12x103 4,079181 9,3926619 95.38

5.5 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Segundo Montaje

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje de inhibición

0 30x104 5,477121 12,611538 0

30 18x104 5,255272 12,100712 40

60 93x103 4,968482 11,440355 69

90 88x103 4,944482 11,385092 70.67

120 81x103 4,908485 11,302204 73

150 71x103 4,851258 11,170435 76.33

180 56x103 4,748188 10,933107 81.33

210 39x103 4,591065 10,571317 87

240 30x103 4,477121 10,308953 90

300 20x103 4,30103 9,9034876 93.33

360 14x103 4,146128 9,5468126 95.33

5.6 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Tercer Montaje

TIEMPO EN MINUTOS

UFC/ml Log 10 UFC/ml

LN UFC/ml

Porcentaje de inhibición

0 28x104 5,447158 12,542545 0

30 15x104 5,176091 11,918391 46.43

60 90x103 4,954243 11,407565 67.86

90 84x103 4,924279 11,338572 70

120 74x103 4,869232 11,211820 73.57

150 69x103 4,838849 11,141862 75.36

180 48x103 4,681241 10,778956 82.86

210 37x103 4,568202 10,518673 86.79

240 28x103 4,447158 10,239959 90

300 15x103 4,176091 9,6158055 94.64

360 11x103 4,041393 9,3056506 96.07

5.7 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de levaduras

Montaje VALOR D(min.) VALOR k 1 178 0.0129 2 169 0.0136 3 172 0.0134

Promedio 173 0.0133

5.8 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de

reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de bacterias ácido

lácticas

MONTAJE VALOR D (min.) VALOR k

1 233 0.0099 2 240 0.0096 3 240 0.0096

promedio 238 0.0097

ANEXO 6

GRAFICAS

6.1 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 1

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/ml

6.2 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 2

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/ml

6.3 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 3

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/ml

6.4 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido

lácticas, Montaje 1

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/ml

6.5 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido

lácticas, Montaje 2

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/ml

6.6 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido

lácticas, Montaje 3

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Log UFC/ml

6.7 Gráfica comparativa del recuento de levaduras de los tres montajes

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Montaje 1Montaje 2Montaje 3

6.8 Gráfica comparativa del recuento de bacterias acido lácticas de los tres montajes

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 100 200 300 400

Tiempo ( min )

Log

UFC

/mL

Montaje 1Montaje 2Montaje 3

ANEXO 7 EVALUACION DE CARACTERISTICAS SENSORIALES

Características Vino con tratamiento hiperbárico de co2

Vino control Vino Pinot noir

Claridez 1 1 0.75

Color 4 4 1.75

Olor 2 2 2.75

Sabor 6.75 5.75 7.5

IMPRESIÓN GLOBAL

13.75 12.75 12.75

ANEXO 8

TABLA NORMALIZADA DE LA OIV ( ORGANIZACIÓN

INTERNACIONAL DEL VINO) PARA LA EVALUACIÓN DE CARACTERISTICAS SENSORIALES

Nombre: ___________________ Muestra:____________________ Fecha: ___________________

CARACTERISTICAS CALIFICACION CLARIDEZ: Turbio 0 Claro 1 Claro brillante 2 COLOR: Atípico 0 Típico 4 OLOR: Defectuoso 0 Neutro 1 Sin notas extrañas 2 Fino 3 Floral 4 SABOR: Defectuoso 0 Neutro ( 1-3 ) 1-3 Liviano con carácter ( 1-3 ) 4-6 Armónico (1-3 ) 7-9 Maduro y noble (10-12 ) 10-12 CALIDAD DEL VINO: Superior 17-20 Medio 13-16 Menos que medio 9-12 Inaceptable 0-8

ANEXO 9

GUIA DE CATACIÓN

Nombre: ___________________ Muestra:____________________ Fecha: ___________________

CARACTERISTICAS CALIFICACION VINO 1 VINO 2 VINO 3 CLARIDEZ: Turbio Claro Claro brillante COLOR: Atípico Típico OLOR: Defectuoso Neutro Sin notas extrañas Fino Floral SABOR: Defectuoso Neutro ( 1-3 ) Liviano con carácter ( 1-3 ) Armónico (1-3 ) Maduro y noble (10-12 )

ANEXO 10

ANALISIS ESTADISTICO 10.1 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 1.

