lección 4.1. introducción al módulo 4

Sergi Maicas PrietoDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València

Lección 4.1. Introducción al Módulo 4

Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 4. Organismos modelo en biología

molecular

¿Qué es un modelo experimental?

En biología, la práctica experimental está organizada alrededor de MODELOS Y

SISTEMAS EXPERIMENTALES para probar HIPÓTESIS DE TRABAJO.

Muchas de las disciplinas se han desarrollado gracias a modelos experimentales.

La genética clásica se ha desarrollado mediante la experimentación con plantas y

Drosophila melanogaster.

La biología del desarrollo usando Drosophila, el nematodo Caenorhabditis

elegans y el pez cebra (Danio rerio).

La microbiología molecular usando la bacteria Escherichia coli y bacteriófagos

(virus).

La neurociencia estudiando axones gigantes de calamar y Mus musculus.

La inmunología usando Mus musculus.

La biología molecular de plantas usando Arabidopsis thaliana.

La biología celular usando la levadura Saccharomyces cerevisiae.

MODELOS FACILES DE OBTENER, MANTENER, REPRODUCIBILIDAD DE

RESULTADOS

Objetivos del módulo

¿Cuáles son los modelos experimentales más importantes?

¿Cuáles son sus características?

¿Qué se sabe de ellos?

¿Cuáles son los recursos disponibles?

Biología molecular. Bases y aplicaciones

• 4.2. Virus

• 4.3. Bacterias (Escherichia coli)

• 4.4. Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)

• 4.5. Nematodos (Heligmosomoides polygyrus)

• 4.6. Plantas (Arabidopsis thaliana)

F. Xavier López LabradorLaboratori de Virologia, Àrea de Genòmica i SalutUMIs Infecció-SP / Genómica-SPCentre Superior Investigació Salut Pública (FISABIO-Salut Pública)

Lección 4.2. Virus


molecular

¿Qué son los virus?

• Del latín virus (del griego:ἰός «toxina» o «veneno»)

• Agentes infecciosos acelulares

• Submicroscópicos (20-450 nm.), (¡ 450-1000 !)

• No crecen ni se dividen (se multiplican)

• No codifican rutas enzimáticas

• Se componen de ácidos nucleicos, proteínas, y

algunos también de lípidos.

• Virión: cápside (con/sin envuelta), ácido nucléico

• ¿Son organismos vivos?

• Parásitos intracelulares estrictos.

• Dos estados: extracelular e intracelular

• Efecto citopático

• ¿Cuál es su lugar en el árbol de la vida?

• El cuarto dominioFoundations of Virology, rev. 2014Frederick A. Murphy, University of Texas Medical Branch

Poliovirus Coronavirus

HerpesvirusEbolavirus

Variolavirus Rabdovirus

Los virus como modelo de evolución

Tipo de infección

Componente Usos Ejemplos

Heteróloga Organismo completo

Atenuación viralPatogénesis modelos

animales

Virus mixoma / conejos

Heteróloga Célula completa Atenuación viralCultivo virus

Vacuna SabinGripe / células perro

Heteróloga Una proteína celular

Genética hospedadorEscape viral

Células humanas transgénicas / SIV

Autóloga Organismo completo

Evolución virusEscape inmunitarioEscape antivirales

Genética poblaciones

SIV en macacosVIH en pacientes

Autóloga Célula completa Evolución virusFitness / mutantesEscape antivirales

Genética poblaciones

HIV en linfocitosPoliovirus

VHC en células de hepatoma

Autóloga Una proteína celular

Genética hospedadorEscape viral

Células humanas siRNA/ VHC

Los virus como modelo de enfermedad

• Los bacteriófagos como modelos de infecciones

agudas, persistentes y latentes (Twort, d’Herelle,

Lwoff, Wollman, Jacob).

• Respuesta inmunológica: experimentos de Doherty

y Zinkernagel (LCMV): restricción del CMH

• Respuesta inmune celular: linfocitos T y la

inmunopatogénesis de la infección.

• Respuesta inmune innata: animales KO, siRNA.

• Modelos de infección viral: aguda, latente y

persistente, oncogénica. Control inmunológico.

• Los virus como modelo en Inmunología: ratón,

hurón, marmota, chimpancé, macaco, humanos.

