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Laboratorios de Biología Celular y MicrobiologíaProfesores: Juan Carlos Higuita V. PhD, Ivonne Ximena Cerón MSc.

LABORATORIO FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA

En las últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la ultraestructura bacteriana, lográndose una identificación bioquímica de muchas de las fracciones subcelulares, estos avances han permitido ubicar definitivamente a las bacterias en el reino Procariota. El conocimiento en profundidad de las diferentes estructuras y su composición ha permitido comprender, como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea cuando lo hacen como integrantes de la flora normal o cuando se comportan como agresoras para el mismo. Ha sido fundamental poder demostrar que muchas estructuras bacterianas bien identificadas son importantes inmunógenos, siendo posible utilizarlas para la preparación de vacunas que han significado verdaderos avances en la medicina de los últimos años. El conocimiento de la composición bioquímico de las diferentes estructuras de las bacterias, así como de su metabolismo, ha permitido la comprensión del mecanismo de acción de diferentes antibióticos. Por tal razón, la observación en el microscopio óptico y la reacción de las bacterias ante las diferentes coloraciones sigue siendo de fundamental importancia en la taxonomía e identificación bacteriana.

1. Fundamentación

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, para realizar la descripción morfológica de estos. La observación de células vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso se una gran cantidad de luz. La observación de frotis teñidlos es más recomendable. Esta se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y tiñen. De acuerdo a los objetivos de estudio se puede realizar diferentes tipos de tinciones como: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los colorantes más usados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. La mayoría de bacterias son teñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observación de forma, tamaño y arreglo de las células.

BACTERIAS

Laboratorio 5: Fundamentos de Microbiología


La tinción propuesta por el médico danés Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas ya que clasifica los cultivos bacterianos en Gram positivas y Gram negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el colorante primario (Cristal Violeta) tiñe por igual a todas las bacterias, pero la combinación con otros colorantes es más permanente en las Gram positivas. Para establecer esta diferenciación, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobre las Gram positivas, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo. En estas circunstancias se dificulta la observación por lo que es preciso adicionarle otro colorante llamado secundario (safranina). Este colorante no modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color primario, pero tiñe a los microorganismos decolorados.

Estas diferencias de tinción se deben a los cambios en la composición química y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retención o eliminación del colorante primario después del proceso de decoloración. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas siendo importante criterio de clasificación taxonómica. Además, debido a que algunas especies de microorganismos son patógenas y de gran toxicidad, su detección microbiológica alimentaria y médica es de gran interés. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:

● El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.

● La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células gram-positivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

● Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.

La diferencia entre las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas, se debe a la morfología de la estructura de la pared celular. Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida que da forma a la célula. Los principales constituyentes de la pared celular son los aminoácidos, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono, grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al Gram.



Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que

está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y

se une sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido Teicoico es el responsable del determinante

antigénico del organismo.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La

membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O polisacárido está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero el lipopolisacárido

entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de

substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un

espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de

transporte.

Por lo tanto la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la definición "taxonómica" de las bacterias: el color que adquiqAeren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas. En lo relativo a la coloración, los microorganismos Gram-positivos se tiñen de color azul-violeta y los Gram negativos se visualizan de color rojo-rosado.

Identificación Macroscópica de microorganismos bacterianos.Cuando las bacterias crecen en la superficie de un medio de cultivo sólido, las células en división permanecen aproximadamente fijas en su posición y forman masas de muchos millones de células visibles a simple vista. Las colonias así formadas varían desde un tamaño diminuto, apenas visible, hasta masas de varios milímetros de diámetro. Su tamaño, forma, textura, olor y en algunos casos color son, a veces, muy orientativos para la identificación de las bacterias que la componen. Aunque estas características dependen a menudo de la naturaleza del medio de cultivo y de las condiciones de incubación, cuando éstas se controlan cuidadosamente, son muy constantes y, en muchas ocasiones, tienen un valor diferencial considerable. La morfología de las colonias es una de las características básicas de las bacterias y es indispensable su estudio para comenzar correctamente una identificación preliminar. Las características morfológicas más importantes de una colonia bacteriana



aislada sobre un medio de cultivo sólido son:

Tamaño: es en condiciones de cultivo favorable, bastante uniforme para cada especie o tipo. La visualización del tamaño se suele hacer a simple vista, aunque a veces es preferible utilizar lupas. Las colonias de estreptococos, por ej., son relativamente pequeñas (menos de 1 mm de diámetro), mientras que las de estafilococos o las de algunos bacilos pueden alcanzar hasta 1 cm de diámetro. El tamaño de las colonias bacterianas se puede expresar en:

● Pequeñas o puntiformes: 1 mm de diámetro o menor ● Medianas: hasta 4 mm de diámetro ● Grandes: mayores de 4 mm de diámetro

El tamaño de las colonias debe ser considerado y medido en la parte final de la zona de aislamiento, que es donde presentan su máximo tamaño. No deben valorarse más que colonias bien aisladas.

Morfología: La morfología de una colonia viene dada por su borde y forma de elevarse sobre el medio de cultivo. El borde puede ser:

● liso (redondeado u ovalado) ● irregular (aserrado, lobulado o espiculado).

Si se hiciese un corte en un plano perpendicular a la base de la colonia se podría encontrar las siguientes posibilidades:

● semiesférica o convexa ● plana o en disco ● acuminada ● cerebroide● plana con bordes elevados (en cráter)● plana con centro elevado (en huevo frito)

Superficie: La superficie de la colonia, examinada mediante luz reflejada, puede mostrar un aspecto liso y brillante a la luz o, por el contrario, una textura irregular, rugosa y mate, sin brillo. Puede mostrar un aspecto filamentoso o cerebroide. La utilización de una lupa estereoscópica permite la observación de esta característica mediante la detección del reflejo del filamento de la lámpara en la superficie de la colonia.A continuación, se muestran las características para la descripción e identificación macroscópica de una bacteria.



Identificación Microscópica de microorganismos bacterianosEn lo que tiene que ver con la morfología bacteriana y se puede observar con la tinción GRAM se tiene:

Cocos: Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño

Forma

esférica:

se llama

Coco

División a lo largo

del mismo plano,

formando

cadenas cortas

División a lo largo de 2

planos diferentes: TétradasDivisión a lo largo de 3

planos

2 cocos juntos: Diplococos

4 - 20 en cadenas:

Estreptococos Regularmente: SarcinasIrregularmente:

Estafilococos

Las diferencias entre los subtipos de cocos se basan en los agrupamientos celulares. Estos aparecen como consecuencia de dos factores: el plano o planos de división celular y la tendencia de las células hijas a permanecer unidas entre sí, una vez que se completa la división.

Bacilos: variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos



Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en

X, V o Y

Las formas alargadas o bacilares agrupan una gran cantidad de subtipos morfológicos. Las diferencias en anchura, longitud y forma de los extremos de la célula proporcionan una considerable heterogeneidad a la forma bacilar.

Espirales

Forma espiral rígida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Las bacterias espirilares pueden considerarse de dos tipos: con espira rígida o con espira flexible. Al conjunto de las formas espirilares flexibles se le conoce como espiroquetas. La clasificación y diferenciación de las espiroquetas patógenas se basa en criterios morfológicos tales como la longitud de vuelta, el ángulo en los extremos de la célula, la presencia de una envuelta externa y la composición del filamento axial.

HONGOSLos hongos son organismos eucariotas y de mayor tamaño que las bacterias, se distinguen de otros eucariotas como los animales por ser inmóviles y de las algas y las plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos). Las levaduras son células de forma esférica u ovalada, que se reproducen asexualmente por gemación, un proceso en el cual brota una protuberancia o yema de la célula madre que posteriormente se separa como célula individual. El cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos (mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. El mecanismo de reproducción es asexual por fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de abundantes esporas en conidióforos y esporangióforos formados en hifas aéreas llamadas hifas reproductivas.El examen microscópico de los hongos en las muestras o cultivos se efectúa previa tinción o directamente en fresco. Los hongos se observan en muestras teñidas con la tinción de gran como gram-positivos. También se visualizan, contrastando las muestran con una gota de azul de lactofenol. Existen diferentes tinciones como: PAS, Tinciones agénicas, entre otras. Un hongo se identifica en primer lugar por la morfología macroscópica de la colonia, color,



textura y velocidad de crecimiento. Para observar la estructura microscópica puede tomarse un pequeño fragmento de cultivo y montarlo en el cubreobjetos, en fresco o contrastado con un colorante para su posterior observación, lo que permitirá confirmar si el hongo es levaduriforme o filamentoso, basado en la morfología colonial.