Linear Regression Results for: Y = Hoja1!$C$3:$C$14 X = Hoja1!$A$3:$A$14

Descriptive Statistics Variable Mean Std Dev. N

ln UFC/ml 10,877 1,077 11 Tiempo (Min) 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo (min) ln UFC/ml 1,000 -0,966 Tiempo (Min) -0,966 1,000 Significance for Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo (min) ln UFC/ml - 0,000 Tiempo (Min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,932 0,966 0,925 0,295

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 10,819 1 10,819 124,129 0,000

Residual 0,784 9 0,087 Total 11,604 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,331 0,158 11,974 12,689 78,039 0,000Tiempo (Min) -0,009 0,001 -0,966 -0,011 -0,007 -11,141 0,000 Residuals

Pred Y Std Pred

Y Residual Pred Norm

Res Std

Residual Stu.

Residual 12,331 1,398 0,517 0,474 2,072 2,702 12,055 1,133 0,246 0,307 0,944 0,937 11,779 0,868 -0,441 -0,474 -1,635 -1,839 11,504 0,603 -0,319 -0,307 -1,157 -1,182 11,228 0,338 -0,193 -0,209 -0,689 -0,668 10,952 0,072 -0,093 -0,064 -0,330 -0,313 10,676 -0,193 -0,157 -0,132 -0,560 -0,537 10,400 -0,458 0,063 0,064 0,226 0,214 10,124 -0,723 0,185 0,132 0,676 0,654 9,573 -1,254 0,226 0,209 0,881 0,869 9,021 -1,784 -0,034 0,000 -0,148 -0,140

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

Normal DistributionR

esid

uals

Residuals vs Pred ln UFC/ml

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0 5 10 15

Predicted ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo (Min)

ln U

FC/m

l

10.2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 2.

Linear Regression Results for:

Y = Hoja2!$C$2:$C$13

X = Hoja2!$A$2:$A$13

Descriptive Statistics

Variable Mean Std Dev. N

Ln UFC/ml 11,003 1,065 11

Minutos 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo (min)

Ln UFC/ml 1,000 -0,950 Tiempo (min) -0,950 1,000 Significance for Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml - 0,000 Tiempo (min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,903 0,950 0,893 0,349

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 10,247 1 10,247 84,161 0,000 Residual 1,096 9 0,122 Total 11,343 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,419 0,187 11,996 12,841 66,501 0,000Minutos -0,009 0,001 -0,950 -0,011 -0,007 -9,174 0,000

Residuals

Pred Y Std Pred

Y Residual Pred Norm

Res Std

Residual Stu.

Residual 12,419 1,398 0,598 0,560 2,029 2,597 12,150 1,133 0,392 0,363 1,272 1,324 11,882 0,868 -0,452 -0,560 -1,420 -1,520 11,614 0,603 -0,362 -0,363 -1,110 -1,127 11,345 0,338 -0,263 -0,248 -0,795 -0,778 11,077 0,072 -0,162 -0,076 -0,486 -0,464 10,808 -0,193 -0,212 -0,157 -0,637 -0,615 10,540 -0,458 0,006 0,000 0,017 0,016 10,271 -0,723 0,038 0,076 0,117 0,110

9,734 -1,254 0,309 0,248 1,021 1,024 9,197 -1,784 0,108 0,157 0,403 0,384

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

Normal Distribution

Res

idua

ls

Residuals vs Pred Ln UFC/ml

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 5 10 15

Predicted Ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo(min)

Ln U

FC/m

l

10.3 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 3.

Linear Regression Results for:

Y = Hoja3!$C$2:$C$13

X = Hoja3!$A$2:$A$13

Descriptive Statistics

Variable Mean Std Dev. N

Ln UFC/ml 10,912 1,081 11

Minutos 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml 1,000 -0,958 Tiempo(min) -0,958 1,000 Significance for Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml - 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,919 0,958 0,910 0,325

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 10,726 1 10,726 101,510 0,000 Residual 0,951 9 0,106 Total 11,677 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,360 0,174 11,967 12,754 71,045 0,000Minutos -0,009 0,001 -0,958 -0,011 -0,007 -10,075 0,000 Residuals

Pred Y Std Pred Residual Pred Norm Std Stu.

