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Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales. Campus Río San Pedro, Avda. República Saharaui, s/n, Puerto Real, 11510 (Cádiz)

POSGRADO EN MEDIO MARINO: CIENCIA Y

DESARROLLO SOSTENIBLE MASTER EN ACUICULTURA Y PESCA: RECURSOS

MARINOS Y SOSTENIBILIDAD

FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR Y AMBIENTALES DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA, BIOTECNOLOGÍA Y SALUD PÚBLICA

LOCALIZACIÓN CROMOSÓMICA DE CLONES BAC Y SU APLICACIÓN EN EL MAPEO FÍSICO DE GENES DE INTERÉS

PARA LA ACUICULTURA DE Solea senegalensis

ANA MARÍA GARCÍA CEGARRA

TESIS DE MASTER (PERFIL INVESTIGADOR)

MASTER ACUICULTURA Y PESCA: RECURSOS MARINOS Y SOSTENIBILIDAD

Puerto Real a 1 de Diciembre de 2010

cross

Sello





LOCALIZACIÓN CROMOSÓMICA DE CLONES BAC Y SU APLICACIÓN EN EL MAPEO FÍSICO DE GENES DE INTERÉS PARA LA ACUICULTURA DE

Solea senegalensis

Memoria presentada por ANA MARÍA GARCÍA CEGARRA para la obtención del Título de Máster en Acuicultura y Pesca

(Perfil Investigador)

Firma del Tesinando

Fdo.: Ana María García Cegarra

Puerto Real a 1 de Diciembre de 2010

TESIS DE MASTER (PERFIL INVESTIGADOR) MASTER ACUICULTURA Y PESCA: RECURSOS MARINOS Y

SOSTENIBILIDAD

cross

Sello





LAUREANA REBORDINOS GONZÁLEZ, DOCTORA EN CIENCIAS

BIOLÓGICAS E ISMAEL CROSS PACHECO, DOCTOR EN CIENCIAS DEL MAR, como Directores de la Tesis de Máster titulada: “Localización cromosómica de clones BAC y su aplicación en el mapeo físico de genes de interés para la acuicultura de Solea senegalensis (Kaup, 1885)”, realizada por Ana María García Cegarra

INFORMAN: que el trabajo presentado en la presente memoria se ha llevado a cabo bajo nuestra dirección en las dependencias del Departamento de Biomedicina, Biotecnología y Salud Pública.

Y para que así conste firmamos el presente informe en Puerto Real a 1 de Diciembre de

2010.

Firma del/los Director/es

Fdo.: Laureana Rebordinos González Fdo.: Ismael Cross Pacheco

TESIS DE MASTER (PERFIL INVESTIGADOR)

MASTER ACUICULTURA Y PESCA: RECURSOS MARINOS Y SOSTENIBILIDAD

cross

Sello

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, me gustaría dar las gracias a mis Directores de Tesis de Máster, la

Dra. Laureana Rebordinos González por darme la oportunidad de realizar esta Tesis y

brindarme su ayuda en todo momento, y el Dr. Ismael Cross Pacheco, por enseñarme a

investigar, trasmitirme su pasión por la genética y apoyarme en la realización de este

trabajo.

A mis compañeros de laboratorio: Tito, Cuca, Silvia, María y Roger por las horas que

hemos pasado juntos “cacharreando” y resolver todas las dudas que surgían durante el

trabajo de laboratorio.

Al centro de investigación IFAPA “El Toruño” por haber participado en el desarrollo de

esta Tesis de Máster.

A los alumnos colaboradores y nuevas promesas: Aglaya, por haberme ayudado durante

la realización de la Tésis, Roberto y Julio.

A los compañeros de laboratorio que ya no están, pero que estuvieron durante mi etapa

como alumna colaboradora en el laboratorio de Genética: Hicham, Irma, Tiziana e Isabel.

A los compañeros de microbiología: Jesús Cantoral, Eugenia, Mari, Carlos, Kiko, Paula y

Elodie.

Me gustaría dar las gracias a todos mis compañeros de Máster por las horas que hemos

pasado juntos en clase, el apoyo que nos hemos dado unos a otros en todo momento, las

risas y los buenos ratos que hemos pasado tanto dentro como fuera de clase. En especial a

Javi y a Natalia, por siempre sacarme una sonrisa y escucharme en todo momento para

ofrecerme su ayuda y ánimo.

Agradecer también a todas aquellas personas que he conocido durante mis años de

carrera, compañeros de clase y todos los compañeros de prácticas, a las que están cerca y

a las que están lejos. Me llevo un trocito de cada uno de vosotros.

A mis nuevas compañeras de piso Isa y Pilar, que las he conocido en esta última etapa

de Tesis, pero que me llevo genial con ellas.

A mis hermanas, aunque no de sangre, sí de corazón: Moni, Rocío y Juani mis puntos de

apoyo en los buenos y malos momentos. Gracias por siempre estar ahí, por confiar en mi, y

por vuestro amor.

A Transi, Alejandra y May, por ser mis amigas, aguantarme y escucharme siempre,

ayudarme y animarme con una sonrisa.

Muy especialmente a mi familia, a mis abuelos, a mis tíos, por estar ahí siempre.

Y por último y más importante a mi madre Mª Carmen, por todo su apoyo, por toda su

confianza, por haber luchado siempre por mi, y ofrecerme todo lo que ha estado en su mano

y más. Por este año difícil que hemos pasado juntas. Te quiero.

Tesis de Máster Resumen

- 1 -

I.- RESUMEN

El lenguado senegalés (Solea senegalensis, Kaup 1858) es una de las especies más

valorada económicamente en la acuicultura, de ahí el interés por su cultivo y producción

en el Sur de Europa desde la década de los 90. Uno de los principales problemas con los

que se encontró el cultivo del lenguado en sus inicios fueron las bajas tasas de

crecimiento en juveniles y la gran susceptibilidad a enfermedades, consecuencia del

escaso conocimiento científico adquirido acerca de las necesidades fisiológicas de esta

especie. El estudio del genoma de una especie de tan alto valor comercial es

imprescindible para mejorar y optimizar su cultivo. En este sentido, el conocimiento de

la localización de genes de interés en los cromosomas del lenguado senegalés facilita la

construcción de mapas genéticos, y es útil en los estudios evolutivos, ya que podemos

deducir las reorganizaciones cromosómicas que se producen en el curso de la evolución

a través del análisis de las posiciones relativas de los mismos genes en organismos

relacionados

Este trabajo es una primera aproximación a la localización cromosómica de genes de

interés de S. senegalensis y la elaboración de un mapa físico. Para ello se ha partido de

una genoteca BAC (Cromosoma Artificial de Bacteria). Se ha desarrollado un protocolo

de Hibridación in situ de fluorescencia que ha permitido localizar estos clones BAC en

los cromosomas del lenguado senegalés y, una vez conseguido, se ha desarrollado el

protocolo de Hibridación in situ doble, que permite localizar dos secuencias a la vez.

Además se han localizado los clones BAC que contienen genes de importancia para el

cultivo de esta especie, como son los genes Lisozima y Mx involucrados en el sistema

inmune innato. El gen lisozima se localiza en una posición subtelomérica en un par

cromosómico de pequeño tamaño mientras que la señal de hibridación del gen Mx se

localiza en posición intersticial en un par cromosómico de tamaño medio. También se

ha localizado el gen receptor de la hormona tiroidea (TRB), involucrado en la

metamorfosis del lenguado senegalés. Este gen presenta una señal en 2 parejas

cromosómicas. En una pareja cromosómica la señal es más intensa y se localiza

posiblemente en una posición intersticial de una pareja cromosómica acrocéntrica y la

Tesis de Máster Resumen

- 2 -

otra señal presenta menor intensidad y probablemente se localiza en posición

centromérica de una pareja cromosómica acrocéntrica

Todos estos marcadores junto con los marcadores ribosómicos ADNr 5S y ARNnp

U2, ya estudiados anteriormente para esta especie, han contribuido en el comienzo de la

elaboración del primer mapa físico de S. senegalensis.

Tesis de Máster Abstract

- 3 -

II.- ABSTRACT

Senegalese sole (Solea senegalensis, Kaup 1858), is one of the most economically

valued species in aquaculture, hence the culture and production interest in the South of

Europe since the 90’s. One of the main troubles found in the beginning of the

Senegalese sole culture were the low growth rates in juveniles and the greater

susceptibility to disease, which were consequence of its limited physiology knowledge.

The study of genomes belonging to so high value species is essential to improve and

optimize its culture. In that sense, knowing the location of genes of interest in the

Senegalese sole chromosomes facilitates the construction of linkage maps, and it is

useful in evolution studies because the rearrangements that occur in the course of

evolution can be deduced through the analysis of the relative positions of these genes in

related organisms.

This work is a first approach in the development of a physical map of S.

senegalensis. In order to gain that objective, the work started from a genomic library

cloned in vectors capable of accommodating large fragments, in our case, Bacterial

Artificial Chromosomes (BAC).

We have developed a fluorescent in situ hybridization protocol which has allowed

us to locate the BAC clones in the chromosomes of Senegalese sole. Afterwards, we

have developed the double fluorescent in situ hybridization protocol, which allowed us

to locate two markers at the same time. Moreover, BAC holding important genes for the

species culture, such as Lysozime and Mx genes, both involved in the innate immune

system, were isolated from the library. Lysozime gene shows a signal in a subtelomeric

position in a small chromosome pair, while Mx shows one signal in a medium size

chromosome pair. Also we have localized one of the genes of the Thyroid hormone

receptors (TRB) which is involved in the Senegalese sole metamorphosis. This gene

shows one signal in two chromosomes pairs. One of the signals has low intensity in one

chromosome pair and it is localized in an interstitial position of an acrocentric

chromosome pair, while the other signal has higher intensity and possibly it is localized

in centromeric position of an acrocentric chromosome pair.

Tesis de Máster Abstract

- 4 -

All these markers, along with the previously studied for this specie 5S rDNA and

U2 snRNA ribosomal markers, have contributed to the development of the first S.

sengealensis physical map.

Tesis de Máster Índice

- 5 -

ÍNDICE I.- RESUMEN…………………………………………………………………………..1

II.- ABSTRACT…………………………………………………………………...……3

III.- INTRODUCCIÓN GENERAL…………………………………………………..7

1.- Biología de la especie………………………………………………………….…8

1.1. Descripción de la especie

1.2.- Distribución geográfica y ciclo biológico de Solea senegalensis

2.- Producción en acuicultura e interés económico de S. senegalensis………….....12

3.- Genética en especies de interés comercial……………………………………...15

4.- Citogenética: usos y aplicaciones en acuicultura……………………………….16

4.1.- Hibridación in situ de fluorescencia (FISH)……………………………...17

4.1.1.- Secuencias repetidas

4.1.2.- Secuencias de copia única

5.- Mapas genéticos en acuicultura…………………………………………….…..21

5.1.- Mapas genéticos o de ligamiento…………………………………………22

5.2.- Mapas físicos……………………………………………………………...23

6.- Genotecas como herramienta en la elaboración de mapas genéticos…………..25

IV.- OBJETIVOS…………………………………………………………………...…27

V.- MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………....29

Descripción general…………………………………………………………….30

1.- Caracterización de los clones BAC……………………………………………..31

1.1.- Genoteca BAC

1.2.- Cultivo y conservación de BAC

1.3.- Extracción de ADN de los BAC

1.4.- Técnicas electroforéticas

Tesis de Máster Índice

- 6 -

1.5.- Secuenciación

1.6.- Amplificación de familias multigénicas

2.- Técnicas citogenéticas……………………………………………………….….34

2.1.- Obtención de las preparaciones cromosómicas …………………………...34

2.2.- Hibridación in situ de fluorescencia simple………………………………35

2.2.1.- Marcaje de sondas

2.2.2.- Preparación de la solución de hibridación

2.2.3.- Pretratamiento de las preparaciones cromosómicas

2.2.4.- Hibridación

2.2.5.- Lavados post-hibridación

2.2.6.- Detección inmunocitoquímica simple

2.3.- Hibridación in situ de fluorescencia doble………………………...……...38

2.3.1.- Preparación de la solución de hibridación

2.3.2.- Detección inmunocitoquímica doble

VI.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………...40

1.- Caracterización genética y localización cromosómica de clones BAC

prcedentes de una genoteca de S. senegalensis………………………………….…41

2.- Caracterización genética y localización cromosómica de genes

de interés en S. senegalensis: Lisozima (Lys) y Mx………………………………..47

3.- Caracterización genética y localización cromosómica del

gen TRB de S. senegalensis. .....................................................................................50

4.- Caracterización citogenética de familias multigénicas en S. senegalensis……...51

5.- Localización doble de los genes de interés procedentes de la genoteca BAC y

familias multigénicas en S. senegalensis...................................................................55

VII.- CONCLUSIONES……………………………………………………………....59

VIII.- BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………....61

- 7 -

III.- INTRODUCCIÓN GENERAL

Tesis de Máster Introducción

- 8 -

1.- Biología de la especie

1.1.- Descripción de la especie

El lenguado senegalés, Solea senegalensis (Kaup, 1858) es un teleósteo marino

perteneciente a la Clase Actinopterygii (aletas con radios), Orden Pleuronectiformes

(peces planos), Familia Soleidae (lenguados):

Reino: Animalia

Filo: Chordata

Subfilo: Vertebrata

Supercalse: Osteichthyes

Infraclase: Teleostei

Superorden: Acanthopterygii

Orden: Pleuronectiformes

Suborden: Pleuronectoidei

Famlia: Soleidae

Género: Solea

Especie: senegalensis

La familia soleidae está compuesta por un amplio grupo de pleuronectiformes con

un total de 22 géneros y 89 especies que se distribuyen principalmente desde Europa

hasta Australia y Japón.

