INSTITUTODEESPAÑA

REALACADEMIANACIONALDEFARMACIA

LASÍNTESISORGÁNICAENLAERADELOSFÁRMACOSBIOLÓGICOS

DISCURSODELEXCMO.SR.D.JOSÉCARLOSMENÉNDEZRAMOS

LEÍDOENLASESIÓNDELDÍA11DEOCTUBREDE2018PARASUINGRESOCOMOACADÉMICODENÚMERO

YCONTESTACIÓNDELA

EXCMA.SRA.DÑA.MARÍADELCARMENAVENDAÑOLÓPEZ

Madrid,2018

ÍNDICE

Prólogo 5RecuerdobiográficodelExcmo.Sr.D.RomándeVicenteJordana 6

LASÍNTESISORGÁNICAENLAERADELOSFÁRMACOSBIOLÓGICOS

1.Introducción 11

2.Síntesisorgánicaenlageneracióndenuevasmoléculascandidatasafármaco:laexploracióndelespacioquímico 13

3.Síntesisorgánicaconbiomoléculascomosustratos 20 3.1.Modificaciónquímicadeproteínas 20

3.2.Químicaclick 22

4.Síntesisorgánicaintracelular 28

4.1.Proteómicaquímica.Aplicacionesdelasíntesisinvivoaldiagnósticoporimagen 28

4.2.Haciaelmetabolismoartificial 30

5.Obtenciónymejoradefármacosbiológicosmediantesíntesisorgánica 35

5.1.Vacunassintéticas 35 5.1.1.Vacunaspeptídicas 36 5.1.2.Vacunasglucopeptídicas 40

5.2.Síntesisquímicadebiomoléculasnaturales 425.4.Síntesisquímicadebiomoléculasartificiales 48

6.Moléculasorgánicaspequeñasquellevanacabolafuncióndefármacosbiológicos 50

7.Observacionesfinales 57

DISCURSODECONTESTACIÓN 59

BIBLIOGRAFÍA 71

-5-

PRÓLOGO

ExcelentísimoSr.PresidentedelaRealAcademiaNacionaldeFarmacia,ExcelentísimasSeñorasySeñoresAcadémicos,Señorasyseñores,queridosamigos

Quisiera que mis primeras palabras sean de agradecimiento hacia losAcadémicos de Número de esta Real Academia por su generosa acogida.

Espero poder corresponder con mi trabajo a favor de esta Corporación alhonor que me hacen al admitirme en ella. En particular, quiero dejarconstanciademiprofundoagradecimientoa losAcadémicosque tuvieron la

amabilidad de avalar mi candidatura, la Excelentísima Señora doña CarmenAvendañoLópezylosExcelentísimosSeñoresdonAntonioMongeVegaydonFidelOrtegaRuizdeApodaca.

Me gustaría agradecer especialmente a la Dra. Avendaño, compañera detrabajodurantemuchosañosyamiga,elentusiasmoconelquehaimpulsadomientradaenestaRealAcademiayhapreparadosudiscursodecontestación.

También quiero recordar con agradecimiento a todos los compañeros delDepartamentoquemeayudaneneltrabajodiarioymeproporcionanelánimonecesario para perseverar en el trabajo, a menudo con su mera presencia.

Gracias también a mis padres, mis mejores profesores, por enseñarme avalorarelesfuerzoyelamorporeltrabajobienhechoyamiesposaehijospor

sucomprensiónconlosinconvenientesqueimplicamidedicaciónprofesional.Finalmente, a todos los presentes, compañeros, familiares y amigos, quieroagradecerosvuestracompañíaenesteacto.

-6-

RECUERDOBIOGRÁFICODELEXCMO.SR.D.ROMÁNDEVICENTEJORDANA

Antes de iniciarmi discurso de ingreso propiamente dicho, es grato paramícumplirconunade lasmásarraigadastradicionesacadémicas, ladeglosar lafigurademiantecesorenlamedallanúmero15,elExcelentísimoSr.D.Román

deVicente Jordana.Aunque leconocí solo superficialmente,elestudiodesudiscursodeingresoydealgunasotrasdesuspublicaciones,asícomoladelascontribuciones de varios miembros de esta Corporación a su sesión

necrológica, 1 me permiten calificarle como un investigador original yapasionado por su trabajo, que contribuyó de forma entusiasta a lasactividadesdeestaRealAcademia.

NacióenZaragoza(6sept.1920),elmayorde8hermanos.CursólosestudiosdeMaestroNacional(Zaragoza,1940)ylosdeFarmacia,lograndosutítulodeLicenciadoen1944yeldeDoctorenFarmaciaporlaUniversidadComplutense

en 1949, con premio extraordinario. Se colegió enHuesca en 1952 y llegó aejercercomofarmacéuticoenMonzón,2perosuinterésporlainvestigaciónlemovióa solicitaryobtenerunabecaen laUniversidaddeCambridge,donde

pasó varios años. En este período trabajó con Kenneth Smith, uno de lospadresde la virología vegetal, y conWalter JohnDowson,unespecialistaenfitopatologíadelDepartamentodeBotánica,obteniendounMasterofScience

por la FacultaddeBiología (1957).Mencionaré también, comopruebade suinextinguible curiosidad intelectual, que en la etapa de madurez de su vidaobtuvo también una Licenciatura y después, en 2004, un Doctorado en

MedicinayCirugíaporlaUniversidadComplutense.

A su regreso a España desde Cambridge, inició su carrera científica en elConsejoSuperiordeInvestigacionesCientíficas,dondellegóaserProfesorde

Investigación y Jefe del Departamento de Bacteriología y de la Unidad deFitobacteriología del Instituto de Microbiología Jaime Ferrán, además deocuparcargoscomoeldeConsejeroAdjuntodelCSICyservocaldelConsejo

TécnicoAsesordelPatronato"SantiagoRamónyCajal".