Y Res Residual Residual 12,360 1,398 0,588 0,521 2,141 2,880 12,086 1,133 0,303 0,338 1,054 1,062 11,811 0,868 -0,437 -0,521 -1,473 -1,594 11,536 0,603 -0,311 -0,338 -1,024 -1,027 11,262 0,338 -0,293 -0,231 -0,953 -0,947 10,987 0,072 -0,147 -0,146 -0,475 -0,454 10,712 -0,193 -0,141 -0,071 -0,456 -0,435 10,438 -0,458 -0,003 0,000 -0,011 -0,011 10,163 -0,723 0,112 0,146 0,373 0,354

9,614 -1,254 0,290 0,231 1,028 1,032 9,064 -1,784 0,041 0,071 0,163 0,154

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

Normal Distribution

Res

idua

ls

Residuals vs Pred Ln UFC/ml

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 5 10 15

Predicted Ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo(min)

Ln U

FC/m

l

10.4 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los

promedios de los recuentos de levaduras.

Linear Regression Results for: Y = Hoja1!$G$3:$G$14 X = Hoja1!$F$3:$F$14

Descriptive Statistics

Variable Mean Std Dev. N

Ln UFC/ml 10,933 1,073 11

Tiempo(min) 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo(min)

Ln UFC/ml 1,000 -0,959

Tiempo(min) -0,959 1,000 Significance for Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml - 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,919 0,959 0,910 0,322

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 10,571 1 10,571 101,928 0,000 Residual 0,933 9 0,104 Total 11,504 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,371 0,172 11,981 12,761 71,775 0,000Tiempo(min) -0,009 0,001 -0,959 -0,011 -0,007 -10,096 0,000 Residuals

Pred Y Std Pred Residual Pred Norm Std Stu.

Y Res Residual Residual 12,371 1,398 0,569 0,516 2,093 2,754 12,098 1,133 0,318 0,335 1,117 1,134 11,825 0,868 -0,444 -0,516 -1,510 -1,648 11,553 0,603 -0,332 -0,335 -1,103 -1,118 11,280 0,338 -0,251 -0,228 -0,821 -0,805 11,007 0,072 -0,136 -0,070 -0,442 -0,421 10,735 -0,193 -0,172 -0,144 -0,561 -0,539 10,462 -0,458 0,020 0,000 0,066 0,062 10,189 -0,723 0,108 0,144 0,364 0,345

9,644 -1,254 0,276 0,228 0,988 0,987 9,099 -1,784 0,043 0,070 0,172 0,163

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

Normal Distribution

Res

idua

ls

Residuals vs Pred Ln UFC/ml

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 5 10 15

Predicted Ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo(min)

Ln U

FC/m

l

10.5 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 1.

Linear Regression Results for:

Y = Hoja4!$C$2:$C$13

X = Hoja4!$A$2:$A$13

Descriptive Statistics

Variable Mean Std Dev. N

ln UFC/ml 10,883 0,918 11

MINUTOS 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml 1,000 -0,983 Tiempo(min) -0,983 1,000 Significance for Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml - 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,966 0,983 0,962 0,179

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 8,140 1 8,140 253,149 0,000 Residual 0,289 9 0,032 Total 8,429 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,144 0,096 11,927 12,361 126,543 0,000MINUTOS -0,008 0,001 -0,983 -0,009 -0,007 -15,911 0,000 Residuals

Pred Y Std Pred Residual Pred Norm Std Stu.

Y Res Residual Residual 12,144 1,398 0,324 0,288 2,140 2,879 11,905 1,133 -0,130 -0,127 -0,819 -0,802 11,666 0,868 -0,269 -0,288 -1,645 -1,855 11,426 0,603 -0,112 -0,080 -0,669 -0,647 11,187 0,338 0,038 0,039 0,224 0,212 10,948 0,072 0,149 0,187 0,874 0,862 10,709 -0,193 0,131 0,127 0,767 0,748 10,469 -0,458 -0,035 0,000 -0,209 -0,197 10,230 -0,723 -0,144 -0,187 -0,870 -0,857

9,752 -1,254 -0,071 -0,039 -0,458 -0,437 9,273 -1,784 0,120 0,080 0,867 0,854

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

Normal Distribution

Res

idua

ls

Residuals vs Pred ln UFC/ml

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 5 10 15

Predicted ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo(min)

ln U

FC/m

l

10.6 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 2.

