lab n°1 microparasitología

FACULTAD DE SALUD, DEPORTE Y RECREACIÓNDepartamento de Ciencias Químicas y Biológicas

INTRODUCCIÓN

El principal impedimento en la observación de bacterias en microscopio óptico es la falta de

contraste entre la célula en observación y el medio que la rodea, la manera más simple de facilitar

el contraste es la utilización de colorantes, revelando la presencia de determinados

constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de

actividad respiratoria, etc. Para bacterias, el proceso de fijación por calor es lo más habitual.

Después de esto se añade el colorante. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las

células; la tinción, por el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que son

realmente. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad

por los materiales celulares.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra

sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente;

un mordiente o fijador habitual es el Lugol. Este compuesto forma un complejo insoluble con el

colorante impidiendo su liberación natural de la bacteria.

Una técnica de coloración y la más conocida es la Tinción de Gram, denominada así por el

bacteriólogo danés Christian Gram, quien desarrollo esta técnica en 1844. Sobre la base de la

Tinción de Gram, las bacterias se clasifican en dos grupos: Gram Positivos y Gram Negativos.

Las bacterias Gram positiva y Gram negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias

constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para

definir su tamaño y su forma como también para prevenir la lisis osmótica.

La idea central de este laboratorio se centra ahí, en identificar estos dos grandes grupos de

bacterias y evidenciar sus más elementales diferencias estructurales.

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OBJETIVOS

Objetivo General

A través de un proceso llamado Tinción de Gram, clasificar una colonia de bacterias en

uno de los dos grupos mayoritarios según la estructura de su pared celular.

Objetivos Específicos

Aplicación de técnica de coloración diferencial para la identificación de bacteria Gram

Positiva y Gram Negativa

Asociar los correctos resultados de una tinción de Gram

Aprender técnicas fundamentalmente empleadas en la transferencia y la aislación de

microorganismos

Conocer los medios de cultivo y su finalidad

Aplicar técnicas de esterilización utilizadas en Microparasitología

Desarrollar una metodología de aprendizaje inductiva a partir de la experimentación

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXTRACCIÓN DE ADN DE PLÁTANO

1. Materiales:

ARNasa 10 mg/ml 1/3 de Plátano Detergente Antigrasas 10 ml Mortero H₂O Destilada Autoclavada Probeta de 60 ml NaCl 5M 600 µL Varilla de agitación 1 Vaso Precipitado de 100 ml 1 Tubo de Ensayo de vifrio con tapa Baño Termoregulado a 50°C

Etanol Puro Calidad Análisis Frío 4 ml Proteinasa K 10 mg/ml ARNasa 10 mg/ml Embudo Matraz Kitasato Bomba de vacío Papel Filtro Micropipeta de 1000 µL Puntas de Micropipeta de 1000 µL Micropipetas 200 µL Puntas de Micropipeta de 20 – 200 µL Varilla de Agitación

2. Procedimiento:

Se vertieron 20 ml de agua destilada y la mitad de un plátano sin cascara, en un mortero. En él, se

comenzó a moler todo junto, terminando por agregar 15 ml de agua destilada y moliendo hasta

obtener una pasta homogénea. Una vez que se terminó este proceso, se traspasó todo a un

matraz de 100 ml, se agregaron 60 ml de solución de Lisis y se revolvió todo, sin formar espuma,

por 3 minutos. Luego se tomó un embudo, en él se introdujo un papel filtro y se procedió a filtrar

la mezcla preparada, la cual se depositó directamente en un tubo de ensayo, ayudando al proceso

con una varilla de agitación (proceso se realizó con mucho cuidado procurando que solo cayeran

gotas de líquido al tubo).