Fue un investigador imaginativo, capaz de proponer nuevos conceptos ydefenderlosconpasión.Fueautordelateoríadelafuncióncitoarjé,decytos

(célula)yarjé(dirigir),unmodelofuncionaldelossistemasvivosqueempezóa

-7-

dar a conocer aproximadamente a partir de 1955. El citoarjé sería una

estructura de carácter universal capaz de dirigir toda la actividad celular,moduladaenconjunciónconlosfactoresambientales.Élpropusoinicialmenteque podría tratarse de una familia de nucleoproteínas responsables de las

características de cada especie. Las nucleoproteínas propias de cada especieforman el arjesoma y dirigen las operaciones de síntesis de la célula. Lapresencia de otro organismo, simbiótico o parasítico, induce una síntesis

anormalenlacélulahuésped,quepropusodesignarcomoarjevirus. AunqueRomán de Vicente dedicó una buena parte de sus esfuerzos a explorar lasimplicacionesdeestasideas,trabajótambiénenotroscamposcomoelcáncer,

el análisis microbiológico de alimentos y los estudios medioambientales. Entotal, publicó alrededor de 100 artículos de investigación, divulgativos y deensayo,asícomovarioslibros.

Recibió múltiples reconocimientos nacionales e internacionales a su laborcientífica.Destacan lospremios“LeonardoTorresQuevedo"(1949)y"AlonsodeHerrera" (1962)enEspaña,elDiplomadeHonor,Consejode lasCiencias,

Damasco(1969)yelPrixd´Honeur(Hors-Concurs)yMedalladeOro,AcademieInternationaledeLutéce,Paris(1978).Además,fueelegidoFellowdelaWorldAcademyofArt& Sciencede Estocolmo (1963),AcadémicoCorrespondiente

de la Sociedad Argentina deMicrobiología (1966),MembroHonorario de laAcademia Nacional de Medicina de Río de Janeiro (1967) y miembro de laWorldAcademyofArtandSciencedeWashington(1994).

A pesar de estos éxitos, su vida profesional no fue siempre sencilla,probablementeacausade lopococonvencionaldesus ideas.Ademásde losinevitables problemas de escasez de financiación, encontró a menudo la

incomprensión de sus compañeros y tuvo muchas dificultades para que sepublicaran sus primeros artículos científicos. Relata estas desventuras desoslayoensudiscursodeingresoenestaAcademia,enelquehablaconcariño

del “Dr. Gonzalo Bilbao Agejas, que tanto batalló en compañía del Dr. JoséGarcía Vicente por la publicación de mis trabajos”. En el mismo discursoconfiesahaber luchadocontra“una ideadeabandono,causadaporunacoso

absurdoypermanente”.

-8-

En cuanto a su actividad en esta Academia, entró en ella como Académico

Correspondiente en 1962, propuesto por los Excelentísimos Señores ÁngelSantosRuiz,ManuelLoraTamayoyLorenzoVilasLópez.Sudiscursodeingresotuvopor título“Acciónde la temperaturaen ladeterminacióndeun focode

intoxicación alimenticia en alimentos congelados”. Posteriormente, ingresócomoAcadémico deNúmero tras ser propuesto por losmismos académicosqueenlaocasiónanteriorytomóposesiónel8-05-1986delamedallanº15,

vacanteporfallecimientodeRamónTurrientesyMiguel.Sudiscursodetomade posesión se tituló “Reflexiones sobre la biogénesis del ontos, ser, y deloncos,tumor,enlaunidaddelafuncióncitoarjé”.FueadscritoalaSección5ª,

entonces denominada de “Higiene y Deontología”, y hoy Sección 6ª con elnombre de “Historia, Legislación y Bioética” de la que fue Presidente entre1993y1999.Tambiénlecorrespondiópronunciareldiscursosolemnedelacto

protocolariodeaperturadecursoacadémico,el18deenerode1990,paraelqueeligióeltítulo“Elgravepeligrodepensar”,unelaboradoensayoliterariosobrelalibertaddeexpresión.

LASÍNTESISORGÁNICAENLAERADELOSFÁRMACOSBIOLÓGICOS

-11-

1.INTRODUCCIÓNLa palabra “síntesis” proviene del griego σύνθεσις, formada por σύν (juntocon)yθέσις(colocación),porloqueetimológicamentesíntesissignifica“ponerjunto”, es decir, unir dos elementos para formar algo más complejo. Estapalabrasehautilizadoenelámbitodelaquímicadesdehaceunos300años,

antesdequeexistieranlasideasmodernassobrelaestructuraquímicayantesinclusodelateoríaatómicadeDalton.3

Enlenguajemoderno,lasíntesisquímicapuededefinirsecomolaconstrucción

planificadadecompuestosporaplicacióndereaccionesquímicas.Lasíntesis,ysobre todo la rama de ésta que se centra en la obtención de compuestosorgánicos,haexperimentadounprogresoespectacular,4,5,6,7hastaelpuntode

que se ha afirmado que es ya una cienciamadura y que cualquiermoléculaorgánicarazonablementeestablepuedeprepararseporlosmétodossintéticosconocidoscontaldequehayaunsuministroilimitadodefinanciación,tiempo

ymanodeobra.Aunqueesprobablequeesto seacierto, también loesquenuncasedispondrádecantidadesilimitadasdelosrecursosmencionados,porlo cual la investigación en la mejora de los métodos existentes y en el

descubrimiento de otros nuevos continúa siendo una de las partes másimportantesde laQuímicaOrgánica.Dehecho,puedeafirmarseque,apesarde sus éxitos, la síntesis orgánica está todavía poco avanzada en muchos

aspectos cruciales por lo que estamos todavía muy lejos de disponer demétodos sintéticos ideales. 8 , 9 Algunas facetas de la síntesis que serán

presumiblementelabasedesucrecimientofuturoson:

1. Mejorademétodos.Apesarde losprogresosrealizados,haymuchostipos de transformaciones que no se pueden llevar a cabo con la

metodología actual y serían de gran importancia, entre todos loscampos de la ciencia, incluyendo el descubrimiento de nuevosfármacos.10

2. Química verde. La química sintética debe aspirar a causar lamínimaperturbacióndelentornonatural,yseestáponiendocadavezmayorénfasis en el desarrollo de métodos que contribuyan a este

objetivo.11,12

-12-

3. Mayoreficienciasintética.Implicaeldesarrollodemétodoscapacesde

alcanzar rápidamente diversidad y complejidad estructurales a partirde materiales de partida sencillos, normalmente mediante lageneracióndevariosenlacesenunasolaoperaciónsintética.13,14

4. Automatización de métodos sintéticos, que permita disminuir elesfuerzomanualasociadoaellosymejorarsueficacia.15,16,17,18

5. Síntesis eficiente a escala industrial de moléculas complejas, tales

comoproductosnaturalesysusanálogos.19

6. Síntesisorgánicadebiomoléculas.

A pesar de lo tentador que resulta para mí desarrollar el tema con mayor

extensión,novoyadedicarestediscursoalasíntesisorgánicacomotal,sinoasurepercusiónenelcampodeldescubrimientodefármacosy,sobretodo,asuconexiónconlosfármacosbiológicos.Porello,detodoslospuntosanteriores,

solotocarébrevementeelúltimo,queguardaunaestrecharelaciónconotraspartesdeldiscurso.