Linear Regression Results for:

Y = Hoja5!$C$2:$C$13

X = Hoja5!$A$2:$A$13

Descriptive Statistics

Variable Mean Std Dev. N

ln UFC/ml 11,025 0,908 11 Tiempo (min) 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml 1,000 -0,981 Tiempo (min) -0,981 1,000 Significance for Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml - 0,000 Tiempo (min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,962 0,981 0,958 0,186

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 7,931 1 7,931 228,066 0,000 Residual 0,313 9 0,035 Total 8,244 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,270 0,100 12,044 12,496 122,939 0,000Tiempo (min) -0,008 0,001 -0,981 -0,009 -0,007 -15,102 0,000

Residuals

Pred Y Std Pred

Y Residual Pred Norm

Res Std

Residual Stu.

Residual 12,270 1,398 0,341 0,299 2,167 2,953 12,034 1,133 0,067 0,041 0,405 0,385 11,798 0,868 -0,358 -0,299 -2,100 -2,771 11,562 0,603 -0,177 -0,194 -1,014 -1,015 11,326 0,338 -0,023 -0,041 -0,132 -0,124 11,089 0,072 0,081 0,132 0,456 0,435 10,853 -0,193 0,080 0,084 0,451 0,430 10,617 -0,458 -0,046 -0,084 -0,260 -0,246 10,381 -0,723 -0,072 -0,132 -0,416 -0,396

9,908 -1,254 -0,005 0,000 -0,030 -0,029 9,436 -1,784 0,111 0,194 0,773 0,754

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

Normal Distribution

Res

idua

ls

Residuals vs Pred ln UFC/ml

-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4

0 5 10 15

Predicted ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo(Min)

ln U

FC/m

l

10.7 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 3.

Linear Regression Results for:

Y = Hoja6!$C$2:$C$13

X = Hoja6!$A$2:$A$13

Descriptive Statistics

Variable Mean Std Dev. N

ln UFC/ml 10,911 0,955 11

MINUTOS 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml 1,000 -0,985 Tiempo(min) -0,985 1,000 Significance for Pearson Correlations

ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml - 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,970 0,985 0,967 0,175

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 8,852 1 8,852 290,018 0,000 Residual 0,275 9 0,031 Total 9,126 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,226 0,094 12,015 12,438 130,762 0,000MINUTOS -0,008 0,000 -0,985 -0,009 -0,007 -17,030 0,000 Residuals

Pred Y Std Pred

Y Residual Pred Norm

Res Std

Residual Stu.

Residual 12,226 1,398 0,316 0,280 2,142 2,883 11,977 1,133 -0,059 -0,078 -0,380 -0,361 11,727 0,868 -0,320 -0,280 -2,005 -2,542 11,478 0,603 -0,139 -0,182 -0,854 -0,840 11,228 0,338 -0,017 -0,038 -0,100 -0,095 10,979 0,072 0,163 0,182 0,978 0,976 10,729 -0,193 0,050 0,078 0,298 0,282 10,480 -0,458 0,039 0,038 0,235 0,223 10,230 -0,723 0,010 0,000 0,059 0,056

9,731 -1,254 -0,116 -0,124 -0,763 -0,744 9,232 -1,784 0,073 0,124 0,546 0,523

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

Normal Distribution

Res

idua

ls

Residuals vs Pred ln UFC/ml

-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4

0 5 10 15

Predicted ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo(min)

ln U

FC/m

l

10.8 Análisis estadístico de los resultados obtenidos del promedio de los recuentos de bacterias ácido lácticas.

Linear Regression Results for: Y = Hoja2!$G$4:$G$15 X = Hoja2!$F$4:$F$15

Descriptive Statistics

Variable Mean Std Dev. N

Ln UFC/ml 10,943 0,925 11

Tiempo(min) 158,182 113,121 11

Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo(min)

Ln UFC/ml 1,000 -0,984

Tiempo(min) -0,984 1,000

Significance for Pearson Correlations

Ln

UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml - 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary

R2 R Adj. R2 S.E. of

Estimate 0,968 0,984 0,965 0,174

ANOVA

Source Sum Sq. D.F. Mean Sq. F Prob. Regression 8,285 1 8,285 273,392 0,000 Residual 0,273 9 0,030 Total 8,558 10 Regression Coefficients

Source Coefficient Std Error Std Beta -95% C.I. +95% C.I. t Prob. Intercept 12,215 0,093 12,005 12,426 131,107 0,000Tiempo(min) -0,008 0,000 -0,984 -0,009 -0,007 -16,535 0,000 Residuals

Pred Y Std Pred

Y Residual Pred Norm

Res Std

Residual Stu.