2. Objetivos:● General

Conocer las técnicas de preparación de frotis, fijación y coloración más usadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos, obtenidos en medios sólidos y líquidos.

● Específicos○ Identificar las principales formas de bacterias y la importancia de las tinciones

en la caracterización morfológica de los microorganismos.

○ Examinar el aspecto microscópico y macroscópico de la morfología

microbiana.

○ Conocer los métodos de tinción para diferenciación de microorganismos.

○ Diferencial especies bacterianas en Gram Positivas o Gran Negativas de

acuerdo a la tinción de gran.

3. Materiales y Reactivos

Materiales● 1 Probeta de 100 mL● 1 beaker de 100 mL● 1 mechero● 1 asa de siembra● 5 portaobjetos y cubreobjetos● Microscopio● Agua destilada● Cristal violeta● Lugol (solución yodada)● Alcohol cetona● Safranina



● Aceite de inmersión● Agua salina fisiológica● Solución de azul de lactofenol● Cultivos líquidos y sólidos● Toallas o papel absorbente● Etanol

4. ProcedimientoPreparación del frotis1. Lave los portaobjetos y secarlos con toalla absorbente y etiquételos.2. Prenda el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al

rojo vivo. Cultivos sólidos3. Después cerca del mechero abrir la caja Petri y enfriar el asa en una esquina del agar

del cultivo y así evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos por el calor.

4. Con el asa tomar cuidadosamente la muestra en la sección donde más concentradas se encuentren los microorganismos.

5. Marcar por la parte inferior el portaobjetos (el área de trabajo). Previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3 y 4. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.

Cultivos líquidos6. Realizar el paso 1 y 2.7. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean

destruidos. Después acercar al mechero el Erlenmeyer de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.

8. Marcar por la parte inferior el portaobjetos (el área de trabajo). Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente.

9. Esterilizar nuevamente el asa hasta el rojo vivo. Dejar secar el frotis al aire

Fijación del frotis1. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de etanol y dejar secar al aire (hacer



esto en zonas alejadas al mechero).2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se

pasa el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.

3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.

Tinción simple1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave de agua destilada.1. Observar en el microscopio. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del

microscopio. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

2. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas.



Preparación y fijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos

Describa macroscópicamente y microscópicamente las formas bacterianas de los cultivos sólidos entregados.



Tinción diferencial de Gram1. Preparar un frotis para cada una de los cultivos sólidos y líquidos.2. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 1 minuto.3. Lavar cuidadosamente el frotis con agua de destilada para eliminar el exceso de

colorante (5 segundos).4. Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol y dejarlo actuar

por 1 minuto.5. Lavar cuidadosamente el frotis con agua para retirar el exceso de lugol (5 segundos).6. Inclinar el portaobjetos y aplicar lentamente el decolorante por 10 segundos y lave

inmediatamente con agua destilada.7. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.8. Lavar nuevamente con agua, y secar cuidadosamente con papel absorbente la

superficie de lámina opuesta al frotis. Finalmente dejar secar al aire.9. Observe en el microscopio. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del

microscopio. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.




Tinción de hongos3. Colocar una gota de agua salina fisiológica encima del portaobjetos y con la ayuda del

asa microbiológica esterilizada toma una muestra del hongo presente en el muestra y se expande por encima de la gota de agua salina fisiológica, hasta que se seque. O sino se deja al aire libre para que el portaobjetos se seque.

4. Después de seca la muestra, se añade una gota de azul de lactofenol a la muestra. Es aconsejable esperar un par de minutos, después de introducir el reactivo.

5. Observar en el microscopio. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.


Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo de los resultados.Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos.Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

Preguntas de consulta1. ¿Investigue cuáles son las estructuras celulares o moléculas responsables de la tinción

simple. De ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.2. ¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? 3. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?4. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos

ejemplos de tinción diferencial.5. Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la

preparación? ¿Qué dificultades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción?

6. Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.

7. Realice un cuadro que represente las características más importantes de bacterias, levaduras, hongos, algas, microalgas y virus.

8. ¿Cómo se conservan, cómo se utilizan y cómo se almacenan los medios de cultivo?BIBLIOGRAFÍA



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