Entre los teleósteos marinos, los pleuronectiformes se sitúan en las primeras

posiciones en interés para la acuicultura. Presentan un alto precio en el mercado ya que

su carne es muy apreciada al ser blanca y magra, su sabor fino y sus espinas se retiran

fácilmente. Entre los géneros de mayor importancia destacan el rodaballo (Psetta

maxima), el fletán (Hippoglossus hippoglossus), el lenguado común (Solea solea) y el

lenguado senegalés (S. senegalensis).

Desde hace años se han llevado a cabo multitud de estudios sobre la biología de

estas especies, encaminados a desarrollar su cultivo intensivo.


- 9 -

El lenguado senegalés es un pez plano, con ambos ojos en el lado derecho de la

cabeza y sin simetría bilateral (juveniles y adultos). El cuerpo es alargado, oval y

altamente comprimido, algo redondeado en el lado ocular y plano en el lado ciego,

llegando a alcanzar los 60 cm de longitud máxima (Figura 1) (Ben-Tuvia 1990).

Se diferencia un lado pigmentado que se corresponde con la posición “dorsal” del

animal o flanco derecho, mientras que el lado no pigmentado, correspondiente a la

posición “ventral” o flanco izquierdo, es totalmente plano y de color blanco. Sobre la

línea media del cuerpo aparecen manchas marrones de tamaño mediano y otras manchas

más pequeñas se sitúan en columnas transversales a la línea lateral.

Los lenguados son peces bentónicos, neríticos que se alimentan de invertebrados

bentónicos como larvas de poliquetos, de moluscos bivalvos y pequeños peces. Tienen

hábitos básicamente nocturnos, viviendo enterrados en la arena durante el día. Los

dientes se localizan en el lado ciego de la boca, en ambas mandíbulas.

Figura1: Solea senegalensis (Kaup, 1858)

Como característica típica de esta especie se puede destacar la presencia de una

mancha negra en la aleta pectoral del lado ocular que ocupa la totalidad de la mitad

distal de la aleta, mientras que la del lado ciego es blanca.

1.2.-Distribución geográfica y ciclo biológico de S. senegalensis

El lenguado senegalés se localiza en climas subtropicales, entre 47ºN – 14ºN y

19ºW – 1ºW, y tienen la costa Atlántica desde Senegal como límite sur en el Atlántico,


- 10 -

las islas Canarias como límite occidental y las costas de La Rochelle en Francia

(Legardere et al., 1987) (Figura 2). Su distribución geográfica en el Mediterráneo es

bastante amplia, abarcando el sur y el este de la Península Ibérica (Ben-Tuvia, 1990) la

costa Norte de Túnez, los lagos de Bizerte y Ichkeul en Túnez (Goucha y Ktari, 1981) y

el Golfo de Lions (Quignard et al., 1986) (Figura 2). Su hábitat característico está

constituido por fondos móviles de arena o fango, principalmente en zonas costeras,

hasta profundidades de 100 m., aunque debido a que es un pez euritermo y eurihalino,

también se pueden encontrar en lagunas saladas o salobres comunicadas con el mar,

estuarios de ríos (Imsland et al,. 2003) y esteros.

Figura 2: Distribución geográfica de S. senegalensis

El lenguado es un teleósteo gonocórico o de sexos separados, que no presenta

dimorfismo sexual aparente, observándose únicamente caracteres sexuales externos

diferenciales en las épocas de puesta, cuando las gónadas están ampliamente

desarrolladas. La primera madurez sexual se alcanza entre el segundo y el tercer año de

vida en el caso de los machos, y entre el tercer y cuarto año de vida en el caso de las

hembras (Ramos, 1981; Dinis et al., 1999). Su principal época de reproducción es en

primavera (Marzo/Abril-Junio), pero existe un segundo periodo de menor importancia


- 11 -

en otoño (Septiembre/Octubre-Noviembre) (Arias y Darke, 1990) (Figura 3). Estas

épocas de puesta están fuertemente influenciadas por la temperatura del agua, siendo

viables entre los 13ºC -23ºC (Anguis y Cañavate, 2005), aunque resultan óptimas con

temperaturas del agua por encima de 16ºC, fotoperiodo natural y una salinidad del agua

mayor del 30%, si bien esta última no representa un factor limitante para la puesta

(Dinis et al,.

1999). Entre el pico primaveral y otoñal de puesta existe una fase de regresión parcial

de las gónadas femeninas y masculinas (García-López et al,. 2006, 2007; Anguis y

Cañavate, 2005). El desarrollo gonadal de las hembras es de tipo asincrónico

presentando sucesivos episodios de puestas de forma que desarrollan ciclos ovulatorios

cada 2-4 días (Ramos, 1982; Rodriguez, 1984)

Los huevos del lenguado senegalés son pelágicos y no adhesivos, y no requieren de

cuidados parentales. Tras la eclosión nacen larvas pelágicas (Figura 3) de hábitos

diurnos que presentan simetría bilateral hasta que sufren un proceso de metamorfosis

entre los días 11 y 19 post-fertilización del desarrollo larvario (Dinis et al,. 1999). En

estadíos juveniles presentan una marcada asimetría corporal, siendo bentónicos y de

hábitos nocturnos, características que mantienen el resto de su ciclo de vida (Bayarri et

al., 2004).

Figura 3: Esquema del ciclo biológico de S. senegalensis.


- 12 -

El proceso de metamorfosis contempla cambios fisiológicos, moleculares,

bioquímicos y morfológicos drásticos, tales como: migración del ojo izquierdo hacia el

flanco derecho, remodelación cráneo-facial, de la boca, de los orificios operculares, de

las aletas y del patrón de pigmentación corporal, y rotación de 90º de la posición del

cuerpo. Asimismo, este proceso conlleva cambios conductuales tales como variaciones

en el comportamiento en la columna de agua y de sus hábitos de vida (Power et al.,

2001; Arjona et al., 2008; Isorna et al., 2009).

El proceso de metamorfosis parece estar mediado por las hormonas tiroideas TH

(Manchado et al., 2008a). Estudios llevados a cabo han demostrado la importancia de

las hormonas tiroideas en los sistemas fisiológicos que incluyen el sistema

cardiovascular, el sistema esqueleto-muscular y el sistema digestivo (Manchado et al.,

2010). Los mecanismos y genes involucrados en este proceso todavía están siendo

identificados ya que parece ser que las perturbaciones de la hormona tiroidea durante el

desarrollo larvario y juvenil tienen grandes consecuencias para la viabilidad de las

larvas. Actualmente los fallos en la metamorfosis representan una barrera para la

expansión de su cultivo. Un mejor entendimiento del sistema endocrino en peces y de

las hormonas tiroideas, en particular, facilitaría la diversificación continuada de las

especies de acuicultura.

2.- Producción en acuicultura e interés económico de S. senegalensis

La acuicultura produce hoy en día más de la mitad del pescado consumido en el

mundo (Figura 4), siendo España el estado miembro de la Unión Europea con una

mayor producción en acuicultura en toneladas, con 249.070 en 2008 (19.5% del total de

la UE), seguido por Francia (18.6%) e Italia (14.2%) (FAO – APROMAR).


- 13 -

Figura 4: Evolución de la producción acuática (acuicultura y pesca) mundial en el periodo

1950-2008 (FAO, APROMAR).

El lenguado senegalés es una de las especies mas valorada económicamente en la

acuicultura, de ahí el interés por su cultivo y producción en el Sur de Europa desde la

década de los 90. Al comparar el precio en el mercado del lenguado con especies más

comerciales, podemos observar cómo el valor económico del lenguado es casi tres veces

más que otras especies tan importantes comercialmente como dorada o lubina (Tabla 1).

El cultivo de peces planos en Europa comenzó en Gran Bretaña con el lenguado

común (S. solea, Linneo 1758) y el rodaballo (Psetta maxima), aunque con unas bases

fisiológicas poco claras. Si bien estos países fueron pioneros, posteriormente en otros

países, especialmente Portugal, España, Grecia, Alemania y Noruega, se iniciaron

también en su cultivo. Desde los últimos treinta años, el lenguado (S. solea y S.

senegalensis) aparece en el sur de Europa como un buen candidato para la

diversificación de los mercados europeos, saturados a causa de la superproducción de

dorada y lubina que provoca una reducción en los precios de mercado. Una vez

superados los problemas iniciales, el lenguado ha demostrado ser una prometedora

especie para la acuicultura marina.


- 14 -

Tabla 1: valor de producción de acuicultura en España, 2008.

Especie Producción (Tm.) Valor Unidad

(euro/Kg)

Valor total (euros)

Dorada 23.690 3.75 88.837.500

Lubina 13.840 4.53 62.695.200

Rodaballo 8.320 6.77 56.326.400

Anguila 510 8.1 4.131.000

Besugo 185 9.5 1.757.500

Corvina 1.660 4 6.640.000

Lenguado 188 10.7 2.011.600

Langostino 47 26 1.222.000

Total 48.440 4.62 223.621.200

Uno de los principales problemas con los que se encontró el cultivo del lenguado en

sus inicios fueron las bajas tasas de crecimiento en juveniles y la gran susceptibilidad a

enfermedades, consecuencia del escaso conocimiento científico adquirido acerca de las

necesidades fisiológicas de esta especie. El problema de las bajas tasas de crecimiento

en cautividad ha sido parcialmente resuelto a lo largo del tiempo mediante la mejora de

las dietas y las densidades de cultivo, en cambio, sigue siendo necesario el estudio

científico de la especie para solventar totalmente el problema de patologías (Cañavate,

2005).

La resistencia a enfermedades virales junto con patógenos microbianos es otro de

los problemas que plantea el cultivo de lenguado senegalés y debe ser resuelto antes de

estandarizar la producción de peces. Estas infecciones son una amenaza constante para

la acuicultura de las especies de peces, debido a la inmunodepresión causada por la

sobrecarga de animales existente en el ambiente, la cual facilita el contagio de

infecciones.

La inmunidad innata representa un importante mecanismo de defensa en peces

(Magnadottir, 2005), además su conocimiento es una prioridad con el fin de usar

inmunoproteinas como herramienta para la mejora de resistencia a enfermedades en

acuicultura. En vertebrados, la respuesta antiviral innata mediada por el interferón tipo I

actúa regulando otros genes, entre ellos la proteína Mx que posee actividad antiviral.


- 15 -

Las proteínas Mx son capaces de reconocer diferentes tipos de virus y prevenir su

replicación en el interior de las células. Los genes Mx son de especial interés en peces,

ya que su expresión puede ser utilizada como informador de la actividad del interferón

(Caipang et al., 2004).

Existen varias enzimas líticas que son importantes elementos de defensa innatos

contra bacterias. Uno de estas enzimas es la lisozima, la cual es un parámetro

importante en la defensa inmune en invertebrados y vertebrados como peces, con acción

bactericida. La importancia de conocer estos genes y poder controlar su expresión sería

de gran ayuda en la optimización del cultivo en cautividad del lenguado senegalés.

Otro factor limitante en la acuicultura del lenguado senegalés es la ausencia de

métodos para el control de la reproducción en cautividad, lo cual se ha conseguido con

éxito en otras especies como dorada o lubina. En zonas del sur de España y Portugal se

han conseguido puestas viables a partir de reproductores salvajes de lenguado senegalés

estabulados durante varios años en cautividad, aunque estas ocurren de manera

espontánea y poco predecible (Dinis et al., 1999; Anguis y Cañavate, 2005). Sin

embargo, los tratamientos hormonales para la inducción a la puesta generalmente no

funcionan, o producen gametos da baja viabilidad (Dinis et al., 1986, 1999).

En España, la producción de lenguado se concentra en las comunidades de

Andalucía y Cataluña, aunque también se realizan experiencias en instalaciones

ubicadas en Galicia y Santander.

3.- Genética en especies de interés comercial

La genética ha experimentado en las últimas décadas un desarrollo espectacular en

todas sus ramas: genética molecular, citogenética, genética del desarrollo, genética

cuantitativa, genética de poblaciones…etc. Todas estas ramas inciden en el cultivo de

los organismos acuáticos, algunas de forma más o menos directa o con mayor o menor

relevancia. Características como la mejora en la producción, reproducción o resistencia

a enfermedades han sido puntos de especial importancia para las especies de interés en

acuicultura. Sin embargo, la optimización en el cultivo y la domesticación de las

especies que se utilizan en acuicultura no se habrá completado hasta que se controlen

todos los aspectos de su biología, incluyendo la genética. Por otra parte, la mayoría de

los reproductores de las especies criadas en cautividad proceden o han procedido de


- 16 -

capturas en el medio natural, por tanto es de especial relevancia la preservación de los

recursos genéticos naturales durante el desarrollo de estas actividades acuícolas.

El inicio del Plan Nacional para el cultivo del lenguado, promovido por la Junta

Nacional Asesora de Cultivos Marinos (Jacumar) a comienzos de 2002, y el proyecto de

genómica “Pleurogene” financiado por la Fundación Genoma España en colaboración

con Genoma Canadá, desde 2004 hasta finales de 2007, han proporcionado un punto de

inflexión en la puesta a punto del cultivo y el conocimiento genético del lenguado

senegalés, proporcionando un mapa genético del lenguado, mejorando la calidad

larvaria y reduciendo las malformaciones.

4.- Citogenética: usos y aplicaciones en acuicultura

La citogenética es el campo de la genética que comprende el estudio de la

estructura, función y comportamiento de los cromosomas. Incluye análisis de bandeo G

en cromosomas, otras técnicas de bandeado citogenético, y también la citogenética

molecular del tipo de hibridación por genómica comparativa (CGH) y de Hibridación in

situ de Fluorescencia (FISH).

Los estudios citogenéticos en peces planos son escasos debido al tamaño reducido

de los cromosomas y a que poseen el menor contenido de DNA cromosómico entre los

teleósteos (Bouza, Sánchez, y Martínez, 1994).

