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JI¡u
UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
DEPARTAMENTODE MICROBIOLOGÍA
FACULTAD DE MEDICINA
Tesis Doctoral
¿/lEIf/IhllhhIUuIIIu/u/mn~¡ni309558549
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS ANTIMICROBIANOS
SOBRE LAS
INTERACCIONES FAGOCITOS-NICROORGANISMOS.
Ricardo Ñique
9 0 2’ ~
¿(ji.!
Garci a
1993
PROF. U. PRIETO
DEPARTAMENTO DE MICROSIOLOCIAFACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
2804D MADRID
JOSE PRIETO PRIETO CATEDRATICODEL DEPARTAMENTODE MICROBIOLOGIA
DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE
MADRID:
INFORMO~ Que el presente trabajo de investigación,
titulado: “Estudio del efecto de los anti—
microbianos sobre las interacciones fagocitos—
microorganismos11 constituye la memoria presentada
por Ricardo Ñique Sarcia para aspirar al Titulo
de Doctor en Biologia, y ha sido realizado
integramente en los laboratorios de este
departamento bajo mi dirección.
Y para que conste, expido y firmo el
presente en Madrid, Octubre de mil novecientos
noventa y tres.
Fdo.: ¿1. Prieto Prieto
A mi familia
INDICE
AGRADECIMIENTOS. 1
ABREVIATURAS. 2
JUSTIFICACION. 3
1.- INTRODUCCION. 6
1.— Introducción al sistema inniunitario. 6
2.- Macrófagos y leucocitos polimorfonucleares. 8
2.1.- Origen y desarrollo. 8
2,2.- Caracteristicas funcionales. 11
3.— Características de los microorganismos elegidos. 25
3.1.- Escherichia coli. 25
3.2.— Staphylococcus aureus. 30
3.3.- Candida albicans. 33
4.— Efecto de los antlniicroblanos sobre las célulasfagocíticas. 37
5.— Caracteristicas de los antimicrobianos elegidos. 45
5.1.- Cefotaxima. 45
5.2.- Netilmicina. 47
5.3.- Fluconazol. 51
2.- OBJETIVOS. 55
3.- MATERIALES y MÉTODOS. 58
3.1.— MaterIal. 59
3.2.— Metodología. 66
3.2.1.- Efecto directo de los AM sobre las funciones
implicadas en los mecanismos microbicidas
de los MPM. 66
3.2.1.1.- Concentraciones de los antibióticosestudiados. 66
3.2.1.2.- Obtención y recuento de los MPM. 66
3.2.1.3.- Adherencia, 68
3.2.1.4.- Estudio de la mov4Iidad del MPM. 69
3.2.1.5.- Adhesión y fagocitosis. 72
3.2.2.- Efecto indirecto de los AM actuando sobrela susceptibilidad de E. col], 5. aureus
y C. albicans frente a los mecanismos
microbicidas de los PMN. 75
3.2.2.1.- Microorganismos y antimicrobianos. 753.2.2.2.- Ajuste de los microorganismos por
densidad óptica. 753.2.2.3.- Obtención y recuento de los PMN. 763.2.2.4.- Estudio del efecto con bacterias. 793.2.2.5.- Estudio del efecto con c&ndidas, 84
3.2.3.— Análisis estad{stico. 87
4.- RESULTADOS, TABLAS Y GRAFICAS 88
4.1.- Resultados obtenidos. 894.2.- Tablas. 964.3.- Gráficas. 118
5.— DISCUSIÓN. 151
6.— CONCLUSIONES. 176
7.- BIBLIOGRAFIA. 119
—1—
AGRADECIMIENTOS
Al Prof. José Prieto Prieto. Catedrático del Dpto. de Micro-
biología, por su eficaz dirección, así corno por su constante estimulo
para poder llevar a cabo la realización de la presente memoria.
Al Prof. Fernando Minguez, por su ayuda, comprensión y amistad,
durante la realización del mismo.
Al Prof. Ramón Hernandez Verduzca, por haberme iniciado en
la investigación científica.
A Fernando Gaviria, por su valiosa aportación en el desarrollo
y puesta a punto cte las tecnicas empleadas.
A Mario, compañero de fatigas durante tantas horas de trabajo
en común, alegrías y discusiones.
A Ana, por su ayuda en la redacción y mecanografiado de esta
memoria.
Al Prof. Eduardo De Miguel, por su ayuda desinteresada en
el el análisis estadístico de los resultados.
A Quique y en general a todos los miembros del departamentopor su colaboración e interés.
2
ABREVIATURAS
Ac. Anticuerpo.
Antigeno
Antimí crob
Concentrac
Célula preConcentrac
el 50% deFactor est
Receptor pDensidad 6
Efecto bac
tratami entSolución f
Indice de
ínter leuki
Inmunogí ob
Macró fag osMedio nutr
Leucocitos
Proteínas
tori a.
geno.o que
1 onin 3b del
i ano.lón rriinima inhibi
sentadora de antilón de antifúngic
crecimiento.imulante de coara la fracció
pticatericida de lo
o antibiótico
isiológica deadherenci a.
na 1.ulina.
peritoneales murinos.itivo para bacterias;
polimorfonucleares.
de unión de la penicilina.
inhibe
comp] enento.
s PMN debido al
de las bacterias.
HanIC s
MUel 1 er. Hi nton
fosfato.
del creoPBS. TampónR.C. Retraso
al AM.T—S. Medio nutritivo
UFC. Unidades formado
YNB. Medio nutritivo
base medium.
imiento bacteriano debido
para bacterias
ras de colónias.
para hongos; Yeast
Triptona.Soia.
Ni trogen
%Tc• Porcentaje de transmitancia de la suspensión
control
Ag.
AM.
CMI.
CPA.GIS0.
CFS.
C3bR.D.0.
E.B.
HBSS.
I.A.
IL—l
Ig.
MPM.
M-H.
PMN.
Pepa
-3-
.JUSTIFICACI0N
La evolución de las
depende esencialmente tanto de 1
fagocíticas para ingerir y
como de la aplicación de unaEsto hace que sea necesario e
que se establecen entre
fagocíticas y antimicrobianos
han dirigido, fundamentalmente,
con un espectro de acción cada
la posible aparición de resi
Sin embargo ultimamente existe
enfermedades infecciosas
a eficacia de las células
destruir microorganismos
antibioterapia adecuada.onocer las interacciones
microorganismos, células<1). Los esfuerzos se
a desarrollar fármacos
vez mayor y a controlarstencias a los mismos.
un creciente Interés
por el estud
y sus inipliolo de las
aciones cli
interacciones
nicas <2).
fagocito—antibiótico
Los antibióticos pue
leucocito-microbio de var
conocido son las neutropenel fagocito puede provee
microorganismos frente apodido comprobar como al
incapacesde penetrar en
eficaci a.
den
las
lasr
gun
la
i nterferformas
inducidde una
antimicros de
célul a
ir en
, el
as. Po
protecobi ano,
estos
perdi e
la relaciónefecto más
r otro lado,clón a los
asi se haagentes son
ndo así su
Pueden también interferir directamente con las
células fagociticas modificando su capacidad de quimio-
taxis e ingestión, por dítimo los antibióticos a ciertasconcentraciones pueden modificar la superficie del
microorganismo estimulando secundariamente la capacidad
funcional de los leucocitos.
-4—
Salvo la aparic
citosis, comprobada en
de determinados
han estudiado fuel alcance de su
anti b
nd ament
si gni f
ión de
reí ac
1 óti cos
almente
icado ni
neutropeni a
ión con la
los otrIIvi t r oin
su repercu
os
ysi 6
o agranulo—administración
efectos se
no se conoce
n clínica.
Sin embargo,
y hoy en dia sede las interaccy microorganismosen ellas modifica
microbiana.
estos
puede
iones
como
rán la
hechosadel ant
entrede lo
aplica
no pueden ser ign
ar que el estudio
fagocitos, antibi
s mecanismos impl
ción de la terapia
Estos estudios
si consideramos quecomprometidos es d
infecciones oportu
En estos casos lo
que a la vez que actfacilitaran la labor
de la etapa previa
inmune espec=fica
en la capacidad b
neutrófi los.
pueden cobrar una
el efecto sobreeterrninante a la
nistas, micóticas
ideal seria poder utuaran sobre el microor
del macrófago como cé
al desencadenami ento(presentación de antfg
actericida de los PO
mayor importanciaenfermos inmuno-
hora de adquirir
y bacterianas.
Mizar fármacos
ganismo patógenolula responsable
de la respuestaenos) así como
limorfonucleares
Por todo
para realizar
antifúngico de
ello creemos estar en un buen momento
este estudio con das antibióticos y un
gran uso clinico.
orados
tantoáticos
i cadosantí -
-5—
1.- INTRODUCCIÓN
6-
1.- INTRODUCCIÓN AL SISTEMA IN!4UNITARIO
Nuestro medio entde agentes microbianoshongos y parásitos.de forma incontrolada
orno contienecomo son los
Todos ellos sidentro del hues
una gran dive
virus, bactse multipí
ped podrían
a provocarno rm.a 1 esduración1 nmuni tan
su muertla granlimitada.o combate
e, peromayori a
Estoestos a
en la
de 1
se deb
gentes
real i dadas infecce a queInfeccioSos.
en md
iones
el
Se conocen dos tipos de inmunidad:
pr] mera
* Inmunidad
línea debarreras fisiy el sistema
las diferentes
Innata
defensa.
co—qu¶mi cas
reticul oclases de
(inespe
Aqul sede las
endotel i
células
c=flcinc
superfi cial <SRE)fagociti cas.
es ccompu
* Inmuní
tras la intera
extraño y el
memoria inmiinol
marcha. Es porinmunitario las
rizan: especificno propio.
dad
cci 6 npropioógi ca
tanttresdad,
adaptatí va
entre elsistema
para el ao la que
propí edadesmemoria y
<espec¶fica>
agente reconoc
nmune, generangente que la
confiere al
que mejor ladiscriminación
Aparece
ido comodose una
puso ensistema
caracte-propio
El sistema
clases celulproceden de
lfneas princí
i nmuneares
cél ulpales
comprende un conjuntointerrelacionadas entreas pluripotenciales ade diferenciación.
heterogéneo
si (3),
través de
rsi dad
en asi caranllegar
ivi
sonsi st
duosde
ema
a). Actua
luyen todas
comolas
ral espor
orpo
esto
deque
dos
-7—
- La línea linfoide, que dará lugar a los linfocitoS~
- La linea mieloide, origen de las células fago-
citicas
Las células fagociticas se subdividen
clases básicas: los monocitos, que al pasar
tejidos se transforman en macrófagos, y los
polimorfonucleares, que pueden agruparse enbasófilos y eosinófilos, según la tinciónde sus gránulos.
en das
& losgranial ocitosneutrófi los,histológica
Todos ellos
hacia el lugar de lade concentración detaxis>, y una vezunirse a él, englobar
poseen la
infí amaciónsustanciasallí, reclo y destr
capacidad de dirigirse
atraídos por un gradí entequimí oatrayentes <qUltiii O-
onocer al agente causal,
uirl o.
-8-
2.- MACRÓFAGOsY LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES
.
2.1.- ORIGEN Y DESARROLLO.
Hace aproximadamente un siglo, Metchnikoff (4>observó que los leucocitos ingerian partículas y queesta propiedad era indispensable para la defensa del
organismo humano frente a ciertas einfermedades, desde
entonces, los progresos en el conocimiento de las célulascon capacidad de fagocitosis (fagocitos) se han sucedido
de forma ininterrumpida, merced al estudio tanto delos fagocitos normales como de aquellos que presentanalteraciones funcionales.
Los granulocitos neutrófilos, junto
citos y macrófagos hísticos constituyen1guardlanes’ móviles del organismo contrabacteriana, circunstancia que ha motivadodefagocitos profesionales”, a diferencia
citos, plaquetas y hematies que carecen
fagocítica.
con los mono—os verdaderos
la infeccióna denominación
de los linfo-de capacidad
Tanto los leucocitos polimorfonucleares (Pcomo los macrófagos proceden de las mismas célu
primitivas de la médula ósea, así estas célulasdiferenciaran en monoblastos y mieloblastos (ng. 1los monoblastos exhiben escasa avidez por las superficí
vitreas, son escasamente fagoci’ticas y su movilides lenta. En una fase posterior del desarrollo, céluldefinidas como promonocitos presentan adherencia
vidrio. Su tamaño es relativamente grande (de 10
20 micras de diámetro>, su cociente citoplasma-nifcl
MN>
lasse
es
ad
as
al
aeo
-9-
e
MAcROFAGO DE LOS TEJIDOS
Desarrollo de los fagocitos ¡nononticleares.
Origen y desarrollo de los macrófagos y neutrófilos
MIELOB LASTO
PROMIELOCITOBASOF [LO
Desarrollo de los granulocitos.
FAGOOCtIOA(MEDULA ÓSEA)
FNOMONOCITO(MÉDULA OSEA)
MONOCITO(SANGRE)
Figura 1. (tomada
de Alexander y Good, 1980).
lo -
es alto
aparatoy prelisoendocitos
paso denucleares decon un nUcse tiñe de
aparato de gdistribuidas
y poseende golgi
somas. Estais pero radesarrollo
citoplasnia basófilo.
desarrollado, granul
s células parecen caparamente la fagocitosis
son los monocitos,
tamaño (de 10 a
escotado
con el
gran
leo central
azul grisác
olgi despor el
arro
ciciticas y de una vidalos monocitos originany cavidad peritoneal), my contienen uno o máscorpúsculos de inclusióngran tamaño.
Los macrófagoslargo tiempo, hasta
eo
llado ytopí asma,
media delos macr
iden de 2
núcleos
micras
un ciorante
Presentan un
os azurófilos
ces de ejercerEl siguiente
células mono—18 de diámetro>
y toplasma que
col de Nright,
mitocondrias uniformemente
son activamente fago-
tres dias. Por últimoófagos tisulares (higado
O a 80 micras de diámetro
vesiculares y numerososo granulos citoplasmicos de
tisulares parecen cap
varios años, pudien
aces de vivirdo replicarse
o permanecer latentes (5>.
En la otpuede dar lugar
eosinófilos y
uno de ellosgranulocitos,basófilos. Elnormalmente so
mielobí astosuna gran acumu
plasma basófilaqui un granpromi nentes
ra ramaa promi
de diferenciación
elocitos neutrófilos
promielocitos basóf
se diferenciará ena saber, neutréfidesarrollo de las
lo tiene lugar en
originan el promilación de granuo, al igual quenúcleo ovalado
tambi!n presenta
líos <Fiformas
los, eosen es
la médulelocito q
los azurófen el miecon uno
un aparat
el mieloblaspramielocitg. 1), cadistintassi nófí los
neutróf 1
a ~sea,ue pres
ilos en
lobí asta,o más nu
o de galgí
toosdade
y
5
a
1 as
loent
su cito—
exí stencl eol os
desa-rrollado y un retículo granular extenso con polirribosomas
— 11 —
libres, con
el cociente
se reduce elde golgi se amaduras del(generalmente
(cayados) (6>.
la maduración desaparecen los
núcleo-citoplasma se reduce a 1
tamaño celular, posteriormentetrofia y cesa la granulog~nesis.granulocito son las células muí
de 3 a 4 lObulos> y las célula
nucleolosa vez queel aparato
Las formasti lobuladass en banda
Los neutrófilos puedencirculación de la sangre ode los vasos sangui neosla reserva de granulocitosel tiempo de vida mediomaduro es corto, tres dias
lación procedente de la
aparecer libres en la
adheri das a las paredesestos ultimos constituyen
en circulación, normalmente
del granulocito neutrófilodesde que llega a la circu-reserva de la médula ósea.
células emigrlos espacios
nari al sistemaeliminadas por
an, atravesantisulares y
circuí atorí o.los macráfagos
do el
rarasSu vida
(Fig. 2>.
endotel loveces, ofi nal 1 za
2.2. - CARACTERISTICAS FUNCIONALES.
La base de la defensa del huesped frente a
fecciones por microorganismos invasores está constit
por los fagocitos, dentro de los cuales están lnclulos leucocitos polimorfonucleares <PMN) y los fagoc
macrófagos. Estas células eliminan a los microorganl
invasores mediante toda una serie de mecanismos mi
bicidas que se ponen en marcha una vez que estossido ingeridos.
El proceso
ininterrumpida dede fagocitosis comprende una serie
pasos que permiten que esta función
vasnunal 1
Estas
ar, aretor
i endo
cuí
ca,is
in-
ul daidositossmoscro—
han
— 12 —
saliendo desanguíneo
Figura 2. Esquema de la fagocitosis por leucocitos polimorfo-
nucleares (PMN> y macréfagos tisulares, después de que las
bacterias patógenas han atravesado la piel y han invadidotejidos profundos. Los PMN llevan a cabo una fagocitosis
más eficaz que los macréfagos, pero estos últimos constituyenla etapa previa para el desencadenamiento de respuestas inmunes
especffi cas.
- 13 -
pueda ser llevada a
miotaxis, fagocitosis y
buen termino: Adhesividad,
actividad microbicida.
Adhesi vide adherirse
en las venularespuesta infí
situadas en 1
el mecanismo
intervienen
los péptidos
agentes reínuc 1 eóti dos
dad. Los leucocitos
al endotelio vascs postcapilares, como
amatoria (7) y dependi
a membrana de los le
exacto de regulación
diversos factores
formilados, el factor
acionados con elcíclicos, cationes
tienen
ul ar,pri mer
ente de gucoci tos
no estácomo la
C5a del
proceso.d i y a 1 en t e s
la capacidadprí ncipalmente
paso en la
11 coprotel n as
<8). Aunque
muy claro,
fibronectina,
complemento,
inflamatorio,
etc.. (7,
9, 10, 11).
Quimiataxis. Los PMN
la capacidad de emigrary los macrófagos
a través de los tejidos,
emime dessuaccegede
y
graciánlante
la qperfí citi vadasndentaln eradasi ncr eme
orí entar
pun
uime
aen
dnt
e
aumentando
uedeest
iota
y 5pHsu
urantar la1 movi
ser al azarimulo qufmicoxis. Estos 1ecretan enzimtisular y qucapacidad de
e la imflam
velocidad de
miento en lala concentración
o dirigida especificamente
Inflamatorio, este procesoeucocitos contienen en su
as proteolíticas que son
e cumple un papel trans-
emigrar. Muchas sustanciasación tienen la propiedad
emigración (quiniioci nésí sdirección de un gradiente
del agente (quimiotaxis):
- Productos bacterianos
en leucocitos como las
N-formulmetioninicos (12,
que md
endotoxi
13).
ucen
nas
qul
y
mi otaxí s
pépti dos
- Factores derivados del suero como
C5a y complejos antígeno-anticuerpo
la anafilotoxina
(14, 15>.
qui —
poseen
esta
- 14 —
- Derivados del
se encuentran lamonohidroxilados
leucotrienos como
áci dopro st
delel B4
araqui dónicoaglandina El,ácido araqui(LTB4) (16).
Entre ellos
los derivadosd6nico y los
- Compuestos de lin
que pueden atraer ade inflamación y retar
sensibilidad (17).
foci
los
dan
tos T y
macrófago s
las reacci
- Factores producidos
pueden estimular la(18).
por las células
quimiotaxis en
monon u cíe ares
neutrófi los
Existen sustancias en los sitios
que inhiben la migración al azar de estas
que escapen de las zonas dañadas, asi,cinas como el factor inhibidor de migraci
enzimas proteoliticas producidas durant
del complemento como el factor Bb,pl asmí négeno asf como su factor actí vado
decél ul
estan
ón dee la
la plr <11,1
inflamación
as evitandolas linfo-mac r 6 f a g oactivación
asmina, el
9,20,21).
Todas estas sustancias quimiotacticas
la propiedad de actuar a discon ciertos receptores que s
de las células fagocíti casque para la transducción dese requiere de reaccionespor 5-adenosin metionina
activación de fosfolipidos
evidencias sugieren que 1
está
lnduc
que
i nvol
idasen
tancia mediantee encuentran en
(16,la
dequede
a p
22,señal
trans
sonmemb r a
rotel na
ucrada en la transduccipor qui mi oatrayefltes
a membrana plasmAtica
ón(25>exi
23>parametidi rlna
su i
las
nteracci ónmembranas
Se ha observadola quimiotaxis
lación mediadas
gidas hacia la(24>. Recientes
kinasa C también
algunas señal ese sabe también
esterasas que
cte
5
sten
Ben
ones
esti
los
de
muí adossitios
hi per—
tienen
estan relacionadas con este proceso (26>, en él también
- 15
se producen fenómenos de despolarización y posterior
carga de la superficie de la membrana plasmática delfagocito <16>, también se requiere de cationes divalentes
calcio y magnesio (27, 28) así como de nucleátidos
cfclicos AMPc y GMP0 (29, 30).
Los
mediante 1delgadas, 1
del leucoci
llamada ur
contienen
contracti 1
y miosina
de actina
la base de
de las células
1 eucoc
a emi
itos
siónse muevende unas pr
sobre
otubera
la
nci assuperficie
planas yos pseudópodos, a la vez en la parte posterior
to se formará una cola de retracción tambiinápodo. Los pseud6podos a nivel estructural
microfilamentos que representan la parte
del citoesqueleto, constituidos por actina
entre otras proteinas (31), la transición
en su forma globular a fibrina, constituye
la clásica transición sol—gel del citoplasma
en movimiento (32>.
Se sabe que los agentes
estimular el ensatblaje de losdel mantenimiento de la forma
del movimiento así como aument
modo la polimerización de la
a la dirección de migración
tiempo un acortamiento de los mi
perpendiculares a esta (35>.
los microtubulos ha sido puest
tratamientos con colchicina,
ensamblaje de la tubulina
de la direccí
de respuesta
su movimiento
ón de desplazamien
a est<mulos qu
al azar (36>.
qulmiot~cticos
microtubulos, respocelular, de la po
ar el GMPc ~t34>
tubulina sería p
produciendose al
crotubulos en direc
El papel que dese
a en evidencia con diesta droga inhibe el
y produce una alter
to asi
imi otact
como
i cas
pueden
nsabl es
1 andad
de este
aral el a
mismo
ciones
mpeflan
versosauto—
ación
una perdida
aumentando
— 16 —
Fagocitosis
conoeda
la
tic
a,i ge
tic
Este proceso
cimiento eser ingerida
membrana del f
as de tamaño yeste material
no-anti cuerpo
ulas virales
rófagosun recep
señal de
la part{cU
articulas
compí emense unen
ocito, est
ací ón.