Puede considerarse que la investigación en nuevos fármacos previa a su

estudioclínicoconstade lastresgrandesetapasqueseresumenenlaFigura1.20Lasíntesisorgánicaescrucialenlastres,yeldesafíoalqueseenfrentaesel de desarrollar métodos que aumenten su probabilidad de éxito. Dada la

enorme amplitud de este tema,me voy a centrar sobre todo en la primeraetapa,esdecir,lafaseinicialdedescubrimiento.

Fase de descubrimiento Fase de optimización Fase de manufactura

Diseño y síntesis de moléculas orgánicas que formarán la quimioteca sobre la que se realizarán los ensayos

Optimización de las moléculas de interés identificadas en la fase inicial. Relaciones estructura-actividad.

Preparación a gran escala de las moléculas seleccionadas

Figura 1. Las tres etapas del descubrimiento de fármacos en las que interviene lasíntesisorgánica

-13-

2. SÍNTESIS ORGÁNICA EN LA GENERACIÓN DE NUEVASMOLÉCULASCANDIDATASAFÁRMACO:LAEXPLORACIÓNDELESPACIOQUÍMICOPuestoque, inclusoenestaerade los fármacosbiológicos, los fármacos sonpredominantementemoléculasorgánicaspequeñas,yenmiopiniónseguirán

siéndolo, voy a comentar algunos aspectos de lamanera en que se generanactualmente nuevos compuestos bioactivos (hits) que inician una línea deoptimizaciónquequizátermineenunfármacoenelmercado.

Losfármacosconocidosactúansobreuntotaldeaproximadamente500dianasterapéuticas.Sinembargo,sehaestimadorecientementequehayunas4.500proteínas susceptibles de ser dianas terapéuticas,21de las cuales la mayoría

estándesaprovechadas.Porotraparte,solamenteun4%delosprogramasdeinvestigación sobre nuevos fármacos en la industria farmacéutica conducenfinalmente a un fármaco en elmercado. Esta baja tasa de éxito de atribuye

principalmente a dos factores: (a) la información que proporcionan losexperimentos preclínicos no es trasladable a los resultados clínicos enhumanos; (b) la diana seleccionada puede no ser la más adecuada para

combatir la enfermedad en cuestión. Por estosmotivos, esmuy importanteque se incremente el número de proteínas identificadas como dianasterapéuticasyquesedescubranmoléculascapacesdeinteraccionarconellas.

Eldesarrollodelosmétodosdeensayodealtaproductividad(high-throughputscreening, HTS) ha hecho que la mayor parte de los proyectos dedescubrimiento de fármacos en la industria farmacéutica se inicien por el

estudioautomatizadodeunacoleccióndecompuestos(unaquimioteca)comoligandosdeunadeterminadadianaqueseconsideraprometedoraparatratarunaenfermedad.Losresultadosdeestafaseinicial,delaquedependentodas

las posteriores, están condicionados, obviamente, por la calidad de laquimioteca investigada. En principio, es deseable que represente moléculascon la mayor diversidad estructural posible, para que sea máxima la

probabilidad de que algunas de ellas se unan a dianas diversas. En otraspalabras,lasquimiotecasempleadasenlabúsquedadecompuestosbioactivosdebenocuparunaregiónlomásampliaposibledelespacioquímico.

-14-

El espacio químico se define como el conjunto de todas las moléculas que

cumplen una serie de reglas estructurales establecidas previamente, y lasdimensionesdedichoespacio,enlugardelascoordenadasespacialesquenosson familiares, son tres omáspropiedadesdedichasmoléculas. Esta noción

puedeaplicarseaotras situaciones,peroenel campodeldescubrimientodefármacos el espacio químico relevante es el que forman las moléculas conactividad farmacológica. En la Figura 2 se representa el espacio químico,

definido por tres propiedades que corresponden a los tres ejes decoordenadas, y se indican regiones en las que existen determinadaspropiedadesterapéuticas,asícomootraenlaqueexisteactividadporvíaoral.

Lasregionesdelespacioquímicoconocidasenlaactualidadcorrespondenalasestructuras de los productos naturales y de síntesis. Sin embargo, no existegarantíadequeestasregiones,queestánlimitadasporlostiposdeestructuras

alasquepermitenaccederlasrutasbiosintéticasylasmetodologíassintéticasconocidas, sean las más adecuadas para la búsqueda de moléculas conactividad biológica. De ahí la importancia de la investigación en nuevos

métodosde síntesis quepermitan generar estructurasmuydiferentesde lasconocidasactualmente.

Figura2.Representaciónesquemáticadelespacioquímico

-15-

Laformatradicionaldeconseguirdiversidadestructuralconsisteenintroducir

diferentessustituyentesentornoaunnúcleocomún;estaes lametodologíaempleada, por ejemplo, en la Química Combinatoria. Sin embargo, estamaneradeprocederconduceúnicamentea laocupacióndelespacioquímico

entornoalpuntoquecorrespondealesqueletonosustituido(Figura3).Sisedeseapoblarelespacioquímicodeunamaneramáscompletaysistemática,loideal sería empezar por generar una elevada diversidad de esqueletos y

despuésunaseriedeanálogosdecadaunodeellos(Figura4).Estaestrategiase conoce como “síntesis orientada a la diversidad” (diversity-orientedsynthesis, DOS)20,22,23y, a pesar de su sencillez conceptual, es relativamente

reciente,yaquefuepropuestaporSchreiberen2000.24

Desde su introducción, este concepto ha sido ampliamente aceptado comoherramienta para el estudio de procesos biológicosmediante la genómica y

proteómicaquímicas,enlasqueseestudialafuncióncelulardeunaproteínamediante su bloqueo con moléculas orgánicas en lugar de utilizar unaalteración de los genes que codifican la proteína.25,26Por tanto, la síntesis

orientadaaladiversidadestáresultandoesencialparaelcampodelaQuímicaBiológica(traducciónhabitual,aunqueincorrecta,deChemicalBiology),queseocupa del estudio de los procesos biológicos utilizando como herramientas

moléculasorgánicas.TambiénsehanempleadoconéxitométodosbasadosenDOS para la identificación de compuestos cabeza de serie en el ámbito deldescubrimientodefármacos.27,28