Por otro lado, es importante conocer el número de cromosomas que presenta cada

especie con vistas a futuros programas de mejora genética. Actualmente sólo se conoce

el cariotipo de alrededor del 10% de los peces. De hecho, se desconoce la composición

cromosómica de muchas especies con interés para la acuicultura.

El lenguado senegalés presenta un número diploide de 42 cromosomas, y 48 brazos

cromosómicos. En cuanto a la forma de las parejas cromosómicas, se observan 3 parejas

metacéntricas, 2 parejas submeta-subtelocéntricas, 4 parejas subtelocéntricas y, por

último, 12 pares cromosómicos acrocéntricos (Figura 5). Esto evidencia un cariotipo

con un amplio rango de variación en el tamaño y la forma de sus cromosomas (Vega L.,

et al, 2002).


- 17 -

Figura 5: Cariotipo de Solea senegalensis (Vega et al., 2002).

4.1.- Hibridación in situ de fluorescencia

La Hibridación in situ de fluorescencia (FISH) es una poderosa técnica de detección

de secuencias de ADN en cromosomas o cromatina. Esta técnica de citogenética

molecular permite identificar, detectar y caracterizar cromosomas, así como anomalías

cromosómicas asociadas a caracteres de interés, mapear genes concretos y realizar

estudios de estructura celular.

Las principales secuencias analizadas en organismos marinos hasta el momento

incluyen:

4.1.1.- Secuencias repetidas:

a) ADN satélite: este ADN está constituido por secuencias cortas que se repiten

en tándem cientos de miles o millones de veces en un genoma. Estas secuencias carecen

de función codificadora y se acumulan en regiones determinadas de los cromosomas del

genoma de una especie. Concretamente, estas secuencias constituyen la heterocromatina


- 18 -

constitutiva que se acumula en los centrómeros y regiones subteloméricas,

principalmente. Repeticiones de ADN satélite localizado en posición centromérica, han

sido mapeadas en cromosomas de peces como medaka, tilapia, salmón, dorada (Cuñado

et al., 2000) o esturión (Robles et al., 2004). Contribuyendo así a ampliar el

conocimiento estructural y cartográfico de los cromosomas en peces y la importancia de

estas secuencias (de la Herrán et al., 2008).

b) Secuencias GATA: estas secuencias son una familia de DNA satélite no

funcional. Normalmente estas secuencias se encuentran repetidas aleatoriamente por

todos los cromosomas, pero se han encontrado secuencias GATA asociadas a

cromosomas sexuales en humano y en algunas especies de vertebrados (Demas y

Wachtel, 1990; Subramanian et al., 2003). Este hallazgo de secuencias GATA

localizadas concentradas en organismos mas evolucionados genéticamente

(Subramanian et al., 2003), ha convertido a esta secuencia en una herramienta para

estudios de caracterización citogenética. La localización de secuencias GATA ha sido

raramente estudiada en organismos marinos mediante el uso de la técnica FISH (Vitturi

et al., 2002; Cross et al., 2005) aunque se han realizado trabajos en ostras, lenguado y

pez sapo entre otros (Cross et al., 2005, 2006; Merlo et al., 2007; Úbeda et al., 2010).

c) Secuencias teloméricas: las secuencias (TTAGGG)n están presentes en los

telómeros de cromosomas de vertebrados y otros organismos, y su estudio permite

establecer la presencia de reordenaciones cromosómicas, como las fusiones

Robertsonianas (fusión de dos cromosomas acrocéntricos por sus centrómeros) o

inversiones, las cuales están involucradas en la evolución de los cromosomas. En

algunas especies de peces la secuencia (TTAGGG)n ha sido localizada intercalada entre

la familia multigénica ribosómica (Sola et al., 2003; Gornung et al., 2004), siendo esta

asociación inusual en vertebrados.

d) Familias multigénicas: una familia multigénica es un conjunto de genes con

un alto grado de homología que, sin llegar a ser alelos (variantes de un mismo gen)

porque codifican para productos distintos, poseen un parentesco evolutivo que es

consistente con un proceso de copia, diversificación y evolución independiente.

Generalmente las familias multigénicas se encuentran agrupadas, y los genes que las

constituyen distan unas pocas kilobases unos de otros, pero son independientes, cada


- 19 -

uno con sus propios elementos de regulación que, a veces, actúan de manera totalmente

independiente. Entre los más estudiados se encuentran los genes de ADN ribosómico y

los genes de las histonas.

- ADN ribosómico:

El ADN ribosómico (ADNr) es una secuencia de ADN contenida en los

cromosomas del núcleo que codifica ARN ribosómico. El ARN ribosómico (ARNr)

forma parte de los ribosomas, que se encargan de la síntesis de proteínas. En

organismos eucariotas existen cuatro ARNr distintos denominados por unidad de

sedimentación: 5S, 5.8S, 18S, 28S. Los genes ribosómicos se clasifican en ribosómicos

mayores 45S (5.8S, 18S, 28S) y menores (ADNr 5S). Los mayores se localizan en las

regiones organizadoras del nucleolo (NOR), las cuales pueden ser localizadas mediante

técnicas citogenéticas (Amemiya and Gold, 1986; Phillips and Ihssen, 1985; Rab et al,

1996). Los menores pueden encontrarse localizados en cromosomas diferentes al

ribosómico mayor. Los genes ribosómicos, son considerados excelentes marcadores

genéticos para la identificación de cromosomas en especies de peces de interés en

acuicultura como lenguado (Cross et al. 2006) dorada (Sola et al. 2003), esturión

(Fontana et al, 1999), y en otras especies como pez sapo (Merlo et al. 2007). El bajo

nivel de polimorfismo en la unidad de repetición de los genes de ADNr permite la

caracterización de cada especie usando sólo unos pocos ejemplares y hace que este

ADN sea útil para la comparación interespecífica. Además, las regiones codificantes y

las espaciadoras presentan distintas tasas de evolución. Como resultado de ello, este

ADN ha sido muy usado en estudios de filogenias e identificación de especies.

La familia multigénica del ADNr 5S ha sido localizada y descrita para S.

senegalensis (Manchado et al., 2006). En este estudio se ha utilizado esta familia

multigénica como herramienta para comparar su localización en el genoma de esta

especie con el resto de genes estudiados en este trabajo.

- ARN nuclear pequeño U2:

Los ARN nuclear pequeños U, son parte del complejo denominado espliceosoma

(Yu et al., 1999) que escinde los intrones del pre-ARN mensajero y une los exones para

formar el ARN mensajero maduro. La combinación de un ARN nuclear pequeño U

específico con su proteína se conoce como una ribonucleoproteína pequeña nuclear


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(RNPnp). La función del RNPnp U2 es unirse a la secuencia del punto de ramificación e

inducir la formación de la estructura en lazo del intrón (Lamond, 1993; Yu et al., 1999).

La familia multigénica del ARNnp U2 ha sido previamente localizada en el genoma

de S. senegalensis ya que se encuentra en una unidad de repetición localizada mediante

FISH (Manchado et al., 2006) que incluye al ADNr 5S y a los genes del ARN pequeño

nuclear U1, U2 y U5. Sin embargo, la presencia de otras regiones y unidades de

repetición del U2 no han sido estudiadas hasta el momento en esta especie.

- La familia génica de las histonas:

Las histonas son proteínas básicas (cargadas positivamente), de baja masa

molecular, muy conservadas evolutivamente entre los eucariotas y en algunos

procariotas. Además de su papel en el mantenimiento de la estructura cromosómica, las

histonas también pueden jugar otros papeles en la expresión génica, demostrando así su

importancia en la regulación de la trasncripción en la célula. Por consiguiente, el

mapeado genético de histonas mediante la técnica FISH es de gran interés, y ha sido

realizado en humanos, maiz, bivalvos y recientemente en algunas especies de pez

(Tripputi et al, 1986; Pendás et al. 1994; Drabent et al, 1995; Wang et al, 1996; Zhang

et al, 2006)

4.1.2.- Secuencias de copia única:

Los genes de copia única, en general, constituyen la mayor parte de los genes que

codifican para polipéptidos. Entre estos genes se encuentran aquellos relacionados con

caracteres cuantitativos de gran interés económico como crecimiento, adaptación,

resistencia a enfermedades o control del sexo.

Los genes ligados al sexo son genes situados en cromosomas sexuales. Estos genes

se heredan y se manifiestan de forma distinta en machos y hembras. La importancia de

la localización mediante Hibridación in situ de fluorescencia de estos genes, permite

conocer e identificar los cromosomas sexuales de las especies.

En platyfish, pez medaka, tilapia y salmónidos han sido identificados los

cromosomas sexuales mediante FISH (Phillips, 2001). En platyfish (Nanda et al., 2000)

y medaka (Matsuda et al., 2003) se han usado genotecas de cósmidos que contenían

genes ligados al sexo de copia única como sondas FISH para identificar cromosomas


- 21 -

sexuales. Con la disponibilidad de genotecas BAC y cósmidos para otras especies de

interés, sería posible identificar los cromosomas sexuales usando FISH .

Otros genes de copia única ha sido localizados mediante FISH en otros organsimos,

como en el caso de los genes MHC y C-src1 localizados en la rana Xenopus (Courtet et

al., 2000; Krylov et al., 2007).

5.- Mapas genéticos en acuicultura

Los tipos de genes que un organismo posee y sus posiciones en los cromosomas son

aspectos fundamentales del análisis genético. Las razones principales para confeccionar

los mapas genéticos tienen que ver con la función, evolución y aislamiento de los genes.

Se sabe que la posición de un gen afecta, en numerosas ocasiones, a su expresión, un

fenómeno que suele conocerse como “efecto de posición”. Genes con funciones

relacionadas están a menudo agrupados en los cromosomas, normalmente debido a que

se transcriben como una sola unidad. La posición de un gen eucariota en una región de

heterocromatina o cerca de ella puede afectar su expresión. El conocimiento de la

posición de un gen es útil en los estudios evolutivos, ya que podemos deducir las

reorganizaciones cromosómicas que se producen en el curso de la evolución a través del

análisis de las posiciones relativas de los mismos genes en organismos relacionados

(Bouza and Martínez, 2007). Finalmente, si se pretende aislar un gen para su análisis

molecular, el conocimiento de su posición cromosómica representa a menudo el

comienzo del procedimiento de aislamiento.

Los mapas físicos de genes son especialmente importantes en peces debido al alto

grado de interferencia genética en los cromosomas pequeños (Martínez y Figueras,

2007). Por ejemplo, para mapear loci de caracteres cuantitativos (QTL), sería

importante conocer dónde están localizados esos genes en el mapa físico.

Un QTL es una región genómica en la que se encuentran uno o varios genes con un

efecto significativo sobre un carácter cuantitativo. La mayoría de los caracteres

productivos presentan variación continua y están controlados por varios genes con un

efecto pequeño, pero acumulativo sobre el carácter. Existen genes para algunos

caracteres, que explican un elevado porcentaje de la variación fenotípica, y el resto de la

variabilidad del carácter es causada por numerosos genes con efecto pequeño, además

del efecto ambiental (Lande, 1981). La localización de QTLs, es muy importante en


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acuicultura porque permite asignar una posición en el mapa a genes de interés

económico y poder hacer programas de mejora genética dirigidos con mayor eficiencia.

Para la localización de estos genes, se lleva a cabo un estudio genético de la

segregación de alelos polimórficos de marcadores moleculares. Para ello es muy

importante la utilización de los mapas físicos y de ligamiento existentes, y la presencia

de un adecuado diseño estadístico. Gracias al incremento de marcadores polimórficos

moleculares en el mapa genético, así como la adecuación y desarrollo constante de

programas estadísticos y diseños experimentales, se ha logrado optimizar sensiblemente

la localización de QTLs para genes candidatos relacionados con la salud y el

crecimiento en animales domésticos (Danzmann y Gharbi., 2001) El desarrollo logrado

en este campo en organismos de interés en acuicultura, principalmente en peces, ha sido

hasta el momento muy inferior al de otras especies domésticas, en gran parte debido a la

limitación en el número necesario de marcadores moleculares y de mapas genéticos de

la densidad apropiada (Martínez y Figueras, 2007).

5.1.- Mapas genéticos o de ligamiento: los mapas genéticos o de

ligamiento ubican genes en el genoma mediante el análisis de la frecuencia de

recombinación entre loci. Si dos genes se encuentran en cromosomas distintos, o a una

distancia muy grande dentro del mismo cromosoma, se heredan de forma independiente

(Frecuencia de recombinación >50%). En cambio si existen grupos de genes que se

encuentran relativamente cercanos unos de otros (Frecuencia de recombinación <50%)

se heredan conjuntamente y son conocidos como grupos de ligamiento. La frecuencia de

recombinación entre dos loci, por tanto, es proporcional a la distancia física que los

separa y la unidad de mapa (m.u) o centimorgan (cM), se define como la distancia entre

genes donde uno de cada 100 productos meióticos es recombinante. Las distancias de

mapa son generalmente aditivas y permite construir los mapas genéticos, facilitando el

posicionamiento de nuevos loci y genes. Los mapas de ligamiento son de gran ayuda

para la ubicación relativa de los marcadores moleculares en el mapeado genético y una

herramienta básica para estudios de asociación y búsqueda de QTLs. Sin embargo, para

la realización de un mapa de ligamiento, es necesario disponer de marcadores

polimórficos y el cruzamiento de un gran número de animales, que nos permita observar

la proporción de gametos recombinantes y poder estimar la frecuencia de

recombinación.


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En especies de acuicultura, la mayor parte del esfuerzo se centra en el mapeo de

QTLs que incluyen: eficiencia de conversión del alimento, tolerancia a enfermedades

bacterianas, época de reproducción, tasas de desarrollo embrionario, albinismo y

tolerancia a bajas temperaturas. Todos ellos han sido identificados en pez cebra, pez

gato, trucha arco-iris y tilapia (LaPatra et al., 1993, 1994, 2001).