Una
tor
for
la
ext
toa
ep
vez
de
ma d
(37.)raña
C3
este
roce
podemos
ngesti ón.
dividirlo en
Para que
ha de unirse a de
agocito; dependiendoforma de la superfic
particulado puede sery componentes o
y células intactas
que se producen 1
superficie del fagocesconocida dando luga
El reconocimiento d
s va a estar mediadoby C5 ) y
facilitando
so se conoce
antísu
con
dos
unatermi nadas
de las c
ie de ladesde co
elularesen el c
as interaito se tr
r a la in
el microor
por comp
cuerpos
1 nteracc
el nomb
etapas
parti cuí a
greas
aracte—
partf-
mpl dos
hasta
aso de
cci ones
ansmi tegestión
ganí smo
onentes
(IgG e
ión co
re de
IgM)
n el
opso-
En la membrana
toda una serie de
proceso
del macrófago se Han
receptores relacionados
- Receptores para las regi ores Fc de las Inmuno-
globu
reo onencarA2,
en
Fol
se
con
linas. As
ocen el
ga de auniela cual
cascada del
1, que reco
cree que
centrad ón
1 estan los receptores FoRI que
isotipo ¿.2a de las IgG, este se
ntar la actividad de la fosfolipasa
está relacionada con el mecanismo
ácido araquidónico. Los receptores
nocen el isotipo Ví y ~2b (38>,
su papel sea de mediador en la
intracelular del AMP~ <39). También
re
pu
de
ri scuíantpar
macconuna
de
op
del
quefagni z
encon
con
trado
este
exí sten evidencias que indican la existencia
— 17 —
de sitios
‘¡‘3 del IgG
de unióny del IgE
específicos
(40).
para el
- Receptores para el complemento. Son
<41>, estos pude la molécula
en su interacc
las partículas
son adheridas
macrófagos infíEn fagocitos mo
receptores par
papel de estesecrección de
taxis (43>.
edenC3
i ón
ext
yamat
nona
u1
re
i nte
reconocer distintaspero han sido
con C3b y C3brañas envueltas
posteri ormente
orios gracias acleares tambien
a anafilotoxina
ceptor es elrleukina-l e in
mej
1.porfagoc
estosse ha
C5a
de
i ciar
porcionesor observados
Se sabe que
03b y C3bi
itadas porreceptores
n detectado<42>. El
inducir la
la quimio—
- Receptores p
la capacidad de
glicoproteinas
y N-acetilgluco
Se desconoce la
ara manos
1 macrófag
que tien
samina ofunción
pero se cree que podr
raccionar cón determi
en la fagocitosis.
En la membrana de los PMN
a-fucos a
o perito
en como
residuos
exacta de
la ser otra
nados eleme
tambí en
Se ha descritoneal para reconocer
terminal manosa
de fucosa (44).
estos receptores
forma de inte-
ntos microbianos
se han descrito
recept
el C3b
ores
del
para la porción Fc de
complemento (45).
La internalización de las
que requiere de una adherencialeucocito a los ligandos unidos
de circunferencia, este es un
tambien denominado zipper (46,
no están en densidad suficiente
las IgG así como para
partde
a
proc
41pa
icul as
losla p
eso
ra
es un proceso
receptores del
articula a modode ‘cremallera
Si los ligandos
que ocurra este
1 soti PO
CRí y CR3
- 18 -
Lisosamaprimario
Formaciónde un
lisosomasecundaria
Mitocandria
Vacuolaprimaria
Retículaendoplásmíco
Corpúsculo residual
Fusión de vacuolas
Aparato de Golgí
Figura 3. Representación esquemáti ca de las estructuras vesiculares
.y granulares de un fagocito (tomadas de Alexander y
Fusión para formar un fagolisosoma
Fagasoma
Exocitosis
Retículo endopiásmico rugoso
Good, 1980).
- 19 —
fenómeno de reconocimientoficie no se muevende la membrana, este
Una vez formada en
vesi’cul as fagoc<ticas
nuclear, guiadas por
que requiere energiade proteinas citoplásni
(48). La
div al entes
además de
i ngesti 6
(calcio
otros fac
El la zon
se convierten e
fusión con los 1
las vacuolas e
o si los
lo suficiente
receptores de super-
en
proceso se detiene
la periferia del
se dirigen hacia
los microtdbulosy que utiliza unicas contractiles <
n es
y mag
tores
dependi enesio) y
(37).
a perinuclear,n lisosomasisosomas prima
ndocfticas o
la fase liquida
en la fijación.
leucocito las
la zona peri-en un proceso
a gran cantidadactina y miosina)
nte de lcspos iblemente
las vacuolassecundarios de
nos, de formafagosomas p
cationes
del AMPc~
endociticas
spuís de su
alternativa,ueden unirse
con lisosomas secundarioalgún momento entre la fo
endosomica y la formacilos contenidos empiezan
de membrana, receptores
sp
rmacón
a
ci top
reexistentes (Fig. 3). En
ión inicial de la membranadel lisosoma secundario,
acidificarse y porcioneslásmicos así como algunos
de sus contenidos son devueltos a la superficie celular.
Dentro del
como algunasdigeridos a
cas (49). Las
carbono. comp
reducidos a
11 sosoma,
protel naspH ácido po
macromol écul
lejos y hp
subuni dades
los
der
asid
de
contenidos
la membranamás e 40 enzi
com roteinas
os digeri
o peso
d
op
son
pequefl
fagoci tadospl asm&ti ca
mas hidro-
hidratos
dos hasta
molécul ar
que pueden escapar
A diferencia depueden expulsar mater
virtud de un proceso 11
del lisosoma hasta el
loslas
amado
neutrófi los,
residuales noexoci tosi s
citopí asma.
los macrófagosdigeridas en
as 1
son1 íti
de
ser
- 20 -
Los cambios metab6li
citosis son además de 1
aumento de la glicolisis,de las pentosas, un aumenoxigenada y del lón super
de lipidos, recambio del AR
cos que acompañan a la fago—
a liberación enzimatica, ununa activación de la ruta
to de la producción de aguaoxido, así como la sintesis
Ny quimiluminiscencia (50,51>.
El estallido respiratorio que se
de que
produce
a supero
asociadadores de
La fuentela ruta d
protei nacomo NADH
la
unxi d
a
parti culalto co
o en una
la membra
la respí
de NADPH
e las pen
que in
(52, 53,
a ha sido ingeridansumo de oxigeno, e
reacción catalizadana y que es insensibración mitocondrial,
para la oxidasa 1
tosas, esta oxidasaVitre’ podría utilí
54>(Fig. 4>.
por el
ste, es
por unale a los
utilizaa proporc
seria unazar tanto
fagocito
reducí dooxidasa
inhibi —
NADPH.
i onaríaflavo—
NADPH
Con el estallido respiratorio
oxigeno consumido se transforma
la oxidasa y luego por mediación
superóxido se transformaría en agua
202 + NADP > 2O~ + NOxidasa
la gran mayoríaría en superc5xido
de una dismutasa
oxl genada:
ADP+ + H +
20 + 2H > 0~ + 2H20
Di smutasa
En este proces
tipo b (55). Tantoforman parte de una
desde el NADPH al
se pueden formar r
o está implicado
la flavoproteina
cadena transport
oxígeno (56>. En
adicales hidroxilo
un
comoadora
todo
por
citocromo del
el citocromo
de electrones
este proceso
la Interacción
produce después
del
por
de
- 21 —
glucosa
4glucógeno —*~ glucosa-6-P
NAQ
lactato plruvata
kciclo TCA
CLAVE DE ENZ<MAS(5) glucosa 6-fosfato deshidrogenasa© NADI-( oxidasa~»deahidrogenasa láctIca ligada a NADH
03 NADPH oxidasa(¡3 deshldrogenasa láctIca lIgada a NADPH
GSSG reductasaGSH peroxídasa
NADP
NADPH
11202
lactato
piruvato
H20H202
02
Figura 4. Vias oxidativas del neutrófilo humano (tomada de Cline,l975>.
— 22 -
de los perdxidos de hidrógeno y los superdxidos:
+ H202 >0K + 02 <“02”>
Asimismo puede
singletes de oxl’genoluz (57> aunque esta
o peróxido de hidrógen
aparecer un estado excitado, los
pueden revertir a 02 para generar
luz podria proceder del super6xldoo (50).
Mecanismos microbicidas. Estos pueden ser divididosen oxigeno-dependientes y oxígeno-Independientes:
- Mecanismos oxigeno-dependientes.
1.— Mecanismos oxígeno-dependientes
independientes, cuentan con la acc
de los derivados de la reducciómolecular, el superóxido y elhidrógeno así como la formaciónhidroxflicos (53, 58>.
mieloperoxidlón microbic
n del oxfg
peróxidode radical
asa
Ida
eno
de
es
2.— Mecanismos oxfgeno-dependientes mieloperoxidasa
dependi entes
2.1.- Activación de halógenos. Los distintos
halógenos intracelulares como el bromo yel yodo, pero especialmente el cloro y elyodo son activados por la presencia de agua
oxigenada y mieloperoxidasa. Dicha enzima
es una hemoproteina (59>, se combina primerocon el agua oxigenada formando un complejo
enzima-sustrato que puede oxidar a una serie
de componentes entre los que se encuentran
los iones haluro, esta oxidación da lugara un hipo-halógeno con un poder bactericida
- 23 -
muy acentuado (58>. La reacción es:
Halógeno + H202 + mieloperoxidasa
--—-> hipo-halógeno
En el caso
pri nci pal
muy tóxicopuede dar
agentes
oxl’geflo
de 1 ión
prod ucto
A part
lugar aoxi dantes
y las clorami
cles
irla
como
n as
oruro perece quel ión hipoclo
de este productformación de
los singletes
(60, 61>.
2.2.— Descarboxilación debásica es la siguiente:
aminoácidos. La reacción
R-CHNH2-COOH > R-CHO + CO2 + NH3.
Esta reacción, controlada en
peroxidasa degrada muchos
de la membrana bacteriana,
la muerte del germen (62>.
parte porde los
lo cual
la mielo—aminoácidos
da lugar a
fagocitos h
oxfgeno qu
superóxidos uperóxi do
a formació
el imi nada
catal 1 za
an de protegerse contra los
e son altamente tóxicos,
es eliminado por la a
dismutasa, (ya vistas) que
n de agua oxigenada, esta
por dos sistemas <58>, la
la reacción:
H202 > H20 + 02
y el sistema glutatiénreductasa
peroxi dasa — glutatión
2GSH + E1202 > GSSG +
Glut. Peroxidasa
GSSH + NADPH + H + > 2GSH + NADP +
+ H20
e el
rito,
o seotros
de
Losde1 ónlaalesque
radi ca
así
cci ónda lu
a su
catal
lesel
de
gar
vez
as a
H20
Glut. Reductasa
— 24 -
- Mecanismos oxígeno-independientes.
Cambio defagosoma
do láctico
pH. Elllevay áci
meta
aldo ca
bol
arbó
ismo anaer
rapida prnico con
pH disminuye hasta cifras que6,5 y 4. Este es suficiente pormatar una serie de microorgStreptococcus pyogenes o detener
de otros como Escherichia coli (49>.
fluctuansi solo
ani smosel crecimi
entre
para
como
ento
2.-
lis armur ámi
muchos
Li beración
bacteriasco y la
germenes
3.- Lactoferrina.
de ligar
bacterias
su normalme
4.- Protei
nueve proteacídicos y
de muchas
Parece que
ser diferenteconsecuencia,
de ellas puedecróní casmicroorganismos
ávi
de
tabo
de lisozima. Esta
rompiendo la uniónN-aceti 1 glucos ami na
gram—positivos (63>.
Esta proteína
el hierromicroelemento(64>.
damenteeste1 i smo
nas catiónicas. Son u
mas de bajo peso molécu
que interfieren conbacterias Impidiendoel efecto de cada una
sobre dia carencia
asocí arse
debidos
(65>.
enzimaentre e
prese
puede
1 ácidante en
tiene capacidad
privando a lasnecesario para
n
lar
el
sude
stintos gérmegenética de u
con procesos
a
conjunto de
con gruposmetabolismo
crecimiento.
ellas puedenes y, en
na o varias
infecciososdetermí nados
5.- Defensinas. Son moléculas pept<dicas
actividad antimicrobiana muy variada (66).
1.—~del
áci
obi cooduccílo c
dentro
ón deual el
con
25 -
3.- Caracteristicas
seleccionados.
de los microorganismos
3.1.- Escherichia ccli.
Sonbacilar
formande 2Posee
en labacteri
formand
gui rse
germenes gram—negativos, moviles y con
fueron aislados por Escherich en 1881esporas y son relativamente pequeños, pues
a 3 p de longitud y de 0,4 a 0,6 >~ de ancflagelos perítricos y fimbrias o pili especiali
transferencia cromos6mica durante la conjug
ana. Algunas cepas son capaces de producir cao grandes colonias mucoides, que pueden di
facilmente de la variedad lisa habitual no c
lada.
La pared de las bacterias gram— negativas estáconstituida, desde el exterior al interior, por unamembrana externa, una capa de peptidoglicano, un espacioperiplasmico y la niembrana citoplásmica. La membrana
externa hace posible que los bacilos resistan a los
factores de defensa del huesped, como la lisozima o
determinadas proteínas leucocitarlas que suelen ser
muy tóxicas para las bacterias gram—positivas, estasbacterias al ser huespedes habituales del tubo digestivo,
están protegidas contra su degradación por las salesbiliares y por las enzimas digestivas.
Porcomo una
bacteriasy que por
gram— posi
otra pa
barrera
contra
lo tant
ti Vos
rte, la membrana externa se comportade permeabilidad que protege a las
ciertos antibióticos no difusibles
o, solamente son activos sobre gérmenes
Macról idos, novobiocina, cl indamicina,
formaNo
miden
hura
zados
ación
psul a
sti n-
aps u-
- 26 -
ácido fiflcsico (67).
La membrana externa está constituidaelementos constitutivos (Fig. 5>:
por distintos
- Fosfolípidos.
es parecida a
conforman una ca
La compola de la
pa biniolecu
sidón enmembrana
lar hidrófoba.
tos fo
ci topí
Li popol i sacáridos. Abarcan tres reglones
distintas:
pol iosfdica
0, el “cor
y el Lípido
Las molécu
consti tui daunidos ala fraccí
lisas la
5,
e”
1
5
1
ón
q
Las cadenas laterales
A
as
pas
PO
ue
que transportan
o nucleo de POunido al “core
de lipopolisa
or 6 o 7 ácido
gí ucosaminas
liosídica de lo
lleva consigo
o secuencias
las especificidadeslisac¿YIdo de base,
por un trisac~rldo.
cárido (LPS) están
s grasos saturados,del disac~rido; es
s LPS de las cepas
las especificidades
O de las bacterias de las que proviene. Los LPS++
unidos entre ellos por iones Mg , lo que asegura,de esta manera, la estabilidad del conjunto.
Los LPS o endotoxinas son los responsables del
‘shock” por bacilos gram—negativos, cuando tiene
lugar la lisis bacteriana en la circulación
sangul nea.
- Proteldi ferentOmpA. La
del conjgí icano,de agua,
hldrófi 1lipidica,
nases,
1 ip
untolos
que
as a
Exi steentre
oprotei
de la
porospermí te
travéstiene
unaellasna mumembr
son
n elde
un
gran cantilos poros
reina asegUana externa
canal es
paso de
la membrpapel
protel nas
protei naabi lidadpeptido-
llenosécul as
fosfo-
de
1 ¶pidos
asmica
dad de
y la
ra la estcon el
protei cospequeñas mol
ana externa
de difusión
— 27 —
Cápsula de poí¡sacárídús
Fepí ¡dogl ¡caro
Meuwbrau,a c¡iopl rw~ca
Membrana exíerna
Poros yL~ popo 1 isacá ridos=endoío~dnas
Upoprofriíii&s 1 —I —~~~~11
Pepiidoglicano
Beialacti.musuiS —
.
Eniimus.dianun = PBPEspacio peripUsmico OMembrana interna eiioplasm~IiCa IIIIItInm, man 11111 minI ¡MII 11111’ 1111 III i#IIbuIIi mían n,m,~, u
No existe en •od,s Iu% bacterias.pAr Proteínas lijadoras de penicilinas.
O RAM-POSITIVO
GRAM~NEOATIVO
Figura 5. Estructura de la pared bacteriana (tomada de Bingen, 1987>.
- 28 —
nutrientes (68).los poros y losdeterminan la ori
los primeros a la sristica funcionalbarrera hidrófoba
moléculas nutritial mismo tiempo,
moléculas mayores,
antibióticos, así
plásmicas,
Existe una interacción entreLPS, puesto que estos Gítimos
entación y la exposición de
uperficie bacteriana. La caracte-
de la membrana externa es la
que permite el paso de las
vas esenciales, pero impidiendola penetración al interior de
como las enzimas o determinadoscomo la salida de enzimas peri-
El peptidoglicano es un
cadenas lineales de N—acetil—D
N-acetil murámico. Estas cad
unidas entre sí por cadenasque contienen L—alanina, ácidoy D—alanina. Estos tetrap~ptidosde sus extremidades al ácido
la otra a otro tetrapéptido,por medio de aminoácidos suplem
En la sintesis del peptidoglicano
transgl i onas de poí
Intervienedipépti do
speptidació
ria un pap
lo tanto,
olasa queisacári dos
cortando elde alanina,
n, de este
el en la reguen el grosor
pol fmero—gí ucosami na
enas polios
cortasD—gl uestán
N-aceti
bien
ent ar
tres
asegura laentre si y
puente entreImpidiendo
modo 1
1 acióndel p
de
támiuni
compuesy de
idicastet
ce,dos
1 murámidi rect ame
ios (pentenzimas eformación
la carbox
a
de
epti
to deáci do
estanrapépti dos
L-lisi napor una
co y por
nte, bien
aglicina)
sencí al es,
de las
1 pepti dasa
los dos pépt
por ello
carboxi pepti
la síntesis
doglicano
idos
la
das a
y,69).
Los betalpeptidasas y lasde estructura en
de alanina.
act ámi co
c arbox i
tre el n
s actuan inhibiendo
peptidasas, gracias aúcleo betalactámico y
las trans—
su analogía
el dipeptido
un acade
quedel
tran
tend
por
— 29 -
La unión defijadoras de
la inhibición
la detención
estos betalactgmicos
penicilinas (PSP) es lade la sintesis de pepti
del crecimiento bacteriano.
El espacio periexterna y la membrana
las enzimas capaces
las betalactamasas.
pl ásmi
citopíde hi
co situado
ásmica, es
drolizar
en
donos
res
dogí
trede s
bet
o proteinas
pons ab leicano y
dede
la membrana
e encuentranal act6mlcos;
La niembdoble capa de
para las moléde longitud y
grasos que laen la masa de
la difusión
membrana. Lasplásmica porproyectado h
ranafosf
cuí as
pía
ol ipPo 1
smáti caidos cuy
ares) est
está const
a permeabi 11
á influida p
ituida p
dad <muy 1
or la va
por el grado de saturación de los ácidos
componen. Ciertas proteinas que “flotan”
los fosfol¶pidos son pernieasas que facilitany el transporte activo a través de laPSP están insertadas en la membrana cito-
su extremidad COOH, estando, igualmente,
acia el substrato su lugar enzlmáti co
activo (70).
Con respecto a la virulencia y el poder patógeno
de E. col] el
celular son 1
son los antfgun gran número
mente son conocomo endotoxí
de la paredy por hidrólí
lipoidea no i
más importante
os lipopolisacáridos
enos predominantes si
de actividades biolog
cidos como antígenos O
nas. El lipopolisacá
bacteriana por trat
sis ácida suave, se
nmunogénica Hipido
constituyente de(LPS>
no quIcas <
y fa
ri doami e
obtiA)
e
71>
rmac
puednto co
enen uque c
la paredestos no solo
además mediaserol ogica-
ologio amentee extraerse
n fenol
na fracciónontiene los
s químicos
ión con los
res pon
antigen
sablesos O.
de la toxicidad
or unaimitadari ación
grupofracc
y una
- 30 -
Algunos de los
lipidos A en una
activación de loy promoción delLa parte polisa
tidas de oligoimportante en 1Ciertas cepas po
son los antígena nienudo los gr
antfgenos O situa la bacteria de
efectos que pueden provocar los
son pirogenicidad, neutropenia,
os, del complemento, inducción
mediadores de la inflamación.á formada por unidades repe-
(12> y desempeña un papela y patogeneidad de E. coli
infeccións macrófag
número decarida est
sacan dasa virulenci
see envuelt
os K, la
upos inniun
adosla
más
acc
as
pre
ob
capsul aressencia de
gi camenteprofundamente,
ión bactericida
de polisacáridos,
estos enmascara
activos de los
y puede proteger
de los fagocitos
y el complemento (73).
Las enfermedades
por E. coli sonLos organismosa las vi as unlinfática y porbacterias en or
existe infecciónembarazadas y
y enfermedades
urinari as.
caten zací ón
las
pasan
narí asvi a
1 na
un
pácí
ne ur
Actuany otras
infecciones
causadas más frec
de las vías
del tubo
por vía h
uando e
100. 00en ni
posiblemente
y riñones
c ndente. C
upenior aFrecuente
as e
es 5
naní a.entesolégí e
como
formas
1
oños,
u en t emen t eurinarias.
digestivo
ematógen a,
número de3
Ufc/ cmmujeres
con lesiones obstructias que afectan a las
factores desencadenantesde instrumentación uretral.
vas
vi asla
3.2.- Staphylacoccus aureus
.
Son gérmen
agrupándose enuvas”.>. Roberto
el estafilococoRosenbach desc
es estén
racis
Koch en
en pus
ribió
cos gram-.positivos
(griego, staphyle
1878 fué el primero
humano. Más tar
dos especies:
que crecen
“racimo deen describir
de en 1884,
Staphyl ococcus
— 31 —
(pyogenes) aureus y Staphylococcus
actualmente clasificados en dos
(Staphylococcus) de la familia Microcen 1930, introdujo la primera cl
estafilococos basada en diferenciasgénica y en 1942, fisk desarrolló
por bacteriófagos.
