INFORME ANUAL 1995

LINEA 7ACTIVACION Y REGUlACION DE lA RESPUESTA INMUNE

7.1 Papel del correceptor CD43 en la regulaci6n de las funciones de linfocitos T tanto desdeel punta de vista de 105 mecanismos de adhesi6n como de transmisi6n de sefialesde activaci6n celular

7.2 Estudio de las vfas de transmisi6n de sefial a traves de CD43. Analisis de 105 requerimientosestructurales de la molecula CD43 necesarios para la transmisi6n de sefiales de activaci6n

En Iinfocitos T, la especificidad antigenica esta de-terminada par el receptor para el antfgeno (TcR).La transmisi6n y amplificaci6n de las seiiales deactivaci6n intracelulares generadas par la interac-ci6n especffica del TcRcon su complejo IMHC-Agjesta a cargo del llamado complejo CD3. Ademasdel complejo TcR-CD3,las celulas T presentan ensu superficie una serie de moleculas llamadas mo-leculas accesorias 0 correceptoras involucradas enregular las fases de reconocimiento, activaci6n yefectos de los Iinfocitos T. La funci6n de dichasmoleculas puede ser la de estabilizar la interac-ci6n ffsica entre celula T y APC (adhesi6n) y/o la departicipar en los fen6menos de activaci6n y trans-misi6n de seiial hacia el interior de la celula efec-tora. Entre estas se encuentran CD2, CD4, CD8,CDlla! CDI8, CD45,VLA-4, VLA6 YCD43.

La molecula CD43, tambien conocida comogpL 115,sialoforina 0 leucosialina, se expresa enla superficie de todas las celulas hematopoyeti-cas, excepto en eritrocitos. Si bien la estructurade esta molecula se conoce relativamente bien,poco se sabe acerca de sus funciones en la su-perficie de las celulas linfoides. Sin ser la causaprimaria del padecimiento (el gene de CD43 seencuentra en el cromosoma 16). se ha descritoque los Iinfocitos T de los pacientes afectadoscon la inmunodeficiencia de Wiskott-Aldrich (aso-ciada al cromosoma X) carecen de CD43 en susuperficie celular, 0 bien expresan formas an6-malas de la molecula. La capacidad de respuestade las celulas T y B de estos individuos esta seve-ramente comprometida, por 10 cual, ademas de

una grave trombocitopenia, estos pacientes pre-sentan numerosas infecciones recurrentes.

PROGRAMA 7.1Papel del correceptor CD43 en la regulaci6nde las funciones de linfocitos T tanto desdeel punta de vista de 105 mecanismos de adhesi6ncomo de transmisi6n de sefiales de activaci6ncelular

7.1 .a Papel del correceptor CD43 en laregulaci6n de las interacciones celulares

Debido a su larga estructura cilfndrica (45 nm).es probable que CD43 ejerza un papel importanteen la regulaci6n de las interacciones adhesi-vas de los linfocitos con otras celulas. Hemos de-mostrado que CD43 puede interaccionar de unamanera especffica con CD54 (ICAM-I). aunquequeda por determinar si esta interacci6n regulala adhesi6n de linfocitos T con otras celulas, 0

bien si CD43 tiene, como es el caso de CD54, masde un contrarreceptor. Por medio de un analisis deestructura!funci6n se delinearan los requerimien-tos estructurales necesarios para que CD43 fun-cione como molecula de adhesi6n. Para ello seestan generando mutaciones a partir del cDNAde CD43 en la regi6n extracelular de la molecula.Cada mutante se expresara posteriormente en unhibridoma T murino, antfgeno-especffico, y su ca-pacidad de regular fen6menos de adhesi6n ce-lular con CD54 u otros ligandos sera evaluada.

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA

- Papel de C043 en la regulaci6n de los fen6-menos de adhesi6n intracelular: identificaci6nde nuevos ligandos; definici6n de dominios dela regi6n extracelular involucrados en dichafunci6n.