Frente al fuerte progreso de los estudios de genómica estructural y de los mapas

genéticos en un amplio rango de especies terrestres, tanto animales como vegetales, los

estudios en organismos acuáticos han sido hasta el momento muy limitados (Wang et

al., 2007). De las 25000 especies de peces, existen mapas genéticos disponibles en

menos de 20, incluyendo modelos de investigación (Danio rerio, Oryzias latines,

Xiphophorus spp., Takifugu rubripes). La escasez de mapas genéticos es aún más

acusada en moluscos (3 de 80000spp.) y crustáceos (4 de 30000 spp.) A lo largo de la

última década se ha iniciado la construcción de mapas genéticos en organismos

acuáticos de interés comercial, principalmente en peces (Danzmann y Gharbi 2001;

Franch et al., 2006; Wang et al., 2007), así como en unas pocas especies de moluscos y

crustáceos (Hubert y Hedgecock, 2004; Sekino y Hara, 2007). Los mapas genéticos de

ligamiento representan recursos genómicos valiosos de aplicación directa para la mejora

de la producción en la acuicultura, permitiendo la identificación de regiones genómicas

y genes relacionados con caracteres productivos. Asimismo, son indispensables para el

análisis genómico comparado y para el desarrollo de proyectos genoma en especies de

interés (Danzman y Gharbi, 2001; Jaillon et al., 2004; Kai et al., 2005; Sarropoulou et

al., 2007).

Es importante continuar con el desarrollo de mapas de ligamiento cada vez más

densos (Danzmann and Gharbi, 2007) para que usando un marcador cercano a un gen

permitir identificar el gen o genes y la variación alélica que da lugar a un rendimiento

superior. Esto se conoce como Selección Asistida por Marcadores (MAS) que permite

realizar una selección objetiva y confiable de las variaciones específicas del ADN que

se encuentran asociadas con una diferencia cuantificable, o efecto sobre un determinado

carácter o complejo de caracteres.

5.2.- Mapas físicos: El análisis estructural del genoma puede ser explorado a

diferentes niveles, desde los mapas de ligamiento correlacionados con cromosomas, a la

cartografía física de secuencias genómicas (Brown, 1999). Los mapas físicos son

aquellos que posicionan genes o marcadores sobre los cromosomas (Figura 6) utilizando


- 24 -

para ello diversas estrategias como la Hibridación in situ de fluorescencia, los paneles

de células somáticas híbridas y la construcción de contigs (conjunto de clones de

fragmentos solapados).

Un incremento adicional en el grado de resolución cartográfico se consigue

mediante la manipulación directa de fragmentos de ADN clonados. El objetivo es

generar un conjunto de contigs de fragmentos solapados, que cubran en conjunto una

región cromosómica, un cromosoma entero, o incluso la totalidad del genoma. Para ello

es necesario fabricar una genoteca de insertos clonados en vectores capaces de albergar

fragmentos de gran tamaño, como por ejemplo cromosomas artificiales de levaduras

(YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o cromosomas artificiales de fago

P1 (PAC).

Figura 6: Interacción de mapas de ligamiento y físicos. El mapa genómico de un

cromosoma dado puede contener: i) información citogenética (morfología y

bandeado cromosómico, ii) posiciones relativas de marcadores genéticos en un

mapa de ligamiento, iii) secuencias cromosómicas largas en clones de alta

capacidad, como BACs, caracterizados a su vez en subclones solapados de menor

capacidad.

Los insertos de gran tamaño se obtienen mediante la digestión parcial del ADN

genómico y separación mediante electroforesis en campo pulsante (PGFE). Esta

estrategia permite ordenar los clones que contienen fragmentos solapados mediante

hibridación en filtros o técnicas basadas en PCR. Una vez ordenados los clones, permite


- 25 -

la caracterización genética de una región específica de interés o la búsqueda de genes,

además de servir como molde para la posterior secuenciación de dicha región.

El objetivo final de los mapas físicos es la identificación exacta de cada uno de los

marcadores posicionados sobre los cromosomas, además de determinar en colaboración

con los mapas de ligamiento la longitud de los mismos, así como los grupos de genes

sintéticos entre especies. Sin embargo, la práctica totalidad de los mapas genéticos en

especies de interés en acuicultura continúan pendientes de asignación física a

cromosomas. La única asignación de grupos de ligamiento a cromosomas específicos

mediante FISH ha sido desarrollada en unas pocas especies de peces, con aportaciones

relevantes a los estudios de evolución cromosómica en teleósteos desde un proto-

cariotipo ancestral de vertebrados (Phillips et al., 2006a,b).

6.- Genotecas como herramienta en la elaboración de mapas genéticos

Una genoteca es una colección desordenada de clones conteniendo todo el genoma

del organismo de interés en forma de trozos aleatorios. Esta genoteca genómica debe

representar el genoma completo en forma de un conjunto de fragmentos clonados

parcialmente solapados, producidos de modo aleatorio y mantenidos de forma estable en

la que no haya una mala representación de secuencias.

Las genotecas son útiles para muchas aplicaciones en la genética moderna: estudios

de la organización génica, clonación posicional, identificación de posibles elementos

reguladores cis, todo el mapeo físico del genoma y rastrear en busca del clon o clones

que porten el ADN con el gen o genes de interés.

Uno de los métodos más frecuentes de identificación de clones recombinantes de

interés en una genoteca es la hibridación de ADN usando alguna sonda marcada.

Aunque también existen otros métodos como el rastreo inmunológico (uso de

anticuerpos frente al producto de interés) o rastreo o selección de la actividad biológica

de la proteína.

Para la elaboración de estas genotecas se usan vectores de clonación, siendo los

BAC (Cromosomas Artificiales Bacterianos) uno de los más usados. Los BACs están

basados en el plásmido factor-F (fertilidad) de 7kb de E. coli (Shizuya et al., 1992;

Osoegawa et al., 1998; Amemiya et al., 1999) y son capaces de integrar fragmentos de

ADN de entre 100 y 300 kilobases, lo cual permite reducir el número de clones


- 26 -

necesarios para la elaboración de la genoteca. Otras ventajas que presenta es que se

amplifican en bacterias, se pueden aislar y manipular simplemente y generan pocos

insertos híbridos (compuestos de varios fragmentos distintos que influyen

negativamente en la ordenación de los clones).

Hasta el momento el desarrollo de mapas de ligamiento y mapas físicos en especies

acuícolas ha sido notablemente inferior al desarrollado en agricultura y ganadería. En

los últimos años se han iniciado proyectos de secuenciación masiva en diferentes

especies, en paralelo al desarrollo bioinformático de bases de datos para su almacén y

análisis. Entre los recursos genómicos disponibles destaca la construcción de las

genotecas BAC en distintas especies de peces y moluscos como trucha arco-iris, carpa

común, tilapia, salmón, especies de ostras, dorada, bacalao y lenguado (Katagari et al.,

2001; Miyake y Amemiya, 2004; Cunningham et al., 2006)

(http://www.genome.gov/11008350).

Este trabajo supone un primer paso en la elaboración de un mapa físico del lenguado

senegalés, para ello se ha puesto a punto el protocolo de localización cromosómica de

clones BAC, obtenidos de la genoteca disponible para dicha especie, mediante la técnica

de Hibridación in situ de fluorescencia (FISH-BAC). Además, se ha establecido un

protocolo para localizar simultáneamente dos clones BAC (double-color FISH-BAC).

- 27 -

IV.- OBJETIVOS

Tesis de Máster Objetivos

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Los objetivos generales de esta tesis de master son los siguientes:

1.- Caracterizar genéticamente mediante patrones electroforéticos clones BAC

de una genoteca del lenguado senegalés Solea senegalensis.

2.- Desarrollar un protocolo para la localización de clones BAC, en los

cromosomas de S. senegalensis, mediante la técnica de Hibridación in situ de

Fluorescencia (FISH).

3.- Localizar clones BAC que contienen genes de interés para la acuicultura

involucrados en el sistema inmune innato de S. senegalensis mediante FISH-BAC: gen

Lisozima y gen Mx.

4.- Localizar el clon BAC que contiene el gen Receptor β de la Hormona

Tiroidea (TRB) contenido en la genoteca BAC mediante FISH.

5.- Localizar por parejas los clones BAC y los genes anteriormente descritos

mediante FISH doble y comparar su posición con los marcadores cromosómicos ADN

ribosómico 5S y ARN nuclear pequeño U2.

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V.- MATERIAL Y MÉTODOS

Tesis de Máster Material y métodos

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Descripción general

En la figura 7 se muestra un esquema del proceso general seguido para la

caracterización molecular y citogenética de clones BAC a partir de la genoteca de S.

sengalensis.

Figura 7: Esquema general para la caracterización genética de clones BAC en S. senegalensis.


- 31 -

1.- Caracterización de los clones BAC

1.1.- Genoteca BAC: para llevar a cabo los objetivos del proyecto se adquirió

una genoteca BAC de S. senegalensis por el equipo del IFAPA “El Toruño”.

La librería de clones BAC consta de 76 placas en formato de 384 pocillos que

corresponden a 29,184 colonias positivas de ADN genómico de S. senegalensis.

El BAC (CopyControlTM pCC1BACtm Vector, EPICENTRE) posee dos orígenes

de replicación, un replicón F-factor de E. coli de copia única y un origen de replicación

oriV” (Figura 8). Este BAC contiene el gen de resistencia al cloranfenicol, lugares de

unión de primers para secuenciar los extremos del BAC y lugares de reconocimiento de

las enzimas de restricción Not I, Bam HI, Hind III y Eco RI. El tamaño medio del

inserto es de 285 kb y el tamaño del vector BAC es 8,1 kb.

Figura 8: Vector CopyControlTM pCC1BACTM

1.2.- Cultivo y conservación de BAC: para realizar el cultivo de los clones

BAC de la genoteca, se transfirieron 15 μl del clon de la placa de 92 pocillos a un medio

de cultivo LB sólido (bactotriptona 1%, extracto de levadura 0.5%, cloruro sódico 1% y

agar 2%) con cloranfenicol (20 μg/ml) como medio selectivo. Se sembraron a modo de

césped y se dejaron incubando durante una noche a 37ºC consiguiendo así el


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crecimiento de las bacterias que contienen el BAC. Posteriormente el cultivo se

conserva a 4ºC hasta el momento de su uso. Las extracciones de DNA de los BAC se

hicieron a partir de colonias aisladas. Para ello, se siembra en un nuevo medio de

crecimiento LB sólido-cloranfenicol, con ayuda de un asa de cultivo, usando la técnica

de siembra en zig-zag. Se dejan crecer las bacterias durante una noche a 37ºC.

Una vez conseguidas las colonias aisladas, éstas se transfirieron a un matraz estéril

con 50 ml de medio LB líquido con cloranfenicol (bactotriptona 1%, extracto de

levadura 0.5%, cloruro sódico 1%, cloranfenicol 20 μg/ml). Para ello se inocula una

colonia aislada con ayuda de un asa de cultivo y se deja incubando en agitación (aprox,

250 rpm) a 37ºC durante 12-16 horas para su posterior extracción.

1.3.- Extracción de DNA de los BAC: para la extracción del BAC-DNA se

utilizó el “BACMAX DNA purification kit” (BMAX044, EPICENTRE). El principio

básico de este método se basa en una lisis alcalina, una posterior precipitación de los

ácidos nucleicos con isopropanol, una digestión de RNA mediante la enzima

RiboShredder RNAse Blend (EPICENTRE) y una precipitación del BAC-DNA con

etanol y resuspensión del mismo con TE Buffer toda una noche a 4ºC.

1.4.- Técnicas electroforéticas: para caracterizar los clones BAC se realizaron

dos técnicas.

- Electroforesis estandar: los clones BAC se digirieron con la enzima de

restricción EcoR I. Tras 1 hora 45 min. a 37ºC se cargaron los productos digeridos en un

gel de agarosa al 1% en TBE y se visualizaron con bromuro de etidio (0.5 μg/ml) tras

una electroforesis de aprox. 1.5 horas a 70V. El gel se visualizó en un transiluminador

de luz ultravioleta y el tamaño del ADN se determinó por comparación con un patrón

conocido mediante el uso de marcadores de peso molecular de ADN (lambda Hind III

molecular marker II 0.23-23.1 kbp de Roche Biochemical y BAC-Tracker supercoiled

DNA ladder, BIOCENTRE). Cada clon presentó un patrón de bandas específico que

indicaba la presencia del inserto en el vector BAC. Una vez observados los resultados

en el gel de agarosa, se midió la concentración de BAC DNA (200-400 ng/μl) y se

envió a secuenciar a las instalaciones del IFAPA Centro El Toruño, donde se

secuenciaron los extremos de los BAC analizados. En total se extrajeron nueve BACs,

de los cuales, siete presentaron inserto y cinco se enviaron al IFAPA El Toruño para ser

secuenciados.


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- Electroforesis en campo pulsante: los clones BAC se digirieron con la

enzima de restricción Eco RI, Eco RV y Pci I. Tras 1 hora 45 min a 37ºC se cargaron en

un gel de agarosa campo pulante al 1% en TBE 0.5X y se sellaron los pocillos con el

mismo tipo de gel de agarosa. Las condiciones de electroforesis fueron de 18 horas,

12ºC, 6.0 V/cm, 90 s. cada pulso en tampón TBE 0.5X y se visualizaron con bromuro

de etidio (0.5 μg/ml) en un transiluminador de luz ultravioleta. El tamaño del ADN se

determinó por comparación con un patrón conocido mediante el uso de marcadores de

peso molecular de ADN (λHind III molecular marker II 0.23-23.1 kbp de Roche

Biochemical y BAC Tracker supercoiled DNA ladder, Biocentre).