Compuestos de partida sencillos

Un esqueleto

Diversidad de sustituyentes

Figura3.Ocupacióndelespacioquímicopormanipulacióndeunúnicoesqueleto.Cadapuntogrisrepresentauncompuestoderivadodelesqueletoprincipal

-16-

Diversidad de esqueletos

Compuestos de partida sencillos

Diversidad de sustituyentes

Diversidad de sustituyentes

Diversidad de sustituyentes

Diversidad de sustituyentes

Diversidad de sustituyentes

Diversidad de sustituyentes

Figura4.Ocupacióndelespacioquímicoatravésdelasíntesisorientadaadiversidad(DOS).Cadapuntogris representaun compuestoderivadodeunode losesqueletosimplicadosUnade lasmanerasde llevara cabounaexploraciónsistemáticadelespacio

químico se representa en la Figura 5, y se conoce como estrategia deconstrucción-emparejamiento-acoplamiento (build-couple-pair).20, 29 La etapade construcción implica simplemente la síntesis de losmateriales de partida

adecuadamente funcionalizados para poder llevar a cabo las etapasposteriores. En la fase de emparejamiento, se combinan dichos materiales,idealmente en un solo paso mediante el empleo de reacciones

multicomponente, para dar lugar a un incremento inicial de complejidad.Finalmente,en lafasedeacoplamientoseaprovechanlosgruposfuncionalespresentes en los materiales de partida para llevar a cabo una reacción

adicional de generación de complejidad estructural, generalmentemedianteprocesosdeciclación.

-17-

Build Couple Pair

Functional group designed for pair stage (reactivity 2)

Functional group designed for couple stageFunctional group designed for pair stage (reactivity 1)

Grupo funcional diseñado para la fase de acoplamiento (couple)Grupo funcional diseñado para la fase de emparejamiento (pair), reacción 1Grupo funcional diseñado para la fase de emparejamiento (pair), reacción 2

Figura5.Laestrategiaconstrucción-acoplamiento-emparejamiento(build-couple-pair)paralogrardiversidadestructuralNohayunmétodoúnicoparadeterminareltamañodelespacioquímico,peroapartirdealgunassuposicionesdepartidarazonables(compuestosformados

porC,H,N,S,O,unmáximode30átomosycuatrociclos)sehaestimadoen1063moléculas.30Esunnúmeroinmenso,difícildeconcebir.Comoreferencia,el Chemical Abstracts contiene 1,43 x 108 compuestos descritos en la

bibliografíaquímicaapartirde180031y laedaddelUniversoesde4,3x1017

segundos. No existe, por tanto, la posibilidad de sintetizar ni siquiera unapequeña fracción de este conjunto de compuestos. Por este motivo, es

frecuente tratardedirigir laconstruccióndequimiotecasDOShacia regionesdelespacioquímicoenlasqueseconsiderequeexisteunamayorprobabilidaddeéxito.Unaposibilidadeselempleocomoguíade losproductosnaturales,

ya que se considera que han sido “optimizados” en el transcurso de laevolución para interaccionar con biomoléculas. Otra posibilidad es basar eldiseñode lasquimiotecasenelconceptodeestructuraprivilegiada.Se llama

asíaunaseriedefragmentosestructurales,confrecuenciaheterocíclicos,queestán incluidosencompuestosquehandemostrado lacapacidaddeunirsea

-18-

dianasfarmacológicasvariadas,porloqueseinterpretaquedichasestructuras

tienenunaespecialafinidadporelmaterialbiológico.32

Para ilustrar la construcción de quimiotecas basada en estos principios,mencionaré dos ejemplos procedentes de mi grupo de investigación. En el

primer caso, la quimioteca se construyó alrededor de un núcleo detetrahidropiridina, fácilmente accesible a través de una reacciónmulticomponente que previamente habíamos puesto a punto a partir de

materiales de partida sencillos y económicos. 33 Las transformacionesposteriores incluyeron, entreotros, procesosdedeshidrogenaciónparcial34ocompleta, 35 reacciones de reducción diastereoselectiva, 36 de Povarov, 37 de

metátesis, 38 , 39 de Diels-Alder38 y de Pictet-Spengler. 40 Algunas de estastransformacionesseresumenenlaFigura6.

NR1

CH3

ZR3

O

OR6

R4

NR1

CH3

ZR3

OR4

N

ZR3

O

OR6

R7

N

ZR3

O

R7

N

ZR3

O

OR7

R8R2

N

CH3 ZR3

O

OR2

N OCH3

O

H

H HH

Pumiliotoxina C

NH

CO2Et

NR1CH3

CO2EtH

HR

H3C

NH

H

HN CH3

ZR3

OR4R5

MCR

Figura6.Ejemplosdeconstruccióndequimiotecasorientadasadiversidadapartirdederivados de 6-alcoxi-1,4,5,6-tetrahidropiridina procedentes de una reacciónmulticomponente

-19-

Enelsegundoejemplo,lasmoléculasestánconstruidassobrenúcleosdepirrol

procedentestambiéndeunareacciónmulticomponente,queenestecasosellevóacaboencondicionesmecanoquímicas.41,42,43Algunosdelosprocesosdeciclación que se llevaron a cabo posteriormente para dar lugar a diversos

esqueletosheterocíclicos44seresumenenlaFigura7.

NR5

OOR3

NR5

OOEt

OCH3

CO2Et

N R2

OOEt

Ar

NCH3

OOR3

R

N CH3

OOR3

N Rn

N CH3

OOR3

OEtO

( )n

n = 1,2

N

N

OR3

O

OEtO

( )n12-22

NCH3

O

OEtNH3C

O

EtO( )n

R2

COR3

NR1

R5

R4

MCR mecanoquímica

R2

COR3

OR5

R4

O NH2

R1

Figura7.Ejemplosdeconstruccióndequimiotecasorientadasadiversidadapartirdederivadosdepirrolprocedentesdeunareacciónmulticomponente

-20-

3.SÍNTESISORGÁNICACONBIOMOLÉCULASCOMOSUSTRATOSDando por sentada la relevancia de la síntesis en el descubrimiento y

obtención de fármacos con estructura de moléculas orgánicas pequeñas,quisiera hablar ahora de su importancia en los fármacos biológicos, dondepuede no resultar tan evidente. Dedicaré, por tanto, el resto del discurso a

esteaspectodeldescubrimientodefármacos.3.1.MODIFICACIÓNQUÍMICADEPROTEÍNAS

La modificación química de las cadenas laterales de determinadosaminoácidos, formando éstos parte de una proteína, permite la posteriormanipulaciónquímicadeéstayconstituyeelejemplomássencillodesíntesis

orgánica realizada sobre una biomolécula como sustrato. Por ejemplo, laelevada nucleofilia del grupomercapto de la cisteína permite su alquilacióncon derivados de maleimida a través de reacciones de adición de Michael

(Figura8).