(pyogenes
géneros di
occaceae. ..Jul
asi fi caci ónde estructur
un método de
albusferentes
íanel le,
de los
a anti-tipado
Los
no forman
las 1,2 ji
en dos p
en medioscortas de
estafi locoesporas.
formanlanos perp
sólidos, en
no más de 4
cos son organi
Sus diámetros
racimos porendi cuí ares.
los líquidos
elementos.
smos inmoviles que
varían entre 0,7 ydivisiones irregulares
Esto es más evidente
forman a menudo cadenas
S.aureus formapigmento aman
lta-caroteno y
nas elaboranagula el plasma.
col
lío
la
un a
onias amarillo-doradas, debido
formado por 2 carotenoides,rubixantina. Todas las cepas
enzima denominada coagulasa
La pared
gruesa, está consglicano (Fig. 5>.constitutivos en
loa ácidos tejo
covalente a las
glicano. La capde virulencia,
5. aureus (74>.
de 1
ti tuiPued
si t
ol cas
caden
sula
const
as gram
da en suen estar
uaci ón
polis
as de
externa
ituye u
— positivas,
mayor partepresentes
superficial,acáridos uní
polisacaridosde polisac
n elemento
reí
por e
otros
espdos
del
ani do
1 ncon
atí vamente
1 peptlda-
el ementos
ecl almentede manera
peptido-s, factor
stante en
Los fact
son varias
crecen en medi
ore
75)os
s de vi
Los
arti fi ci
rul enciestafi 1
ales 11
a y toxinas de 5. aureusococos patógenos cuando
beran diferentes toxinas.
a un
el de
patógeque co
1
- 32 -
Las más elaboradas frecuentemente incluyen
hemolisinas (alfa, beta, gamma, lambda),no hemolítica (produce degranulación de
y toda una serie de toxinas pi rog~nicay B, enterotoxina y TSST-l ) . Producen as
extracelulares <coagulasa y estafiloqui
poseen diferentes antfgenos de superfde capsula (ácido glucosaminurónico)
A, un ácido glicerolteicoico, una protemente coman para 5. aureus y 5. albus
la proteina A; esta interacciona de formcon la porción Fc de las inniunoglobulinases importante como factor de virulenci
puede tener una gran variedad de efec
del complemento tanto por via alterna
la clásica con la generación de agentes
inhibición de la actividad opsonizante de
por competición con los receptores Fc d
impidiendo su posterior fagocitosis,
liberación de histamina por leucocitos
de linfocitos E.
una leucocidína
los leucocitos)
s <exotoxina A
1 mismo enzimas
nasa). Tambiénicie como los
polis acgri do
ma antigenica—y por último
a no especi’fica
esta proteina
a e “In Vivo”
tos: activación
tiva como por
quimiotacticos
los anticuerpos
e los fagocitos,
inducción de la
y proliferación
Es necesario resaltar la
para sobrevivir en el interiorcapacidad muchas veces responsab
de este microorganismo.
capacde lo
le de
idad de
5 fagocí
la pat
5. aureustos (76>,
ogeni ci dad
En las iaquí un papel
resistencia a 1
problema en la
nuevo fSrniaco y
apareciendo nuev
nfecciones causadas
Importante la niutacos antibióticos, esto
clinica, ya que la
a disminuyendo gradu
as cepas de 5. aureus
.
por
i ónpl
efe
al me
S.aureus juega
como forma de
antea un grave
ctividad de unnte cuando van
4
- 33 —
La infección
como corntorios,de la pi
mel 1 itus
infección
la penetra
pl icaci óny aboesos
osti omí el itgraves los
estafi locdcica
plícación de traumas accidenta
de quemaduras y otras lesel y de enfermedades crónicasy la cirrosis hepática. Es
de la piel, vias respiratorias
ción profunda en los tejidosde 5. aureus ocasionando a
localizados, Así tambi&
is y endocarditis. Solo en
microorganismos penetranbarreras locales de la
linfáticos y el torrente
El hombre
natural frente
suero, formadosestafí lococicas
especfficos; pes
cocia generaliza
deprimidas <77>.
lesión esanguíneo.
posee un alto g
al estafilococo ycomo resultado de
de la piel y lase a todo,se puede
da si las defensas
aparece a menudoles y postopera—
iones importantes
como la diabetes
muy frecuente la
y tubo digestivo,
provoca la niulti-
menudo necrosispueden ocasionar
infecciones mása través de las
invaden los ganglios
nado de resistencia
además tiene en elpequefias infecciones
mucosas, anticuerpos
alcanzar una estafilo—
bacterí anas se hallan
3.3.— Candida albicans
El tratado de
las bases para laun crecimiento dimórfsólidos, ricos crece
con un di5metro de 3
las levaduras y su
formar cadenas o psefundidad en el nied
estructura tubular r
Lodder y Kreger de 1952
taxonomía de C. albicans
,
ico, en la superficie de lo
como levaduras gemantesa 5 ji aproximadamente <en oc
progenie se adhieren entreudohifas > cuando lo hacenio pueden formar hitas,amificada, de unos 2 a
establecí ó
Presenta
s mediosoval es
asi ones
si para
en pro-
con una
,u de
- 34 -
diámetro y enambas formas
varios cromosperfectamentereticulo endop
por lo que semás que a la
semejanza de 1de la membra
una estructurfundamental de
un 3 - 6% de
20% de manoprantigénicos q
C. albicans
)
(glucanos>
de la pared
compon en tespero la quitde los tubos
losCit
omasdeti ni da,~smis eme
dede
tejidos inológi cament
diferentes
fectados pueden encone son eucarióticas,
y una membrana nasí como mitocondrias
ranaslos
asre
la
emb a
ormad
0,6
ontí e
1 co. Sus memb
a jan a la de
las bactenia las bacterias
na citopl~smica,
a de aspectola pared está fproteinas, un
oteinas (que cue determinan
y un 48 - 60% de
que constituyen el
(78). La cantidad
no1 nade
varia mucho con
se incrementa 4
genl nací én.
contienenorganí smos
La paredcubre la
pared
rdado.
a por un
— 2,7%nen los
los serotipos
pol <meros
principal
de estos
la fase d
veces con
transeposee
ucí eary un
esteroles,
superi ores
celular aparte externa
celular posee
La estructura
2% de lípidos,de quitina, un
determí nantes
A y B dede hexosas
componente
dos ultimas
e crecimiento
la formación
C. albicans
como la fosfatasa
(estrechamentcambio entrede los gluc
relacionadas
e reí
cel ulanos),
con la
secreta
ácida, un
toda una
a fosfolipacionada con laa-pared y regula
y proteinasaspatogenicidad de
sen e
asa, una
morf
ciónácl
c.
A
oge
en
das
al bí
de enzimas
B—gl ucanasa
nes 1
la
est
cans
s, ínter—estructura
rech amente
(78).
Recientemente sela fracción 03b del c
C. albicans, que son esp
y cuya función seria 1
los leucocitos (79).
han descubierto receptores para
omplemento en la superficie de
ecíficos, saturables, reversibles
a de inhibir su tagocitosis por
- :35 —
C. albicans se encuentra presente con frecuencia
en las mucosas normales de la boca, vagina y tubo
digestivo. No suele sen patógeno para el hombre sano
pero puede actuar como tal en personas afectadas por
otnas enfermedades (p. ej; línfonias malignos, diabetes
graves, sida etc..) y los individuos que han sido intensa-
mente tratados con medicamentos antibacterianos o trata-
mientos inmunosupresores, cuando se hacen invasoras
por estas circunstancias pueden producir diferentes
tipos de lesiones, agudas o crónicas, más o menosdiseminadas.
La candidiasis oral consiste en unas placas ben las mucosas de la boca y faringe, están comp
por hitas y levaduras, suele darse en recien n
infectados durante el parto y en paci entes en eterminal de enfermedades caquectizantes como por ela carcinomatosis. Otra es la que afecta a lavaginal, candídiasis vulvovaginal. La invasión dtejidos bronquiales y pulmonares es en generalcuencí a de la obstrucción bronqul al cróní ca, por e
el carcinoma bronquial.
1 ancasuestas
aol dos
stadl ojemplo
mucosae los
conse-
jemplo
La candidiasis intertrigianeas de la piel que estány maceradas. La endocarditis p
es poco frecuente, pero pued
ocasiones en individuos adictos
La pní
diasis es ladirectamente
así ambas más
hongos porfagos (80>.
nci pali nmu ni
pon
bí
los
nasa afecta enpermanentemente
roducida por C.e observarse en
al consumo de drogas.
linea de defensa frente
dad celular. O. albicanslos anticuerpos y el
en favorecen la fagocito
neutrófilos, monocitos
aquel las
húmedasal blcans
ciertas
a la candi—
no es lisadocomplemento,
sis de estos
y macró-
- 36 -
Una forma de evitar
su habilidad de formar tubosde las células fagocitica
hifas dificultan enormemente
penetrar en los tejidos
levaduras (78).
la muerte intracelular es
de germinación en el interiors, tambien la formación de
su fagocitosis y le permite
más facilmente que como
- ~37-
4.- EFECTO DE LOS ANTIMICROBIANaS SOBRE LAS CELULASFAGOCITICAS
:
El que una enfermedad infecciosa pueda prosperardepende en gran medida de la capacidad de las células
fagocíticas para ingerir y destruir los microorganismos
patógenos, así como de una quimioterapia adecuada;esto hace que sea necesario conocer las interaccionesque se establecen entre microorganismos, células fago—
cíticas y antimicrobianos <81).
HUESPED
4 Sensibilidad
Figura 6. Triángulo de Davis y cols,
Se sabe que
la acción de las cé
al— Pueden
conocido desde hacese han descrito con
los antimicrobianos
luías fagocíticas de
inducir neutropenia.
tiempo, los casos
la administración
pueden modi
varias formas
Este efect
de mayor grade cloranfe
Resistencia
MICROORGANISMO >‘ANTIMICROBIANOr
ficar
o es
vedad
nicol.
- 38 -
(82). Este ant
medular, suele
en el procesocasos menores
estreptomicina(86), y B-lact
se han descrí
carbenici lina
(90), nafcilina
El mecaniantibióticos no
parece que en ely rinfamnpicina
los precursores
producidos porparece inmunológ
ibiótico -puede producir una grave aplasia
ir acompañada generalmente de una detención
de maduración de la médula ~sea. Otros
se han descrito con gentamlcina (83>,
(84), rinfampicina (85), sulfamidas
ámicos (87>. En derivados penicilínicas
to en relación con penicilina G (87),<88), cloxacilina (89>, piperacilina
<90>, oxacilina (91> y meticilina (92).
smc de producción de neutropenia por
está muy claro (93>, así por ejemplo,
caso del cloranfenicol , sulfacotrinoxazol
se produce una toxicidad directa sobre
mieloides <94). Sin embargoantibióticos ~—lactámicos el
ico (95).
en
mec a
los
ni smc
en el inte
Pueden
rior d
fagocitados sifagocitos pueden
microorganismosque no tienen
si la tienen, pue
se comprobó que
pacientes conrespondían al t
debido a unacelular (96).
con carbono 14
neda en el
atr
e la
avesar
cél ul a
no se in
proporcí on
frenteuna buena
den quedar
en infec
enfermedad
rat amiento
dificultad
Mandel 1
vió que 1exterior
la membrana célular y actuar
frente a los microorganismos
activan en su interior. Losar una protección para algunos
a determinados antibióticos
penetración intracelular o
inactivados. Así por ejemplo
ciones por Staphylococcus en
granuloniatosa crónica no
con penicilina ni estreptomicinade penetración por la pared
utilizando penicilina mancada
a mayor parte del isótopo pernia-de los leucocitos polimorfanu—
cleares y que Staphylococcus preví amente fagocitados,
- 39 -
incorporaban mucho menas antibiótico quenecian sin fagocitar (97>.
los que perma-
Con otros
son similares,
intracelular de
»—lactámicos 1
lo que demuestra
este grupo de ant
os result
la bajaib lóticos
ados obtenidos
penetrabilidad
<98).
En los amlnoglic6si
poco poder de penetrac
es capaz de inhibir el
dos,
1 óncrec
la
(99) ymiento
gent
lade
ami cina
estreptMycob
tiene
omí cina
acterí um
tuberculosis
superiores a
cuando se usanla concentración
concentraciones 200 veces
mínima inhibitoria (100>.
Otrosy ejercer su
fagocitados.cl oranfeni col
cli ndami cina
antibióticos pu
acción bacteriEntre estos des
(102>, etambutoly rifampicina
eden
cidatacan
iso(98,
penetrar
sobre lostetracicli
niazida, en102, 103>,
faci lmente
organí smosna (101>,
tromí cina,
tambien
los nuevos dey norfloxacina
El mecanismono es bien conocido
rivados quinoleinicos
(104, 105>.
de penetración deen todos los casos.
como ci profloxací na
los antibió
Puede reali
ticos
zarse
por transporte pasivomicroorganismo durante
sucede con penicilina
forma el transporte es
delel
ysól
mismo fijadoproceso de t
cefalosporinas
o de un 10%,
Laen el i
y se baa pasanestabí ec
acumulación de eritromicina y
nterior de las células fagocític
sa en que son sustancias básicas
al medio Intracelular, en virtud
ido entre el pH extracelular y el
mientos celulares En la captación
cli ndami cina
as es rápida
que tiendendel gradiente
de comparti-
de clindamicina
muy
sol o
a laagocí to
<106).
paredsi 5,
De
del
comoesta
It
- 40 -
i ntervi en
a travésración se
en además un sistema de transportede la membrana y se ha comprobado que su
inhibe competitivamente por nucleósidos
activoi ncorpo-
(107).
Por último, 1
lípidos, comovirtud de sus
uieren consumo de
os antibióticosrifampicina y
propiedadesenergia (97>.
con buena solu
cloranfenicolfisico-quimicas
c/— Efectos sobre las células fagocíticas
las bacterias
ultimos años sla posibilidadlos mecanismos d
empleados en eldos microorganlas bacteriascon concentracpueden alterarde crecimiento
(108>.
expuestas a
e ha prestadde obtener
e defensa del
tratamiento deismos. Esto se
expuestas por
Iones de antib
su morfología,sin interferir
los antibo conside
efectoshuésped y
mf ecc ionbasa en
un breveiótico pr
adherenci a
ióticos. En los
rable atención asinérgicos entre
los antibióticos
es por determina-el hecho de que
periodo de tiempoóxlmas a la CMIy características
seriamente en su viabilidad
Estos cambios en la
la patogenicidad de los ni
factores de virulencia yreconocimiento e ingestión
células fagociticas (108).
superfi c1 croorga
paralelde la
je bacteriana aten
nismos, al dismin
amente favorecens bacterias por
Laconcentra
previ aclones
incubación desubinhibitorias
Escheri chi ade cefotaxima
colí cony cefta-
zidima consiguió promoverSimilarmente la incubacióncon concentraciones subinhib
la quimiotaxis (109, 110>.
de E. coli y Staphylococcus
itorias de penicilina (111>
en
enreq
bi í i dadpasan
y no
de
úan
ul rel
las
— 41 —
yclindamicina (112), estimulan la fagocitosis y actividadbactericida de los PMN.
En 1979 Pruul y McDonald <113) demostraron que
E. coli previamente tratado con una concentración sobre-inhibitoria de cloranfenicol <4xCMI) durante un corto
periodo de tiempo (10 mini era suficiente para aumentarsu susceptibilidad a los mecanismos microbicidas de
los PMN, denominaron a este fenómeno PALE (Postantibiotic
Leukocyte Enhancement Y Este efecto en fase postanti—biótica se consi guió tambi en con cortas exposicionesde StaphylococcL¡5 aureus, Escherichia colí y Pseudomona
aeruginosa con penicilina G (114>, aztreonam (115>
y lomefloxacina (116>.
Las alteraciones producidas por los antimicrobianossobre los microorganismos no están muy claros, así
p.e. se sabe que la previa incubación de Streptococcus
con clindamicina modifica su superficie con perdidade la proteina M produciendo un aumento de la fagocitosis
y digestión del microorganismo por las células
fagocíticas (117>.
Es posible que el aumento de la susceptibilidad
tras la exposición a los antibióticos como losbetalactámicos sea debido a que debiliten o disminuyanel grosor de las paredes de las bacteria y permitana los agentes bacterioliticos acceder más facilmentea la célula extrafia. En este sentido algunas cefalospo-rinas reducen la formación de la cápsula de una cepa
de Klebsiella pneumoniae y favorecen su ingestión (118>.
La repercusión clínica de estos hallazgos noestá totalmente comprobada, aunque es posible que estos
- 42 —
cambios encontri buyande defensa.
la superficie
a aumentar la
de lasefi cací a
bacteriasde los
patógenasmecani smos
di— Efecto directo delas funciones de los fagocitos.
actuar directamente sobre losprincipales funciones como sony capacidad microbicida <119>.
los antimicrobianos sobreLos antibióticos pueden
fagocitos alterando susquimiotaxi s, fagocitosis
Este hechtratamiento de
presentan altercomo en la cela las infeccione
o tiene una gran trascendenci apacientes inmunoconprometidos,
aciones tanto en la inmunidad
ular y por tanto están más
s oportunistas (micóticas y bacte
en elestos
humoralexpuestos
rl anas)
Muñozlas tetraci
mi croorgani 5
autores hanciclinas tie
(121>, lamicrobi ci davalidez decomprobar enproduce ense han encon
(124>. Elcelular pormonof osfato
y Geister (120> demostraron, en 1950, que
dinas inhibian la capacidad de fagocitar
mos de los PMN. posteriormente, diferentescomprobado que diversas formas de tetra-
nen un efecto inhibidor sobre la fagocitosis
movilidad celular <122) y la capacidad
(123), sIendo este dosis dependiente. La
estos hallazgos “in vitro” se refuerza alvoluntarios, que la ingestión de tetraciclinalos leucocitos las mismas alteraciones quetrado al incubar las células con antibióticos
cloranfenicol inhibe el metabolismo intra-interferencia con la ruta de la hexosa-
y tambiin puede afectar a la movilidad
de las células (125, 126).
Del mismo modo laa la capacidad migratoria
en tromi cinade las células
puede
<122)afectar
y las
- 43 -
sulfamidas interfieren con la fagocitosis y la actividad
microbicida (127). Dentro de los farmacos bactericidas,la rifampicina puede interferir con la capacidad migra-
toria de las células <128), asi como con la producción
del anión superóxido y con la quimioluminiscencía
de PMN (129). Otros estudios con ciprofloxacina, norfloxa-cina y ofloxacina sobre PMN no han mostrado alteraciones
funcionales. Existen estudios discordantes en relacióncon los efectos de aminoglicósidos y betalactámicos,
así a modo de ejemplo mientras Ferrari y cols <130)
demostraban que los aniinoglicdsidos, especialmente
gentamicina, inhibian la actividad candidicida, otros
investigadores obtuvieron una respuesta normal (i21 ).
Esta variabilidad parece depender en gran partedel método empde los estudiosestudios compara diferentesestabí
micosa los
ecidosteni an1 eucoc
alteraci on
anti bi óti cinhiben ladiente (13fagocitosisbicida (133).de los antibes conocido,
capacidad de
Inicipoca
1 tos,laes
lidLa
32>El
lóti
es deos de
movi1>.
(1
leadoEn
at i vos,
y lasla actu
queconcentraciones
almente se
capaci dadsin embargo
capacidad tute grupo. La
ad celular yampi ci lina
y la cefalo
mecaní smocos betalact
diversas
alidad sonincluyen
y utilizapenso que
de afecttambien
ncional decefoxití na
el efecto esy cefotax
tina la cres pon
ámi cos
c anacvalor
varios
n métlos
ten sticasables los
fármacosodas bienbetal actg-
ar directamentese han descritoPMN con algunos
y cefoperazonadosis depen-
ima inhiben laapacidad micro-
sable de
sobre
la acción
los PMN nopero parece estar en relación con su
fijarse a la membrana de la célula y
modificar su superficie.
- 44 -
Muy poco
antifangicos enLa anfotericina
se sabe sobre la interacción
las funciones de los leucocitos
B es el unico agente que ha
<leh urna
los
nos.
estudiadode losasí algde lade. la1 Mg/mlficativa
cercanasinhibirci tosi na1 umi ni sc(134).descritode célulAbruzzo
mini scene itrac
PMNunos
quimue
(1de
ala
seencDen
alas
yciaona
sobre suaunque lasinvestigad
miotaxis y
rte intrac36) . Otrosla fagocit
10 .ug/mlquimi lumi
ha descia perotro de
ket oc ofagoci’ti
cols.
era
zol. E
interferencia con
conclusiones pued
ores encontraron un
fagocitosis (134
elular de Candidaencontraron una
osis y muerte solo
la anfotericinascencia de los PMNni
ritosinlos
n azo 1cas h
137,reducín un
las fUnd
an ser dispaefecto inhib
135) peroalblcans a
reducción si
a concentraCiB también p
(137). 5—flu
como un inhibidorningun efecto en 1
derivados imidazólcomo supresor de 1
umanas (138) o sin f
140> encontraron qu
da por ketoconazoltrabajo más reciente,
de
a qí cosa quimie ecto
e la q-El u
R
la quui mi ot
se
ot
(1u] m
con
oíl
ones
res,i dor
rio
ungni -
onesuede
oro -
1 mi -
axisha
axis39),i 1 u—
azol1 des
y cols (141>, encontraron un efecto inhibidor
quimiotalos PMN
5 .ug/mltaxis yci tosi nade las
terapeuti cas.
xis, fagocitosis y metabolismo oxidativo depor anfotericina 8 a una concentración de
mientras que ketoconazol potenciaba la quimio—
la muerte intracelular a 5 pg/ml . La 5—f 1 uoro—fluconazol y cilofungina no afectaron a ninguna
funciones de los PMN a concentraciones
Todos estasaciones que se
imicrobianos , tespecial almecanismos de
estudios permitenestablecen entre
eniendo en cuenta stratar pacientesdefensa.
conocer mej
las célulasus posibles econ alterado
sido bien
de la
reí
antenlos
or
yfecnes
las
lostos,
de
- 45 -
5.- CARACTERíSTICASSELECCIONADOS
.
DE LOS ANTIMICROBIANOS
5.1.- Cefotaxima.
La cefotaxi ma es un antimi crobí ano perteneci enteal grupo de las cefalosporinas de la 3A generación,
son »-lactámicos, con un anillo betalactámico unidoa otro de di hi droti aci na. Posee una cadena 1 ateral
de aminotiazol y otra de axime (Fig. 7).
Mecani smcla síntesis dede acción son(PBP>, estas
transpepti dasasimplicadas enpared (70>.
delalas
prote
yla
acción. Actuan interfiriendopared celular bacteriana y su 1proteinas fijadoras de penicil
mas estan constituidas porlas carboxipeptidasas que
síntesis del peptidoglicano
Espectro antimicrobiana. Se haactividad mediante pruebas “in Vitro”germenes: Staphylococcus, Streptoc
Streptococcus faecalis es poco sensible)pneumoniae, E. col], Citrobacter, Klebsiella
aerogenes, Serratia, Proteus, (indol positnegativos), Haemophi lus influenzae
,
Clostrldium, Salmonella, Shigella yresistentes: Enterococo, ListeriaClostridium diffici le, Legionella
,
Bacteroides fragilis y la mayoría dedel género pseudomonas. Sus combinaciones
glicósidos suelen ser sinérgicos y raramente
enug ari nas
1 asestan
de la
demostrado su
frente a losoccus, (el
Str e pt oc oc cusEnterobacter
ivos e indolNei sseri as
Yersinla. Sonmo n oc yt oge n esAcí netobacter
,
las especies
con amino-antagñni cas.
Resistencias. La resistencia a cefalosporinas
puede ser o por p—lactamasas o por perdida de perrneabi—
- 46 -
lidad porbiótico ade todas
ser raros
porinas, dificultando así el paso deltravés de la pared bacteriana hasta lo
formas en tratamientos con cetotaximalos desarrollos de resistencias.
Farmacocinética.difunde bien en loslíquido cefalorraquidInflamadas. La unióndel 40%, posee una vid
dose una concentracióvia intravenosa y deLa excrección renal se
y secrección tubular.
anti -
5 PBP,suelen
No es absorbible por via oral,tejidos pero penetra poco en eleo cuando las meninges no están
a proteínas puede alcanzar nivelesa media de 1 a 2,5 horas alcanzan-n sérica máxima de 102 ug/ml por
20,5 ug/ml por via intramuscular,realiza por filtración glomerular
La cefotencontrandose
antibacterianay 145>.
aximadesacetsimilar
se metaboli1 lcefotaxima
a la cefot
za
con
axima
en el hiuna acti
(142, 143,
Indicaciones terapéuticas.
- Como terapia inicial
con compromiso vitalinfecciones de heridas y
en infecciones gr
(septicemias, neumon
tejidos>.
- En infecciones urinariaspor bacterias multiresistentes.