1.5.- Secuenciación: los resultados de secuenciación fueron positivos para los

clones A6 y A3 y las secuencias se encuentran depositadas en el Centro IFAPA “El

Toruño”. De hecho, en la secuencias del A6 se encuentra una zona codificante para la

proteína ribosómica MRPL5 por lo que este clon es ya útil para la elaboración del mapa

físico del lenguado. A partir de resultados preliminares de hibridación nuestros estudios

de puesta apunto se centraron en los clones A3 y A7 porque presentaban las mejores

condiciones de número de señales y repetibilidad. Posteriormente se amplió el estudio a

otros clones BAC que contenían los genes de la lisozima, Mx y del receptor de la

hormona tiroidea (TRB).

1.6.- Amplificación de familias multigénicas: se ha amplificado el gen ARNnp

U2 mediante el uso de cebadores diseñados a partir de una región muy conservada del

gen de varios organismos alejados filogenéticamente disponibles en el Genbank (Cross.

2005). La PCR se realizó en un volumen final de 50 µl, conteniendo 2 µl de ADN de la

extracción, 1.75 µl de dNTP (100mM), 1.5 µl de cada cebador (10 µM), 2U de la

enzima polimerasa Taq Long Template (Roche Molecular Biochemicals), 5 µl del

tampón apropiado para la enzima (10X). La reacción se llevó a cabo mediante 1 ciclo de

5 min a 94ºC, 35 ciclos de 45s a 94ºCm 45 s a 59ºC, 1 min 15 s. a 72ºC y una extensión

final de 10 min a 72ºC.

Los productos se visualizaron en un gel de agarosa al 1.5% (1X TBE) con bromuro

de etidio (50 μg/ml) tras una electroforesis de 45 min a 80V.

El ADNr 5S fue amplificado mediante PCR cuyo volumen final fue de 50 µl que

incluían: 2 µl de ADN de la extracción mediante Fastpreep, Buffer 10X, MgCl2 25mM,

dNTP 10mM, cebadores 10 µM, Taq polimerasa (Roche Molecular Biochemicals) 5U/


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µl. La reacción se llevó a cabo mediante 1 ciclo de 5 min a 94ºC, 35 ciclos de 45s a

94ºCm 45 s a 59ºC, 1 min. a 72ºC y una extensión final de 10 min a 72ºC.



2.- Técnicas citogenéticas

2.1.- Obtención de las preparaciones cromosómicas: el estudio citogenético se

ha realizado a partir de larvas de lenguado de la especie S. senegalensis obtenidas de las

instalaciones del IFAPA Centro “El Toruño”, con un tiempo de vida de un día desde su

eclosión. Una vez obtenidas, las larvas se transportan al laboratorio donde se les realiza

un tratamiento con colchicina (0.01% - 0.02%) durante 3 horas para detener la mitosis

en metafase. Tras este tiempo se someten a un choque hipotónico con KCl (0.4%)

durante 1 hora 30 min haciendo frecuentes lavados. Una vez lisadas las células, las

larvas se fijan con carnoy (etanol: ácido acéico, 3:1) durante 1h. 15 min. con cambios

cada 20 min, en fijador fresco. Las muestras finalmente se conservan a 4ºC.

Para elaborar las preparaciones se ha utilizado la técnica del esparcido en la cual 5 o

6 larvas son homogeneizadas suavemente con una micropipeta en 60 μl de ácido acético

45%, e inmediatamente depositadas desde cierta distancia, en diferentes gotas, sobre el

portaobjetos previamente calentado a 45ºC (Figura 9). Finalmente las preparaciones se

dejan secar y se deshidratan en diferentes pasos de 5 min. en etanol a concentraciones

crecientes 30, 50, 70, 90, 100%. Posteriormente se guardan a -80ºC hasta la aplicación

de la técnica de hibridación (Cross et al., 2006).


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Figura 9: Esquema del procedimiento para realizar preparaciones

cromosómicas de S. senegalensis.

2.2- Hibridación in situ de fluorescencia (FISH): El procedimiento de Hibridación

in situ de fluorescencia se basa en la unión específica de una sonda desnaturalizada a

aquella secuencia genómica que presente una perfecta, o casi perfecta

complementariedad con la misma. Posteriormente, la sonda puede detectarse mediante

la unión de anticuerpos marcados con un compuesto fluorescente a la biotina o la

digoxigenina. El protocolo se llevó a cabo según Shoguchi et al., (2004) con

modificaciones. A continuación se describen los diferentes pasos llevados a cabo para la

realización de las FISH.

2.2.1.- Marcaje de las sondas: se usaron dos técnicas según el tipo de sonda:

Nick Translation y PCR.

- Nick Translation: en este método una DNAsa I produce cortes al azar en el

DNA molde y posteriormente una DNA polimerasa I incorpora, además de dNTPs,

DIG-11-sUTP cada 20-25 posiciones en el DNA sintetizado. Para realizar este método

se usó el kit DIG BIO-Nick translation Mix (Roche Molecular Biochemicals) siguiendo

las instrucciones del fabricante. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final

de 20 μl, conteniendo 1 μg de DNA, 4 μl de la solución del kit (5X) y agua destilada.

Para precipitar la sonda, se añadieron Cot1-DNA humano (Cat: 15279 011 Invitrogen,

1mg/ ml), LiCl y etanol absoluto enfriado a -20ºC. Tras precipitar 2 horas a -80ºC se

recuperaron mediante centrifugación y tras un lavado con etanol 70% y secado al vacío

Colchicina

Choque hipotónico (1h 30 min)

Fijación (1h 15 min)

KCl 0.4% Carnoy

Aireación (2-3h)

Splash


- 36 -

se disolvieron en 20 μl de agua consiguiendo la sonda marcada lista para añadirle la

solución de hibridación cuyo proceso se explicará más adelante.

Las sondas marcadas con este método fueron: clones BAC lisozima, Mx, TRB y

ADNnp U2.

- PCR: este método fue usado con la sonda de ADNr 5S y consiste en la

utilización de nucleotidos modificados con moléculas, en nuestro caso biotina y

digoxigenina, que se fijan a la base de uno de los cuatro nucleótidos usados como

precursores en la síntesis de DNA. Los cebadores empleados para la obtención de la

sonda del ADNr 5S de lenguado senegalés fueron: (5’-

TACGCCCGATCTCGTCCGATC) y (5’- CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC) (Pendás

et al., 1994).

La PCR se realizó en un volumen final de 50 μl, conteniendo 2 μl de ADN

genómico de la extracción mediante FastPreep, MgCl2 25mM, 0.4 μM de cada cebador,

2U de la enzima polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals), el tampón 1X, 200

μM dATP , 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 150 μM dTTP y 50 μM de Biotina-16-

dUTP (Roche Molecular Biochemicals). La reacción se llevó a cabo mediante 1 ciclo de

5 min a 94ºC, 35 ciclos de 45s a 94ºCm 45 s a 59ºC, 1 min. a 72ºC y una extensión final

de 10 min a 72ºC.



2.2.2.- Preparación de la solución de hibridación: La solución de hibridación se

compone de dextran sulfato 10%, formamida desionizada 50%, SSC 2X, SDS 0.15% en

agua MiliQ estéril. Cada preparación cromosómica lleva 50 μl de la solución de

hibridación conteniendo de 100-200 ng de la sonda marcada.

2.2.3.- Pretratamiento de las preparaciones cromosómicas: Se realiza un primer

tratamiento con pepsina (0.005%) y HCl (10mM) durante 10 min. a 37ºC. Los portas se

lavan en PBS 1X en agitación 5 min. y se fijan con una solución de paraformaldehído

2% en 1X PBS (pH 7,3-7,4), durante 30 min a temperatura ambiente. Las preparaciones

se deshidratan en sucesivos pasos con etanol a concentraciones crecientes y se dejan

secar al aire.


- 37 -

2.2.4.- Hibridación: a cada porta se le añaden 50 μl de la disolución de

hibridación, se le coloca un cubre-objetos (24x60) y se lleva a una placa calefactora

durante 5 min. a 75ºC. Transcurrido ese tiempo se colocan los portas en una cámara

húmeda con formamida 50% y sellada, la cual es introducida en una estufa a 37ºC

donde se produce la hibridación toda la noche.

2.2.5.- Lavados post-hibridación: para los lavados post-hibridación se realiza en

primer lugar un baño de 5 min. en formamida al 50% y 0.1X SSC pH7 a 43ºC y 2

lavados de 5 min en SSS 2X.

Finalmente, para el bloqueo inmunológico, las preparaciones se incuban en

TNFM (SSC 4X, Tween 20 0.05% , 5% skin milk a 30ºC durante 30 min. y un posterior

baño de 5 min a la misma temperatura.

2.2.6.- Detección inmunocitoquímica simple:

1.- La sonda marcada con biotina se detecta mediante el uso de 3 anticuerpos. En un

primer paso se cubren las preparaciones el anticuerpo Avidin FITC (Fluoróforo verde,

Vector labs) disuelto en TNFM 42ºC (1:200) y se deja incubar durante 1 hora a 37ºC en

una cámara húmeda. A continuación se realizan tres lavados de 5 min. con TNFM

precalentado a 42ºC. En el siguiente paso se añade el segundo anticuerpo antisheep

Biotinylated anti-avidin D (Vector labs) disuelto en TNFM (1:100) y se incuba a 37ºC

durante 30 minutos en una cámara húmeda. A continuación se le añaden el tercer

anticuerpo Avidin FITC (Vector Labs) disuelto en TNFM (1:200) y se incuba a 37ºC

durante 1 hora. Transcurrido el tiempo se realizan 3 lavados de 5 min. en TNFM

seguidos de dos lavados de 5 min. con 4X SSC, 0.05% Tween 20. Finalmente se lava

con PBS 1X durante 5 min. Tras los lavados las preparaciones se deshidratan en etanol

70% y 100%. Una vez secas las preparaciones se tiñen con DAPI-Vectashield ó ioduro

de propidio-Vectashield (REP. H-1200) y se incuban en oscuridad durante 10 min.

2.- La sonda marcada con digoxigenina se detecta mediante el uso de dos

anticuerpos. El primer anticuerpo es Anti-Dig rodhamine Fab fragments (Roche) (señal

roja) disuelto en TNFM (1:200), se le añade el anticuerpo, se cubre con un cubreobjetos

y se incuba en una cámara húmeda a 37ºC durante 1 hora. Transcurrido ese tiempo se

realizan 3 lavados con TNFM precalentado a 42ºC. El siguiente anticuerpo es Texas Red


- 38 -

antisheep (Vector labs) (señal roja) disuelto en TNFM (1:100) y se vuelve a incubar en

una cámara húmeda a 27ºC durante 30 min. Una vez terminada la incubación del

segundo anticuerpo se realizan 3 lavados de 5 min. en TNFM precalentado a 42ºC

seguidos de dos lavados de 5 min con 4C SSC, 0.05% Tween 20 y un lavado final con

PBS 1X de 5 min. Tras los lavados las preparaciones se deshidratan en etanol 70% y

100%. Una vez secas las preparaciones se tiñen con DAPI-Vectashield (ATOM) y se

incuban en oscuridad durante 10 min.

2.3.- Hibridación in situ de fluorescencia doble: mediante esta técnica, se

puede visualizar la localización de dos secuencias de ADN simultáneamente. Esto

permite determinar si las secuencias analizadas están colocalizadas en un mismo

cromosoma y también observar la posición relativa de las secuencias estudiadas dentro

del complemento cromosómico del organismo estudiado. Los pasos de pretratamiento

de las preparaciones cromosómicas, hibridación y lavados post-hibridación se realizaron

igual que para la FISH simple.

2.3.1.- Preparación de la solución de hibridación:

La solución de hibridación se compone de dextran sulfato 10%, formamida

desionizada 50%, SSC 2X, SDS 0.15% en agua MiliQ estéril y filtrada. Cada

preparación cromosómica lleva 50 μl de la solución de hibridación conteniendo de 100-

200 ng de cada una de las sondas.

2.3.2.- Detección inmunocitoquímica doble:

En un primer paso se preparan los anticuerpos correspondientes Avidin FITC y

ANTI-DIG rhodamine Fab fragments (Roche), ambos disueltos en TNFM (1:200). A la

sonda marcada con biotina y digoxigenina se le añade el anticuerpo y se incuba en una

cámara húmeda a 37ºC durante 1 hora. Transcurrido ese tiempo se realizan 3 lavados

con TNFM precalentado a 42ºC. El segundo conjunto de anticuerpos son Texas Red

antisheep (Vector labs) para la digoxigenina y Biotinylated anti-avidin D (Vector labs)

para biotina, ambos disueltos en TNFM (1:100). Se le añaden estos anticuerpos y se

vuelve a incubar en una cámara húmeda a 27ºC durante 30 min. Una vez terminada la

incubación del segundo anticuerpo se realizan 3 lavados de 5 min. en TNFM

precalentado a 42ºC. A continuación se añade el tercer anticuerpo Avidin FITC (Vector


- 39 -

Labs) disuelto en TNFM (1:200) y se incuba a 37ºC durante 1 hora. Transcurrido el

tiempo se realizan 3 lavados de 5 min. en TNFM seguidos de dos lavados de 5 min. con

4X SSC, 0.05% Tween 20.

Finalmente se lava con PBS 1X durante 5 min. Tras los lavados las preparaciones se

deshidratan en etanol 70% y 100%. Una vez secas las preparaciones se tiñen con DAPI-

Vectashield y se incuban en oscuridad durante 10 min.

Esta técnica es muy sensible y puede permitir de manera clara y directa diferenciar

parejas cromosómicas mediante el uso de múltiples sondas. Esto es de gran utilidad en

la búsqueda de marcadores cromosómicos específicos de la especie.

- 40 -

VI.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tesis de Máster Resultados y Discusión

- 41 -

1.- Caracterización genética y localización cromosómica de clones BAC

procedentes de una genoteca de S. senegalensis

Este trabajo ha supuesto un punto de partida en la elaboración de un mapa físico

para el lenguado senegalés.