• Antivirales: potencia, especificidad, resistencias

• Vacunas: efectividad a corto, medio y largo plazoFoster ES, et al. Emerg Infect Dis 2006

Lymphocytic choriomeningitis virus

Rolf Zinkernagel & Peter Doherty

Nobel Prize in Physiology, Medicine 1996

Mus musculus

Los virus como modelos de terapia

• Fagoterapia: ¿el fin de los antibióticos?

• Vacunas “clásicas”:

• viruela, poliomielitis, sarampión, gripe

• Virus defectivos y VLPs

• Virus pseudotipos

• Terapia génica: los virus como vectores de genes:

• completos, truncados, antisentido, siRNA…

• Protección del ácido nucleico

• Liberación dirigida a la célula diana

• AdV (caso Gelsinger), AAV

• Oncoretrovirus, lentivirus (ADA/SCID)

• Vacunas contra el cáncer

• Virus oncolíticos (VSV, Vaccinia)

Félix d'Hérelle

Jonas Salk Albert Sabin

Edward Jenner

Maurice Hilleman Anderson, Culver, Blaese

Los virus como modelo biotecnológico

• Bacteriofagos: clonaje y expresión génicas.

• Vacunas subunidad: hepatitis B (rHBsAg)

• Virus defectivos y VLPs (virus-like particles): papilomavirus

• Virus con reordenaciones genéticas: rotavirus

• Vacunas de “nueva generación” (vectores recombinantes)

• Dengue, West Nile, Encefalitis Japonesa

(YFV17D204-DENV, WNV ó JEV)

• Ébola zaire (VSV-EBOVGP, AdV3-EBOVGP)

• Modelos de expresión de proteinas. Bacteriofagos.

• Modelos de control de plagas:

• Baculovirus, NPV (orugas)

• O. rhinoceros virus (escarabajo)

• Myxoma, Calicivirus (conejos)Fr

ont.

Mic

robi

olht

tps:

//doi

.org

/10.

3389

/fmic

b.20

16.0

0429

BMC Microbiology. 11: 213. PMC 3224144

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1754

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edia

Links:Los virus como modelo en Biología (Esteban Domingo y Margarita Salas)

http://publicacions.iec.cat/repository/pdf/00000177/00000080.pdf

http://www.rac.es/ficheros/doc/00424.pdf

De los experimentos de Doherty y Zinkernagel a las vacunas contra el cáncer:

http://www.uzh.ch/en/about/portrait/nobelprize/zinkernagel.htmlhttp://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1996/

Historia de las vacunas:

https://www.historyofvaccines.org/

Vacunas recombinantes basadas en el vector del YFV:https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Yellow_Fever_Vaccine

Control de conejos mediante liberación de virus:http://dpipwe.tas.gov.au/invasive-species/invasive-animals/invasive-mammals/european-rabbits/release-of-rabbit-calicivirus-disease

Referencias bibliográficas y enlaces

Sergi Maicas PrietoDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València

Lección 4.3. Escherichia coli


molecular

Biología y bioquímica

• Bacteria Gram negativa

• Anaerobia facultativa

• No esporulada

• Células bacilares

• Aproximadamente 2 μm de largo y 0.5 μm de diámetro

• Volumen celular 0.6 – 0.7 (μm)3

• Puede vivir sobre una gran cantidad de sustratos

• Temperatura de crecimiento óptima de 37°C

• Las cepas con flagelos (peritricos) son móviles

• Pueden transferir DNA mediante conjugación, transducción o transformación,

posibilitando la transferencia génica horizontal

Ventajas

• Procariota (unicelular, sin núcleo)

• Cultivo fácil y barato

• Posibilidad de almacenamiento por congelación

• Tiempo de generación de 30 minutos

• Puede usarse como almacén de DNA foráneo

• Puede usarse como sistema de expresión de DNA foráneo

• Disponible una gran cantidad de mutantes

• Genoma secuenciado (en varias cepas)

• K12 y derivadas (DH1, DH5α, DH10B) y las comerciales (XL1 Blue, JM109, TOP10)

• B y derivadas (serie BL21)

• C

• W

Modelo estructural en bacterias Gram -

• Pared celular bacteriana • Flagelo

• Componentes de señalización (Familia

proteínas Che, movimiento flagelar)

Fisiología de la división bacteriana

Anillo-FtsZ

FtsBFtsLFtsQFtsIFtsN

FtsA

ZipA

FtsKFtsW

Divisoma

FtsZ

Modelo a nivel genético

• Conjugación • Transducción

• Bacteriófagos (T4)

Modelo evolutivo

Estudio en curso en la evolución experimental dirigido por Richard Lenski que sigue los

cambios genéticos en 12 poblaciones inicialmente idénticas de la bacteria Escherichia coli

desde el 24 de febrero de 1988.