- Tratamiento
(colagenitis,
complicadas
de infecciones severas
neumonias, pielonefritis >
lizadas, producidas pora cefazolina y penicilinas
- Infecciones
a penicilinas.
bacterias
semi si nteti cas.
severas en pacientes
produci das
localizadas
o genera-
resi stentes
al ergi cos
gado,vi dad
144
aves
i as
- 47 -
- Meningitis por Haemophilus
,
Klebsiellay E.coli
.
- Gonococia, incluidos losproductoras de fl-lactamasa.
ocasionados par cepas
Reacciones adversas. Alergia a cefalosporinas.
5.2.— Netilniicina.
Es un aminogí(un derivado N-etilsisustancia estable e hunidos a hexosas.
icésido derivado de
somicina), se presentaidrosoluble <Fig. 7.>.
la sisornicinacomo sulfato,Ami noazúcares
Mecanismo de aocinoglicósidos inhibierferencia con la
ón a uno o más
ón. Actuaendo la
acti vi dadlugares ri
al iguals< ntesi 5
de losbosómi cos
que los demásproteica por
ribosomas. Supuede además
de inhibir, provocar
al producirse errores
En altas concentracioalteraciones de laen medios alcalinos y
anaerobias (146>.
laen
nesparcon
sfntesis de
la lectura
la netilmic
ed. Es bactmenor activ
proteínas extrañasdel RNA mensajero.
ma puede ocasionarericida muy activo
idad en condiciones
Espectro antimicrobiano.
- En bacterias g.ram-negativas. La netilmicinaes activa frente a un amplio espectro de enterobacterias:E. coli , Enterobacter ~p, Klebsiella ~, Proteus ia.Salmonella ~, Shigella ~p, Serratia ~p, Citrobacter
~p y Yersinia ~p. Tambien es activa frente el meningococo,
gonococo y Haemophilus intluenzae. La netilmicina
es menos activa contra Acinetabacter IP> Bacteroides
ami1 ntuni
II
II
- 48 -
fragilis y otras bacterias anaerobias gram—negativas.
— Enla mayoria deepi dermi di 5
,
St re pt oc oc u
5. faecalis se
bacterias gram-positivas.
las cepas de Staphylococcon otros cocos gram—
pyogenes , Streptococcus
crean resistencias.
Son sensibles
cus aureus, 5
.
positivos como
pneumoniae y
Resistencias. Tieneincompleta con gentamicin
(las cepas amicacin-resist
a netilmicina pero nunca al
una resistencia cruzadaa y parcial con amicacina
entes son siempre resistentes
contrario)
Los mecanismos de resistencia que pueden darseson dos:
- Porgeneralmodifiocomo sfosfotrEstas
inhibir
enzimas inactivantes o modificantes.
todos los aminoglicásidos puedenados en su estructura por enzimas bacteron acetiltransferasas, adeniltransferansferasas y nucleotidiltranster
modificaciones los hacen ineficacesla sintesis proteica bacteriana.
Enser
1 anasasas,asas.
par a
- Por impermeabilidad. Senución en la capacidad de
biótico al interior depor mutación y consí steproteina Hl de los puntosglicrisidos existentes en
Esta proteína bloquea lolos cationes divalenteslugar de unión de los
produce por una dismí-penetración del ant]-
la bacteria, suele seren un bloqueo por lade unión a los amino-
la membrana externa.s puntos de unión de
<calcio y magnesio>,
antibióticos catiénicos
como polimixinas y aminoglicésidos.
-49
-
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ru
e.’1u
r
2
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Farmacocinética. La absorciónen nula, posee una vida media de
unas concentraciones séricas máxidespués de una inyección intrave
netilmicina, mientras que por ina igual dosis se alcanzan niveles de
oral2,5
masnosa
yecci7,1
de lahoras
de 6de
ónmg/l
neti lmi cina
alcanzandoa 8 mg/l
2 mg/Kg deintramuscular
La combinación desm&ticas es muy
25%. Penetramón y circuí
noglicosidos,filtración gílos tubulos.
inistrado enlos riñones,
la netilmicina conbaja, del orden que va
poco en el liquido c
ación fetal. Al igual qla netilmicina se excretaomerular, siendo parcialmen
Se sabe que un 40% deltratamiento a pacientespreferentemente en la c
lasdesd
efalue
porte rami n
seorte
protei rase O hastao ira q u 1 de o,
los demásel rifion
eabsorbi daogí icosí do
deposi taza renal.
Indicaciones terapéuticas.
- Útil en Infecciones producidas por Enterob
o Pseudomonas
.
acteri as
- En pacientes con infecciones urinaribiliar y gastrointestinal, peritonitis,
pleuropulmonares, cutáneas, tejidos
osteoarticulares, septicemia e intecc
pacientes granulop~nicos con cancer,por germenes sensibles al antibiótico.
as
1 nf
tracto
ecci ones
blandos,
iones encausados
Reacciones adversas. Los dosprincipales de la netilmicina sonla nefrotoxicidad. Se han descrito t
de las transaminasas y de las fos
hiperbilirrubinemia, tronibocitosis,
efectos sec
la ototoxianibién un
fatasas alprol ongací
undarí oscidad y
aumento
cal 1 nas
ón del
píaun
pulamiporporadmen
F
- 51 -
tiempo de protombina, exantema y fiebre medicamentosa
(147>.
5.3.- Fluconazol.
Es un antifúngicoestructuralmente de los prien que el anillo imidazól
sustituido por un anillo trila eliminación de un punto
y le confiere una mayor especfúngica desmetilasa. Por ode un segundo grupo triazóly resistencia a la degradacióunidos a las propiedades dendel grupo fenil, han incr
bi s-tri azól 1 co.
meros antifúngicos aico característico hazólico, lo que ha s
de degradación metificidad frente latra par tr
ico han metabóvadas de die me n t a do
te,eleva1 Ica.1 ra
la
Difiere
zól icosa sidoup uestoaból i ca
a enzimala in oducción
do su potenciaEstos cambios,cal sustituido
polaridad del
compuesto, dandoplasm’aticas (Fig
como resul.7 Y
tado una baja unión a proteínas
Mecanismo deser la lesión depermeabilidad de
vitales, lo quey muerte celular de
deleterea es laergosterol como con
tilación del C-llanosterol en ergosC-14 demetilasa,
P-450. (148).
acción. El mecanismo principalla membrana celular, aumentola membrana y pérdida de elprovoca trastornos del nieta
los hongos. La clave de estainhibición de la biosfntesi
secuencia del blociueo de la
4 en el proceso de conversiterol , paso mediado por laque es dependiente del cit
Espectro antimicrobiano. Fluconazolser un potente y eficaz antífúngico in
parecede la
ementosbali smcacción
5 delde s me—
ón deenzimaoc r o mo
ha demostrado
Vivo” frente
- 52 -
a un amplio espectroCandida, Cryptococcus
,
de hongos y levaduras, incluyendo
Aspergillus y dermatofitos.
En pruebas con modelos animales de infecciones
superficiales, como dermatofi tosi s y candi di asís vagí nalse ha comportado con una potenci a de acción hasta 10veces superior a la de ketoconazol . En la candidiasis
sistémica el fluconazol ha resultado ser hasta 100
veces más activo que el ketoconazol y tener una potenciaequivalente a la de anfotericina B y de 10 a 20 vecesmayor que la de ketoconazol
La actividad “in Vitro” de fluconazol frentea ciertos patógenos seleccionados no se corresponde
con su actividad ‘1in Vivo’ en otros modelos de infeccionesanimales, así en un estudio de susceptibilidad con
fluconazol comparado con ketoconazol, este último semostró 16 veces más efectivo frente a distintas especiesde Candida albicans “in Vitro’ mientras que fluconazol
fué 24 veces más efectivo “in Vivo” (149>.
Resistencias. No se han detectado resistencias
man asstenci aazól i cos
aunque algunosde resistencias
estudios parecen
cruzadas con otros
indicar
anti fúngi
gua, su
alta bibro-espientraci o
puedeces.
Farmacaciunión aodi spon
nal ynes.
néti ca.protei nas
ibi lidad,
se excreFi uconazol
El fluces muy
penetra
ta en laes metabo
onazol es
baja propobien en e
orina en
1 i camente
recuperar más del 90% de la dosis
sol ublerci onando
1 fluido
grandesestable,
en orina
priexí
tri
lacos
en aun a
cereconcy sey he
— 53 -
La absorción despuésuntarios humanos es
relativas en piasma
r 1 mg/Kg se obtiene 1estudio de la dist
smo indican que pueiones ocasionacb.,s es como el tracto
de unabuena; sealtas, p.
A ug/ml.rl buci ón
de ser
n ungastrol nt
administración oralobtienen concentra-
e. después de sunii-
Los datos obtenidosdel fármaco en elefectivo frente a
variada numero de
estinal, el tracto
y el sistema nervioso central (150).
demás
fluidodel 60
La mayor
azoles escerebro-eal 80% de
Estudi os(50 mg/dia) han
diferencia
tá en suspinal, se
los niveles
con dosisproduci do
entreni velhan
en
el fluconazolde penetración
alcanzado concentrsuero.
muíuna
tiplespequeña
de
ac umu
y losen el
aciones
tí uconazolladón de
fármaco
de 1,05y 28 regator -5
media en
en el tiempo
2,21 2,37specti vamen
Referenceplasma de
con unosy 2,62 ug
te (PfizerManual, 1
una sola do
picos de
¡ml en 1Central
986>. Elsis fué de
nivelesos dias
Researchti empo22h
Indicacionesen el tratamiento
terapéuticas. Fluconazolde las siguientes micosis
está indicadocandidiasis,
tanto local
candi di asi scomo lasendocardi tiperitonitistanto en suy otras di
indicado en
aquellos
izadas (candidiasis orofaringeas, esofágicas,
oral atrófica crónica> candidiasis vaginal)formas sisténiicas o invasivas (candidemia,
s por Candida, endoftalmltis por Candida
,
por Candida...>; en las criptococosis,
forma meníngea como en su forma pulmonarferentes localizaciones. Igualmente, está
la profilaxis de infecciones fúngicas en
pacientes especialmente predispuestos a padecer
en volci ones
ni strapor el
organi1 nfeccorganourinario
enl,.7
Inde
pl asma
14,vesti -
vida
1!
— 54 -
estas infecciones <SIDA, paci entes oncológicos, paci entestrasplantados,
Reacciones adversas. No se conocen, fi uconazol
suele ser bien tolerado en dosis por encima de
400 mg/dia, pueden darse algunos casos aisladosesfol i ación de la piel y toxicidad hepática.
etc. )
de
- 55 -
2..- OBJETIVOS
- 56 -
OBJETIVOS
Sonmani fi esto
muchos los estudiosque los antimicrobi
en losanos no
los microorganismos para los que sonque además pueden interferir en la f
de las células tagocíticas, actuando
las funciones básicas del fagocitocambios morfológicos y funcionales omicroorganismo invasor, facilitando así s
y fagocitosis por los leucocitos. Estees determinante en aquellos antimicrobiuna mala penetración intracelular yel microorganismo termina cuando este Qlpor el leucocito; muchos de estos
en su interior.
En nuestro trabajo
aspectos:
- En el estudio de la
sobre los fagocitos se utilizódos antibióticos ampliamente
con una discreta capacidad decomo fagocito se escogió al mala primera por su importanteinmune específica (presentador deporque existen muchos trabajos
especíuncióndi rect
o bienn leta
u reoúlti
anos
su atimo e
pueden
hemos estudiado
acción directacefotaxima y
uti 1 izadospenetración
crófago porpapel en
antígenos>con PMN
ficas
microbiamente s
i nduciles en
onoc 1 mimo aspque ti
colón s5 fagoci
sobrev
sino
ci daobreendo
elentoecto
enen
obre
tadoi vi r
estos das
de losnetí lmic
en cli
i ntracel u
dos razola respuy la segy pocos
AM1 na,nica
lar,nes;esta
undacon
macrófagos
Se valoraronlas siguientes
las modificaciones
funciones celulares:
producí das
quesol o
se po
ac tu a n
ne de
sobre
en
- Adherencia a placas MIF.
— 57 -
- Capacidad de movilidad.
Movilidad espontánea.
Quimiotaxis.
- Capacidad
- Capacidad
adherente.de fagocitosis.
En el estudi o del efecto indirecto de los AM
en la capacidad micrabicida del leucocito
además de los dos antibióticos antes mennuevo antifúngico azólico; el fluconazol.debido a la importancia que han adquirido en
tiempos las Infecciones micóticas oportunistamente en pacientes Inmunocomprometidos. Como
se escogieron los PMN <fagocitos profesionalmicroorganismos un bacilo, un coco y un hongo;
se enci onados
Se inclos últs espec
1 eucoc
es> yEscheri
coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans
.
Se valoraron:
- CMI , CISC- Curvas de 1- Cinéticas
previamente t
y C125.
etal i dad.de crecimiento de los microorganismos
ratados con antimicrobiano.
- Susceptibil
tratados con
de los leucoc
idad de los microorganismos
antimicrobiano a la acción
itos polimorfonucleares.
previ amente
microbicida
sayó
un1 uyóirnosial -
itoscomochía
- 58 -
3.- MATERIALES Y METODOS
— 59 -
3.1.- MATERIAL
.
Ani mal es
Para la obtención de macrófagos hemos empleado
ratones de la raza Balb/c tanto hembras como machos
con 12 semanas21 g, suministrados
y con un peso comprendido
por
entre 19 y
la casa Panlab S.A. de Barcelona.
Agua
Se utilizó agua, desioni zada y esteri 1 izada
autoclave.
Solución salina tamponada con
La solución fisiológica utilizada tiene la siguiente
composición por
- CíNa- PO4H2K
- PO4HNa2
Solución
litro:
7,20 g.0,44 g.
1,54 g.
salina
Se preparó disolviendo 9 g. de dNa en un litro
de agua destilada, esterilizando la disolución en auto-
clave y conservandola en nevera a 4~C.
Medio de cultivo para células
Se ha utilizado como medio de cultivo para PMN
en
fosfato
y macrófagos solución fisiologica de Hanks (HBSS),
— 60 —
preparado con la siguiente composición por litro:
- HBSS sin Ca~~ Mg~~ ni NaHCO3.
- CíNa.- KCl
- Na2HPO4.- KH2PO4.- Glucosa.
2H20
8 g.0,4 g.0,048 g.0,06 g.
1,0 g.
- Reactivos adicionales para HBSS completo.
- CaCl2..- NaHCO3.- MgSO4.2- MgCl2.6
0,14 g.0,35 g.
H20 0,16 g.H20 0,1 g.
Preparación de HBSS al 0,1% de gelatina
Un gramoen 100 ml debaño maria paranuación a 90 ml
para obtener ¡-IB
de gelatina purí
agua destiladalicuaría. Se g
de HBSS se leSS con gelatin
fi cada
estgri íuarda en
añade 10a al 0,1%.
(Sigma) sey se calinevera; a
ml de la
disuel veenta al
contí -
gel atí na
Solución isotónica de cloruro amónico
Se pesan:
- Cl NR4..- NaHCO3.
4,16 g.
0,42 g.
Todo se500 ml.
añade en agua destilada estéril hasta
- 61 —
Azul de tripano al 4%
Se pesan 4 gramos de
disuelven en 100 ml de agua des
colorante en polvo y se
ti lada estén 1
Caldo de MUeller—Hinton
suelven 21un litro deiza en autocí
gramos
aguaave a
de caldoestéril, se
1219C durante
MUel 1 er—Hi nton
mezcla bien15 minutos.
Caldo de Triptona—Soja
ven 30 gramoslitro de agua
en autoclave a
de caldoestéril, se
1219C durante
Tri pton a-Sojamezcla bien
15 minutos.
Agar de Mueller—Hinton
Se suspenden 35 gramos
litro de agua destiladaver el medio por completo
9C durante 15 minutos.
de Mueller-Hinton <Oxoid)
estéril y se hierve hastaSe esteriliza en autoclave
Agar de Triptona-Soja
Se suspenden 40 gramos
en un litro de agua destilada
disolver el medio por completo
a l2l~C durante 15 minutos.
de Triptona-Soja <Oxoid>
estéril y se hierve hastaSe esteriliza en autoclave
Agar de Sabouraud
Se suspenden 65 gramos de Sabouraud
un litro de agua destilada estéril y se h
disolver el medio por completo. Se esteriliza
a 1212C durante 15 minutos.
(Oxoid> enierve hasta
en autoclave
(Oxoiy se
Se did) enesteri 1
(Oxoiy se
Se did) enesteri 1
s ue 1un
i za
en undi sola 121
- 62 —
Caldo de YNB (Yeast nitrogen base mediun) al 1% de
glucosa en tampón fosfato
.
Se prepara la siguiente composición:
- Medio YNB <Difco>.
- Glucosa- Cloranfenicol- Sulfato de gentamicina..
A continuación se
tampón fosfato 0,01 M.
3,35 g.5 g.0,2 g.0,02 g.
disuelve todo en 500
Aparatos
.
— Nevera <Zanussi- Autoclave
- Estufa (Se- Espectrofo- Medidor de- Balanza de- Micropipet
- Microscopi- Agitador d
- Centrifuga- Baño de ag
<Selecta Autester>.
lecta)tómetro (Hitachi U-iba>.
pH electrico (Giralt>.
precisión (Precisa 80A -
as fijas y regulables <Gilo óptico (Nikon SE).e tubos (Heidolph Reax 200
de precisión (Selecta Meditación (Selecta Unitronic
200 M>.son).
itroní c )3200 R>.
Material de laboratorio
.
- Cámaras de Boyden- Homocitometro de- Placas MIFfagocitosis.- Filtros de estere
- Tubos de 5 ml con A- Tubos c6nlcos de 1,5tapón incorporado (Labcli
NeubauerSteri 1 i n>
s deEDT
cel ulodesec
mlnics>
para
sa (Milhablesen po
adherenci a
1 i pore)(Labcl i
lipropí 1
y
nies)
ena con
ml de
- 63 -
- Tubos con fondo .cí5nico de 20 ml
- Jeringas estériles de un solo u- Puntas para micropipeta (Soria
- Maten al fungible: Matraces,
y tubos (Simax y Schott Mainz>.
(Labcl ini
so <SoriaGreiner>
pipetas,
cs )Grei ner>
probetas
Reactivos
.
- Alcohol- Alcohol
- Alcohol- Xileno— Caseina- Glucosa-. Cloruro- Cloruro- Cloruro- Cloruro
- Cloruro- Fosfato- Fosfato- Bicarbon- Fosfato- Diff-Qui
- Gelatina- Azul de- Azul de
Panreac)
(Panreac( Panreac
etílicometf 1 icopropflico YPanreac>purificada (Sigma).(Kodak>.
amónico (Sigma).
¡nagnesico (Panreac).sbdico (Parireac>.
potásico <Panreac).cálcico (Panreac).
magnésico (Panreac>.disódico (Sigma>.
ato s6dico (Panreac>.monopotásico <Panreac).
ck <nade>.
(Sigma>.
metileno <Pa
tripano (Mer
Esteri 11 zaci ón
nreac
k)
El material y los medios utilizadosen autoclave a 1202C y 1,5 atniosferas de
15-20 minutos.
se esterilizaron
presión durante
- 64 -
Obtención del suero.
El suero que se utilifagocitosis se obtuvo de
de individuos sanos que seestériles. Se dejó coagulay tras retirar el coágulominutos a 800 g.
zó ensangrerecogir a
se
los estudios de la
venosa de un grupoé en tubos de vidriotemperatura ambi ente
centrifugó durante 20
Posterde cada 10500 ul , con
a utilizarsobrante.
iormente sedonantes y
gelandose a
se descongel
realizaron pooles de
se envasaron en a
- 30~C. La cantidadaba y se deshechaba
los sueroslícuotas de
que se iba
el volumen
Microorganismos
.
dio se utinegativo,
positivo
Todos 1
ara todo el estu5922 como gram—
5923 como gram —
0231 como hongo.
ron y se renovaron cada-Hinton o Triptona-Sola
Saboureaud para candidas.
lizó EscherichStaphyl ococcus
y Candida
mi croorganhoras en
caso de
os
72
en el
ia coliaureus
al bi cansismos se
medio debacteri as
Antí microbianos
.
Se utilizaron una cefalosporina de 3~
axima (potencia de 928 mg/g, sumíni
st Iberica s.a.>, un aminoglicósido,ncia de 586 mg/g, suministrado por Sc
y un derivado azólico, fluconazol (psuministrado por Pfizer, s.a.). Se
concentrados en solución salina y sesu uso posterior.
generación,
strado por
neti lmicina
heri ng-Essexotencia 998
prepararon
congel aron
P
ATCC 2
ATCC 2ATCC 1cultiva
MUeI 1 ery medio
cefotHoech
(pote
s.a.rng/g,
muypara
— 65 —
Los reactivos empleados así como los aparatos
utilizados en cada una de las tecnicas realizadas seran
especificadas durante la descripción de las mi smas
- 66 -
3.2.- METODOLOGÍA
.
3.2.1.- EFECTO DIRECTO DE LOS ANTIMICROBIANOSSOBRE LAS FUNCIONES IMPLICADAS EN LOS MECANISMOSMICROBICIDAS DE LOS MACRÓFAGOS PERITONEALES MURINOS.
3.2.1 .1.— Concentracionesestudiados.
de los antibiñticoS
Para nuestro trabajo se utilizaron al icuotas
(previamente preparadas>concentradas en soluciónde Hanks (HBSS> hastarequeridas (mayores, lguaterapéutica alcanzada en
de cefotaxima ysalinayse diluyeron
alcanzar las concles o menores a la co
pl asma).
neti lmicinaen soluciónentraci onesncentraci ón
Para cefotaxima
12 60 y 120 mg/l y para
las concentraciones fueronnetilmicina 0,5 2 8 y 32 mg/l.
1,2
3.2.1.2.- Obtención y recuento de los macrófagos.
con
di s(siun(Fi
Ratones de la raza Balb/c fueron anestesiadoseter (Analema) y seguidamente sacrificados por
locación cervical. Una vez descubierto el peritoneon abrirlo) se inyectaron 3 ml de HBSS a 42C y a
pH entre 7,3 y 7,4 con agujas y jeringas esterilesg. 8>.