A pesar de la importancia económica de esta especie y de que comenzó a cultivarse

en acuicultura en la década de los 90, existe muy poca información sobre la localización

de genes de importancia en el cariotipo de dicha especie. Incluso, aún conociendo su

cariotipo (Vega et al., 2002), continúa siendo una tarea ardua distinguir sus

cromosomas, debido a su similitud en tamaño y morfología. Esto mismo también

sucede en otras especies de teleósteos como el pez cebra (Sola et al., 2001).

Mediante el uso de una genoteca BAC para S. senegalensis se ha obtenido un

protocolo de Hibridación in situ de fluorescencia para estos BACs (FISH-BAC) que ha

permitido localizar clones BAC anónimos en los cromosomas del lenguado.

Con el objetivo de caracterizar y localizar genes de interés para el cultivo en

acuicultura de la especie S. senegalensis se partió de una placa de clones BAC

procedente de la genoteca BAC proporcionada por las instalaciones del IFAPA “El

Toruño”.

A partir de esta placa que contiene 96 pocillos de clones BAC se realizó la selección

de dos clones al azar nombrados como A3 y A7. Estos dos clones BAC sirvieron para la

puesta a punto de la técnica de caracterización y localización en los cromosomas de S.

senegalensis mediante la técnica FISH.

La extracción de ADN-BAC se realizó con éxito para ambos clones (concentración

300-500 ng/μl). A continuación se digirieron con la enzima Eco RI y se cargaron en un

gel de agarosa para observar el patrón electroforético de los mismos. Se comprobó que

ambos poseen un patrón electroforético diferente y característico de cada uno de ellos

(Figuras 10 y 11).


- 42 -

1 2 3

Figura 10: Electroforesis mostrando la digestión con la enzima Eco RI del BAC

A3 de la genoteca de S. senegalensis. Calle 1 BAC tracker DNA ladder, calle 2 y

3 BAC A3 tras la digestión.

1 2 3

Figura 11: Electroforesis mostrando la digestión con la enzima Eco RI del

BAC A7 de la genoteca de S. senegalensis. Calle 1 BAC tracker DNA ladder,

calle 2 y 3 BAC A7 tras la digestión.

8 kb

8 kb

28 kb

28 kb


- 43 -

Para la realización de la FISH se llevaron a cabo diferentes pruebas hasta llegar a

obtener correctamente la puesta a punto de la técnica de hibridación.

El clon BAC A3 hibridó en una pareja cromosómica de pequeño tamaño en una

posición telomérica (Figura 12).

Figura 12: Localización cromosómica del clon A3 de la genoteca BAC de S.

senegalensis mediante FISH.

En cuanto a la localización del clon A7 en los cromosomas de S. senegalensis, se

observa una localización preferente en una pareja cromosómica de pequeño tamaño

(Figura 13). Sin embargo, en un porcentaje minoritario se han encontrado también

señales de hibridación en otra pareja adicional de cromosomas (Figura 14). Esto puede

ser debido a la presencia de regiones homólogas en dos parejas cromosómicas,

incluyendo la existencia de alguna secuencia repetida, que dé lugar a esta doble

hibridación en las placas analizadas.


- 44 -


senegalensis mediante FISH. A) sonda marcada con digoxigenina y detectada con

fluorocromos Rodamina y Texas Red (señal roja) y B) sonda marcada con biotina y

detectada con fluorocromo FITC (señal verde).


senegalensis mediante FISH mostrando señales de hibridación en 2 parejas

cromosómicas.

A B


- 45 -

Una vez obtenida con éxito la Hibridación in situ de fluorescencia simple se

realizaron las FISH dobles para observar si las localizaciones de los BAC analizados

coincidían en la misma pareja cromosómica.

Para llevar a cabo la visualización simultánea de dos sondas de ADN-BAC, se

combinan las fotos realizadas con los diferentes filtros para dar lugar a una imagen final

en la que se observen los cromosomas, la sonda A3 y la A7 tal y como se explica en la

figura 15.

Figura 15: Proceso de combinación de fotografías obtenidas con filtros azul, rojo y

verde (A, B y C) para obtener la foto final (D) con la localización simultánea de

dos sondas de BAC en S. senegalensis.

En cuanto a la localización simultánea de ambas sondas, se puede afirmar que

claramente no están localizadas en el mismo par cromosómico (Figura 16).

A B C D


- 46 -

Figura 16: Localización simultánea de dos sondas BAC en S. senegalensis. En

rojo se muestra la sonda marcada con digoxigenina (A7) y en verde la marcada con

biotina (A3).

Como se puede observar en la figura 16, la técnica es muy sensible y permite

detectar simultáneamente, sin señales inespecíficas ni ruido de fondo apreciable, dos

sondas BAC de la genoteca de S. senegalensis.


- 47 -

2.- Caracterización genética y localización cromosómica de genes de interés

involucrados en el sistema inmune de S. senegalensis: Lisozima y Mx.

Además de la importancia de localizar clones BAC anónimos en los cromosomas

para poder diferenciar unos cromosomas de otros, las instalaciones del IFAPA “El

Toruño” han realizado un rastreo en la genoteca BAC, localizando genes de interés para

la acuicultura de S. senegalensis, como por ejemplo genes involucrados en el sistema de

inmunidad innato Lisozima y Mx (Manchado et al., 2008 y 2009) y uno de los

Receptores de la Hormona Tiroidea involucrado en la metamorfosis del lenguado

senegalés (Manchado et al., 2010).

Los clones BAC conteniendo ambos genes fueron suministrados al laboratorio de

Genética de la Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales para proceder al estudio

citogenético y molecular.

La extracción de ADN-BAC para los clones Lisozima y Mx se realizó con éxito.

Seguidamente se procedió a su digestión con las enzimas Eco RI, Eco RV y Pci I, cuyo

patrón electroforético fue único y estable para cada uno de los clones digeridos con cada

una de las enzimas (Figura 17).

Para caracterizar los clones BAC se incluyó la técnica de electroforesis en campo

pulsante, la cual permite la visualización de bandas de gran tamaño en un gel de agarosa

(Figura 18)

Una vez llevada a cabo la técnica, se observó que no fue más resolutiva que la

electroforesis estándar en gel de agarosa, por lo que para la caracterización

electroforética de los clones BAC se eligió la técnica de electroforesis en gel de agarosa

al 1% previamente descrita.


- 48 -

1 2 3 4 1 2 3 4 5 6

Figura 17: Electroforesis en campo pulsante mostrando la digestión con enzima

(A) Pci I, calle 1: BAC Tracker DNA ladder; Calle 2: λ HindIII molecular

marker; Calle 3: BAC Lisozima digerido; Calle 4: BAC Mx digerido. (B) Eco

RV de dos genes contenidos en diferentes BACs de S. senegalensis. Calle 1:

BAC Tracker DNA ladder; calle 2: λ HindIII molecular marker; calle 3: BAC

Mx sin digerir; calle 4: BAC Lisozima sin digerir; calle 5: BAC Mx digerido;

calle 6: BAC Lisozima digerido.

A B

2027 pb

4361 pb

23130 pb 9416 pb

23130 pb

55 kb

9416 pb

4361 pb

2322 pb A B


- 49 -

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 18: Electroforesis estándar mostrando la digestión con enzima Eco RV de dos genes

contenidos en diferentes BAC de S. senegalensis. (A) Calle 1: Marcador de peso molecular

λ Hind III; Calle 2: BAC Lisozima digerido; Calle 3: BAC Lisozima sin digerir: Calle 4:

BAC Lisozima digerido. (B) Calle 1: Marcador de peso molecular λ Hind III; Calle 2: BAC

Lisozima digerido; Calle 3: BAC Lisozima sin digerir: Calle 4: BAC Lisozima digerido;

Calle 5: BAC Lisozima sin digerir; Calle 6: BAC Mx digerido; Calle 7: BAC Mx sin digerir;

Calle 8: BAC Mx digerido; Calle 9: BAC Mx sin digerir.

En cuanto a su localización, la técnica FISH nos mostró su localización relativa en

los cromosomas de S. senegalensis tal y como se muestran en la figura 19. La señal del

gen Lisozima se localiza en una posición subtelomérica en un par cromosómico de

pequeño tamaño mientras que la señal de hibridación del gen Mx se localiza en posición

intersticial en un par cromosómico de tamaño medio.

23130 pb

2322 pb

564 pb

23130 pb

6557 pb

4361 pb

2322 pb

564 pb A B


- 50 -

Figura 19: Localización cromosómica del clon BAC que contiene el gen Lisozima

(A) y Mx (B) en una genoteca BAC de S. senegalensis mediante FISH.

3.- Caracterización genética y localización cromosómica del gen TRB de S.

senegalensis.

Otro de los genes de interés en la acuicultura de S. senegalensis es el Receptor β de

la Hormona Tiroidea (TRB), involucrado en la regulación de la metamorfosis del

lenguado senegalés (Manchado et al. 2009).

Después de llevar a cabo un rastreo en la genoteca BAC de S. senegalensis se

localizó el gen en la placa 9, posición 8-E, (proporcionada por las instalaciones del

IFAPA “El Toruño”, y fue traído al Laboratorio de Genética de la Universidad de Cádiz

para su caracterización citogenética).

La extracción del ADN BAC que contenía el gen TRB se realizó con éxito al igual

que para los genes anteriormente descritos.

La localización cromosómica del clon BAC que contiene el gen TRB en los

cromosomas de S. senegalensis presentó una señal en 2 parejas cromosómicas. En una

pareja cromosómica la señal es más intensa y se localiza posiblemente en una posición

intersticial de una pareja cromosómica acrocéntrica y la otra señal presenta menor

intensidad y probablemente se localiza en posición centromérica de una pareja

cromosómica acrocéntrica (Figuras 20 A y B)

A B


- 51 -

Figura 20: Localización cromosómica del clon BAC que contiene el gen TRB en

S. senegalensis (color verde) y el gen Lisozima (color rojo) (A y B).

4.- Caracterización citogenética de familias multigénicas en S. senegalensis.

Para ampliar el estudio citogenético de la especie y para determinar la posible

colocalización de los clones BAC de interés con otros marcadores cromosómicos, se

han realizado también hibridaciones con genes pertenecientes a familias multigénicas: el

gen ARNnp U2 y ADNr 5S.

La amplificación del ADNr 5S en S. senegalensis (Figura 21) dio lugar a una banda

de mayor intensidad aprox. 200 pb. otra banda de menor intensidad de aprox. 441 pb y

una de mayor tamaño de aprox. 2100 pb que corresponden con las descritas por

Manchado et al. (2006).

A B


- 52 -

1 2 3

Figura 21: Amplificación del ADNr 5S de S. senegalensis. Calle 1: Marcador

XIV; calle 2: ADNr 5S S. senegalensis marcado mediante PCR con Biotina; calle

3: ADNr 5S de S. senegalensis sin marcar.

La familia multigénica del ARNnp U2 ha sido amplificada mediante el uso de los

cebadores descritos en material y métodos. En la figura 22 se puede observar un

producto de amplificación de aprox. 2000 pb que coincide con el tamaño esperado del

cluster del NTS de mayor tamaño del 5S que incluía el U2 descrito por Manchado et al.

(2006). 1 2 3

Figura 22: Amplificación del gen ARNnp U2 de S. senegalensis mediante el uso

de la enzima Taq polimerasa Long Template (Roche Molecular Biochemicals).

Calle 1: Marcador XIV; calle 2 y 3: gen ARNnp U2 S. senegalensis.

50 pb 100 pb 200 pb 400 pb

2000 pb

2642 pb

1000 pb

400 pb


- 53 -

La hibridación llevada a cabo para detectar la familia multigénica del ADNr 5S

(Figura 23) muestra cómo la señal de mayor tamaño se localiza en una posición

subcentromérica de un par cromosómico submetacéntrico y la señal menor aparece en

una posición centromérica de un par cromosómico acrocéntrico como había sido

descrito previamente (Manchado et al., 2006).

Figura 23: Localización cromosómica del ADNr 5S de S. senegalensis.

La hibridación llevada a cabo para la familia multigénica del ARNnp U2 (Figura 24)

muestra la existencia de dos señales de hibridación, una señal mayor localizada en una

pareja cromosómica en posición subcentromérica y una señal menor localizada en una

pareja cromosómica acrocéntrica en posición metacéntrica, tal y como sucede en el

ADNr 5S (Manchado et al., 2006).


- 54 -

Figura 24: Localización cromosómica del gen ARNnp U2 de S. senegalensis.


- 55 -

5.- Localización doble de los genes de interés procedentes de la genoteca BAC y

familias multigénicas en S. senegalensis.

La siguiente tabla (Tabla 2) muestra las combinaciones de sondas que se han llevado

a cabo durante la FISH-doble (la combinación Mx-ARNnp U2 no se ha llevado a cabo

ya que el resultado es el mismo que para la combinación Mx-ADNr 5S).

Tabla 2: Tabla que muestra sobre la diagonal la combinación de sondas (TRB, Mx,

Lisozima, ADNr 5S y gen ARNnp U2) en las hibridaciones in situ de

fluorescencia dobles realizadas para S. senegalensis.

Mx Lisozima TRB ADNr 5S ARNnpU2

Mx X X X --*

Lisozima X X X

TRB --* --*

ADNr 5S X

ARNnp U2 *-- No se ha llevado a cabo.

Los resultados de las hibridaciones dobles realizadas se pueden observar en las

figuras 25 y 26. En ninguno de los casos los genes hibridados mediante FISH-doble han

cólocalizado en un mismo cromosoma, exceptuando la hibridación de la familia

multigénica del ARNnp U2 la cual colocaliza con la familia del ADNr 5S en la misma

posición. Previamente se había descrito a nivel molecular la presencia de ambos genes

en una unidad de repetición del ADNr 5S, la cual fue localizada mediante FISH.

