levaduras - comparacion de la respiración y la fermentación

5/22/2018 Levaduras - Comparacion de La Respiraci n y La Fermentaci n

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARAFACULTAD DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS

BIOTECNOLOGA

PRACTICA 1. COMPARACION DE LA RESPIRACIN Y LAFERMENTACIN

OBJETIVO. El alumno analizar y distinguir el comportamiento de una levaduracuando su metabolismo se desarrolla bajo condiciones aerobias y bajo condicionesanaerobias, relacionando los resultados de la produccin de biomasa con la eficiencia encada proceso.

INTRODUCCION.Las levaduras son microorganismos eucariotes ubicuos encontrados en diversos

ambientes naturales. Esta capacidad de colonizacin est relacionada con su altaadaptabilidad fisiolgica. Las rutas metablicas entre diferentes especies de levaduras sonbsicamente idnticas, sugiriendo la conformacin de un grupo metablicamentehomogneo. Sin embargo, los mecanismos para la toma de nutrientes, el nmero dediferentes isoenzimas, y sobretodo la regulacin de fermentacin y respiracin difierensustancialmente.

En las levaduras, como otros organismos heterotrficos, el metabolismo de laenerga y el carbono estn ntimamente interconectados, es decir, el anabolismo estacoplado al catabolismo. El ATP provee la energa para toda clase de trabajo celular y esprovisto por la oxidacin de molculas orgnicas que tambin sirven como fuente decarbono para la biosntesis. En la naturaleza, las diferentes especies de levaduras utilizanun espectro de fuentes de carbono, tales como polioles, alcoholes, cidos orgnicos,aminocidos, pero prefieren los carbohidratos.

Enfocando la atencin sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae, es unmicroorganismo facultativo que emplea la respiracin aerobia al igual que lafermentacin alcohlica para metabolizar la glucosa como fuente de energa y decarbono. La glucosa inicialmente es transformada a travs de la gliclisis hasta laformacin de piruvato, el cual es un punto de ramificacin del flujo metablico,dependiendo de la presencia o no de oxgeno.

En la presente prctica, se tiene como objetivo que el alumno determina lacantidad de biomasa producida, la velocidad de consumo de glucosa y formacinevidente de metabolitos bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, para establecer ladiferencia del crecimiento de la levadura.

MATERIAL.Medio de extracto de maltaGlucosaAgua destiladaLevadura secaSolucin de azul de metileno 0.01%Solucin de DNS


Microscopio de campo claroMicroscopio de contraste de fasesHematocitmetroPipeta PasteurTubos de vidrio

EtanolBao maraTermmetro

METODOLOGIA.Medio de cultivo.1.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 500 mL con 50 mL de medio extracto de malta2.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio extracto de malta3.- Preparacin del medio extracto de malta: pese 35 g de extracto de malta, 20 g deglucosa, disolver el extracto de malta y la glucosa en 1 L de agua destilada.

4.- Esterilizar en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada4.- Colocar el medio en los matraces y esterilizar por calor.

Suspensin de levadura.1.- Pesar 0.5 g de levadura seca y adicionar a 10 mL de agua destilada en un tubo deensaye, mezclar hasta obtener una suspensin uniforme.2.- Realizar conteo en cmara de Neubauer3.- Anotar la cuenta de levaduras y calcular el nmero de clulas por mL.

Incubacin.1.- Tome uno de los matraces y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete

como fermentacin y coloque en una incubadora a 30C.2.- Tome el segundo matraz y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete comorespiracin y coloque en una agitadora a 30C y 200 rpm.3.- Realice observaciones en 1 hora, 12 horas y 24 horas. Tome muestre en cada matraz ygurdelos en refrigeracin.4.- Determine el nmero de levaduras para cada muestra.5.- Determine la cantidad de glucosa en cada muestra.

Conteo de levaduras.A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno yhomogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en el hematocitmetro y

realice el conteo al microscopio. En el apndice 1 encontrar informacin acerca del usodel hematocitmetro o de la cmara de Neubauer.1. Verifique que el microscopio est alineado, y en su caso haga la correccin necesaria.2. El conteo se realiza en 5 cuadros grandes, considerando que estos formen una cruz.3. Realice el clculo del nmero de clulas/mL.


Determinacin de glucosa.La determinacin de glucosa se realiza utilizando el mtodo del DNS (apndice 2).1) Diluir la muestra, calculando que la concentracin de glucosa se encuentre en el rangode 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilucin.2) Tomar un alcuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso

3) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos5) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con elblanco.7) Interpolar lectura en la curva patrn para determinar la concentracin de glucosa.

CUESTIONARIO1.- Cul es el papel del azul de metileno en la tincin de levaduras?2.- Qu es fermentacin desde el punto de vista bioqumico?

3.- Cuntas y cules son formas de reproduccin tiene Saccharomyces cerevisiae?4.- Explique cmo se coloca la muestra para el conteo en la cmara de Neubauer5.- Qu es respiracin celular?6.- Dnde se obtiene mayor biomasa, en la respiracin o en la fermentacin? Expliquepor qu7.- La tcnica del DNS es til para cuantificar sacarosa, por qu8.- Qu es la gluclisis?9.- Qu es el catabolismo?10.- Durante los experimentos que desarroll, Saccharomyces cerevisiaerealizanabolismo, explique.

REPORTE.Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la prctica, objetivo, introduccinbreve, metodologa, resultados, discusin, conclusin, bibliografa. Como gua puedeutilizar el formato de cualquier artculo cientfico.


APENDICE 1. CUANTIFICACION DE LEVADURASOBJETIVO. El alumno cuantificar levaduras mediante la tcnica de conteo directo almicroscopio.