El abdomen se masajeó con suavidad duranteminuto y se extrajo la suspensión de macrófagosdespués se colocó en tubos de plástico a 4~C
temperatura (151>. El recuento celular se realizóuna c&mara de Neubauer o hemocitómetro considerando:
unque
de
en
u-nídLi,o>ao-a-,It5..
a>-ci‘ooa5.-E<oa>ídcl,aO4-,
5-o,aLo
oO)
íd4-
‘o5.-uídII
Eo>
-cia‘ouao>.4-,-coIt6-o,•r
68 -
a> El número de célulcon macrófagos, contadasparte superior e inferior
la fiabilidad a la horatipos célulares que se
peritoneal, se empleó el
esterasas no especi fi cas con
con el método de Koski
al menos el 95% de las céluly el resto eran hematies y 1
b)cada
1,0
Co nt a
al es
La correccióncuadrante de
1,0 x 0,1 mm yr las célulasde 0,4 mm:3. Pa3
por cada mmobtuvi mosorrecci ón
dellaporde
ra co
tuvimos queun volumen deera de 2,5.
asende
dee
anoc.
niorfol ogicamente clos 4 cuadrant
la camara. Para
distinguir losncuentran elálisis cit ico-natil-buti de
152). Según
as obtenidasi nfocitos
volumen se hizo
cámara tenía unastanto un volumen
los 4 cuadrantes,
nocer el número d
en
oquimrato,
ompatib les
e s de lacomprobardistintos
liquido
de lasacuerdo
los resultados,eran macrófagos,
consi derandodimensiones
3de 0,l,mniel volumen
e macrófagospor 2,5 ymultiplicar 0,4
1 mm . Por tanto el factor
La viabilidad cecon el colorante vitalempleadas en los estudisuperior al 85%.
lular seAzul de
os tenían
estudió
Trí pano
siempre
paralel amente
Las célulasuna viabilidad
3.2.1.3.- Adherencia.
estudio dela adherenci a
(MPM) se reali
efectode los
zó de la
de los ant
macrófagossiguiente forma:
i mi crperi t
Se colocaron 100 ,ul
macrófagos ¡mí) en las placentonces 100 ul del antibde las dosis a estudiar,los pocillos controles.
de suspensión celular (1x106
as MIF (Sterilin>. Se añaden
iótico concentrado al dobleremplazandose por HBSS en
quedeal
tot
aside c
Elsobre
muri nos
obí anosoneal es
- 69 -
Después
humedad, se
procedi endose
de 30 minutos de incubación a 37% con
agitan los sobrenadantes vigorosamente,
al recuento de los MPM no adheridos.
El indicela ecuación:
de adherencia (I.A.) se calculó
- MfI.A. - x 100
Mf
en dondenúmero de
M. = numero de macrófagos Iniciales y Mf el
macrófagos en el sobrenadante.
3.2.1.4.- Estudio de la movilidad del macrófago.
- Preparación de la tecnica.
Se empleó unadescrito por Boyden
modificación de
<14).
1 método originalmente
La cámara de(Fig. 9) consiste enpor un filtro (b)
que impiden la cay solo pueden sermigración activa.
de 3 um para laum para los estud
1300>
pol ieti leno (Mark—it-Engineering)
dos compartimentos (a y o) separados
cuyos poros tienen un tamaño talida de las células por mera gravedad
atravesados por los macrófagos porSe emplearon del tipo Millipore M.F;
quimiotaxis (SS. WPO. 1300) y de 8
ios de movilidad espontanea <SC. I>JPO.
Despues de montadadejando libre el ori
para poder proceder
la camara, se selló con
ficio del compartimentoal llenado del mismo
pl asti -
inferior
con una
segun
lina(e)
- 10 -
u1
e
Cd)
Camara de Boyden para(a) compartimento superior; <b)
<c) compartimento inferior;
los estudios de movilidad:
filtro de nitrocelulosa;
Cd) suspensión de macrófagos;
(a)
‘4(b)
e
(c)
(e)
Figura 9.
<e) orificio de entrada para el quimioatrayente.
— 71 —
solución que será distinta según el estudio que
cemos
- Quimiotaxis.
En nue
caseína pur
de Wilkinson
inferior de
stro estudio se utilizó comoificada (sigma> preparada
(153>, tras inyectaría en
la camara se procedió al selí
qu
seg
elado
imioatrayente,
ún el métodocompartimentodel orificio.
El la parte superior300 ul de la suspensión depreviamente fueron incubadoscon HBSS durante 30 minutos a
(Fig
cél ulcon
37~C
9,aselen
d) se depositaron
<2x106 MPM/ml > queantibiótico o bien
baño de agitación.
Una vez llenas las ca3 horas a 379C con un 100%atmosfera de CO
2 del 5%.
a su tinción y lectura.
maras se incubarande humedad relativPosteriormente se
durante
a y unaprocedió
— Movilidad espantanea.
Se siguió el mismo método empleado en el estudio
de la quimiotaxis, con la variante de que se sustituyóel quimioatrayente por HBSSI
- Lectura y recuento.
Tras finala desmontar las
y teñirlos sigui
izar el periódo de incubación,camaras, extraer los filtros,
endo el siguiente proceso:
se procedió
fijarlos
real i -
— 72 —
1- Meta2- Alco
3- Agua4- Hemat5- Agua
6- Agua7- Alcoh8- Alcoh9- Alcoh1 0-Xi lol
nol alhol etfdesti 1
oxi 1 i ndesti 1del grol etíol prool propuro.
50%..
lico al 75%..
ada...
a...ada..1 fo.lico al 95%...p4lico al 98%..pflico/xilol (1:1).
La lectura se realizó ende 100 aumentos y se contóque atravesaron el filtro hasta
en 20 campos al azar.
microscopioel númerollegar a su
con un obje
de macrófcara infer
3.2.1.5.- Adhesién y fagocitosis.
Se utilise depositaronconcentración
incubó duranta 379C, de
no adheridos
zaron1 00~
dee 30
esta
(Hg.
placasnl delxl o6
minutosmanera
10).
MíE (Sterilla suspensión
MPM/ml . ) ; POy se lavé co
se eliminaron
in) en las quecelular <a una
steriormente se
n tampón fosfatolos macrófagos
Paralelamente candidas cultivadas en meSaboureaud se tomaron con un asa de siembra y
uspendieron en HBSS esteril, homageneizándose
pensión. Se ajustaron entonces a una concentra
14X106 Cándidas/ml y despues de comprobar su viabilazul de metileno (viabilidad superior al 95%>
ubaron en dos tipos de soluciones distintos:
diose
la
ci én1 dad
se
6 mm.2 mi n2 mm.2 mm.
2 mm.5 mm.5 mi n5 mm.5 mm.5 mm.
ti yoagosi or
de
ressus
deconinc
—73
—
DO
u.ti,’-’0
0’
-Jr<o
00<
E”,
e
ee1e
-U<civi
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.—r-
Uíd
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I~o
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lo-4-’
1-.‘o
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U-a
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di‘--ti
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U-a->«ci
UE
g,
cd(4-a
-<Ao
>>
,
a‘o.—U
UIt-4-’
1-.c<o
-Ua>
Ito
.a>
a>
It5—o,II-
u-
ee
- 74 -
- En una100 pl de
solución A: Conla suspensión de
40 .ij
c&ndi
1 de HBSS por cadadas <Sin suero).
— En una solución B: Con
100 til de la suspensión de
40 .1V
c&ndi
de suero por cada
das. <Con suero)-
durante 30 minutos, a 379C en bailo de agitación a 60rpm.
A cada pocillo de las placas MIF con los macrófago s
ya adheridos sede la soluciónpreviamente opso
correspondienteEn los pocillos
por HBSS.
les
oa
A
ni z
(al
añadió 1B según
das o no y
triple de
00 nl de HBSS, 100 x¡l
se trabaje con cándidas100 ul del antimicrobiano
la concentración deseada).
control se sustituyó el antimicrobi ano
Despu& de 30a 37~C con humedad,con tampón fosfato
fijaron con metanolcon eosina y hematoxil
ini nutosse proce
a 37~Cdurant e
i na.
de incubacióndió a lavar
Fig. lO~segui
5 minutos y
en estufalas placasdamente se
se tiñeron
Tras dejar transcurrir un período de
24 horas a temperatura ambiente,de 100 macrófagos anotandose
- El número dede 100 macrófagos
se procedió
candidas adheridas en
(capacidad adherente).
secado de
al recuento
un total
- El número de cándidas fagocitadas en un total
de 100 macrófagOs (capacidad fagocitica)
75 -
3.22.- EFECTOACTUANDO SOBRE5. aureus y 0.
MICROBICIDAS DE
INDIRECTO DE LOS ANTIMIGROBIAMOSLA SUSCEPTIBILIDAD DE E. cali
,
albicans FRENTE A LOS MECANISMOSLOS PMN.
32.2.1.- MicroorganiSmOS y antimicrobianos-
Para el estudio se utilizaron un grEscherichia coli ATCC 25922, un grStaphylococcus aureus ATCC 25923 y un hon
albicans ATCC 10231. Los antimicrobianosbetalactámico; cefotaxima, un aminoglic&sidoy un derivado triazólico; fluconazol.Se determi
centración minima inhibitoria (CtlI) para cad
por el método de macrodilución en tubo
el fluconazol se calculó además de la CMI
am- n e g at i y o;am-positivogo; Candida
fueron unnetí lmicina
nd su con—a bacteria154), para
la 0150
y la CI25~
Losen soluc500 pl y
antimi crobíión salina,
se congelaron
anosseen
se prepararon muy concentr
repartieron en alícuotasnevera hasta su uso.
3.2.2.2.- Ajuste deoptica.
Para determinar elo nos servimos
fin se prepararonrepresentación de
acterias y 540 nniufc/ml. Se part
los microorganismos por densidad
número
de un
unasla den
para ca15 de
de ufc/ml en todo el
espectrofotómetro, conrectas patrón resultado
sidad óptica <a 580 nmndidas> frente al número
un tamaño de inóculo
de íO~ ufc/mle YNB-Glucosa
30 minutos en
en cpar
los
aldo de Milelía hongos, seque tras medir
er-Hintontomaron
su DO.
para bacteriasmuestras cada
se plaquearon
ados
de
estudiestede lapara bde
— 76 -
agar de Muellerestufa a 372C.
uento en placa p
bles (Fig. 11)-
- HinAl
ara
ton o Sabouraud y se
dia siguiente se procedideterminar el número de
nc u bar o n
ó a sucolonias
Los valores de
,3 para E. coli ysuspensión de 10
utilizado fué deulo de 5x106 - 101
abde
8
sorbanci a más utí 1 izados fueron0,25 para 5. aureus obteniendose
ufc/ml . En C. albicans el dato0,11 para obtener un tamalio de
ufc/ml -
3.22.3.~ Obtención y recuento de los PMN.
a la obtención de<por extracción
donantes sanos en
acetic acid), sem4 ml a 16 ml de unnato sódico cont
(155), se agitófria a 49C paraa 55 g durantese eliminó el
de la mismauna segunda5 ml de soluci
tubos con
ezcló bien
a soluciónenidos endurante 15
lisar los
10 minutosso br en ad a nte
mezcla antervez. El pelíón de Hanks
los PMN
venosa)
se recogieron
procedentes
EDTA (Ethylenediaminey segul
de cloru
un tubml nuto
en troci
(Fig.y se re
ior repiet finalHBSS> sin
d amen tro amo
o con5 en
e senico
fobañ
tos y se12), a osuspendió
ti endosese rescalcio
muestras
de variostetra-
afiadi erany bicarbo-
ndo cónicoo de agua
centri fugóontí nuaci ón
en la mlel proceso
uspendió enni magnesio
para evitar posibles activaciones de
Las células se mantuvieron ena 4~C hasta poco antes de su uso enbacterias o candidas, momento en el
centrifugar y resuspender en HBSS
Magnesio y un 0,1% de gelatina> ajustan
tración celular de 1O~ cel .Iml en c
los PMN no deseadas1
bafio de
la incub
que se
compí etadose a unamara de
agitaciónación convolvió a
<Calcio,
a concen-Neubauer
enenrec
vi a
de Ouna
mási nóc
Parde sangre
— 77
Log10 ide/ml
Representación de la absorbancia <a 580 nm> en función
0.9
0.7
0,5
0.3
0..1
E
a
ou-,
c
c
1~-ooo‘-4
4)~zLio
6 7 8
Figura 11.de la concentración celular de Escherichia colE
-78
-
OO.
zza-
‘o
1<
u.>o’
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LáioE‘LIa
-u)‘oM
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1~It1-.
o’-‘-
1.>~
E
79 -
(la pureza en PMN
mente se evaluóazul de tripanosuperior al 95%.
fué
su(1
siempre
vi abi lid56) que
superior al 85%>. Paralela
ad celular con el coloranteen este caso fué siempre
3.2.24.— Estudio del efecto con bacterias.
- Determinación de las curvas de letalidad.
Se hicieron para estimar el mayor tiempo de incuba-
ción con antibiótico (4xCMI) que no reducía significa-tivamente la viabilidad bacteriana. Se prepararon suspen-
siones bacterianas de E. coli y 5. aureus en fase expo-
nencial de crecimiento ajustadas a 10 ufc/ml por densidad
optica y se incubaron con 4XCMI de cefotaxima o netil-micina en caldo de MUeller-I-iinton y 5. aureus con 4XCMI de
netilmicina en caldo de Triptona-Soda a 37~C y en bañode agitación. Cada 10—15 minutos se realizaron siembras
de 20 .ul sobre medio agar, se incubaron a 37~C en estufa
durante toda la noche y se procedió a su recuenta en
placa al dia siguiente, los resultados se representeroncomo el Log10 ufc¡ml frente al tiempo de incubación
en minutos-
- Valoración del crecimiento bacteriana en presenciao ausencia de PMN tras el tratamiento antibiótico.
Se tomó una colonia aislresuspendió en 50 ml de caldo
18 horas de incubación a 37~C500 nl de caldo crecido y se
50 ml de caldo, despues de 2a 37~C en baño de agitación
adade
envol
o
en medioMUel ler-H
estufa sevieron a
3(60
agar y se
inton, tras
recogi eronInocular en
horas de incubaciónrpm) las bacterias
- 80 -
alcanzaron la fase exponencron por 0.0. a una concentr
mente se sacó de la neverapreviamente preparado en s
y se diluyó en caldo d
una concentración final
biótico requerido para el
deque
A conticentrífugase añadió
nuacde
(Fi g
Tubo (C);
ión se20 ml
13):
ial de crecimiento,ación de ío8 ufc¡mí -
una alícuota del aolución salina, se
e MUeller-Hinton hast
de 10 veces la dosisestudio (4xCMI)
prepararon(con tapón>
1800 ul de bacterias y
se ajusta-
Paralela-nti bi óti co
descongel óa obtener
de antí-
2 pares de tuboscada una en las
200 ul de caldo
de MUeller-l-4inton.
- Tubo <CX)de Mueller—
1800Iii nton.
ul de bacterias y 200 ul de
- Tubo (AM);biótico dis
1800 uluelto en
de bacterias y 200 ucaldo de Mueller-HI
1 de anti-nton ;4xCM],
- Tubo (AMX>;biótico disuelto
1800 ul de bacterias y 200en caldo de MUeller-HI
Se agitaronen baño de agitacide8
yel icon
bien
ón ay se pusieron60 rpm durante
tiempo (10 — 30 minutos), al
ml de caldo libre de antibiótíc
se centri fugaron durante 10 miminó el sobrenadante dejandose
200 ul de caldo.
a incubar
un corto
final seo a todosnutos a
en todos
a 37~Cperiodo
afladi eronlos tubos
1800 g, seun pellet
A los tubos marcados con X se lespl de HBSS, se resuspendieron y se procedió a
añadió 1600
la deternii-
cal do
ul de
nton;
antí -
4xCMI,
-81
-
‘o-e=
—-4
o
ji—E
5-’
1~T
h4,o
0-.>o’rlJ2E?IID
~J~z?Du
rrrmrrrT
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5.-
cd<A
aq
-di
qlcr
>,-c
i
e-
<uzo,Ij-.
- 82 -
nación de sussin marcar separa detener su
densidadesmatuvi erencrecimiento.
opti cas.
en baño
Los otros dos tubosde agua fria (a 4~C)
Por la relación:
A. obtenida1800 x 200 ul = HBSS-gelatina
A. requerida por añadir.
Absorbanci a.
se calañadir
paralosde
culó la cantidad de HBSS-gelatina que h
a cada uno de los dos tubos sin marcarobtener de nuevo una suspensión ini
ufc/ml. De este modo la concentraciónantibiótico quedó reducida más de 500 veces.
abi a
(C y
cl alresí
queAM)
dedual
Muestras decon antibiótico o
50 jil de
sin tratar
estas bacteriasse añadieron a do
tratadas5 tipos
de tubos:
1.- Con
de suero.
400 nl de HBSS-gelatina y 50 >jl
2.- Conde PMN y
20050 nl
nl dede suero.
HBSS-gel atí na;
de esta forma la relación2:1, la cantidad de suero
opsonización de un 10% y
final bacteria/PMN
requerido para unala concentración
250 A
era
adec
fi nal
de
uada
de
antibiótico diluida más de 5000 veces.
- 83 -
Los 4a 3720 en
periodo deañadieron ay con un pH
tubosbaño de
ti empotubos
de 11
2 tratados y 2 controles> se incubaron
agitación a 110 rpm; cada ciertose tomaron muestras de 20 pl y secon agua destilada esteri 1 a 37~C
para lisar los PMN (157).
Todosrealizaron
los tubosdiluciones
se agitaronseriadas en
vigorosamente y se
solución salina,
tómaron muestrasr de Mueller-Hin
incubación en esplaca expresando
de 20ton por
tufa alos resu
,i.il y se 5
triplicad3720 se prltados como
embraron
o; trasocedió alLog10 ufc
en medio
18 horasrecuento
¡ml
El5. aureus
Tri ptona-
mismo proccon 4xCMi
Soja.
eso antes descrito
de netilmicina
se repitió
pero en caldo
En este estudio se valoraron das efectos:
El retraso
bacterias
ibiótico
utos (t) y
en la cinética de
debido a la previa
Este efecto se eval
se expresó como porcen
crecimiento
exposi ciónuó cada 30taje de retr
en el crecimientomediante la relación:
RC = 100 x ( 1t
<RC) debido al antibiótico
-(St 1 Sc)>
donde St representa la diferencia entre el
de bacterias (previamente tratadas con antia tiempo t y 0< e<presados como Log10
númerobi óti ca)ufc/ml ;
seagadeen
para
de
a)lasantmi n
de
con-60aso
y Sc representa la diferencia entre el número
- 84 -
de bacterias (sin tratar) a tiempocomo Log10 ufc/ml
t y 0, expresados
b) El aumento de susceptipreviamente expuestas connismos microbicidas dese evaluó cada 30—60 micomo el incremento del
los PMN debido al antien porcentajes mediante la
bilidad deantibiótic
los PMN.
nutos (t)
efecto bbiótico
reí ación:
las bacteriaso a los meca—
Este aumento
y se expresóactericida de
ER) expresado
EBt = 100 x
donde Pt representa la diferenciade bacterias viables (previament
antibiótico) incubadas con PMN aexpresados como Log10 ufc/ml
la diferencia entre el número de(sin tratar) incubadas con PMNexpresados como Log10 ufc/ml.
entre el númeroe tratadas con
tiempo t y 0,y Pc representabacterias viables
a tiempo t y 0,
3.2.2.5.- Estudio del efecto con candidas-
- Determinación de la C150, C125 y CMI.
Una suspensión de Candida albicans en 50 ml de
medio YNB (Yeast Nitrogen Base Medlum) con un 1% de
glucosa en tampón fosfato 0,01 M se dejó crecer durantetoda la noche en baño de agitación a 37
9C y 60 rpm.
Al dia siguiente se ajusto la suspensión a una concentra-ción comprendida entre 5x10 y 5x104 ufc/ml por densidad
Pc a)
- 85
óptica ( 0,11 de absorbancia adiluyó, siempre en YNB—glucosa, hde inóculo de 5x103- 5x104 ufc/mltos Uno se ajustá a pH 5.4 yellos se prepararon dos batenuna con 19 ml de la suspensión
antifúngico concentrado 20 vecesfinalmente las concentraciones4 20 100 y 500 ug/ml de fluconazose prepararon añadiendo 1 ml
540 nm Y y luego seasta alcanzar un tamaf¶o
en dos matraces distin-el otro a pH 7,2; con
as de 7 frascos cadade candidas y 1 ml de
para así, poder obteneren estudio (0,16 0,8
1 > . Los frascos control
de caldo YNB—glucosa,
Todos los calde agitación a 60 rsu crecimiento toma
los cambiós de abs
tambi&n se determin
la última concentrac
visualmente turbia la
dospm yndo
orbanó a
én
susp
se incubaron a 379
cada cierto tiempo
muestras de 2 mlcia y transniitancia.
la vez, considerandol
de antifúngico que noensión de O. albicans
.
C en bañose valoró
y midiendoLa CMI
a comodejaba
La concentración ide los datos obtenidosconcentración de antifúngi
criterio:
nhibitonia Opor densidad
co más baja
150 5
ópti cque
e calc
a comocumpí la
%T)(%Tcantroi + N (100 - %Tcontroi)>
en donde %Tcontra 1 esdel control (suspensiónN en este caso vale 1para definir la fraccí
(N) en función de lasin antifúngico (158).
Las valoraciones
hasta las 48 horas.
el porcentajede candidas libre
/2, esta relaciónón de Inhibición
turbidez en los
de crecimiento
dede
fde
t
transmi sión
antifúngico)
ue formuladacrecimi ento
ubos control
se realizaron
ul óla
el
- 86 -
Con un inóculonecesario para su est
hallar su 0150 perodel fí uconazol se optó
el mismo procedimiento
inicial mayor, 5x106—5x107
udio posterior con PMN, sedebido al fuerte efectopor determinar su C1
25. Se
y N en este caso valió i/4.
- Valoraciónpresencia oantifúngico.
del crecimiento deausencia de PMN tras
C. albicans en
el tratamiento
Ellas bacteajustadasa 37
9C enen caldo
en solucobtenidos
estudio se realizóri as pero con algunas
a un tamaño de 5x106 -
baño de agitación aYNB-glucosa, posteri
ión de Hanks (HBSS-ge
por el mismo proceso
del mismovariantes,
SxlC7 uf60 rpm
o r me n t elatina
anteri
modo que para
así las cándidasdm1 se incubarondurante 6 horas
se resuspendió0.1%), Los PMIIormente descrito
se ajustaron a 5x106 cel./mlde 500 áil de C. albicans
antifúngico se añadieron a 2
enpre
tipos
HBSS-gel atí na,viamente trata
de tubos:
1- 400 ~il de HBSS-gelatina y 100 Ml de suero.
2- 150 pl de HBSS-gelat
de suero.
ma, 250 pl de PMN y
de esta man
2:1. Tubospararon deidéntico al
era la relaciónde cándidas sinla misma forma.
descrito anteri
final
previo
El re
o rme nte
cántrat
stopar
con la diferencia de que la siembra yplaca se realizó sobre agar Sabouraud.
dida
ami e
delal
el
/PMN fué de
nto se pre-proceso fué
as bacteriasrecuento en
ufc ¡mlintentó
i nócu loutilizó
muedas
stras
con
100 »l
- 87 -
3.2.3.- ANALISIS ESTADíSTICO.
Se cari tméti calas formula
al cuí ó(Y) y
s habit
para cadadesvi ación
uales para el
grupo de datosestandard (0.
número de datos
la mediaE.) según
manejados.
Parados grupos
compa rarexperi ment
est
ale
adj st i c amen ts, se real
hipótesis a
estabí eci endoselas medias pobí
partir de
como hipóaci onal es
la diferencia entre adel 5%. Así pues se“t” de Student.
mbasuti 1
los par~ruet
tesis nula lay como hipót
un nivel
la pruebacon
izó
ros
i guaes i 5
de sidel
muestral es,ldad entreal ternatí vagni fi caci ónestadfsti ce
En los casos en
la fórmula del estvarianzas muestralesFisher-Snedecor. En
a una distribución Cala prueba del test de
que fué
adfsti comedi ante
necesario,“t”, sela prueba
las muestras que
antescompde
no
de aplicar
araron lasla “F” de
se ajustaban
ussiana (no paramétrica> se utilizó
Wi lcoxon.