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Al obtener 1,5 ml de la preparación filtrada en el tubo de ensayo; en primer lugar, se aplicó 30 µL

de ARNasa y se dejó reposar por unos minutos, luego se aplicó 30 µL de Proteinasa K y

nuevamente se dejó reposar por unos minutos más, y finalmente se aplicó 600 µL de Cloruro de

Sodio (NaCl) y se revolvió la solución. Después de este procedimiento se aplicó, 4 ml de Etanol

Puro muy frío, a la solución y se dejó reposar la mezcla hasta que se comenzó a observar la

aparición del ovillo de ADN, el cual se vio claramente flotando en la preparación (Fig. 1.1).

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RESULTADOS

NOMBRE DE LA PREPARACIÓN:

ADN DE PLÁTANO

TINCIÓN: SIN TINCIÓN

OBSERVACIONES: Se observó un ovillo de filamentos de ADN de color blanquecino el cual precipitó por la acción del Etanol, entre la interfase de la preparación y este alcohol. El ovillo se distinguía claramente del resto de la preparación, pudiendo incluso extraerlo con alguna pinza.

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DISCUSIÓN

En el presente informe se muestran los resultados obtenidos de una serie de intervenciones

realizadas en laboratorio a una colonia de bacterias, las Echerichia Coli, sin embargo, los resultados

obtenidos no fueron completamente favorables debido a que la colonia de bacterias no reaccionó

bajo los estándares esperados.

Primero que todo, el procedimiento al cual fue sometida la colonia de bacterias (E. Coli) es

comúnmente llamado Tinción de Gram. Este procedimiento permite separar las bacterias en dos

grandes grupos, Gram Positivas y Gram Negativas. Las bacterias positivas se tiñen de un color

morado, y las negativas se tiñen de un color rosa (sin safranina) o rojo (con safranina).

El problema en sí se presentó en la coloración final de las bacterias estudiadas, vistas en el

microscopio. La mayoría de ellas presentaba una coloración más bien cercana al morado, y muy

pocas de ellas presentaban tonalidades rosas. Cabe también mencionar que ninguna de ellas

presentó una tonalidad propia de la safranina. Por tanto, todo esto indicaba que se trataba de un

resultado pseudo Gram Positiva.

La Tinción de Gram, como se mencionó anteriormente, clasifica en dos grandes grupos a la

mayoría de las bacterias descubiertas. Este procedimiento basa su fiabilidad en las claras

diferencias estructurales existentes en estos dos grupos. Específicamente, estas diferencias se

presentan en la pared celular bacteriana.

La pared celular de una bacteria Gram Positiva está exclusivamente constituida por una gruesa

capa de peptidoglicano entrelazada por ácidos teicoicos y lipoteicoicos, que se cree que ayudan a

mantener la estructura de la pared.

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En cambio, la pared celular de una bacteria

Gram Negativa es mucho más compleja, primero

que todo porque la componen tres capas

generales, una muy delgada de peptidoglicano,

otra algo más gruesa llamada membrana

externa, y un espacio intermedio periplásmico.

Cuando se realiza la Tinción, las bacterias (E.

Coli) absorben el cristal violeta, luego se fijan

con la aplicación de Lugol (yodo en solución de

yoduro de potasio) a las proteínas ribonucleares

dentro de la célula, y la diferencia antes mencionada entre estos dos grupos de Gram, permite que

en estas bacterias, al aplicarles solventes de alcohol y acetona, se logre penetrar la débil pared

celular que las protege, extrayendo el colorante desde el interior de la célula, permitiendo la

decoloración propia en este procedimiento.

El problema se presenta ahí, y a continuación se definen algunas causas que pudieran ocasionar el

error antes mencionado:

1. Exceso en el tiempo y en la cantidad aplicada de cristal violeta

2. Exceso en el tiempo y en la cantidad aplicada de Lugol

3. Exceso en el tiempo de aplicación de

solventes a base de alcohol y acetona

4. Poca información del cultivo de

bacterias manipulado (trazabilidad)

Encontrar los argumentos exactos para

explicar el resultado de la Tinción de Gram

realizada es muy difícil, sin embargo,

claramente es una combinación de todas

aquellas causas mencionadas que explicarían en un gran porcentaje la problemática.