RN

O

O

Adición de Michael

HN

SH

O

OHN

S

O

O

RN

O

O

Cys

Figura8.LaadicióndeMichaeldeunresiduodecisteínacontenidoenunaproteínaaunderivadodemaleimida

Estatransformaciónhaencontradonumerosasaplicaciones.Porunlado,esunmétodomuyeficazparafijarcovalentementeproteínasasoportessólidosparaestudiardespuéssuafinidadporcoleccionesdemoléculas.Comoejemplo,se

representa en la Figura 9 el método empleado por Schreiber para fijar unaproteína a una lámina de vidrio, aprovechando que éste contiene grupossilanol, para posteriores estudios de Química Biológica de quimiotecas

orientadasadiversidad.45

-21-

SiOH

O SiOH

O SiOH

SiO

O SiO

O SiO

SiHO O

NH

O

NO

O

SiO OH

NH

O

NO

O

Si

NH2

SiEtO

EtONH2EtO1.

O

N

O

O

ON

O

O2.

SiO

O SiO

O SiO

SiHO O

NH

O

NO

O

SiO OH

NH

O

NO

O

Si

NH2

Proteína Proteína

Proteína

Figura9.Fijacióncovalentedeproteínasasoportessólidos

Las adiciones deMichael a unidades demaleimida se han utilizado tambiénpara lograr la conjugación de fármacos de estructura polipeptídica con

proteínastransportadoras.Unejemploeselcasodelasincretinas,unafamiliade polipéptidos que resultan muy prometedores en el tratamiento de la

diabetes46pero que, como es habitual en este tipo de biomoléculas, soninadecuadascomofármacosacausadesureducidaduracióndeacción,quesedebeasumetabolismoporpartedeunadipeptidasaplasmática (DPP-IV)ya

su rápidaeliminaciónpor vía renal.Unamanerade retrasarambosprocesosconsiste en asociar el péptido a seroalbúmina, que dificulta el acceso de laspeptidasas y, a causa de su gran tamaño, evita la filtración glomerular. El

antidiabético experimental CJC-1131 consta de una molécula de GLP-1, laincretinanaturalhumana,modificadapor sustitucióndel segundoresiduodeL-Ala por D-Ala, con objeto de dificultar su hidrólisis por DPP-IV, y a la que,

además, se ha añadido un resto de lisina a su extremo C-terminal. El grupoamino de esta lisina se une, a través de un espaciador, a un fragmento demaleimida. Una vez en el plasma, la maleimida reacciona con residuos de

cisteínadelaalbúminaydalugaralsistemaconjugado(Figura10).

-22-

S

Lys

HN

OO O

HN

O

N

O

O

Albúmina

GLP-1 modificada

Espaciador

CJC-1131

Figura10.ProductoconjugadoformadoinvivoporreacciónentreelfármacoCJC-1131ylaalbúmina

3.2.QUÍMICACLICKUna reaccióndebioconjugaciónpuededefinirse comouna reacción sintéticaque tienecomosustratoalmenosunabiomolécula,dando lugaraunenlacecovalente. Las biomoléculas modificadas sintéticamente que se generan así

tienenmuydiversasaplicaciones,queincluyen:

1. Monitorizacióndeprocesoscelulares.2. Estudiosdedistribucióndeproteínas.3. Estudiossobrelafuncionalidaddeenzimas.4. Vectorizacióndefármacoshacialugaresespecíficos.5. Generacióndeimágenesdebiomarcadores.

-23-

En síntesis orgánica, la expresión “química click” no designa, en principio, a

unareacciónconcreta,sinoaunconceptoquepretendeimitarlamaneraenlaquelanaturalezaconstruyesusestructuras,yquebusca,entreotrosobjetivos,lograrlacompatibilidadentrelasíntesisquímicaylasmoléculasbiológicas.En

general, la química sintética que cumpla esa condición se describe como“química bioortogonal”, en el sentido de que no interfiere las reaccionesbioquímicas(es“ortogonal”aellas).47,48

El concepto de reacción click fue propuesto inicialmente por Sharpless. Unareaccióndebereunirlassiguientescondicionesparapodersercalificadacomotal:49

1. Tenerlugarenunasolaoperaciónsintética.2. Darrendimientosmuyaltos3. Darlugaraproductosdeelevadaestabilidad4. Generarunmínimonúmerodesubproductosnotóxicos.5. Serrápida,irreversibleytranscurrirconelevadorendimiento.6. Permitirlaconstrucciónmodulardeestructurascomplejas.

7. Si sevaa llevara caboenunentornobiológico, ser compatible conelagua.

Laprimerareacciónqueseconsideródeformageneralizadacomomerecedora

de ser calificada como click es la cicloadición 1,3-dipolar entre alquinos yazidas para dar derivados de 1,2,3-triazol. Esta reacción fue descrita porprimera vez por Huisgen, quien la llevó a cabo en condiciones térmicas y

encontró que se formaban los dos posibles productos regioisoméricos, conestructurasde triazol1,4- y1,5-disustituidos.50,51Enelaño2002,Meldal,porun lado, 52 y Fokin y Sharpless, por otro, 53 descubrieron de forma

independienteunaeficazcatálisisdeestacicloadiciónenpresenciadesalesdeCu(I). Esta variante de la reacción de Huisgen suele designarse de formaabreviada como CuAAC (copper-catalyzed azide–alkyne 1,3-dipolar

cycloaddition), y tiene la ventaja respecto a la reacción original de poderllevarse a cabo a temperatura ambiente y ser regioselectiva, ya queproporciona exclusivamente triazoles 1,4-disustituidos. Unos años después

FokinyJiadescribieronuncatalizadorderutenioquepermitellevaracabounareacción análoga, que se conoce como RuAAC (ruthenium-catalyzed azide–