CONTEO EN CMARA DE NEUBAUER.

La cmara de Neubauer es una cmara de conteo que se utiliza para determinar elnmero de clulas.

Figura 1. Cmara de Neubauer.

Para utilizar la cmara de Neubauer realice el siguiente procedimiento: Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, esta debe quedarcentrada. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucinde las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con una jeringa yaque la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro dellenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara esde lquido abundante en las terminaciones del recuadro.

Para el conteo: Lleve la cmara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo conel ocular de 4X. Al hacerlo observar en el campo una imagen parecida a la figura 2.

Figura 2. Cmara de Neubauer en 4X

Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias, etc.,ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizar de la siguientemanera:



En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulaspresentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central,lo que garantiza un conteo aleatorio.

Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de loscampos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar entodos los cuadros. El conteo en estos campos de la cmara de conoce como AP (altopoder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:


Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar elconteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas dos veces o no que no

se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lneas que delimitan elcuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales clulasson contables o cuales estn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan lasegunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen.Grficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las clulas que tiene una Xson las que no se deben contar.

Figura 5. Conteo en cmara de Neubauer.


Despus de contar las clulas se procede a calcular el nmero de clulas por unidad devolumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio ocupado por el lquido enel que estn las clulas que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cmaray la laminilla de cuarzo. La cmara de Neubauer tiene las siguientes dimensiones, y suprofundidad es de 0.1 mm.

Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las clulas uotras partculas no se sobrepongan, y deben estar uniformemente distribuidas. Paraclulas pequeas se recomienda contar cuatro esquinas 1/25 mm2y el cuadro del centro.Por ejemplo, si se cuentan 187 clulas en los cinco cuadros descritos. Cada cuadro tieneun rea de 1/25 mm2, y 0.1 mm de profundidad. El volumen total en cada cuadro es de(0.04x0.1 = 0.004) 0.004 mm3. Si se contaron 5 cuadros, entonces se tiene un volumen de0.02 mm3. Por lo tanto, se tienen 187 clulas en 0.02 mm3, que equivale a 9350clulas/mm3. Hay 1000 mm3en 1 cm3, por lo que la cuenta es de 9 350 000 cluals/mL.

Para fines prcticos, si se cuentan 5 cuadros como los indicados anteriormente:

Clulas/mL = Total de clulas contadas * 50000

Para determinar el nmero de clulas en la muestra original hay que multiplicarpor la dilucin.

METODOLOGIA.A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno yhomogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en la cmara de Neubauery realice el conteo al microscopio.


APENDICE 2. DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES POR DNSOBJETIVO: Determinar el contenido de azcares reductores en mosto fermentadomediante el uso del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) mediante espectroscopia visible.

INTRODUCCION

El mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) se basa en la reduccin del DNS(de color amarillo) al reaccionar con un azcar reductor para formar cido 3-amino-5-nitrosaliclico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de laabsorbancia en la zona de 540-570 nm.

MATERIALES.DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico)FenolSulfito de sdioHidrxido de sodioAgua destilada2 Vasos de precipitado de 600 mL

1 Matraz aforado de 100 mL1 Matraz aforado de 1 LTubos de ensayeEspectrofotmetroPipetas volumtricas de 1 mLPipeta volumtrica de 2 mLPipeta volumtrica de 5 mL

PROCEDIMIENTO.Preparacin de la solucin de DNS.1) Pesar 1 g de hidrxido de sodio y disolverlo en 70 mL de agua destilada en un matraz

Erlenmeyer con agitacin. CUIDADO EL HIDRXIDO DE SODIO IRRITA LA PIEL.2) Pesar 1 g de DNS y adicionar por porciones a la solucin de hidrxido de sodio conagitacin, para lograr una disolucin rpida y completa.3) Esperar a que la solucin se enfri a temperatura ambiente4) Pesar 0.2 g de fenol y adicionar a la solucin anterior con agitacin.5) Pesar 0.05 g de sulfito de sodio y adicionar a la solucin anterior con agitacin.6) Una vez que todo este bien disuelto y mezclado, transferir cuantitativamente a unmatraz aforado de 100 mL y aforar con agua destilada. Homogeneizar la solucin.


7) Guardar la solucin en un frasco mbar para proteger de la luz.

Preparacin de curva patrn.1) Preparar una solucin estndar de 1 mg/mL de glucosa2) Preparar una serie de tubos con las cantidades indicadas en el cuadro siguiente:

TuboNmero

Concentracin Glucosa(mg/mL)

mL deSolucinEstndar

mL deagua

destilada1 0 0 12 0.1 0.1 0.93 0.2 0.2 0.84 0.3 0.3 0.75 0.4 0.4 0.66 0.5 0.5 0.57 0.6 0.6 0.4

8 0.7 0.7 0.39 0.8 0.8 0.210 0.9 0.9 0.111 1.0 1.0 0

3) Tomar una alcuota de 0.5 mL de la solucin de glucosa para cada dilucin4) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar5) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos6) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar7) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con elblanco.

Preparacin de muestras.1) Diluir la muestra si el contenido de azcares reductores es mayor a 1 mg/mL, para quese encuentre en el rango de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilucin.2) Tomar un alcuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso3) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos5) Aforar a 10 ml adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con elblanco.

Clculos1) Con las lecturas de la curva patrn hacer una regresin lineal de concentracin deglucosa contra absorbancia y calcular la ecuacin de regresin lineal correspondiente.2) Sustituir el valor de absorbancia de la muestra en la ecuacin de regresin y calcular laconcentracin de azcares reductores expresados como glucosa. Al dato obtenidomultiplicarlo por la dilucin.

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