Residual

12,215 1,398 0,327 0,279 2,225 3,128 11,974 1,133 -0,034 -0,038 -0,218 -0,206 11,733 0,868 -0,318 -0,279 -1,998 -2,525 11,491 0,603 -0,145 -0,181 -0,890 -0,878 11,250 0,338 -0,003 0,038 -0,015 -0,014 11,008 0,072 0,129 0,181 0,775 0,757 10,767 -0,193 0,086 0,078 0,517 0,495 10,526 -0,458 -0,016 0,000 -0,097 -0,092 10,284 -0,723 -0,068 -0,124 -0,424 -0,404

9,801 -1,254 -0,060 -0,078 -0,400 -0,381 9,319 -1,784 0,101 0,124 0,758 0,739

1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 2,306 All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) 3,900

Normal Prob. Plot

-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

Normal Distribution

Res

idua

ls

Residuals vs Pred Ln UFC/ml

-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,4

0 5 10 15

Predicted Ln UFC/ml

Res

idua

ls

Scatter Plot

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400

Tiempo(min)

Ln U

FC/m

l

ANEXO 11

INTERPRETACION DEL ANALISIS ESTADISTICO

• La primera tabla muestra las estadísticas descriptivas (Media y

desviación estándar) tanto para la variable dependiente (UFC/ml)

como para la independiente (tiempo) y el número de datos que forman

parte del análisis estadístico.

• La siguiente tabla muestra el Coeficiente de Correlación Pearson para

cada par posible de valores de las variables dependiente e

independiente. Estos valores pueden variar desde –1 a 1. Un valor de

–1 indica una CORRELACION LINEAL NEGATIVA PERFECTA

(Mientras la variable independiente aumenta, la variable dependiente

disminuye en una forma lineal consistente); por consiguiente un valor

de 1 indica una CORRELACION LINEAL POSITIVA PERFECTA

(Mientras la variable independiente aumenta, la variable dependiente

aumenta en una forma lineal consistente). La tabla siguiente indica la

Significancia del Coeficiente de Correlación de Pearson precedente;

los valores menores a 0.05 en esta tabla sugieren una fuerte relación

entre las variables que difícilmente puede verse afectada.

• En la tabla Resumen se presenta el valor R2 para el modelo de

regresión lineal. R2 o Coeficiente de Determinación; es la fracción de

la variación en la variable dependiente (y) que es explicada por la

variación en la variable independiente (x) y su rango va desde 0 (No

se explica la variación) hasta 1 (Variación totalmente explicada).

• ANÁLISIS DE VARIANZA (ANOVA): Con frecuencia el problema de

analizar la calidad de la línea de regresión se maneja a través de un

enfoque de análisis de varianza. El análisis de varianza dentro de los

resultados de la regresión evalúa la hipótesis de si existe relación

entre la variable dependiente y la independiente.

• La columna Cuadrados Medios informa la medida de la variación

asociada a la variable dependiente que es explicada por la variable

independiente (Cuadrado Medio de la Regresión) y el nivel de

variación que no es explicado por la variable independiente (Cuadrado

Medio de Residuales). Al realizar la división de estos dos valores se

obtiene en Valor F, que es el estadístico de prueba usado para evaluar

la significancía del modelo de regresión. Un valor grande de F significa

que la variación explicada es mucho mayor que la variación no

explicada, sugiriendo que la variable independiente es un predictor

significativo de la variable dependiente. En la última columna del

ANOVA, se presenta el valor de Probabilidad P; este se evalúa

teniendo en cuenta que un valor P menor que 0.05 se toma

usualmente como fuerte indicador.

• Por último y cumpliendo con el objetivo de la Regresión Lineal se

presentan los Coeficientes de Regresión con los cuales se construye

la línea de regresión del sistema de datos. En el caso del primer

montaje de las levaduras, la línea de regresión estimada es:

ln y = -0.009x + ln 12,331

• El gráfico de residuales es útil para determinar si los residuales reúnen

uno de los requisitos del modelo de regresión lineal: Que estos estén

distribuidos normalmente. Los residuales normalmente distribuidos

deben caer a lo largo de la línea continua.

• Grafico de Residuales versus Valor esperado por el cálculo de

regresión.

• Grafica de dispersión: correspondiente a la dispersión de los datos y la

línea de regresión correspondiente.