-24-

alkyne 1,3-dipolar cycloaddition) y que proporciona de forma regioselectiva

triazoles1,5-disustituidos(Figura11).54,55

Reacción de Huisgen

RuAAC

Calor

R1N N

N

R2H

Isómero 1,4-disustituido +

R1N N

N

HR2

Isómero 1,5-disustituido

R1N N

N

R2H

Isómero 1,4-disustituido

R1

NN+

N–

R2

H

R1

N N+N–

R2

H

R1 N N+ N–

C CR2 H+

R1N N

N

HR2

Isómero 1,5-disustituido

CuAAC

Figura11.Variantesdelacicloadición1,3-dipolarentreazidasyalquinos

La reacción CuAAC ha encontrado una gran aplicación en QuímicaFarmacéuticayenQuímicaBiológica,empleándosemuyamenudoparalograrla unión de dos fragmentos activos en una sola molécula. 56 , 57 , 58 , 59 , 60 Sin

embargo,comoreglageneralnopuedellevarseacaboenentornosbiológicosacausade laelevadatoxicidadde lasespeciesdeCu(I)ydesudesactivacióncomo catalizadores por coordinación con diversos grupos funcionales de las

biomoléculas. Aunque recientemente se han encontrado formas de superarparcialmenteesta limitación,61estosproblemashanservidodeestímuloparael desarrollo de reacciones de cicloadición que no requieran catalizadores

metálicos. La primera se debe al grupo de Bertozzi, y aprovecha la elevadareactividad asociada a la tensión angular de alquinos cuyo triple enlaceperteneceauncarbociclodeochomiembros,queseincrementamediantela

presencia de dos átomos de flúor, fuertemente aceptores, en la posiciónvecina. A partir de estos sustratos altamente reactivos, la reacción decicloadición dipolar tiene lugar en condiciones suaves, aunque, al faltar el

efecto director del catalizador de cobre, proporciona los dos regioisómerosposibles(Figura12).62Estaestrategiahasidodesignadacomostrain-promotedazide–alkyne1,3-dipolarcycloaddition(SpAAC).

-25-

Una alternativa a los cicloalquinos son los cicloalquenos de configuración

trans, especialmente el trans-cicloocteno, que está muy tensionado comoconsecuenciadeladistorsiónqueinduceenelanillocarbocíclicolageometríadeldobleenlace.

F

F

R1 N N+ N–+ SpAAC F

F

NN

NR1

F

F

NN

N R1

+

RR R

R R

R1 N N+ N–+

SpAAC

(a)

(b) NN

N R1

R

NN

NR1

+R

Figura12.LaestrategiaSpAAC.(a)Reaccióndecicloadición1,3-dipolarconderivadosde ciclooctino. (b) Reacción de cicloadición 1,3-dipolar con derivados de trans-ciclohexenoSehanutilizadootrasreaccionesdecicloadicióncomobaseparaprocesosde

bioconjugación.Lacicloadición[4+2]eslaclásicareaccióndeDiels-Alder,enlaqueseformaunciclodeseiseslabonesapartirdeuncompuestodepartidaqueaporta cuatroátomosalnuevoanillo yque contienedosdoblesenlaces

conjugados (dieno) y de un segundo compuesto, del que proceden los dosátomos restantes del nuevo anillo y que contiene un doble enlace aislado(denominadodienófilo).Aunqueexistenejemplosdesuusoenreaccionesde

bioconjugación, tieneel inconvenientedequeel aductopuede revertir a loscompuestos de partida. Una manera de superar este problema es emplear

como dieno un sistema de 1,2,4,5-tetrazina, ya que en ese caso el aductoinicialmente generado evoluciona rápidamente por pérdida de unamoléculade nitrógeno y no tiene la opción de regenerar los compuestos de partida

medianteunmecanismodetiporetroDiels-Alder(Figura13).Lareaccióndelatetrazina con alquenos se clasifica como un proceso hetero Diels-Alder dedemanda electrónica inversa (iEDDA) porque en ella el dienófilo es de baja

densidadelectrónica.

-26-

Diels-Alder

Retro Diels-Alder

NNN N

R

R

Diels-Alder

Retro Diels-Alder NN

NN

R

R

- N2 HNN

R

R

1,2,4,5-Tetrazina

Figura 13. Reacciones de Diels-Alder convencionales y empleo de 1,2,4,5-tetrazinacomoheterodienodedemandaelectrónicainversaSeresumeacontinuaciónunejemplorelativamentesencillodeaplicaciónde

estastécnicasalasíntesisdesistemasdetransportedefármacos.

Laincorporacióndeanticuerposalasuperficiedenanopartículas,dandolugara inmunonanopartículas, permite incrementar la selectividad y especificidad

de su distribución en comparación con las nanopartículas de actuaciónpasiva.63Lospolímerosanfifílicos tienen lapropiedaddeautoensamblarseencontacto conel aguadando lugar a unananoestructuraque tieneel interior

lipófiloypuedeencapsularmoléculasorgánicasyunacoronahidrófilaexterior,quequedaexpuestaalambienteacuoso.Siseincorporananillosdefuranoalpolímero, las nanopartículas correspondientes los presentarán hacia el

entornoacuoso.Schoichetdemostróquelaadicióndeanticuerposalosquesehabía incorporado una unidad demaleimida daba lugar reacciones de Diels-Alder que permitían la unin covalente de ambas estructuras. Esta técnica

permitió la preparación de nanopartículas asociadas covalentemente atrastuzumab,unanticuerpomonoclonaldirigidoaHER-2.Estaproteínaesuna

dianamuy importante en varios tipos de tumores, especialmente demama(Figura14).