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Fig. 1 Envoltura de una bacteria Gram Negativa

Fig. 2 Curva de proliferación bacteriana


Si bien al investigar acerca del tema, existe una convención popular en que no se debe aplicar el

procedimiento a cultivos de colonias de E. Coli antiguas, que se encuentren en su fase

estacionaria, esto porque en aquellos cultivos, los nutrientes son escasos, existe gran cantidad de

material residual producto del metabolismo propio de las bacterias que interrumpe la

proliferación celular. Además muchas células yacen muertas junto a las otras. Todo esto provoca

una alteración en las paredes celulares de aquellas bacterias, producto de la inanición, el contacto

con residuos nocivos y pares muertos.

El solvente aplicado podría verse afectado por estos residuos nocivos y retardar, o derechamente,

no provocar su efecto decolorante. O por el contrario, una mayor exposición a las bacterias, de lo

normal, al solvente podría haber resecado en extremo todas las proteínas responsables de la

permeabilidad celular, provocando un efecto de cierre de la célula manteniendo el complejo

colorante dentro de la célula.

Por otro lado, al observar al microscopio la muestra estudiada, se pudo evidenciar que algunas

bacterias si presentaban una decoloración, un porcentaje mínimo por cierto pero que evidencian,

por qué no, una irregularidad en las concentraciones de cristal violeta y Lugol combinados

aumentando este fenómeno en conjunto antes descrito.

Por último, debemos destacar que se desconocía en el momento, la trazabilidad del cultivo

estudiado, desconociendo la fase en la que la colonia se encontraba, por tanto todas estas

variables podrían haber jugado en contra en el resultado de este procedimiento.

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CONCLUSIONES

Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se presentan

morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar tinción de Gram en estas para

identificar su grupo taxonómico, las Gram positivas se tiñen de color violeta mientras que las

Gram negativas se tiñen de color rosado.

Mediante la tinción de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram negativas gracias al

color que tornan después de ser teñidas; en el caso de las bacterias Gram positivas se tiñen de

violeta, esto se debe a que gracias a que contienen una pared gruesa de peptidoglicano y gran

cantidad de ácidos teicóicos que permiten fijar y retener rápidamente el colorante inicial llamado

cristal violeta, y además son resistentes a la decoloración. Lo contrario ocurre con el caso de las

Gram negativas, las cuales poseen una pared delgada con menos cantidad de peptidoglicano y

lípidos, la cual requiere de un colorante de contraste como la safranina en este caso, ya que el

colorante inicial es fácilmente retirado en la decoloración con alcohol, debido a que por su

delgada pared celular no lo retienen.

A partir de la experimentación, se consolidan los conceptos ya sabidos por la mayoría de los que

estudian esta rama de la medicina. Se pudieron ampliar también estos conocimientos y fomentar

una perspectiva real de cada uno de los elementos estudiados.

El método de extracción celular realizado se aprendió completamente, entendiendo cada uno de

los procesos que fueron dando paso al resultado final.

Este laboratorio también logro incentivar un estudio más detallado y específico de la morfología

bacteriana. Además, de la comprensión de la interacción de los procesos químicos usados sobre

los elementos orgánicos vivos estudiados.

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Finalmente, para obtener mejores resultados siempre se debe confirmar la trazabilidad de las

colonias estudiadas, repasar minuciosamente cada uno de los componentes a usar en el

procedimiento como también priorizar la esterilización de cada una de las herramientas

necesarias para realizar la Tinción de Gram.

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BIBLIOGRAFÍA

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Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología Médica. Vigesimoquinta Edición. México. Mc Graw-

Hill. 2011.

Murray, Patrick. Microbiología Médica. Sexta Edición. España. Elsevier. 2009.

Ryan, Kenneth. Microbiología Médica. Quinta Edición. México. Mc Graw-Hill. 2010.

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NOTAS

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