Nuestros resultados confirman la localización del gen ARNnp U2 en el espaciador de

mayor tamaño del ADNr 5S descrita por Manchado et al. (2006) y la ausencia de otras

localizaciones para este gen U2. Por tanto, finalmente se han localizado de manera

exacta 3 genes marcadores capaces de identificar 3 parejas cromosómicas en S.

senegalensis. Tres de estos genes son de especial interés ya que actúan en el sistema

inmunológico innato y de respuesta a patógenos en peces (Lisozima y Mx) y el tercero

en el proceso de metamorfosis (TRB). Estas localizaciones proporcionan un primer paso

en el desarrollo del mapa físico para esta especie.


- 56 -

Figura 25: Hibridaciones in situ de fluorescencia dobles realizadas con los BAC y

familias multigénicas estudiadas en S . senegalensis. Hibridación doble del clon

BAC Lisozima (señal verde) y la familia multigénica del ARNnp U2 (señal roja)

(A); hibridación doble de las familias multigénicas ADNr 5S (señal verde) y

ARNnp U2 (señal roja) (B); hibridación doble del clon BAC Mx (señal roja) y la

familia multigénica ADNr 5S (señal verde) (C); hibridación doble del clon BAC

Lisozima (señal roja) y familia multigénica ADNr 5S (señal verde) (D).

F


- 57 -

Figura 26: Hibridaciones in situ de fluorescencia dobles realizadas con los BAC y

familias multigénicas estudiadas en S. senegalensis. Hibridación doble clones BAC

Lisozima (señal verde) y Mx (señal roja) (E); hibridación doble clones BAC

Lisozima (señal roja) y TRB (señal verde) (F).

Hasta hoy día, sólo se han realizado trabajos relacionados con el mapeo físico

mediante BAC en vertebrados como caballos (Chowdhary et al., 2003) y humanos

(Shmitt et al., 1996), algunas especies de teleósteos como salmónidos, truchas y pez

cebra (Phillips et al., 2006; Freeman et al., 2007) e invertebrados como ascidias

(Shoguchi et al., 2004, 2007) y ostras (Wang et al., 2005).

La mayoría de estos trabajos han sido útiles para conocer el mapa físico de estas

especies y para ensamblar los mapas de ligamiento.

El estudio de BAC es muy importante en la localización de genes de interés y de

QTLs, por lo que es interesante continuar integrando los mapas genéticos con los mapas

citogenéticos para poder identificar todas estas regiones de interés. Tan sólo se han


- 58 -

realizado estudios de localización de genes de copia única en especies como rana

Xenopus (Courtet et al., 2000; Krylov et al., 2003) y algunos salmónidos (Phillips,

2001).

Conocer la posición de genes en los cromosomas facilita la construcción de mapas

de ligamiento. Este trabajo es una herramienta esencial para el conocimiento y estudio

del mapa genético de S. senegalensis.

- 59 -

VII.- CONCLUSIONES

Tesis de Máster Conclusiones

- 60 -

1.- Se ha desarrollado un protocolo para localizar en los cromosomas de Solea

senegalensis, mediante la técnica de Hibridación in situ de fluorescencia, clones de una

genoteca BAC (FISH-BAC).

2.- Se han localizado clones BAC que contienen genes de interés para el cultivo de

S. senegalensis, involucrados en el sistema inmune innato de dicha especie: Lisozima

localizado en una posición subtelomérica en un par cromosómico de pequeño tamaño y

Mx localizado en posición intersticial en un par cromosómico de tamaño medio.

3.- Se ha localizado mediante la técnica FISH-BAC el clon BAC que contiene el gen del

Receptor β de la hormona tiroidea (TRB). Este gen presenta señal en 2 parejas

cromosómicas de S. senegalensis.

4.- En paralelo se ha puesto a punto la técnica FISH doble que permite localizar parejas

de clones BAC simultáneamente o co-localizar estos clones con familias multigéncias

de S. senegalensis. Mediante esta técnica se ha observado que los genes Lisozima, Mx,

TRB, y la familia multigénica del ADNr 5S no se encuentran situados en el mismo

cromosoma. Por lo que con todos ellos se tendrían marcadores en 5-6 parejas de

cromosomas distintas de las 21 que componen el cariotipo de S. senegalensis.

- 61 -

VIII.- BIBLIOGRAFÍA

Tesis de Máster Bibliografía

- 62 -

Amemiya, C. T., and Gold, J. R. (1986). "Chromomycin A stains nucleolus organizer regions of fish chromosomes." Copeia: 226-331.

Anguis, V., Cañavate, J. P. (2005). "Spawning of captive Senegal sole (Solea senegalensis) under a naturally fluctuating temperature regime." Aquaculture 243: 133-145.

Arias, A. M. A., Darke, P. (1990). "Estados juveniles de la ictiofauna en los caños de las salinas de la Bahía de Cádiz." Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Cádiz.

Arjona, F. J., Vargas-Chacoff, L., Martín del Río, M. P., Flik, G., Mancera, J. M., Klaren, P. H. M. (2008). "The involvement of thyroid hormones and cortisol in the osmotic acclimation of Solea senegalensis." General and comparative endocrinology 155(3): 796-803.

Artieri, C. G., Mitchell, L. A. (2006). "Identification of the sex-determining locus of Atlantic salmon (Salmo salar) on chromosome 2." Cytogenetic and Genome Research 112: 152-159.

Ben-Tuvia, A. (1990). "A taxonomic reappraisal of the Atlanto-Mediterranean soles Solea solea, S. senegalensis and S. lascaris." Journal of Fish Biology 36: 947-960.

Bouza, C., Hermida, M., Pardo, B. G., Fernández, C., Fortes, G. G., Castro, J., Sánchez, L., Presa, P., Pérez, M., Sanjuán, A., de Carlos, A., Alvarez-Dios, J. A., Ezcurra, S., Cal, R. M., Piferrer, F., Martínez, P. (2007). "A microsatellite genetic map of the turbot (Scophthalmus maximus)." Genetics 1774: 2457-2467.

Brown, S. E., Severson, D. W., Smith, L. A., Knudson, D. L. (2001). "Integration of the Aedes aegypti mosquito genetic linkage and physical maps." Genetics 157(3): 1299-1305.

Caipang, C. M. A., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. (2004). "Possible role of Mx, an interferon-inducible gene, in antiviral response in teleosts." Marine Biotechnology 6: 475-479.

Cañavate, J. P. (2005). "Opciones del lenguado senegalés Solea senegalensis Kaup, 1858 para diversificar la acuicultura marina." Boletín Instituto Español de Oceanografía 21: 147-154.

Cañavate, J. P. F.-D., C. (1999). "Influence of co-feeding larvae with live and inert diets on weaning the sole Solea senegalensis into commercial dry feeds." Aquaculture 174: 255-263.

Courtet, M., Flajnik, M., Du Pasquier, L. (2001). "Major histocompatibility complex and immunoglobulin loci visualized by in situ hybridization on Xenopus chromosomes." Developmental & Comparative Immunology 25: 149-157.

Cross, I., Díaz, E., Sánchez, I., Rebordinos, L. (2005). "Molecular and cytogenetic characterization of Crassostrea angulata chromosomes." Aquaculture 247: 135-144.

Cross, I., Merlo, A., Manchado, M., Infante, C., Cañavate, J. P., Rebordinos, L. (2006). "Cytogenetic characterization of the Solea senegalensis (Teleostei: Pleuronectiformes, Soleidae); Ag-Nor, (GATA)n, (TTAGGG)n and ribosomal genes by one-color and two-color FISH." Genetica 128: 253-259.

Cunningham, J. P., Yu, B. M., Shenoy, K. V. (2006). "Optimal target placement for neural communication prostheses." Proc of the 28th Annual Intl Conf of the IEEE, New York: 2912-2915.

Cuñado, N., Sánchez-Morán, E., Barrios, J., Santos, J. L. (2001). "Searching for telomeric sequences in two Allium species." Genome Research 44: 640-643.


- 63 -

Chowdhary, B. P., Raudsepp, T., Kata, S. R., Glenda, G., Millon, L. V., Allan, V., Piumi, F., Guérin, G., Swinburne, J., Binns, M., Lear, T. L., Mickelson, J., Murray, J., Antczak, D. F., womack, J. E., Skow, L. C. (2003). "The First-Generation Whole-Genome Radiation Hybrid Map in the Horse Identifies Conserved Segments in Human and Mouse Genomes." Genome Research 13: 742-751.

Danzmann, R. G., Davidson, E. A., Ferguson, M. M., Gharbi, K., Hoyheim, B., Koop, B. F., Lien, S., Lubieniecki, K., Moghadam, K. H., Phillips, R. B. and Davidson, W. S. (2001). "Distribution of ancestral proto-Actinopterygian chromosome arms within the genomes of 4R-derivative salmonid fishes (Rainbow trout and Atlantic salmon)." BMC Genomics.

Darke, P., Arias, A.M. and Rodriguez, A. (1984). "Cultivo extensivo de peces marinos en los esteros de las salinas de San Fernando (Cádiz). II Características de la producción de peces." Inf. Tech. Insti. Inv. Pesq. 116: 1-23.

de la Herrán, R., Robles, F., Margínez-Espín, E., Lorente, J. A., Ruiz-Rejón, C., Garrido-Ramos, M. A & Rejón, M., (2004). "Genetic identification of western Mediterranean sturgeons and its implication for conservation." Conservation Genetics 5: 545-551.

De la Herrán, R., Robles, F., Navas, J. I., López-Flores, I., Herrera, M., Hachero, I., Ruiz-Rejón, C., Garrido-Ramos, M. A & Ruiz-Rejón, M., (2008). "The centromeric satellite of the wedge sole (Dicologoglossa cuneata, Pleuronectiformes) is composed mainly of a sequence motif conserved in other vertebrate centromeric DNAs." Cytogenetic and Genome Research 121: 271-276.

Demas, S. W., S. (1990). "DNA fingerprinting in reptiles: Bkm hybridization patterns in Crocodilia and Chelonia." Genome 34: 472-476.

Dinis, M. T. (1986). "Quatre Soleidae de l'Estuarie du tage. Reproduction et Croissance. Essai d'Elevage de Solea senegalensis Kaup 1858." These d'Etat es- Sciences Naturelles, Université de Bretagne Occidentale, Brest, Francia.

Dinis, M. T., Ribeiro, L., Soares, F., Sarasquete, C. (1999). "A review on the cultivation potential of Solea senegalensis in Spain and in Portugal." Aquaculture 176: 27-38.

Drabent, B., Kardalinou, E., Bode, C., Doenecke, D. (1995). "Association of histone H4 genes with the mammalian testis-specific H1t histone gene." DNA Cell Biology 14: 591-597.

Dunham, R. A., Majumdar, K., Hallerman, E., Bartley, D., Mair, G., Hulata, G., Liu, Z., Pongthana, N., Bakos, J., Penman, D., Gupta, M., Rothlisberg, P. & Hoerstgen-Schwark, G. (2001). "Review of the status of aquaculture genetics." 137-166.

Fernández-Trujillo, M. A., Porta, J., Manchado, M., Borrego, J. J., Alvarez, M. C., Béjar, J. (2008). "c-Lysozyme from Senegalese sole (Solea senegalensis): cDNA cloning and expression pattern." Fish & Shellfish Inmunology 25: 697-700.

Fontana, F., Lanfredi, M., Chicca, M., Congiu, L., Tagliavini, J., Rossi, R. (1999). "Fluorescent in situ hybridization with rDNA probes on chromosomes of Acipenser ruthenus and Acipenser naccarii (Osteichthyes Acipenseriformes)." Genome 42: 1008-1012.

Franch, R., Louro, B., Tsalavouta, M., Chatziplis, D., Tsigenopoulos, C. S., Sarropoulou, E., Antonello, J., Magoulas, A., Mylonas, C. C., Babbucci, M., Patarnello, T., Power, D. M., Kotoulas, G., Bargelloni, L. (2006). "A genetic linkage map of the hermaphrodite teleost fish Sparus aurata." Genetics 174: 851-861.


- 64 -

Freeman, J. L., Adeniyi, A. (2007). "Definition of the zebrafish genome using flow cytometry and cytogenetic mapping." BMC Medical Genetics 8: doi:10.1186/1471-2164-8-195.

García-López. A., A., V., Couto, E., Canario, A.V.M., Cañavate, J.P., Sarasquete, C., Martínez-Rodríguez, G. (2006a). "Non.invasive assessment of reproductive status and cycle of sex steroid levels in a captive wild broodstock of Senegalese sole S. senegalensis (Kaup)." Aquaculture 254: 583-593.

García-López. A., A., V., Couto, E., Canario, A.V.M., Sarasquete, C., Martínez-Rodríguez, G. (2007). "Ovarian development and plasma sex steroid levels in cultured female Senegalese sole Solea senegalensis." Comp. Biochemical Physiology A Mol Integr Physiol 146: 342-354.

García-López. A., F.-P., V., Couto, E., Canario, A. V. M., Sarasquete, C., Martínez-Rodríguez, G. (2006b). "Testicular development and plasma sex steroid levels in cultured male Senegalese sole Solea senegalensis Kaup." Gen Comp Endocrinol 147: 343-351.

García-Rosado, E., Alonso, M. C., Béjar, J., Manchado, M., Cano, I., Borrego, J. J. (2008). "Expression analysis of Mx protein and evaluation of its antiviral activity against sole aquabirnavirus in SAF-1 and TV-1 cell lines." Veterinary immunology and immunopathology 121: 123-129.

Gornung, E., Mannarelli, M. E., Rossi, A. R., Sola, L. (2004). "Chromosomal evolution in Mugilidae (Pisces, Mugiliformes): FISH mapping of the (TTAGGG)n telomeric repeat in the six Mediterranean mullets." Hereditas 140: 158-159.

Goucha, M. K., M. H. (1981). "Presence de Solea senegalensis Kaup, 1858 sur les cotes du Nord de la Tunisie." Rapp. Comm. Int. Mer Medit. 27: 131-133.