-27-

O

O

NO

O

O

O

N

O

OO

H H

N

O

O OH H

O

O

O

Diels-Alder

Trastuzumab (anti-HER-2)

N

O

O O

H H

Me O O O O

MeO

OH

169Me CO2H

24

OO

Me OHN

O O71

HN

O

O

Auto-ensamblaje

Poli(TMCC-co-LA)-g-PEG-furano

Agua, pH 5,5, 37 °C

Her-2

Figura 14. Síntesis de inmunonanopartículas por reacciones de Diels-Alder. Laestructura del fragmento extracelular de HER-2 unida al fragmento Fab deltrastuzumabhasidorepresentadaconChimera1.10apartirdepdb1n8z

-28-

4.SÍNTESISORGÁNICAINTRACELULAR

4.1. PROTEÓMICA QUÍMICA. APLICACIONES DE LA SÍNTESIS IN VIVO ALDIAGNÓSTICOPORIMAGEN

Laproteómicaquímicasebasaenelusodemoléculasorgánicascomosondas

para investigar la distribución y función de las proteínas, proporcionarinformación sobre las interacciones entre éstas y validar nuevas dianasfarmacológicas. Esta nueva rama de la ciencia es actualmente esencial en el

descubrimientoydesarrollodefármacos.64,65,66,67

Laformacióndeimágenesbasadaenfluorescenciapermitelavisualizaciónnoinvasivadelasbiomoléculasparainvestigarsusfunciones.Porestemotivo,el

descubrimiento de la proteína verde fluorescente, premiado con el premioNobel de Química en 2008,68supuso una revolución en muchas áreas de labiología. El empleo de la química bioortogonal, cuyos principios se han

resumido brevemente en el apartado anterior, ha permitido llevar a caboestudios celulares de la interacción entremoléculas pequeñas y proteínas.69Como ejemplo, se resumen a continuación algunos estudios basados en el

empleo de 1,2,4,5-tetrazinas en reacciones hetero Diels-Alder de demandaelectrónicainversa(iEDDA).70

Enunaaproximaciónalalocalizacióndeladianaintracelulardeunfármaco,se

puede introducir en un cultivo celular un análogo de dicho fármaco que sehaya modificado mediante la introducción de un fragmento de trans-

cicloocteno en una parte de la molécula que, de acuerdo con estudios derelaciónestructura-actividadprevios,noseaesencialparalainteracciónconsudiana.Deentrelasmilesdeproteínaspresentesenlasuperficieoelinteriorde

la célula y que forman el proteoma de ésta, este compuesto debe unirseselectivamente a su diana. Si a continuación se adiciona un derivado detetrazina,dotadodefluorescenciaparafacilitarlamonitorizacióndelproceso,

debe tener lugar una reacción hetero Diels-Alder en la que se genera unaunión covalente entre el fármaco y el fragmentode tetrazina. Puestoqueelfármaco,asuvez,seencuentraunidoasudiana,elprocesoinducelaemisión

fluorescente por parte de ésta (Figura 15). Este método ha permitido la

-29-

localización intracelular de la diana de un elevado número de fármacos,

incluyendoeltaxol,71olaparib,72foretinib73ydasatinib,74entreotrosmuchos.

Proteoma

1

N

NN

N

NHN

2iEDDA

N

NN

N

NN

NN

- N2

NHN

Célula viva

Marcaje fluorescente de proteínas dentro de la célula

Figura 15. Localización de la diana intracelular de un fármaco basada en sumarcajecovalente conderivados fluorescentesde tetrazina.Etapa1:Unióna sudianadeunfármaco, al que se ha incorporado un resto de trans-ciclooctenilo. Etapa 2:MarcajefluorescentedelaproteínaunidaalfármacopormediodeunareacciónheteroDiels-Alder del fragmento de trans-ciclohexeno con un derivado fluorescente de 1,2,4,5-tetrazinaEstaaproximaciónrequiere,obviamente,disponerdederivadosfluorescentesde la 1,2,4,5-tetrazina que actúen comomarcadores. Se ha descrito un gran

número de compuestos de este tipo,muchos de los cuales son actualmentecomerciales.EnlaFigura16serepresentanalgunosejemplosrepresentativos,derivadosde conocidas estructuras altamente fluorescentes comoel BODIPY

(compuesto1),lacumarina(HELIOS347Me)ylarodamina(Rh-5-Tz).

-30-

H2N O O

MeN N

NN Me

HELIOS 347Me

N B N

Me

Me

Me Me

Me

Me

N N

NNMe

F F

O

NNN

N

Me

Me2N N Me

Me

+

Rh-5-Tz

1

Figura16.Algunosderivadosfluorescentesde1,2,4,5-tetrazina

Estametodologíapermite tambiénelmarcaje fluorescentedeproteínaspara

lasquenosedisponedeligandosconocidos.Enunaprimeraetapa,seprocedea la modificación de la proteína que se desea estudiar mediante laincorporación de un aminoácido no natural portador de un resto de trans-

ciclooctenilo,utilizandotécnicasdegenéticamolecular.Enunasegundaetapa,la reacción del fragmento de trans-cicloocteno con un derivado fluorescentede1,2,4,5-tetrazinaconducealmarcajecovalentedelaproteína(Figura17).

Proteoma

1

H2N

HO2C

N

NN

N

2iEDDA

NHN

Figura17.Marcajefluorescentedeunaproteínaparalaquenoseconocenligandos

4.2.HACIAELDISEÑODERUTASMETABÓLICASARTIFICIALES

El metabolismo celular es un proceso extremadamente complejo, en el quecentenaresdeenzimascatalizanmúltiples reaccionesdemaneraorquestada.Puedeespecularsecon laposibilidaddediseñare implementardentrode las

células rutas metabólicas artificiales, compatibles con los naturales y

-31-

destinados a la curación de enfermedades metabólicas o, en general, a la

manipulación de la actividad de las células demaneras difíciles de imaginarhoyendía.

Para poder avanzar hacia objetivo, todavía lejano, de la creación de rutas

metabólicasartificialesesnecesarioeldesarrollodecatalizadoresyreaccionesque permitan llevar a cabo química sintética compatible con el ambientecelular, que puede o no corresponder a reacciones presentes en la

naturaleza. 75 Aunque este es un terreno casi sin explorar, es interesantedestacar que ya se han logrado llevar a cabo varias clases de reaccionescatalizadas por metales de transición en entornos biológicos, incluyendo el

interior de células vivas. 76 , 77 , 78 , 79 , 80 Estas reacciones son especialmentesignificativasdebidoaque,apesardelagranversatilidaddelasenzimascomocatalizadores, hay muchos tipos de transformaciones sintéticas de gran

relevancia que no pueden ser logradas con las enzimas conocidas, como lasindicadas en la Figura 18 (entre otrasmuchas). En cambio, estas reaccionessonposiblesenpresenciadecatalizadoresbasadosendeterminadosmetales

detransición.