La población tiene 67899 generaciones en septiembre de 2017.

Desde el inicio del experimento, Lenski y sus colegas han informado de una amplia gama de

cambios genéticos, algunas adaptaciones evolutivas se han producido en las 12 poblaciones,

mientras que otros sólo han aparecido en una o en algunas poblaciones.

Una cepa de E. coli que fue capaz demetabolizar aeróbicamente el citrato

Indicio de especiación

Modelo ómico

GENOMA

TRANSCRIPTOMA

PROTEOMA

METABOLOMA

DNA

mRNA

Proteína

Metabolito

Interacción proteína-proteína

Activación Inhibición

Modelo de secuenciación Control de calidad de las proteínas

Producción de metabolitos

• 30% proteínas terapéuticas producidas en E. coli

• Se dispone de:

• Vectores de expresión

• Cepas productoras

• Tecnología de plegamiento

• Tecnología de fermentación

• 151 fármacos aprobados por FDA y/o AEM

Patogénesis microbiana

Modelo de colonización Biología sintética

Técnicas con una sola célula(single-cell techniques)

• Biopelículas

CRISPR - Cas 9

http://www.lgcstandards-atcc.org/

http://www.cbs.knaw.nl/About/nccb.aspx

http://www.dsmz.de/

http://bccm.belspo.be/about/lmg.php

The Coli Genetic Stock Center CGSC, at Yale

http://cgsc.biology.yale.edu/ Shiga Toxin-producing E. coli (STEC)


Libros

Molecular genetics of bacteria. Dale, J.W. y S.F. Park. 5ª ed. Wiley-Blackwell. 2010.

Systems biology and biotechnology of Escherichia coli. Lee, S.Y. 1ª ed. Springer. 2009

Bacterial pathogenesis: A molecular approach. Wilson, B.A. et al. 3ª ed. ASM Press. 2011

Artículos

Vollmer W, Bertsche U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in

Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2008. 778: 1714-34.

Berg HC. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 2003. 72:19-54.

Enlaces

http://www.genome.wisc.edu/

http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes

http://myxo.css.msu.edu/ecoli/

Emilia Matallana Redondo Instituto de Biología Integrativa de Sistemas Universitat de València

Lección 4.4. Saccharomyces cerevisiae


molecular

La levadura Saccharomyces cerevisiae

• Usado con fines alimentarios desde la más remota

antigüedad

• Organismo GRAS “generally recognized as safe”

• Louis Pasteur, 1857

• Microorganismo eucariota

Las ventajas del modelo eucariótico Saccharomyces cerevisiae

• Unicelularidad: ciclo de vida haplodiploide, mantenimiento

estable de formas haploide y diploide, con reproducción

asexual por gemación.

• Facilidad de cultivo, escasos requerimientos nutricionales,

tiempo de generación corto (aprox. 100 min).

• Primer genoma eucariótico secuenciado (1997, última revisión 2011), pequeño (12 Mpb,

16 cromosomas, aprox. 6200 genes), el más ampliamente caracterizado estructural y

funcionalmente

http://www.yeastgenome.org/


• Multitud de herramientas genéticas y genómicas

http://syntheticyeast.org


• Disponibilidad de mutantes individuales de todos sus genes, fenotípicamente

caracterizados

http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html

http://www.yeastgenome.org/help/function-help/phenotypes


• Disponibilidad de bases de datos procedentes tanto de análisis de genes y proteínas

individuales como de estudios globales

http://www.uniprot.org/

La historia de Saccharomyces cerevisiae como modelo eucariótico

Antonio Marcilla DíazDepartamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica y Parasitología; Unidad Mixta de Endocrinología, Nutrición y Dietética Clínica, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, Universitat de València

Lección 4.5. Heligmosomoides polygyrus


molecular

Introducción

• Heligmosomoides polygyrus es un nematodo parásito

natural de roedores.

• Produce infecciones crónicas en diferentes cepas de

ratones: buen modelo de helmintiasis intestinales.