Se consideró
cuando el valor de(p) era mayor de 0,05para p<O,OS.
que no habia signifila probabilidad de la
se dié el valor de
cación (n.s.>significación
significativo”
e lasizaron
medías
pruebasdede
— 88 -
4.- RESULTADOS, TABLAS Y GRAFICAS
- 89 -
4.1.- Resultadas obtenidos.
- 90 -
EFECTO DIRECTOLAS FUNCIONESBICIDAS DE LOS
La influencia ddel macrófago analiz
resultados:
DE GEFOTAXIMA Y NETILMICINA SOBREIMPLICADAS EN LOS MECANISMOS MICRO—MACROFAGOS PERITONEALES MURINOS.
e ambos antibióticos en las funciones
adas se muestran en los siguientes
Adherenci a
Las al teraci ones en la adherencia de los macréfagosperi tonealtras unaconcentracse calculó
es murinosincubacióniones deel indice
se estudióde 30 minulos antib
de adherencia.
utilizatos con
ióticos
ndo placas MIElas diferentesPosterí ormente
Cefotaxí ma
respecto a losel análisis esta
afectaba de formaciones ensayadasMIF (tabla II>,
no modificó la
controles <tabdístico demost
significativa a(p>O,05> la
capacidla 1>.
ró quelas dis
ad de adherencia
De igual modo,netilmicina no
tintas concentra—adherencia a las placas
Movilidad espontánea
Los resultados obtenidos en los
movilidad espontánea de los macréfagoscefotaxima y netilmicina se expresaronde células que atraviesan el filtro encampos al azar.
unasi g
netyI
Cefotaxima potencióconcentración terapéutl
nificativa (p<O,05),ilmicina no se observóV~ figuras 14 y 15).
estudios de
incubados concomo el númeroun area de 20
la movilidad espontánea aca de 12 ng/l de forma
mientras que al emplearefecto alguno (tablas II]
- 91 -
Quimiot axis
di sticomomi gr
a un
(p~CprocVy
Tras la incubación dentas concentraciones defactor quimioatrayente
ación dirigida o quimiotaxis.
Cefotaxima produjo un
a concentración superior
0,05>, mientras que net
eso de migración dirigidaVI; figuras 14 y 15).
los macrófagosantibiótico y
caseina, se
aument
a lai lmici
de 1
con
utilizaestudió
o de la
terapéutica,na no interf
os macrófagos
lasndo
la
quimiotaxis
120 mg/lIrió el(tablas
Fagocitosis
El proceso de fagocitosis engloba
fundamentales: la adhesión y la ingesta.
incubaron los macrófagos durante 30 minut
distintas concentraciones de cefotaxima yy después se analizó la adherencia y lacandidas normales o previamente opsonizadas con
Cefotaxima y netilmicina no afectaronmente a la capacidad adherente (p>O,OE>
número de candidas adheridas en 100o sin suero (Tablas VII, VIII, IX y X; fi
dos partesPrimero se
os con lasnetilmicina,
ingesta de
suero.
si gni fi catíesto es,
macrófagosguras 16 yA
va—el
con7>.
La ingesta
con cefotaxima ytivamente (p> 0,fagocitadas en 1de suero (tablas
de candidas pornetilmicina no05), esto es, e
00 macrófagos enVII, VIII, IX y X;
los macrófagosse vió afectada
1 número depresencia ofiguras 16 y
incubados
significa-c5ndi dasausencí a
17>.
- 92 -
EFECTO INDIRECTO DE CEFOTAXIMA Y NETILMICINA
ACTUANDO SOBRE LA SUSCEPTIBILIDAD DE E. coil
Y 5. aureus FRENTE A LOS MECANISMOS MICROBICIDAS
DE LOS LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES(PMN>.
CMI y Curvas de letalidad
Lascefotaxi made 0,12 yde 0,5 ug/ml.
concentraciones mínimas inhibitorias depara E. coli y 5. aureus fueron respectivamente2 Mg/ml mientras que con netilmicina fueron
De las curvas de letalidad realizadas
la CMI) para estimar el tiempo máximo dede E. coli y 5. aureus a los antibióticos s
ello quedaran afectadas sus viabilidades
pudieran producir alteraciones no letales),cieron 30 minutos para cefotaxima y 10netilmicina en caldo de MUeller-Hintoneste último se alargó hasta 30 minutosTriptona-Soja con 5. aureus (tablas XI,
figuras 18, 19, 20 y 21>.
Ci n&ti cPMN
.
(a 4expos
in que
(perose est
m nutosmientras
en caldo
XII y X
veces
1 ci ónporque
able-
paraque
deIII;
as de crecimiento en presencia o ausencia de
Lacon cefen lamás queretrasó
su máxíminutos,
y 48,9%
(Tablas
previa incubación de E. ccli durante 30otaxima aceleró su ciclo de divisiónprimera hora posterior al tratami ento
el control, p 0.05). Con 5. aureus el trasu crecimi ento normal durante 2 horas al
mo en la primera media hora <129,4% a
87% a los 60 minutos, 56,1% a los 90
a los 120 minutos respecto al control,XVI y XVIII; figuras 24 y 26).
ml
n(1
tain
canlo
mi
p•C
n utos
arma 1
04,5%i entozando5 30n uto s0,05>
- 93 -
La capacidad microbicida de los PMN se vióincrementada sensiblemente tras el tratamiento deE. coli y 5. aureus con cefotaxima. En el primer caso
este efecto duró 3 horas (82,7% a los 60 minutos, 87,5%a los 120 minutos y 112,8% a los 180 minutos respecto
al control, p<.O.OS). Con 5, aureus tambiín se detectóeste incremento pero a partir de la primera media hora
posterior al tratamiento antibiótico (120%, 45,7%
y 13,1% a los 60, 90 y 120 minutos respecto a su control,p<O,05) (tablas XVI y XVIII; figuras 24 y 26>.
El
con neti
mientras
produjo
la primera60 minutos
no se aprfiguras 25
previo tratamiento de E. coli y 5. aureus
lmicina condujo a resultados distintos. Asíel tratamiento de 5. aureus con netilmicina
un retraso en su crecimiento normal durante
hora (44,2%a los 30 minutos y 23,1% a los
respecto al control, p< 0h05>, con E. colieció ningún retraso (tablas XVII y XIX;
y 27>.
Neti lmi cinade los PMN durantelos 60 minutos más
5. aureus (89,4% yal control, pca.05>
E
antegdnsulos
ura
aumentó la capac1 hora tanto con
que el control , p27% a los 30 y 60
(tablas XVII y XIX;
1 previo tratamiento de10 minutos en caldo deefecto tanto a nivel
susceptibilidad a losleucocitos pol i morfonucí e
28>.
idad microbicida
E. colí (62% a<0.05) como con
minutos respectofIguras 25 y 27).
5. aureus con
Triptona- So jade su crec
mecani smosares humanos
neti lmici nano ocasionó
imiento como
mi crobí ci das(tabla XX
‘4
durni nade
fi g
- 94 -
EFECTO INDIRECTO DEL FLUCONAZOL ACTUANDO
LA SUSCEPTIBILIDAD DE Candida albicans
A LOS MECANISMOSMICROBICIDAS DE LOS PMN.
Debido a que el fluconazol
a la hora de escoger la concentradincubación adecuados para el tratamise calculó su CMI y la C150 parade tiempo ensayando con varias
antifúngico en caldo Yi~B al 1% dey 7,2 (0,16 0,8 4,0 20 100 y 500 ug/ml>.
es fungiestático,
ón y el tiempo deento de O. albicans
distintos períodosconcentraciones deglucosa a pH 5,4
A pH ácido avisualmente) fué demientras que a pH nigual que la ~
1 as4,0
e utroA las
24 horas 1pg/nil y la
la CMI fué48 horas
a CMICI 50
dede 1
(determinadade 20 »g/ml
0,8 pg/ml alncubación los
valores dea pH 5,4 y
Estos
de inóculo
CMI y C150 erande 4,0 ug/ml a p
resultadosde 5x10
3-5
i guH 7,
ales, siendo2 (tabla XIV;
se obtuvieronx104 ufc/nií, c
conomo
defi g
100 »g/mlura• 22).
un tamañonec e si t ab amos
un inóculoPMN y la
tamaño della CMI y
ufc/mluna C1
50
tamaño de(4 ng/mlconcentrac
de cándidas mayor paraactividad del fluconazol
inóculo y del pH del mediola C150 para un tamaño d
Como resultado final yentre las concentraciones
inóculo se optO por laa las 6 horas de exposiciión y tiempo de exposición
el estudio con loses dependiente delse opté por repetir
e Inóculo de 5x106-
visto que no habiaensayadas para ese
0125 a pH neutroón continuada> comopara el tratamiento
de las cándidas (tabla XV; figura 23).
Como resultado se esta exposicióne incubar las cándidas en HBSS-gelatlna
SOBRE
FRENTE
trascon un
lavar
10%
- 95 -
de suero, se detectó un retraso en su crecim4ento
durante las tres horas sucesivas (72,4%, 60%
a los 60, 120 y 180 minutos respecto a su cpC 0,05>. Tambi6n aumento su susceptibilidada los mecanismos microbicidas de los leucocitos poínucleares humanos en la primera hora (43,8% aminutos más que el control, p < 0,05> (tabla
figura 29>.
normaly 550/o
ontrol
frenteimorfo-
los 60XXI;
- 96 -
4.2.— Tablas.
- 97 -
Efecto de cefotaxima en la adherencia de los macrófagos.
Concentraciones
(mgr/1)
I
Indice de
Adherencia
% del valor
basal
P
0 95+3 100%
1,2 94 + 3 98,9 % n.s.
12 96 + 1 101 % n.s.
60 95 + 1 100 % n.s.
120 96 + 1 101 % n.s.
*
Los resultados se expresan como la X + SD.
Porcentaje de macrófagos adheridos:
Grupos de 9 - 10 ratones.
P refleja las diferencias entre
n.s. no significativo <P>0,05>
el control y los grupos
Tabla 1--
- Mf
Mi
tratados
3—
- 98 -
Tabla II.- Efecto de la netilmicina en la adherencia de los
macrófagos.
*
Concentraciones
(mgr/l>
Indice de
Adherencia
% del valor
basal
F
O 99+4 100%
0,5 98 + 6 99 % n.s.
2 97+4 98% n.s.
8 98 + 6 99 % n.s.
32 99 + 7 100 % n.s.
Los resultados se expresan como X + SO.
Porcentaje de macrófagos adheridos: 100 Mi - Mf
Mi
Grupos de 7 - 8 ratones.
P refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados1
n.s. no significativo (P,0,Q5).
*
- 99 -
Tabla III.- Efecto de la cefotaxinia en la Movilidad Espontáneade los macrófagos.
*
Concentraciones
(mgr/1)
Movilidad
Espontánea
% del valor Basal P
0 10+3 100%
1,2 9+4 90% a
12 19 + 6 190 % s.
60 11 + 3 110 % n.s.
120 12 + 3 120 % n.s.
Los resultados se expresan como X + SD.
Grupos de 7 - 8 ratones.
P refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo (R’O,05).
s. significativo (P<O.05>.
*
- loo -
Tabla IV.- Efecto de la netilmicina en la Movilidad Espontanea de
los macrófagos.
*
Concentraciones
(mgr/1)
Movilidad
Espontánea
% del valor Basal P
0 19 + 7 100%
0.5 22 + 7 115 % n.s.
2 14+5 73,6% n.s.
8 25 + 9 131 % n.s.
32 19+6 100% n.s.
Los resultados se expresan como + SD.
Grupos de 7 - 8 ratones.
P refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo (P.O,05>.
*
- 101 -
Tabla V.- Efecto de la cefotaxinia en la Quimiotaxismacrófagos.
*Concentraciones
<mgr/1)
Quimiotaxis % del valar
Basal
P
0 33+9 100%
1,2 21 + 8 63 %
12 26+8 78% n.s.
60 36 + 10 109 %
120 59 + 16 178 %
Los resultados se expresan como -~ + SD.
Grupos de 7 - 9 ratones.
1’ refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo (P>0,05).
s. significativo (p<0.0S>.
de los
*
- 102 -
Tabla VI.- Efecto cte la netilmicina en la Quimictaxís de los
macrófagos.
Concentraciones
<mgr/1)
QQuimiataxis % del valor
Basal
P
0 7+2 100%
0.5 8+2 114% rus.
2 6+2 85,7% n.s.
8 7+2 100% n.s.
32 9 + 3 128,5 % n.s.
Los resultados se expresan como X + SD.
Grupos de 7 - 8 ratones.
P refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo (PzO.05).
*
103 -
Tabla VII.- Efecto de cefotaxinia en la capacidad de adherecia
y fagocitosis de 105 ~iacrófagosen ausencia de suero.
Concentraciones
<mgr/l)
Capacidad<í>
Adherente
P Capacidad<2>
Fagocitosis
0 39+13 . 11+3
1,2 41 + 12 n.s. 6 + 4 rus.
12 35 + 10 n.s. 9 + 3 n.s.
60 38 + 11 n.s. 6 + 5 n.s.
120 32 + 18 rus. 7 + 5 n.s.
* Los resultados se expresan como la X + 3D.
5’ refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo (P~0,O5).
(1) Grupos de 7 ratones.
(2) Grupos de 6 - 8 ratones.
- 104 -
Tabla VIII.- Efecto de cefotaxima en la capacidad de adherencia
y fagocitosis de los macrófagos en presencia de suero.
Concentraciones
<mgr/l>
Capacidad<í>
Adherente
P Capacidad <2 )*
Fagacitosis
0 41 + 11 38 + 6
1,2 31 + 15 n.s. 35 + 7 n.s.
12 30+17 n.s. 34+9 n.s.
60 42 + 12 n.s. 38 + 10 n.s.
120 32 + 14 n.s. 36 + 10 n.s.
Los resultados se expresan como la X+ SD.
P refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo (P>0,05>.
<1) Grupos de 16 ratones.
<2> Grupos de 17 ratones.
*
- 105 -
Tabla IX.- Efecto de netilmicina en la capacidad de adherencia
y fagocitosis de los macrófagos en ausencia de suero.
Concentraciones
<mgr/1>
Capacidad
Adherente
5’ Capacidad<2>
Fagocitosis
0 31 + 7 18 + 10
0,5 29 + 7 rus. 12 + 7 n.s.
2 25 + 7 rus. 17 + 6 n.s.
8 20+6 rus. 12+4 n.s.
32 25 + 9 rus. 12 + 4 n.s.
*
Los resultados se expresan como la X + SO.
P refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo <P>0,05>.
(1) Grupos de 7 - 9 ratones.
(2) Grupos de 6 — 8 ratones.
- 106 -
Efecto de la netilmicina en la capacidad de adherencia
y fagocitosis de los macr6fagos en presencia de suero.
Concentraciones
(mgr/1>
Capacidad<1~
Adherente
P Capacidad<2>*
Fagocitosis
0 39 + 12 . 51 + 17
0,5 36 + 10 n.s. 48 + 14 n.s.
2 32 + 7 n.s. 45 + 7 nasa
8 30+8 n.s. 53+16 n.s.
32 35 + 14 n.s. 59 + 14 n.s.
* Los resultados se expresan como la Y + SO.
P refleja las diferencias entre el control y los grupos tratados.
n.s. no significativo (P=0,05).
(1> Grupos de 8 ratones.
(2) Grupos de 8 - 9 ratones.
Tabla X.—
107 -
Curvas de letalidad de Escherlchia coilcefotaxima y netilmicina en caldo de Hueller
con 4xCMI de
Hinton.
Tiempo control cefotaxima tiempo control netilmicina
0 7.90 + 0.03 7.90 ±0.03 0 7.86 +0.07 7.86 + 0.06
15 7.97 10.05 7.882 0.04 10 7.94 ±0.07 7.81 ±0.03
30 8.001 0.06 7.71 ±0.04 20 8.12 ±0.04 7.27 ±0,05
45 8.08±0.04 7.30 ±0.02 30 8.19 ±0.07 5.80 ±0.06
60 8.19 ~.06 6.40 ±0.06 40 8.23 ±0.03 5.16 10,02
~, los resultados se expresan en Log10 ufc/ínl como X + SO de 6 ensayos.
Tabla XI.-
- 108 -
Tabla XII.- Curvas de letalidad de Staphyl ococcus aureus con 4xCMIde cefotaxima y netilmicina en caldo de Mueller Hinton.
-Tiempo control cefotaxima tiempo control netilmicina
0 7.76 ±0.01 7.76 ±0.01 0 7.80 ±0.08 7.80 ±0.08
15 7.99±0.05 7.71 10.01 10 8.06 10.18 7.45 ±0.07
30 8.04±0.04 7.59 ±0,01 20 8.19 ±0.02 6.69 ±0.15
45 8.23 ±0.05 7.17 ±0.03 30 8.39 ±0.22 6.08 ±0.01
60 8.51 ±0.01 6.50 10.19 40 8.71 ±0.04 5.77 ±0.06
~, los resultados se expresan en Log10 ufc/m1 como X + SI) de 6 ensayos..
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U
ji
1
- 109 -
Tabla XIII.- Curva de letalidad de aureus con 4xCML
de netilmicina en caldo de Triptona-Soja.
Tiempo control netilmicina
0 7.87 ±0.01 7.87 ±0.01
10 8.18 ±0.07 7.85 ±0.01
20 8.33 ±0.02 7.69 ±0.02
30 8.57 ±0.03 7.37 ±0.03
40 8.87 ±0.01 6.66 ±0.13
~, los resultados se expresaren Log10 ufc/nil como X + SO de 6 ensayos.
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118 -
4.3.— Gráficas.
119 -
Figura 14. Indice de movilidad
quimiotaxis (columnas rayadas>
de ratones Balb/c, incubados con
porcentaje del valor basal.
espontanea (columnas blancas) y
de macráfagos peritoneales murinos
cefotaxima. Indice representado como
Grupos de 7 - 8 ratones. 0, significativo (pC,05)-
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Figura 15. Indice de movilidad
quimiotaxis (columnas rayadas) dede ratones Balb/c, incubados concomo porcentaje del valor basal.
espontanea
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(columnas blancas) y
peritoneales murinos
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Grupos de 7 - 8 ratones.
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- 122 -
Figura 16. Efecto de la cefotaxima en la capacidad de adherencia
y fagocitosis de los macrofagos peritoneales murinos en presencia
y ausencia de suero. Cada columna representa el número de candidas
adheridas o fagocitadas por 100 macráfagos.
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Figura 17. Efecto de la netilmicina en la capacidad de adherencia
y fagocitosis de los macrófagos peri toneales mmi nos en presenci a
o ausencia de suero. Oada columna representa el número de candidas
adheridas o fagocitadas por 100 niacrófagos.
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- 127 -
Figura 18. Curva de letalidad de Escherichia coli con 4xCMIde cefotaxima en caldo de Mueller Hinton. Las bacterias se
incubaron durante 60 minutos con 4xCMI de cefotaxima icorel objeto de determinar el tiempo máximo de exposición a la
que podia estar sometida la bacteria sin comprometer
sensiblemente su viabilidad; cada 15 minutos se tomaron muestrasy se procedió a su recuento en placa al día siguiente.
Control (El’) y tratado (U.>. Cada punto representa el valor
medio de 6 ensayos expresados en Log10 ufc/ml.
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Figura 19. Curva de letalidad de
de netilmicina en caldo de Muelí
incubaron durante 40 minutos con
el objeto de determinar el tiempo
que podia estar sometida la
sensiblemente su viabilidad; cada 10y se procedió a su recuento en placa
Escherichia coil con 4xCMI
er Flinton- Las bacterias se
4xCMI de netilmicina con
máximo de exposición a labacteria sin comprometer
minutos se tomaron muestrasal dia siguiente.
Control ( A. > y tratado ( A ). Cada punto representa el valor
medio de 6 ensayos expresados en Log10 u-Fc/ml.
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Figura 20-. Curva de letalídad de Staphylococcus
4xCMI de cefotaxima en caldo de Mueller Hinton-.
se incubaron durante 60 minutos con 4xCMI de
el objeto de determinar el tiempo máximo de
que podía estar sometida la bacteria
sensiblemente su viablidad; cada 15 minutos se
y se procedió a su recuento en placa al dia sig
aureus conLas bacterias
cefotaxima con
exposición a la
sin comprometer
tomaron muestras
ulente-.
Control ( E.) y tratado (• > fi Cada punto representa el valor
medio de 6 ensayos expresados en 1og10 u-fc/ml
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- 133 -
Figura 21. Curvas de letalidad de StaphylococcLis aureus con
4xCMI de netilmicina en caldos de Mueller Hinton y Triptona-’Soja. Las bacterias se incubaron durante 40 minutos con 4xC$1Ide netílniicina en dos caldos distintos con el objeto dedeterminar el tiempo máximo de exposición a la que podia estar
sometida la bacteria sin comprometer sensiblemente su viabilidad;
cada 10 minutos se tomaron muestras y se procedió a su recuentoen placa al día siguiente.
Caldo de Mueller Hinton: controlde Triptona—Soja: control (A.)representa el valor medio de 6
ufc/ml.
(El.) y tratado <K)Sy tratado (A-.). Cada
ensayos expresados en
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— 135 —
Figura 22. Efecto del incremento de lafluconazol en el crecimiento de Candida
YNB-Glucosa a pH 7,2 <a) o pH 5,4 (b) con unde 5x103 - 5x104 u-Fc/mí-.
Las concentraciones (en mgr/1> fueron: 0,16
4,0 (u>, 20 <*>, 100 <P.) y 500 (*>. Control
concentración dealbicans en caldo
inóculo de partida
<o>, 0,8 (A>,
(A).
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137 -
Figura 23. Efecto del incremento de la
fluconazol en el crecimiento de CandidaYNB-Glucosa a pH 7,2 (a) o pH 5,4 (b) con unde 5x106 - ufc/ml.
concentración de
albicans en caldo
Inóculo de partida
Las concentraciones (en mgr/l) fueron : 0,16 (El), 0,8 (A),
4,0 <U), 20 (*), 100 (~.) y 500 (*)E Control (A>.
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- 139 —
Figura 24. Efecto de la previa exposición de Escherichia coil
con cefotaxima en su cinética de crecimiento asi como en sususceptibilidad frente a los mecanismos microbicidas de les
leucocitos en presencia de suero. Ecoli se incubó con 4xCMI
de cefotaxima durante 30 minutos en caldo de Muel ler Hinton
seguidamente se eliminó el antibiótico por centril’ugacíórly las bacterias tratadas se resuspendieron en HBSS-gelatiflacon suero (5) o una mezcla de suero y PMN ( • >. Paralos controles se utilizaron bacterias sin tratar a los que
se añadió suero (A) o suero y PMN < * >. Los resultadosse representan en Log10 ufc/ml como X + SO. Grupos de 8
indíviduos<
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Figura 25. Efecto de la previa exposición de
con netilmicina en su cinética de crecimien
su susceptibilidad frente a los mecanismos
los leucocitos en presencia de suero. E. coli
4xCMI de netilmicina durante 10 minutos en calHinton, seguidamente se eliminó el antibiótico por
y las bacterias tratadas se resuspendieron en
con suero <A) o una mezcla de suero y PMN
los controles se utilizaron bacterias
se añadió suero (1..> o suero y P~”1N
se representan en Log10 ufc/ml como _individuos.