Y. ROSENSTEIN Y G. PEDRAZA

I994/P/S/DGFM

Oebido a que no existe un ligando activador deC043, y aunque hem os demostrado que C054(ICAM-l) es un ligando para C043, hemos busca-do otras alternativas para estudiar con mayordetalle las funciones correceptoras de C043. Paraello hemos reemplazado alligando activador poranticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos encontra de la molecula C043 y/o el TcR, y hemosentrecruzado estos reactivos en la superficie delinfocitos T. Esta metodologfa nos permiti6 lIegaralas siguientes conclusiones:

a) C043 es una molecula correceptora; es decir,que para transmitir senales de activaci6n re-quiere de las senales transmitidas por el TcR.

b) Para que C043 desempene sus funciones demolecula correceptora requiere de la integridadde su regi6n intracitoplasmica y ha de encon-trarse en el mismo complejo macromolecularque el TcR.

c) Porque se ha reportado que la expresi6n deC043 es anormal en pacientes con el sfndro-me de inmunodeficiencia de Wiskott-Aldrich,estudiamos las funciones correceptoras deC043 en linfocitos aislados de pacientes coneste sfndrome. No encontramos diferencia en-tre la capacidad de transmitir senal a traves deC043 en las celulas de los pacientes de Wis-kott-Aldrich, comparada con las celulas de in-dividuos normales. Por 10 que se puede con-cluir que la molecula C043 expresada porestos individuos es funcional, y que su inmu-nodeficiencia se debe a otra alteraci6n mo-lecular.

-C043, un correceptar de linfocitos TG. PEDRAZA, G. HOLLANDER, S. BURAKOFF E Y. ROSENSTEIN

I993/P/S/DGFM

PROGRAMA 7.2Estudio de las vfas de transmisi6n de sefiala traves de (D43

Simular la interacci6n de una molecula de super-ficie con su ligando reemplazando alligando parun anticuerpo especffico para la molecula de su-perficie, ha resultado ser una buena estrategiapara estudiar los mecanismos de transmisi6n desenal de diferentes moleculas

7.2.a Regulaci6n de la fosforilaci6nde protefnas intracelulares a travesde la activaci6n mediada por (D43

Los experimentos iniciales se han enfocado aevaluar la actividad de tirosina kinasa analizandolos substratos cuyos residuos de tirosina seanfosforilados a consecuencia de los procesos deactivaci6n medidos por C043.

Las celulas C043+ son estimuladas simulandola interacci6n de C043 y del complejo TcR-C03 consus respectivos ligandos por entrecruzamientode C043 y/o el TcR mediante anticuerpos mono-clonales. Los resultados preliminares sugierenque la estimulaci6n de los linfocitos T a traves dela molecula C043 modi fica [os patrones de ban-das fosforiladas, comparando con celulas con-trol, sin estimular 0 estimuladas a traves del TcR.Se proseguira a identificar los substratos quecontengan residuos de fosfotorosina despues dela activaci6n vfa C043.

-ldentificaci6n de las vfas de transmisi6n de se-nales de activaci6n a traves de C043

v IGRAS, G. PEDRAZA E Y. ROSENSTEIN

I994/l/S/DGFM/DFCI

INFORME ANUAL 1995

7.2.b Identificaci6n de dominios reguladoresdediferentes funciones en la regi6nintracitoplasmica de CD43

Con el objeto de definir regiones involucradas enregular las diferentes funciones de C043 (activa-ci6n celular, adhesi6n y cambios en la afinidad dela adhesi6n) se hara un analisis mutacional de la por-ci6n intracitoplasmica de esta molecula. Se dispo-ne de un sistema experimental que permite estu-diar la activaci6n de linfocitos T de una maneraC043-dependiente y C043-especffica. Las diferen-tes mutantes que se generen en la molecula se-ran analizadas en este modelo experimental tanto

en 10 que se refiere a la capacidad de mediar adhe-si6n con C054 u otros posibles ligandos, como ala capacidad de transmitir senales de activaci6n.

eRegulaci6n de la afinidad de C043 por su(s) li-gando(s): analisis estructura-funcion

Y. ROSENSTEIN Y G. PEDRAZA

I 994/IIDG FM

eAnalisis mutacional de la regi6n intracitoplasmi-ca de C043 estudio de las vIas de senalizaci6n

G. PEDRAZA, S. BURAKOFF E Y. ROSENSTEIN

I 994/S/DGFM/DFCI