• Su presencia origina un potente efecto

inmunomodulador (enfermedades autoinmunes,

alergias y respuestas frente a diversos antígenos).

• Gran parte de sus efectos debido a productos de

excreción/secreción (PES).

• Organismo modelo en estudios de parasitología,

inmunología, farmacología y toxicología.

Ciclo biológico de H. polygyrus

Fuente: http://hpoly.blogspot.com.es/

• Ciclo de vida directo (sin hospedadores

intermediarios).

• Adultos en intestino de roedores, tras la

ingestión de larvas infestantes L3 del

medio.

• L3 invaden mucosa intestinal en 24h y tras

4 días mudan a L4 en la submucosa.

• Tras 2 días mas se enquistan en la capa

muscular del intestino, donde origina los

individuos adultos.

• Tras 14 días post-infestación los adultos

se aparean en el lumen intestinal,

producen huevos que son eliminados por

heces al medio externo, donde se da

maduración de larvas L1 a L3.

Patología

Fuente: http://hpoly.blogspot.com.es/

• Tras la infestación se generan respuestas

inmunitarias innata y específica para evitar

establecimiento en intestino.

• Aumenta producción de moco en intestino

• Quistes de larvas en pared intestinal

• Se activan macrófagos por citoquinas Th2 que

aumentan motilidad intestinal e inducen fibrosis

y cicatrización.

• El parásito es capaz de evadir la respuesta

inmunitaria

Fuente: http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/

Fuente: http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/

L3 se enquista y muda L4 y adultos en 7 días

Granuloma en el sitio de infección

Día 7

Día 14

L3 penetran pared duodeno

Adultos tras día 8

Huevos desde día 10

Adultos día 14, cultivados 21 días sin suero

E/S

L3 vía oral

Cultivo en el laboratorio

http://maizelslab.org/wp-content/uploads/2016/09/HES-Protocol-22June11.pdf

Protocolos de cultivo y obtención de productos de excreción/secreción (E/S):https://www.jove.com/video/52412/cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Genoma, transcriptoma y secretoma

Genoma secuenciado en 2014: 560 Mpbhttp://www.nematodes.org/genomes/heligmosomoides_polygyrus/http://parasite.wormbase.org/Heligmosomoides_polygyrus_prjeb1203/Info/Index/

Transcriptoma en proceso:http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/

Secretoma:http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/

Estudios de inmunomodulación

Fuente: Joel Bowrron

Fuente: http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/Parásitos E/S

Recientes estudios con vesículas extracelulares (VEs) de H. polygyrus

Buck et al., (2014), Nature Communications 5, 5488:

• VEs contienen miRNA, tRNA e YRNA

• Se detectan VEs en animales infestados

• Administración de VEs reducen síntomas de

alergia en modelo experimental múrido

Coakley et al., (2017), Cell Reports 19, 1545-1557:

• VEs inhiben activación de macrófagos por vía Th1 y

Th2

• Vacunación con VEs genera fuerte producción de

anticuerpos y protege frente a infestación en modelo

• VEs actúan sobre la vía de IL33 y sobre activación

de macrófagos para evitar la expulsión de parásitos

Links:

Grupo de Rick Maizels en Glasgow (UK): http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-

polygyrus/

Blog de PCS: http://hpoly.blogspot.com.es/

Videos:

Angela Debenedetti: https://www.youtube.com/watch?v=9wETbKzWikY

Cultivo de Heligmosomoides polygyrus y obtencion E/S:

https://www.jove.com/video/52412/cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-

immunomodulatory-nematode

Acción de células B: https://www.youtube.com/watch?v=E4koFMP2njw

Apareamiento de adultos: https://www.youtube.com/watch?v=y9AXzc48WDA

Publicación PLoS Pathogens Hewitson: https://www.youtube.com/watch?v=0y84NaXw-S0


Roc Ros PalauERI Biotecnología y Biomedicina; Departamento Biología VegetalUniversitat de València

Lección 4.6. Arabidopsis thaliana


molecular

Arabidopsis thaliana

• Características morfológicas y moleculares

¿Quién es?

• Recursos biológicos disponibles

¿De qué recursos se dispone?