Escherichia coli
to así como en
inicrobicidas de_______ se incubé con
do de Mueller
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sin tratar a los que* ). Los resultados
>< + SO. Grupos de 8
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Figura 26. Efecto de la previa exposición de Staphylococcus
aureus con cefotaxima en su cinética de crecimiento así comoen su susceptibilidad frente a los mecanismos microbicidas
de los leucocitos en presencia de suero. S. aureus se incubó
con 4xCMI de cefotaxima durante 30 minutos en caldo de Mueller
Hinton, seguidamente se eliminó el antibiótico por centrifugacióny las bacterias tratadas se resuspendieron en HBSS-gelatina
con suero (U.) o una mezcla de suero y PMN . ( • )‘ Para
los controles se utilizaron bacterias sin tratar a los que
se afiadió suero <A.) o suero y PMN ( * ) . Los resultados
se representan en Log10 ufc/ml como X + SD. Grupos de 8
individuos-.
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p~
~4
q9
i,An
ua
UP
pE
IJU
A
- 145 -
Figura 27. Efecto de la previa exposición de Staphylococcus
aureus con netilmicina en su cinética de crecimiento así como
en su susceptibilidad frente a los mecanismos microbicidas
de los leucocitos en presencia de suero< S-. aureus se incubé
con 4xCMI de netilmicina durante 10 minutos en caldo de ~1ue11erHinton, seguidamente se eliminé el antibiótico por centrif’ugación
y las bacterias tratadas se resuspendieron en HBSS-gelatlnacon suero <5> o una mezcla de suero y PMN ( ~). Para
los controles se utilizaron bacterias sin tratar a los que
se añadió suero <A.> o suero y PMN ( .* ) . Los resultados
se representan en Log10 ufc/ml como X + SD. Grupos de 7
individuos-.
-146
-fi’u>o-4-)=eoo-
ZIdE-
1-
LW/3J.fl
sna
~n
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oa> t4J
u,
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A
147 -
Figura 28. Efecto de la previa exposición de Staphylococcus
aureus con netilmen su susceptibi
de los leucocitoscon 4xCMI de netilSoja, seguidamente
y las bacterias
con suero < Ulos controles se
se añadió suero
icina en su cinética de crecimiento asi comolidad frente a los mecanismos microbicidas
en presencia de suero. S. aureus se incubó
micina durante 10 minutos en caldo de Triptona-
se eliminó el antibiótico por centrifugacióntratadas se resuspendieron en HBSS-gelatina
o una mezcla de suero y PMN < • )~ Parautilizaron bacterias sin tratar a los que
A ) o suero y PMN ( * ). Los resultados
se representan en Log10
individuos.
uit/ml como X -4- SD. Grupos de 6
-148
-
o(.1u
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A
- 149 -
Figura 29. Efecto de la pregla exposición de Candida albicaris
con fluconazol en su cinética de crecimento así como en su
susceptibilidad frente a los mecanismos inicrobicidas de los
leucocitos en presencia de suero. C. albicans se incubé con
4 mgr/ 1 de fluconazol durante 6 horas en caldo YNB—Glucosa,seguidamente se eliminó el antifúngico por centrifugación
y las candidas tratadas se resuspendieron en HBSS-gelatina
con suero (5.) o una mezcla de suero y PMN <-.9 >.Para los
controles se utilizaron candidas sin tratar a los que se afladié
suero (A) o suero y PMN <~* ). Los resultados se expresan
en Log10 u-fc/ml como X + SD. Grupos de 8 individuos.
150-
eCC
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—
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~á
Ej
tiaU
P[D
EIJE
A
— 151 —
5.- DISCUSION
- 15? -
ALGUNaS COMENTARIOSSOBRE LA METODOLOGÍAEMPLEADA.
La confrontad
de la infección y
tejidos: pulmones,
estos, el peritoneo
incluso en ausenci
nos permite contar conefectos de la quimioterapí
ón entre los microorganismoslos macrófagos ocurre en cl
higado, pleura, peritoneo
es una fuente de células fag
a de inflamación, accesible
un modelo para estudi
a en los macrófagos.
causantes1 ferentes
etc. DeOC 1 ticas
y que
ar los
Se utilizaron niacrófagos
solo animal, mediante
estimul ación, podíamos
realizar una serie de ex
ar bastante homogénea.
de un
preví ay así
cel ul
en los quIngestiónen compara
(151).
agentede un
empleacon az
de ratones Balb/c porque
lavado peritoneal y sin
obtener hasta 4x106 ceLlini
perímentos con una población
Se eligieron animales jovenes, de
e la adherencia y la capacidad
de partfculas por los macró-Fagosción con los procedentes de ratones
12
deera
más
semanas,unión e
mejor,viejos
Empleamos C. albícans por su importancia como
patógeno oportunista, por otro lado se tratamicroorganismo resistente a los 2 antibióticos
dos, lo que se comprobó viendo su viabilidadul de metileno, que era siempre superior al 95%.
Las concentraciones de los antiuvieron de los niveles que se al
a administración de las dosis est
bí óti cas
canzaronándard
empleados
en plasma
En la preparací
cas que empleanpolímeros, tal
ón de losdextrano o
como indica
PMN no se
gradientes dun trabajo
utilizaron
e densidadpublicado
se obttras 1
técnicon
- 153 -
por Eggleton,
los efectos
los leucocito
en agarosa,irreversible
El ficolí yde su capací
superficies d
Gargan y Fisher en 1989 (155
que estos productos puedens, así el dextrano puede inhibir
estimular su metabolismo y uni
a su superficie alterando sus
el percolí pueden ocasionardad de adherencia y extensión
e plastico y cristaL
son varios
producir ensu migración
rse de forma
propiedadesuna perdida
celular en
Existen también otros efectos
el grado de pureza
restos de polisac
en donde los PMN
morfológicas y fun
relacionados
de estos polímeros, así se
áridos bacterianos en lote
así aislados presentaban
cionales.
encont
s de fal terac
Por todo
de separación pestudios quecon el balase demostró
células se r
ello nosotros optamos por
or cloruro amónico porque siindican una capacidad de
nce electrolítico del PMN
que este efecto era reversI
esuspendian en medio fisiológico-.
labien
i nter
(155>
ble
técnicaexi sten
ferencí a
tambi en
cuando las
Para obtener una lisis complete-utilizó la tecnica del agua b&sica des
y cols. (157), estudios preliminareS
en esas condiciones (pH 11 y 37~ de
conseguía una lisis total de los PMN
la viabilidad bacteriana de E-. ccli
,
C. albicans-
.
de los PMN secrita por Gargan
demostraron quetemperatura> se
sin comprometerS. aureus y
con
raron
icol 1iones
- 154 —
EFECTO DIRECTO DE CEFOTAXIMA Y NETILMICINA SOBRE LAS
FUNCIONES IMPLICADAS EN LOS MECANISMOS MICROBICIDAS
DE LOS MACRÓFAGOSPERITONEALES MURINOS.
Los
capaci dad
represeflt
frente a
enfermos
importan
cifi cas
fagocí
para
laan
una
tos (neutr
fagocí tar
pri mera
invasión b
neutropéni cos
cia de mantener
(159>-.
df
y11 neacte
ilos y monocitos> por su
destruir microorganismos>
a de defensa del huespednana. Las infecciones de
han puesto eintegras estas
n evidenciadefensas me
laspe-
los1 nt
nucci c
gí i
En
que
erfeni
1 eareslina,
cósí dode esosTambí en
165, 166>.
la bibliografía hay numerosos trabajos en
se demuestran como los antímicrobianos pueden
r con las funciones de los leucocitos polimorfo—
humanos (160, 161). Así eritromicina, tetra—
rifampicina, cloranfenicol y ciertos amino—
£ pueden inhibir la actividad quimiostática
granulocitos ‘inpueden alterar su
Vivo (126,capad dad
162
bact
163,en ci da
164).
<124,
La falta de conocimientos sobre el macrófago,como su importancia como célula presentadora de
enos y secrección de mediadores solubles, nos
a seleccionarla en la realización de este trabajo-
ello se utilizaron un betalactámico (cefotaxima)
aminoglicdsido <netilniicifla) fi
Las -funciones del
dad de adherencia,tosi 5
macrófago
movilidad,
estudiadas fueron:
opsOflizficiófl y
asiantfg
llevóParay un
capacifagocí
- 155 -
La adherencia es una necesi
desis de las células fagocitic
Ello constituye el primer paso
fagocitosis de los agentes infec
después de haberse adheridos a
se dirigen al foco de infección
espontáneos y a favor de un
de sustancias quimiotácticas.
pueden ser reproducidas Em
cefotaxima y netilmicina podian
dad previ
as hacia
para que
ciosos -
la pared
por medio
gradiente de
Dado que estas
Vitro’, se
afectar
a a la diapé-los tejidos.
acontezca la
Los macró1~agos
de los vasos,de movimientos
concentración
propi edades
analizó sia estas funciones.
Ni cefotaxima ni netilmicina alteraron 1
de adherenci a al plástico de los macról’a
resultados contrastaron con los obtenidos, con
polimorfonucleares <PMN>, por Rodriguez y c
utilizando cefmetazol, cefotaxima e imipenem.
y cols. (168) ensayando netilmicina si dete
incremento en la adherencia. La explicacióndiferentes resultados obtenidos podria estar
metodol ogí a empí eada, ya que estos trabajos se r
por el método de adherenci a a i bras de nayl on
por McGregor y cols (169).
a capacidad
gos, Estosleucocitos
ols (167)
Seklecki
ctaron Un
de losen la
eal izaron
descrito
En relación con la capacidad de
para moverse orientadamente en función
observamos que el mayor valor de los
tácticos para cefotaxima fué con 120que para la movilidad espontánea fué deencontrandose ningún efecto para el
concentraciones ensayadas.
los
de un
indice
ng/ml
12 pg
resto
macrófagosgradiente,
s quimio-
mientras
¡mil, no
de las
s trabajos
ámicos sobre
conclusiones
real
la
muy
zados por
movilidaddispareS;
otr
de
as¶
os
los
Fi
autores con
PMN humanos
etta y cols.
Lo
act
an
betal
1 ndi c
- 156 -
(131>, ensayando
no encontraron
ni sobre la
al igual que
con cefotaxi
Un grupo
potenciado
mientras
con cefot
(131, 171,
con cefotetam, ceftazidima y
efecto sobre la movilidad
quimiotaxis de monocitos yBelsheim y Gnarpe (170> en la
ma o Majeski y cols. (165> conde investigadores describieron
r de la quimiotaxis con betalactgni
que otros encontraron un efecto
axima, cefoperazona, moxalactani y
172, 173).
moxalactam,
espontánea
neutrófi los,
quiniotaxi s
cefamandol
un efecto
icos (167)1 nhi bi dar
ce fm e tazo 1
En la exposición previa de los macréfagos a
distintas concentraciones de netilmicina, no detectamos
ningun efecto destacable ni en la movilidad espontánea
ni en la quimiotaxis. Estos resultados confirman los
obtenidos por Forsgren y Schmellng (126) con kanamicina
y gentamicína y los de Burgaleta y Moreno <172> con
amikacina, sisornicina y tobramicina. Sin embargo .Seklecki
Khan y Goodhart con amikacina, kanamicina, gentamicina,
tobramicina y netilmicina hallaron efecto inhibidor
de estas funciones en PMN (162, 168, 174)fi
Las diferencias obtenidas por los investigadores
citados, puede radicar en el
por la técnica de migraci&n
Nelson (175), o por el método
tan como parecen indicar losy el más reciente de Bignold <1
Para el reconocimiento
ser fagocitado, los macréfagos
la opsonización o adherencia
caracteristica del macrófago, a
y la movilidad, depende de
método e
en agarosade c~mara
trabajos77) fi
mpl
de
de
del material
se unen al mi
i nmunol 6gi ca
1 igual que
estructuras
eado ya
descrito
Boyden
Qule
sea
por
(14>,
(176>
que va a
smc mediante
(178). Esta
la adherencia
de membrana,
- 157
pero a pesar de
resulta necesar
funcional subsig
La opsonde receptores
del macrófago
opsonización enla existencia y
indicados
ser una propiedad básicamente
la para llevar a cabo la
uiente: la fagocitosis.
i zac i ‘5nFc y CSb
(179>;esta
de c
estructural
acti vi dad
se realiza gracias a la presenciadel complemento sobre la membrana
por tanto el estudio de lacélula es una forma de detectar
uantificar el número de receptores
Los resultados hallados, tras el recuento del
número de candidas adheridas en 100 macr6fagos, indicaronque ni cefotaxima ni netilmicina estimularon esta
capacidad. De igual forma la fagocitosis de Candida
albicans por macrófagos peritoneales tampoco se vié
afectada, pero si fué fundamental la presencia de suero
para incrementar la fagocitosis como indican los
resultados. Lehrer y Cline (80) indIcaron la necesidad
de la presencia de factores termol~blles en el suero
necesarias para una adecuada opsoni zaci ón y consi gui ente
fagocitosis.
Tras
nuclearesBurgaleta
alguno ni
capacidad
Rodríguez
cois. con
tratar previamente a los
con moxalactam, gentami
y cols. (172, 173> no
en la fagocitosis de CE
microbicida. Iguales r
y cols. con cefmetazolnetilmicina (166>.
leucocitos
cina y
encontra
al bí cansesu Ita dos
(167) y
PO
cefron
niobt
Sekl
1 imorfo-
otaxf ma,efecto
en suuvi eron
eckl y
Ferrari y cols (130) hallaron
la fagocitosis y muerte de 0. albicans
de gentamicina, tobramicina, amikacina,
inhibición de
en presencia
si somicí na
- 158 -
y ribostatina por PMN. El previo tratamiento de
alveolares con aztreonam y netilmicina no
la fagocitosis de partículas de zimosán (180
y Midtvedt observaron una potenciación de la
de Escherichia colí por neutrófilos humanos
incubados con cefoperazona, cefotaxima,
y aztreonam (181)-.
macrófagos
efectó a
>‘ Língaas
fagocitosis
previ amente
ceftazidima
Resumiendo, podemos decir que es un hecho fisioló-
gico importante el que un antibiótico estimule la movi—
lidad espontánea y la quimiotaxis de los macrófagos,
ya que ayudaría a un mayor acúmulo de estas célulasen los lugares inflamatorios, facilitando además su
poder fagocítico y su papel como presentador de antígenos,etapa previa para el desencadenamiento de respuestas
inmunes específicas.
— í~9 -
EFECTO INDIRECTO DE CEFOTAXIMAACTUANDO SOBRE LA SUSCEPTIBILIDAD
cali y Staphyl ococcus aureus FRENTE
MJCROBICIDAS EJE LOS PMN.
Y NETILMICINA
DE Escherichia
A LOS MECANISMOS
La patogen
varios factores;por el mismo mi
basados en los
específicos delque determinará
o no.
idad en el
algunos de
croorgani smo
sistemas de
Ivesped. Esta
finalmente si
hombre
los cu
invasor
deten s a
estrech
una in
es dependiente de
ales son producidos
y los demás están
específicos
a relación
fección pros
o
esper
no
la
ará
En circunstancias excepcionales
cepa invasora posee unas ca>—acterístic
especiales o cuando el huesped esta
es decir con sus defensas mermadas, esta
se puede inclinar finalmente hacia
aquí donde el conocimiento y el uso
antibióticos pueden jugar un papel
recuperación del paciente <81).
en la que la
as de virulencianniunocompronieti do,
estrecha relación
el patógeno. Es
adecuado de los
importante en la
Tradici
se median enonalmente
términos de
a actividad de los
concentración mínima
ant Ibióticos
inhibitoria(CMI) y concentración mínima bactericida (CMB>, pero
en la actualidad se sabe que estos antibióticos pueden
tambien inducir cambios morfologicos y metabolicos
no letales que pueden llegar a ser determinantes,
aumentando la susceptibilidad de los microorganismos
patógenos frente a los mecanismos de defensa del huesped.
Así Lorian
la concentración
en la bacteria
y De
mini ma
algún
Freitas (182> en 1977 definieron
de antibiótico que puede causar
cambio morfológico o funcional
- 160 -
repercutiendo en la elaboración de ciertas toxinas,
biósintesis de enzimas, ant¶genos de superficie etc,..
Tambien Parker y cols. (183> y más tarde McDonald y cols.
<184> indicaron que los antimicrobianos in Vitro
podi an retrasar el crecirni ento bacteriano durante unti empo mayor al de exposición al antimicrobi ano. Todos
estos cambios en la bacteri a pueden potenciar y favorecerla actividad microbicida de los leucocitos, potenciando
su fagocitosis y muerte intracelular (113>.
En n
previ ament
de tiempo
cefotaxi ma
neti lmicina.
uestro trabajo estudi amos este efecto tratandoe E. coli y S. aureus durante un breve periodo
con un inhibidor de sintesis de pared como
y un inhibidor de sintesis proteica como
Los betalactamicos como cefotaxima
muy activos frente a la mayoria de los
y gram-positivos, lo mismo ocurre con los
frente a los gram—negativos; si bien
suelen ser inactivos frente a gran parte
gram-positi vas (excepto Staphylococcus
5. aureus y 5. epidermidis > si suele
práctica clínica en combinación con
(inhibidores de sfntesis de pared).que estos pueden causar en la pared bac
la penetración de los aniinoglicósidosy potencian su acción bactericida (185).
La determinación de las curvas de
cefotaxima y netilmicina, se realizaron
el tiempo máximo que podían estar E. coli
expuestas a la acción del antibiótico si
viabilidad, pero que podian provocarles
suelen ser
gr a m— n e g a t i y o 5
ami nogí 1 cósi dosestos ultimos
de las cepas
como losusarse en la
betal actámicos
Las alteraciones
teriana -Favorecenen su interior
etal i
para
yn
al
dad para
esti mar
5. aureus
perder su
gun cambio
- 161 -
morfológico
indicaron 30
neti lmicina
sabe queque según
primera med
cósido al
y letal-.
cl oran
con so
podi a
mecan 1
o funcioñal (114)- Los resultados nos
minutos para cefotaxima y tan solo 10 para
(en amibas bacterias>-. De este último se
posee una acción bactericida muy rápida y
Weisblum y Davies (186) transcurría en la
ia hora de exposición. La unión del aminogíl-
ribosoma sería para entonces irreversible
Con otro inhibidor de s~ntesis de
fenicol, Pruul y McDonald (113) c
lo un minuto de exposición a altas
ser suficiente para sensibilizar
smos microbicidas del leucocito.
El interés por estas c
antibiótico se deben en parte
mal en el leucocito y las bacter
pueden quedar asi protegidas de
Alexander y Good (187> demostrarO
S. aureus y P. aeruginosa con clor
meticilina, ampicilina, penicil
y eritromicina antes de la fag
el porcentaje de muerte Intracel
la acción de un antibiótico que
no
sino
<bact
imitarse solo conque podría comprometer
en as dañadas> tras la
protel nas
omprobaron
concentracE. coli a
como
como
ioneslos
ortas exposiciones de
a que muchos penetran
ias una vez fagocitadas
la acción del fármaco.
n incubando previamenteanfenicol, tetraciclina,
ma 6, Streptomicina
ocitosis, se aumentaba
ular por los PMN. Asi
penetrara poco podría
las bacterias extracel ulsu supervivencí a i ntracelingestión por el leucocito.
ares
ul ar
La penetrad
tos suele ser
poco o nada
• (189, 190>
no afectó a 1
ón de los betalact~I11idOSmuy mala, así se vió que la
penetrante (101, 103, 188>.demostraron que cefmandol a
a supervivencia de f~2im ~v
en los
penici lina
Adinolfi
4 veces
S. aureus
fagoci
6 era
y cols
su CMI
162 -
fagocitados al
Con cefazolina
<103) obt uvieron
igual que el imipenem
y cefalexina tampoco
mejores resultados,
y la piperacilina.
Prokesch y cols.
Los aminoglic5sidos mostraron una
los betaláctamicos (103> debido a
lidad, pero resultaron intracelul
191) al ser sensibles a los cambios
Los resul
crecimiento tras
con antibiótico
al control Así
con cefotaxima
la primera hora
explicación a
por ciertos
a nivel de la
de penicilinala formación
de formas fil
rapidamente el
antibiótico.
mejor penetración
su mejor liposo—
armente inactivosde pH.
tados obtenidos en las cinéticas de
el previo tratamiento de las bacterias
mostraron un comportamí ento distintopues el previo tratamiento de E. coli
aceleró su ciclo de división durante
(104,5 % mas que el control), una posibleeste comportamiento podria ser el dado
betalact~micos que al ejercer su acción
pared, unlendose a las protefnas fijadoras
s (PBP) ocasionarían una inhí bidón de
del septun con la consiguiente formación
amentosas que se dividirian incrementandonúmero de bacilos después del tratamiento
Este efecto fué muy estudiado con concentraci enessubinhibitorias de ampicilína, mezíecilina, aziocilina
y cefsulodina sobre E. coN y P. aeruginosa (108, 192).Algunos autores tambiin hallaron ausencia de retraso
en el crecimiento de bacterias gram-negativas al usar
diversos betalact~wicos como ampicilina (193>, cel’amandol
<194) y cefotaxima (195); en la mayoria de los casos
para producir este retraso se necesitaron concentraciones
varias veces mayores que la CMI.
que
1 ubi
(99’
— 163 -
Cefotaxima si produjo
cimiento de 5. aureus
;
primera media hora
incluso redujo el
ción antibiótica.
un retraso en la
su mayor retraso129,4% más que el
inóculo de partida
cinética
se obtuvo
control
tras la
La diferencia de comportami ento
y 3. aureus podría estar relacionada
requeri do por cada microorganismo para senzimas encargadas de la síntesis de
por ejemplo las proteinas de bajo
constituyen el mayor número de PBP en
no en los cocos, también el tiempo re
síntesis de la pared es más corto en
entre
con el
1 nteti zar
Ja pared<peso molect¿
los bacilos pquerido para
bacilos (19
E. coil
ti empo
nuevas
Así
lar
ero
la
6>.
De esta forma, la breve exposición de E. ccli
con cefotaxima no detendria del todo, el proceso de
división, pero darla lugar a bacilos incompletos y
formas filamentosas. En 5. aureus el efecto de la
exposición podría ser mayor, los cocos tambign sufririan
una detención de su crecimiento, alteraciones estructu-
rales de su pared y serian más sensibles al trauma
ocasionado por los 10 minutos de centrifugación as-Y
como a su posterior resuspensiór¡ en un medio de incubación
menos -favorable para su crecimiento (HBSS—gelatina
+ un 10% de suero)
viabilidad observadoal previo tratamient
ningifn efecto bacty S. aureus
.