Hubert, S. H., D. (2004). "Linkage maps of microsatellite DNA markers for the Pacific oyser Crassostrea gigas." Genetics 168: 351-362.

Imsland, A. K., Foss, A., Conceicao, L. E. C., Dinis, M. T., Delbare, D., Schram, E., Kamstra, A., Rema, P., White, P. (2003). "A review of the culture potential of Solea solea and S. senegalensis." Review of Fish Biology and Fisheries 13: 379-407.

Isorna, E., El M'Rabet, A., Confente, F., Falcón, J., Muñoz-Cueto, J. A. (2009). "Cloning and expression of arylalkylmaine N-acetyltransferase-2 during early development and metamorphosis in the sole Solea senegalensis." General and comparative endocrinology 161(1): 97-102.

Isorna, E., Obregon, M. J., Calvo, R. M., Vázquez, R., Pendón, C., Falcón, J., Muñoz-Cueto, J. A. (2009). "Iodothyronine Deiodinases and Thyroid Hormone Receptors Regulation During Flatfish (Solea senegalensis) Metamorphosis." Journal of experimental zoology 312B: 231-246.

Iziga. R., P., M., Infante, C., Rebordinos, L., Cañavate, J. P., Manchado, M. (2010). "Molecular characterization and gene expression of thyrotropin-releasing hormone in Senegalese sole (Solea senegalensis)." Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 157: 167-174.

J., R. (1982). "Estudio de la edad y crecimiento del lenguado Solea solea." Inv. Pesq. 46: 275-286.

Jaillon, O., Aury, J. M., Brunet, F. (2004). "Genome duplication in the teleost fish Tetraodon nigroviridis reveals the early vertebrate proto-karyotype." Nature 431: 946-57.

Kai, T., Williams, D., Spradling, A. C. (2005). "The expression profile of purified Drosophila germline stem cells." Dev. Biol. 283(2): 486-502.


- 65 -

Katagiri, Y., Hirata, Y., Milbrandt, J., Guroff, G. (1997). "Differential regulation of the transcriptional activity of the orphan nuclear receptor NGFI-B by membrane depolarization and nerve growth factor." Biology Ghemistry 272: 31278-84.

Kimberley, K. W., Morris, C. A. (2006). "BAC-FISH refutes report of an 8p22-8p23. I inversion or duplication in 8 patients with Kabuki syndrome." BMC Medical Genetics 7: doi:10.1186/1471-2350-7-46.

Krylov, V., Tlapakova, T., Macha, J. (2007). "Localization of the single copy gene Mdh2 on Xenopus tropicalis chromosomes by FISH-TSA." Cytogenetic and Genome Research 116: 110-112.

Ktari, G. M. M. H. (1981). "Presence de Solea senegalensis Kaup, 1858 sur les cotes du Nord de la Tunisie." Rapp. Comm. Int. Mer Medit. 27: 191-199.

Lande, R. (1981). "The minimum number of genes contributing to quantitative variation between and within populations." Genetics 99: 541-553.

LaPatra, S. E., Batts, W. N., Overturf, K., Jones, G. R., Shwemaker, W. D., Winton, J. R. (2001). "Negligible risk associated with the movement of processed rainbow trout from an infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) endemic area." Fish Disease 24: 399-408.

LaPatra, S. E., Lauda, K. A., Jones, G. R. (1994). "Antigenic variants of infecious hematopoietic necrosis virus and implications for vaccine development." Dis. Aquat. Org 20: 119-126.

LaPatra, S. E., Turner, T., Lauda, K. A., Jones, G. R., and Walker, S. (1993). "Characterization of the humoral immune response of rainbow trout to infectious hematopoietic necrosis virus." Journal of Aquatic Animal Health 5: 165-171.

Legardere, J. P. (1978). "Feeding ecology and daily food consumption of common sole (Solea vulgaris Quensel) juveniles on the Frech Atlantic coast." Fish Biology 30: 91-104.

Magnadottir, B. (2005). "Innate immunity of fish (overview)." Fish & Shellfish Inmunology 20: 137-151.

Manchado, M., Infante, C., Asensio, E., Planas. J. V., Cañavate, J. P. (2008). "Thyroid hormones down.regulate thyrotropin β subunit and thyroglobulin during metamorphosis in the flatfish Senegalese sole (Solea senegalensis Kaup)." General and comparative endocrinology 155: 447-455.

Manchado, M., Infante, Rebordinos, L., Cañavate, J. P. (2009). "Molecular characterization, gene expression and transcriptional regulation of thyroid hormone receptors in Senegalese sole." General and Comparative Endocrinology 160: 139-147.

Manchado, M., Zuasti, E., Cross, I., Merlo, A., Infante, C., Rebordinos, L. (2006). "Molecular characterization and chromosomal mapping of the 5S rRNA gene in Solea senegalensis: a new linkage to the U1, U2, and U5 small nuclear RNA genes." Genome 49: 76-86.

Matsuda, M., Sato, T., Toyazaki, Y., Naghama, Y., Hamaguchi, S., Sakaizumi, M. (2003). "Oryzias curvinotus Has DMY, a Gene That Is Required for Male Development in the Medaka, O. latipes." Zoological Science 20(2): 159-161.

Merlo, A., Cross, I., Palazón, J. L., Sarasquete, C., Rebordinos, L. (2007). "Chromosomal mapping of the major and minor ribosomal genes, (GATA)n and (TTAGGG)n by one-color and double color- FISH in the toadfish Halobatrachus didactylus (Teleostei: Batrachoididae)." Genetica 131: 195-200.

Miyake, T., Amemiya, C. T., (2004). "BAC libraries and comparative genomics of aquatic chordate species." Comp. Biochemical Physiol. C Toxicol. Pharmacol 138(3): 233-244.


- 66 -

Nanda, I., Volff, J. N., Weis, S., Korting, C., Froschauer, A., Schmid, M., Schartl, M. (2000). "Amplification of a long terminal repeat-like element on the Y chromosome of the platyfish, Xiphophorus maculatus." Chromosoma 109: 173-180.

Osoegawa, K., Woon, P. Y., Zhao, B., Frengen, E., Zeng, C., Catanese, J. J., De Jong, P. J. (1998). "An improved approach for construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries." Genomics 52: 1-8.

Pendás, A. M., Morán, P., García-Vázquez, E. (1994). "Organization and chromosomal location of the major histone cluster in brown trout, Atlantic salmon and rainbow trout." Chromosoma 103: 147-152.

Zhang, P., Li, W., Fellers, J., Friebe, B., Gill, B., Li, W. (2004). "BAC-FISH in wheat identifies chromosomel andmarks consisting of different types of transposable elements." Chromosoma 112: 288-299.

Phillips, R. B. (2001). "Application of Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Fish Genetics and Genome Mapping." Marine Biotechnology 3: 145-152.

Phillips, R. B., and Ihssen, P. E., (1985). "Identification of sex chromosomes in lake trout (Salvelinus namaycush)." Cytogenetic Cell Genetica 39: 14-18.

Phillips, R. B., Nichols, K. M. (2006). "Assignment of Rainbow Trout Linkage Groups to Specific Chromosomes." Genetics 174: 1661-1670.

Phillips, R. B., Reed, K. M. (1996). "Application of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques to fish genetics: a review." Aquaculture 140: 197-216.

Ponce, M., Infante, C., Manchado, M., (2010). "Molecular characterization and gene expression of thyrotropin receptor (TSHR) and a truncated TSHR-like in Senegalese sole." General and comparative endocrinology 168: 431-439.

Power, D. M., Llewellyn, L., Faustino, M., Nowell, M. A., Bjornsson, B. T., Einarsdottir, I. E., Canario, A. V. and Sweeney, G. E., (2001). "Thyroid hormones in growth and development of fish." Comp. Biochemical Physiol. C Toxicol. Pharmacol 130: 447-459.

Quignard, J. P., Bourquard, C. & Shehata, S. (1986). "Note faunistique concernant les Soleidae du golfe du Lion (Pisces, Soleidae)." Vie Milieu 36: 141-143.

Ráb, P., Karakousis, Y., Rábová, M. & Economidis, P. S. (1996a). "Banded karyotype of cyprinid fish Leuciscus borysthenicus." Ichthyology Research 43: 463-468.

Ráb, P., Reed, K. M., Ponce de Leon, F. A. & Phillips, R. B. (1996b). "A new method for detecting nucleolus organizer regions in fish chromosomes using denaturation and propidium iodide staining." Biotechnology Histochemystry 71: 157-162.

Ramos, J. (1981). "Fisiología de la Reproducción y Biología del Lenguado, Solea solea (Pisces, Coleidae)." Tesis Doctoral Universidad Complutense de Madrid: 264.

Robles, F., De La Herrán, R., Ludwig, A., Ruiz Regón, C., Ruiz Regón, M., Garrido-Ramos, M. A. (2004). "Evolution of ancient satellite DNAs in sturgeon genomes." Genetica 338: 133-142.

Rodriguez, R. B. (1984). "Biología y cultivo de Solea senegalensis Kaup 1858 en el Golfo de Cádiz." Tesis, Universidad de Sevilla.

Rozman, T., Dovc, P. (2008). "Evidence for two transferrin loci in the Salmo trutta genome." Animal Genetics 39: 577-585.

Sarropoulou, E., Nousdili, D., Magoulas, A., Kotoulas, G. (2008). "Linking the Genomes of Nonmodel Teleosts Through Comparative Genomics." Marine Biotechnology 10: 227-233.

Schmitt, H., Kim, U.J., Slepak, T., Blin, N., Simon, M. I., Shizuya, H. (1996). "Framework for a Physical Map of the Human 22q13 Region Using Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)." Genomics 33: 9-20.


- 67 -

Schmitt, H., Ung-Jin, K. (1996). "Framework for a Physical Map of the Human 22q13 Region Using Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)." Genomics 33: 9-20.

Sekino, M. H., M. (2007). "Linkage maps for the Pacific abalone (Genus Haliotis) based on microsatellite DNA markers." Genetics 175: 945-58.

Shizuya, H., Birren, B., Kim, U. J. (1992). "Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector." Procedings National Academy of Science 89: 8794-8797.

Shoguchi, E., Ikuta, T. (2004). "Fluorescent in situ Hybridization to Ascidian Chromosomes." Zoological Science 21: 153-157.

Shoguchi, E., Kawashima, T. (2005). "Molecular Cytogenetic Characterization of Ciona intestinalies Chromosomes." Zoological Science 22: 511-516.

Shoguchi, E., Kawashima, T. (2007). "Chromosomal mapping of 170 BAC clones in the ascidian Ciona intestinalis." Genome Research 16: 297-303.

Sola, L., Gornung, E., Naoi, H., Gunji, R., Sato, C., Kawamura, K., Arai, R., Ueda, T. (2003). "FISH-mapping of 18S ribosomal RNA genes and telomeric sequences in the Japanese biterlings Rhodeus ocellatus kurianeus and Tanakia limbata (Pisces, Cyprinidae) reveals significant cytogenetic differences in morphologically similar karyotypes." Genetica 119: 99-106.

Subramanian, S., Mishra, R. K., Singh, L. (2003). "Genome-wide analysis of Bkm sequences (GATA repeats): predominant association with sex chromosomes and potential role in higher order chromatin organization and function." Bioinf Discov Note 19: 681-685.

Suzuki1, G., A. Ura, (2001). "BAC FISH analysis in Allium cepa." Genes and Genetic Systems 76: 251-255.

Tripputi, P., Emanuel, B. S., Croce, C. M., Green, L. G., Stein, G. S, Stein, J. L. (1986). "Human histone genes map to multiple chromosomes." Proc Natl Acad Sci USA 83: 3185-3188.

Úbeda- Manzanaro, M., Merlo, A., Palazón, J. L., Cross, I., Sarasquete. C., Rebordinos, L. (2010). "Chromosomal mapping of the major and minor ribosomal genes, (GATA)n and U2 snRNA gene by double-colour FISH in species of the Batrachoididae family." Genetica 138: 787-794.

Vega, L., Díaz, E., Cross, I., Rebordinos, L. (2002). "Caracterizaciones citogenética e isoenzimática del lenguado Solea senegalensis Kaup, 1858." Boletín Instituto Español de Oceanografía 18: 245-250.

Vituri, R., Catalano, E., Colomba, M. S., Montagnino, L., Pellerito, L. (1995). "Karyotype analysis of Aphanius fasciatus (Pisces Cyprinodontiformes): Ag-NORs and C-band polymorphism in four populations from Sicily." Biol Zent 114: 392-402.

Wang, L., Song, L., Zhang, H., Gao, Q., Guo, X., (2007). "Genetic linkage map of bay scallop, Agropecten irradians irradians (Lamarck 1819)." Aquaculture Research 38: 409-419.

Wang, W., Li, J., He, S. (2007). "Molecular evidence for the monophyly of East Asian groups of Cyprinidae (Teleostei: Cypriniformes) derived from the nuclear recombination activating gene 2 sequences." Molecular Phylogenetics and Evolution 2: 157-170.

Wang, Y., Xu, Z. (2005). "Characterization of Eastern Oyster (Crassostrea virginica Gmelin) Chromosomes by Fluorescence in situ Hybridization with Bacteriophage P1 Clones." Marine Biotechnology 7: 207-214.


- 68 -

Wang, Z. F., Tisovec, R., Debry, R. W., Frey, M. R., Matera, A. G., Marzluff, W. F. (1996). "Characterization of a 55-kb mouse histone gene cluster on chromosome 3." Genome Research 6: 702-714.

Zhang, L., Bao, Z., Wang, S., Huang, X, Hu, J., (2007). "Chromosome rearrangements in Pectinidae (Bivalvia: Pteriomorphia) implied based on chromosomal localization of histone H3 gene in four scallops." Genetica 130: 193-198.

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