• Bases de datos

Impacto de Arabidopsis en la biotecnología y biomedicina

• Posibilidades biotecnológicas: plantas con valor añadido, resistentes a estreses, fitorremediadoras

•Arabidopsis thaliana es una crucífera(Brasicacea) considerada como malahierba

•Conocida vulgarmente como Arabide oArabidopsis (thale cress)

•En los ecosistemas silvestres es unaespecie anual que germina en otoño yflorecen a principio de la primavera

•Las rosetas tienen un diámetro de 2 a 10cm. Cuando la planta madura, produceunos tallos florales que miden entre 20 y40 cm.

Imagen: B and C, Maria Bernal and Peter Huijser; other photographs, InesKubigsteltig and Klaus Hagemann.HTTPS://DOI.ORG/10.7554/ELIFE.06100.002

• Las flores de Arabidopsis miden 2 mm de

longitud y tienen un diámetro de 1 mm.

• Tienen capacidad de autopolinizarse,

aunque también pueden polinizarse

fácilmente con el polen de otra planta.

• Cuando se produce la fertilización y el

ovario se elonga, produce un fruto

alargado llamado silicua que contiene las

semillas.

Distribución geográfica de Arabidopsis

Imagen: Ute Krämer and Klaus Hagemann.HTTPS://DOI.ORG/10.7554/ELIFE.06100.005

• Genoma de pequeño tamaño (1.2 x 108 bases,

aprox. 25000 genes comparado con maíz 2.4 x109

bases, 20 veces más, o trigo 1.6 x 1010, 130 veces

más)

• Fácil cultivo por su pequeño tamaño (placa Petri)

• Ciclo corto (6 semanas de vida)

• Produce muchas semillas para estudios genéticos

En los años 1980s los biólogos moleculares se fijaron

en Arabidopsis por sus características especiales.

En Diciembre de 2000 se publicó la secuencia de su

genoma (5 cromosomas).

• Se han desarrollado métodos de aislamiento y

detección de DNA, RNA, proteínas

• Facilidad para obtener mutantes y para transformar

¿De qué recursos se dispone?Existen bases de datos con información

detallada de Arabidopsis.

•The Arabidopsis Information Resource

http://www.arabidopsis.org/

•En ellas encontramos: colecciones de

semillas y otros stocks (genotecas, BACs,

ESTs, vectores, mutantes disponibles para

los distintos genes).

•Herramientas bioinformáticas

•Información de genes de interés: expresión

espacial y temporal, expresión en distintas

condiciones ambientales, búsqueda de

mutantes (insercionales, micro RNAs,

tilling).

http://signal.salk.edu/

g1g2 WT

Colecciones de mutantes de T-DNA

El estudio de Arabidopsis ha permitido diseñar plantas con:

1. Valor nutricional añadido (proteínas, aminoácidos,

vitaminas) como por ejemplo el arroz dorado,

http://www.goldenrice.org/ Science, 2000, 287 (5451): 303

2. Mayor rendimiento agrícola. Plantas resistentes a estreses biótico (Toxina Bt) y abiótico

(salino), a herbicidas (glifosato) virus, con mayor eficiencia fotosintética. Plant Physiology, 2008,

147:6

3.Plantas para producir medicamentos o productos químicos. Plant Cell Rep 2011, 30, 1367-

1382

Uso de Arabidopsis como modelo de plantas

Enlaces:

https://doi.org/10.7554/elife.06100.002http://www.arabidopsis.org/portals/education/aboutarabidopsis.jsp

https://www.nsf.gov/pubs/2002/bio0202/model.htm

http://www.arabidopsisbook.org/

The Arabidopsis book. (2002). IA Al-Shehbaz SL O’Kane. The American Society of Plant Biologists.

Arabidopsis: A Laboratory Manual. (2002). Detef Weigel and Jane Glazebrook. Cold Spring Harbor

Lab Press.

Arabidopsis: A Practical Approach. (2000). Zoe Wilson ed. Oxford University Press, Oxford, UK.

Arabidopsis: Annual Plant Reviews, Vol.1. (1998). Mary Anderson and Jeremy Roberts, eds. CRC

Press, Boca Raton, FL, USA.

Arabidopsis. (1994).Elliot M. Meyerowitz, Chris R. Somerville, eds. CSHL Press, New York, USA.

Arabidopsis : an Atlas of Morphology and Development. (1993). John L. Bowman ed.Springer-

Verlag, Berlin & New York.


lección 4.1. introducción al módulo 4

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