La
produjo
prev
un
ia
ret
expo
raso
esto
en la
o con
en ci da
sidón
en
explicaría el descenso de
primera media hora posteriorcefotaxima. El suero no tuvo
apreciable sobre E. coil
de 3. aureus con netil
su crecimiento de 1micí na
horaalcanzandose
hora (44,2%
su máximo efecto
más que el contr
durante
ol> en c
la primera media
ambio con E.. colí
de cre
en la
donde
expos i
- 164 -
no se apreció ningún efecto significativo.
Aquí las- diferencias de comportamiento
ambos mi croorgani smos
de recuperación de
breve exposición de
ser suficiente para
sintesis limitando
enzimas y proteinas
pueden estar en base a la
su sintesis protéica, ya
5. aureus con netilmicina
bloquear de un modo parc
la biodisponibilidad de
necesarias para su crecimí
capad dad
que unapodría
ial esta
ciertas
ento (114>.
La
experi enci
acción
as seAsí tras el previo
bactericida de
vió favorecidatratamiento
los PMN ende diferente
nuestras
manera.
de E. ccli con cefotaxinia
se incrementó
3 horas siguie
última hora (11
con 5. aureus
alcanzando su
más que el co
netilmicina el
el control > al
se alcanzó su
hora (89,4% más
la acc
ntes,
2,8% m
este
máxi mo
ntrol )
efecto
igual
máxí mo
que el
Existen experi
los mismos resultados
tanto a concentraci
subinhibitorias.
ión bactericida de los PMN en las
alcanzando su máximo valor en laás que el control). En el tratamiento
efecto perduró durante 2 horas
en la segunda media hora (120%
En los ensayos de E. ccli con
duró solo 1 hora (62% más que
que con 5. aureus, aquí además
valor durante la primera media
control > •
encias similares
con betalactámicos
ones superiores
que
y amino
a la
obtu
glic
CMI
vieron
ósidos
como
Así McDonald y cols-.
PO de la capacidadtenci adoral tratar E. ccli con concen
CMI de cefoxitin, amoxicilina,durante un durante un corto
(de 10 a 30 minutos>-.
(114> hal
bacterici
traci ones
ampi ciii
ti empo
1 aron
da de
mayo
na y
de
un eI’ecto
los PMN
res de la
gentamil cina
exposición
entre
- 166 -
Watanabe y cols. (197> consiguieron también esteefecto potenciador incubando E. coli durante 2 horas
con 1/4 de la CMI de ceftizoxima, Raponi y cols. (198)
con 1/2 de la CMI de netilmicina y ceftriaxona, y
Gutiérrez y cols. (199) con 1/2 de la CMI de ceftazidinia
y gentamicina. En un trabajo más reciente publicado
por Mandelí y Afinan (142> tras incubar E. colí durante
1 hora con concentraciones subinhibitorias de cefotaxima,
su metabolito desacetilce-fotaxima o juntas se consiguió
potenciar la capacidad bactericida de los PMN.
En relación con la cinética de crecimiento de
S. aureus (previamente tratadas con cefotaxima> en
presencia de PMN hay que decir que el efecto bactericidaregistrado durante la primera media hora no es atribuible
a los leucocitos sino más bien al antibiótico, pero
después el efecto potenciador si es evidente.
Revisando los trabajos publicados por otros
investigadores podemos encontrar conclusiones semejantescon S. aureus y otros betalactámicos como penicilina G,
amoxicilina, ampicilina y meticilina donde utilizando
concentraciones por encima de la CMI ocasionaron la
muerte de 5. aureus por PMN <187, 114). Root y cois.
(111) hallaron que 5. aureus tratados durante 2 horas
con 1/4 de la CMI de penicilina G, fueron más sensibles
a la acción de PMN, pero no encontraron este efecto
con gentamicina. Cuffini y cols. (201> determinaron
el mismo efecto potenciador con certazidima, Friedman
y cols. <202> con nafcilina, Adinolfí y cols. (190>
con imipenen.
Los trabajos con 5. aureus y aminoglicc5siclos
son escasos, debido a su poco uso por separado en
terapéutica de infecciones por Grani-posltivos. Pero
- 166 -
se encontró en Gram—negativosexposición con gentamicina fué
lizarla frente a los mecanis
PMN <114>.
como
sufi ci
mos mi
E. coli do
ente para s
crobi ci das
Los mecanismos
aminoglicósid
itos no están
onados con sus
por los cuales
os favorecen la
muy claros, pediferentes maneras
los
ac
ro
de
beta 1 actám
tividad de
parecen e
actuar..
Los betalact
uniéndose a unas
(PBP). De esta ma
sfntesis de pepti
la estructura de
que los antígenosfavoreciendOse una
en nuestro casoconsiguiente facil
y cols. (111> la mo
por el previo tr
como
los
(enz
como
(204
la
mec a
penici
ni smos
ámicos actuan a nivel de laproteinás fijadoras de peni
nera producen una inhibición
doglicano y de esta forma
la pared
de superf
adecuada
por el
itando la
dific ación
atamiento
lina 6,
bacteri c
a ume
idas
imas endogenas como la
contraposición a los
205>.
• Este hecho
ide quedenopsonizaciCn~
complemento 2
agocitcsis
de la superficie
con antibióticosntaría su sensí
no nxidativos d
lisozima y
mecanismos
ciertas p
de muerte
pared
ci linas
de la
al teran
hace también
más expuestos,
principalmente03> y por
Según Root
de S,aureus
de pared
bilidad a
e los PMN
roteasas )
oxi dativa
Los betalact
en los bacilos,
a concentracionesen E. coli por un
carboxi pepti dasa
hidrofobicidad de
su reconocimiento
ámicos también producen alteraciones
así exposiciones por betalactáflicos
subinhibitorias inducen fil amentosa posible inhibición de la 0—alanina
(108). También pueden aumentar la
la superficie celular -Favoreciendo
(115, 206>. Hay reducción de componentes
nde
en si
de
la
bí —
los
y1 eu
reí
los
coc
aci
i cos
los
star
- 167 -
parade
<11sob
debol
la
la síntesis de cápsula con la consiguiente expos
antígenos ocultos <114, 207>. Kudurugawa y
8) observaron en las cefalosporinas un efecto inhire la capacidad de retención de hierro por
las bacterias, requerimi ento esenci al para su
ismo y que de una forma indirecta puede al
síntesis de su cápsula.
En el
a nivel del
así pueden
tales como 1
cuya función
y otras enzi
síntesis de p
en la pared
(209). Todo
caso de los aminoglicósidos estos actuanribosoma uniéndose a la subunidad 30S y
interferir en la s-.íntesis de proteínas,
a proteina A de la pared de S. aureus (208)
es impedir la opsonización <antifagocitaria),
mas que a su vez podrían comprometer la
eptidoglicanos de forma que sus ensamblajes
resultaran defectuosas generando anomalías
ello finalmente, puede repercutir en una
mejor opsonización y
fagocitosis (210>.por tanto en un aumento
Veringa y cols. (211)
la sfntesi s de proteínaos6mico como clindami
tasa de fagocitosis por
demostraron que la
A de 5. aureus por un
cina aumentaba senPMN.
hallaron
a altasgí i cósi d
con la(114) y
213>.
En bacilos Gram-negativos Lida y Koike
alteraciones en la estructura de la
concentraciones de antibiótico. Los
os producen alteraciones de la síntesis
consiguiente producción de proteinasdisminución del material antifagocitari
<212)
pared
amino-proteica
extrañas
o <199,
Diferentes medios
efectos distintos en
de Incubación
la bacteria
pueden
tratada
mostrar
con el
i ci ón
col 5 -
bidor
parte
meta -
terar
de
ri b
su
de la
1 nhl
lnh
sibí
bí ción
1 bí dar
ement e
- 168 -
antibiótico.. Así el previo tratamiento de 5.. aureusdurante 10 minutos con 4 veces la CMI de netilmicina
en caldo de Mueller-Hinton <M-H> en nuestro experimento
ocasionó un aumento de sensibilidad a los PMN mientras
que con caldo
ningún efecto-.
curvas de letal
antes de que
M-H era de 10
hasta los 30 mi
de
Es
i dad
empe
mi n
nutos
Tri
to t
dond
zar a
utos
ptona-Soja
ambién qued
e el tiempo
el descenso
mientras que
(T-S) no se
ó reflejado
máximo de e
de viabil
con T—S s
Es
Tri ptona-
bastan
Soja
te conocido el poder
así como su poder
nutritivo
de resiici
del caldo
tación de
esporas previamente cal
creemos que este medioy le permite soportar niej
relativamente más largo,
No se ha demostrado pero
de exposición más largo,
al experimento con Mueller-
Otros investigadoresde los medios de incubación
entadas (214)..
es más favorab
or durante un
el efecto
pensamos que
obtendri amos
Hi nton
encontraron
utilizados
Por todo ello
le para 5. aureus
periodo de tiempo
del antibiótico..
con un periodo
efectos perecidos
otros
para la
efectos
previ a
exposición de
previamente tr
Soja no se
normal, pero
caso, parece
en el caldo d(215). Wilson
en el retraso
bacterias
atado condetectó
sí con c
que la
e T-S in
y Rolin
de crec
tratadas con penicilina 6 ende cerebro y corazón.
con antibióticos; así
trimetroprim en caldo
ningun retraso en sualdo de Mueller-Hinto
mayor concentracion
hibió la acción del t
son (200) no vieron
imiento de 5. aureus
caldo nutritivo o
con S..aureus
de Triptona-
creci mento
n.. En estede timidina
rimetopririr
diferencias
previ amente
en infusión
Para concluir diremos
y 5.. aureus a cefotaxima y
que la exposición de E..coli
netilmicina durante un corto
apren
xposi
i dad
e al
eci ó
las
ción
con
argo
- 169 -
periódo de tiempo
es sufici
morfol ógi
creci mi en
y lo que
a los
consí gui
y activi
col abora
aquel los
post op erdeten s a
ente
cas
tos
es
meca
ente,
dad i
r a
paci
ator 1
debi 1
a concentración
para produciry funcion
normales
más impor
nismos mi
aunqUe no
ntracel ul ar
la erradi
ente donde
os, sida
itados
en las bacterias
que pueden r
o E-. coli con
los hac n
al es
except
tante
crobl cpuedan
si p
cací ón
ya sea
etc;
idas
tener
uede n
del
por
e m
de los
una buen
de una fo
patógeno
la edad,
tengan sus
superi nhibitori a
al teraci
et rasar
cefotaxi
s sensi
PMN
ones
sus
ma )
á bles
- Por
a penetración
rna indirecta
máxime en
drogadi cci ón
mecani smos de
170 -
EFECTO INDIRECTO DE FLUCONAZOL
LA SUSCEPTIBILIDAD DE Candida
A LOS MECANISMOSMICROBICIDAS DE
ACTUANDO
al bi cans
LOS PMN.
En comparación
los avances en fármacos
por hongos son más
el principal antifúngi
50, mientras que las
los 30, así no es de
lleve un retraso de 20
con los agen
para el tratami
recientes.. La
co que se uti
sulfamidas ya
extrañar que
años.
tes
ento
arfolizó
se
en
antibióticos,
de infecciones
tericina B es
en los añosutilizaban en
este campo se
En la actualidad se ha detectado un aumen
las infecciones por hongos oportunistas, sobre
en pacientes inmunodeprimidos <216, 217, 218,
Además los hongos que antes se consideraban coloni
inofensivos ahora se han transformado en pa
y algunos de ellos son resistentes a varias antí(220, 221, 222).. Ello ha hecho que se promovi
producción de fármacos nuevos más efectivos; yque aumentara la neéesidad de realizar pruebas de
tibilidad in Vitro para informar a los clínicosson los tratamientos más adecuados.
to de
todo
219)..
zadores
tógenosfúgí cos
era la
también
suscep—
cuales
El fí uconazol pertenece a
(triazoles), es un anti-fúngico
hace poco, aprobado por la a
americana para el tratamiento de
por criptococos en pacientes
del fluconazol son su gran
a proteínas~ alta biodisponibi
estabilidad metabólica (150)
el liquido cefalon’aqUídeo (LCR>
la familia
oral mente
dmini stracicandidí así
con sida.
solubilidad, baja
lidad, larga vida
y buena penetrací
(223, 224>.
de los azoles
activo y desdeón de sanidad
s y meningitisLas ventajas
unión
medía,
ón en
SOBRE
FRENTE
— 171 —
El primer problema que presentan los antifúngicos
es la falta de reproductibilidad encontrada en las
pruebas de
trabajos d
estudi aron
tericina B,
226, 227,
afectar lostales como
233, 234,
tiempo de 1
(158, 225,
suscept
e van
una gra
fí uclt
228)
resul
el me
235>,ectur
237,
ib
os
n
osEx
tado
dio
pH
a de
238)..
lidad. Esto quedó patente en los
grupos de investigadores, que
variedad de fármacos como la anfo-
ma, ketoconazol y fluconazol <225,
sten varios factores que pueden
s de las pruebas de susceptibilidad;
de incubación (229, 230, 231, 232,
del medio (229, 231, 235, 236>,
los resultados y tamaño del inóculo
En nuestro
del -fluconazol
de macrodilución
y tamponado para
de pH (239, 240>-.
estu
para
en
evit
dio se ha valorado la susceptibilidad
Candida albicans por
caldo YNB con un 1%ar los efectos negativos
el
de
del
método
glucosa
cambio
La determí
realizó en dos
estos resultados
del pH, así
a 20 ug/ml
7,2 la CMIlas 48 hor
100 ug/ml
de 4 ug/ml..
con el cic
a pH 5,4-.
el tiempo
fungi st~ti
(241>..
a
y
yas
mi en
El
lo
El
se
naciónpH,
obtenidos
de la CMI y la
uno a 6
selas 24 horas
la 0150 de 4la 0150 fuero
a pH 5,4, la
tras que a pH
efecto del pH
de división, y la
cambio de val
debe a que 1
,4 yobser
a pH
u g/m 1
n igu
CMI
7,2 1
tiene
0150
otro a pH
efectovó un
5,4mi
al es
y la
a CM
una
la
entr
a
CI
Iy
est
CMI
as
0,8
50
la
recha
c&ndida crecía
ores de las
os azoles
CMI
tienen
<227)
neutro
1 mpor
se
De
tante
fué igualque a pH
ug/ml .. Afueron de
eran
reí ación
mejory C150 en
una tasa
co/-fungicida alta a concentraciones terapéuticas
— 172 -
Estos resultados
y cols. (242) quienes
en 0,8 pg/ml, o los de
Mcíntyre y cols. (227)
algo menor, 0,5 ..ug/mla las 24 horas pero
aminoácidos-. Anaissi e
CMI de 0,25 xig/ml.
coinciden con los de Vant Wout
determinaron la CMI a pH neutro
Cook y cois. (228)-. Por contra
determi naron una CMI y una CI 50
y 0,25 pg/ml respectivamente,en un medio para hongos con
y cols. <243) encontraron una
Todo
antes menc
agrava másdentro de
obtener en
mentad ón
esto no hace más que remarcar eionado y que en el caso de los
Pese a todo, las CMI y C150 selas concentraciones terapéuticas que
sangre, tejidos humanos y animales
(149, 227, 244, 245).
1problema
azoles se
encuentran
se pueden
de experi-
La discrepancia entre la efí cací a ‘in Vivo’ de
los azoles como el fluconazol
diseminadas en ratones granuloc
248> y su limitada actividad
en curvas de letalidad nos hizo
efecto cooperativo de estos
mecanismos de defensa del huesped
-frente a
itopénicos
in Vitre’pensar en
antifúngicos
(228, 246, 262>..
candi d
(246,demos
asís247,
tradaun posible
can los
Al Intentar valorar la sensi bí 1 idad de C. albicans,
previamente tratadas con -fluconazol, a la acción fungicida
de PMN, nos encontrábamos con dos problemas; primero,se necesitaba un tamaño de inóculo superior al utilizado
6en pruebas ~e susceptibilidad (10 ufc/ml frente a4
10 u-fc/mí> y puesto que había un fuerte efecto inóculo(226> tuvimos que realizar una segunda prueba de suscepti-
bilidad determinando una nueva C150 y un tiempo de
exposición adecuado-. Como no se puede hallar ningunapara ese inóculo, se caictiló í~ CI25 (concentración
— 173 -
mínima que redujo el
cuarta parte respecto a
fué una C125 de 4 xig/ml
y un tiempo que se
vaginales (254), en
cerebroespinal (224>,
orina y suero (250, 255)
crecimiento de
su control > , El
durante 6 horas,
pueden alcanzar
esputo <253),
tejidos vaginal
C. albicans una
resultado final
una concentraciónen secreccionesen el fluido
es (251) o en
El otro problema era la tendencia que tenia
O. albicans a formar filamentos en presencia de suero
(264, 265>. Asi Lehrer y cols. (80) demostraron que
cuando se incuba O. albicans con suero, despues de
4 horas los organismos crecían en fase miceliar y podian
alterar de forma engafiosa el número de unidades viables
en un recuento en placa, así si una sola célula de
una cadena miceliar sobrevive a la fagocitosis podía
formar una colonia y ocultar el hecho de que otras
células habian sido destruidas por los PMN-.
Llegados a este punto tampoco podiamos
del suero en nuestro experimento ya que son mdi
sus factores para una fagocitosis efectiva,
manera se fijó el tiempo de incubación de
<previamente tratadas con fluconazol) con 1
3 horas.. De inmediato se observó retraso en elde C. albicans previamente tratadas con
y en ausencia de PMN. Este efecto se
antifúngico ya que el suero a un 10% no
efecto fungicida apreciable..
El principal mecanismo de
es la Inhibición de la sinte
es el mayor esterol encontrado
y levaduras. Su inhibición puede
prescindir
spensables
de esta
c~ndi das
os PMN en
crecí miento
fí uconazol
atribuyó al
tuvo ningún
acción del fluconazol
sis de ergosterol, que
en membranas de hongos
tener numerosos efectos
174 -
sobre la actividad de las enzimas de
256, 257). Se cree que todos los trtener un modo de acción más directo sobre
de membrana.. Tambien podrían inhibir la
citocromo O y las enzimas peroxidasas,
tanto un aumento en la generación
intracelulares <258, 259, 260)..
membr
i azol e
los -Fo
cxi d
pr ovo
de
ana (148,
s podrían
sfol ípi dos
ación del
cando porperóxidos
La interacción del fluconazol con los mecanismos
de defensa del hucon fluconazol
con O. albicans
,
diferencias en
incubando PMN
en la pro
Roilides y
de interfe
de ½s PMN
y cols.
fí uconazol
y no detec
tenia una
tan siquier
30 minutos
ducc
col
rencal i
262>en
taron
buen
a el
esped Van
(2,5 a
normal es
-t
20
y
Wout
mg/k
ne ut
y
9>rop
cols. (242)
ratones
énicos, no
su efectividad, Abruzzo
con fluconazol encontra
ión de quimiluminiscencí
s.. <141> no determinaro
ia del fluconazol sobre
gual que Senior y Shaw
estudi aron el efectomacrófagos infectados
ningún efecto pese aa penetración intracel
previo tratamiento de O.
aumentó la actividad
tratando
nf e cta dos
hallaron
y cols. (140>
ron un descenso
a; mientras que
n ningún efecto
las funciones
(261>.. Van Etten
Intracelular de
por O.. albicansque ese triazol
ular <263>, ni
albicans durante
intracelular posterior.
En n
de la sens
uestro estudio
ibilidad de C.
sí
alb
se vió un efecto
icans a la acción
potenci ador
bacterici da
de los PMN-. Este
tratamiento con 4
Hubo un aumento del
duró
ug/ml
43,8
una hora despues de un previode fluconazol durante 6 horas.
% con respecto a su control -
Una posible explicación puede ser que C. albicans
tras el tratamiento con fluconazol sufre alteraciones
morfológicas y funcionales <ya comentado> y pueden
ser más facilmente opsonizados y fagocitados por los PMN;
- 175 —
ya en su
peroxidasa,un aumento
peróxidos de
interior serian destrul
una enzima lisosoma!
del consumo de oxígen
hidrogeno (252, 266>..
dos
<252
o y
por la Mielo—
), produciéndosegeneración de
Estos
di f’erenci as
in Vitro’ y
hechos podrían
de efecto entre
los resultados
explicar, en
las pruebas de s
terapéuticos rea
parte, las
usceptibi 1 idad
les.
- 176 -
6.- CONCLUSIONES
177
CONCLUSIONES
.
A/ Los
el sistema de
el buen desar
Por todo ello
cefotaxima y
macrófagos
defensa del
rollo de laestudiamos
netiln¡icina
son una
huesped,
respuesta
el efecto
sobre sus
parte importante enson necesarios para
inmune específica.que podian tener
funciones básicasobteniendo las siguientes conclusiones:
LA— Ni cefotaxima
ficativamente la
a placas MIF.
2.A— La
de los
neti lmici
ni netilmicina
adherencia de
quimiotaxis y
macrófagos no
na. Cefotaxima
la
se
p
movíven
otencí ó
afectan signi—
los macrófagos
1 idad
modifila
espontánea
cadas por
movi 11 dadespontánea y la qulmiotaxís a las dosis
y sobreterapéuti ca respectivamente..
terapéutl ca
3.A-
adh
su
de
con
Cefotaxima
esión de losposterior
que se usaran
suero o no.
y netflmicina
macrófagos a
fagocitosis;
c&ndidas preví
no afectaron la
las cándidas, nl
independientemente
amente opsonizadas
B/ Los leucocitos polimorfonucleares son los
fagocitos profesionales por excelencia-. En esta parte
del trabajo se realizó un estudio del efecto que podíanproducir cortas exposiciones de cefotaxima y netilmicina
(30 y 10 minutos respectivamente) a concentracionessobreinhibitorias <4 veces la CMI> sobre las cinéticas
de crecimiento de Escherlchia coli y Staphylococcus
aureus en presencia o ausencia de PMN-. Con -fluconazol
se estudió este mismo efecto sobre Candí da al bi canspero usando una larga exposi cidn a concentración
terapéutica. Se obtuvieron las siguientes conclusiones:
- 178
LB— El pretratamiento
aumentó su ciclo de di
posterior al tratamiento
retrasó su crecimiento en
de E. coli con cefotaxima
visión en la primera hora
mientras que en S,aureus
las das primeras horas.
2.8— Cefot
de E. coli
los PMN dtratamiento
2 horas.
aximaa los
urante 1
mientras
3.8— NetilmicinaE. coli pero si
acción de los PMN
incremertó la susceptibil
mecani sinos microbi ci das
as 3 horas si gui entesque en 5. aureus fué dura
no afe
aumentódurante
cUY al crecimiento
su sensibilidad a
la primera hora.
i dadde
alnte
de
la
4.8- El medio de incubación tuvo un papel relevante
en el tratamiento de S.. aureus con netilmicina,
así, en caldo de MLJeller-Hinton se observó un
retraso de crecimiento y un aumento desusceptibilidad a la acción microbicida de los
PMN durante la primera hora posterior altratamiento mientras que en caldo Tríptona-Soja
la breve exposición antibiótica no tuvo ningún
efecto.
5..B— La exposición de C.. al
de fluconazol durante 6 horas
en su crecimiento durante las
al tratamiento y aumentó
a la acción de los PMN durante
bicans con 4
produjo un ret
3 horas pasten
su susceptlbi 1
la primera hora,
mg/l
raso
ores
Idad
- 179 -
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