Br

OR

O+ OR

O

Heck

BY2

Metátesis

+ XSuzuki

X X +

Figura18.Algunas reaccionesde formacióndeenlaces carbono-carbonoqueno soncatalizadasporenzimas

El grupo del profesor Mascareñas, en la Universidad de Santiago deCompostela, es muy activo en este campo, habiendo descrito, entre otras,reaccionescatalizadasporpaladiolocalizadasenlamitocondria,orgánuloque

es particularmente activo en el metabolismo oxidativo, 81 y reacciones

-32-

catalizadas por oro o rutenio que pueden llevarse a cabo en paralelo en el

interior de células de mamífero.82Para dar una idea de las dificultades quedeben superarse en el desarrollo de este tipo de química, comentaré conciertodetallelasúltimastransformacionesmencionadas.

Unprimerpasoeneldesarrollodequímicacompatibleconentornoscelulareseseldelautilizacióndeaguacomomediodereacción.Estaetapainicialnoestrivial,yaqueengeneralloscompuestosorgánicossonmuypocosolublesen

agua y, además, en el caso de las reacciones catalizadas por especiesorganometálicas,éstasnosuelenserestablesalcontactoconelagua.Porello,el primer objetivo fue poner a punto un complejo de estructura Au(I)Cl [L],

donde L representa un ligando, que sirviera como catalizador en medioacuoso. La elección de derivados de cloruro de oro (I) se debió a que suscomplejos suelen ser tolerantes al aire y la humedad, aunque tienen el

inconvenientedequesureactividadsueleserbajaanoserqueseadicionensales de plata, que captan el anión cloruro y promueven la reacción. Undescubrimientoprometedor fueque,enuna reacciónmodelo llevadaacabo

en agua, la presencia de sales de plata fue innecesaria, lo que indicó que elagua puede llevar a cabo el papel de estabilización del anión cloruro. Seprocedióentoncesaestudiarlahidroarilaciónintramoleculardelsustrato1al

derivadofusionadodecumarina3enpresenciadeunaseriedecomplejosdeoro, encontrándose que la reacción, aunque lenta, procedía con buenrendimiento pero se necesitaba la presencia de un 20% de acetonitrilo por

limitaciones de solubilidad del material de partida. Se investigó después lacitotoxicidaddeloscompuestos1y3ydeloscatalizadoresempleadosfrenteacélulas HeLa, encontrándose una casi total ausencia de toxicidad para los

compuestosorgánicos.De loscatalizadoresensayados,2 resultó ser tambiénpococitotóxicoyfueseleccionadoparallevaracabolosestudiosposteriores.Finalmente,sedemostrólaaparicióndelafluorescenciapropiadelcompuesto

3enel interiordecélulasHeLa tratadasconelprecursor1 yel catalizador2(Figura19).

-33-

N O O

Ph

NN

N

PAuCl

N O O

PhH H

H2O / CH3CN (8:2), 37 °C, 24 h

3 (83%)

Sin necesidad de aditivos de Ag+

1

2

Figura19.ReaccióndehidroarilaciónintramolecularcatalizadaporAu(I)enelinteriordecélulasHeLaPara completar el estudio, se investigó la posibilidad de llevar a cabo unasegundareacción,catalizadaenestecasoporrutenio,enlascélulasenlasque

previamentesehabía llevadoacabolareaccióncatalizadapororo.Paraello,se incubarondichascélulasconelcompuesto fluorescente4yuncatalizadorderutenio,observándose la reaccióndeO-desalilaciónmostradaen laFigura

20.Esimportantedestacarqueesteexperimentodemostróporprimeravezlaposibilidad de llevar a cabo en una célula dos reacciones catalizadas pormetales de transición en paralelo, sin interferencia entre ellas. En otras

palabras, las reacciones no solo fueron bioortogonales (compatibles con lacélula viva en la que se llevaron a cabo), sino también ortogonales entre sí.Este tipo de comportamiento es indispensable si se pretende, en el futuro,

diseñarrutasmetabólicasartificiales,en lasquedeberáncoexistirnumerosasespeciescatalíticas.

O O

NCH3CH3

H3C [Ru]

O OH

NCH3CH3

H3C

54

+ +

Figura 20. Reacción de O-desililación catalizada por un complejo de rutenio en elinteriordecélulasHeLapreviamenteincubadasconloscompuestos1y2

-34-

Una reacción crucial en la síntesis orgánica moderna es la metátesis, cuya

importanciafuereconocidaconlaconcesióndelpremioNobeldeQuímicade2005. Recientemente, Ward ha descrito por primera vez una reacción demetátesis llevada a cabo en el interior de una célula.83 Para proteger el

delicadocatalizadorderutenionecesarioparallevaracabolareacción,secreóuna enzima artificial a partir de la proteína estreptavidina, que contiene unprofundobolsilloquepresentaunagranafinidadpor labiotina. Sintetizaron,

por otra parte, un compuesto que combina la biotina con uno de loscatalizadores más empleados para promover la reacción de metátesis, unaespeciederutenioconocidacomocatalizadordeHoveyda-Grubbsdesegunda

generación.Seadministróestecompuestohíbridoabacteriasquehabíansidomodificadasparaexpresarestreptavidinaensuperiplasma,loquecondujoalaformación en dicho espacio celular de una enzima artificial dotada de un

centrocatalíticoderutenioycapazdecatalizarreaccionesdemetátesiscomolaquesemuestraenlaFigura21.

HNNH

S

O

NH

OH

H Me

Me

Me

MeN N

RuOCl

Cl

MeMe

Me

Biotina

Catalizador de Hoveyda-Grubbs (2ª generación)

[Ru]

HO O O

HO O O

Enzima artificial

Biotina

EstreptavidinaBiotina

Estreptavidina

Figura 21. Reacción de metátesis catalizada dentro de una célula por una enzimaartificial. Se muestra la estructura de rayos X del complejo estreptavidina-biotina,representadoconChimera1.10apartirdepdb1mk5.

-35-

5. OBTENCIÓN Y MEJORA DE FÁRMACOS BIOLÓGICOS MEDIANTESÍNTESISORGÁNICA

Desdeelpuntodevistaestructural,lamayorpartedelosfármacosbiológicosson proteínas, polisacáridos, o bien estructurasmixtas de tipo glicoproteína.Los fármacos biológicos se obtienen a partir de seres vivos utilizando

tecnologías de ADN recombinante y, a diferencia de lasmoléculas orgánicaspequeñas,sonmezclasdenumerosasespeciequímicas.Aunquees frecuenteconsiderar los fármacos biológicos y los de síntesis como pertenecientes a

ámbitos distintos que además compiten entre sí, los avances de la síntesisorgánicaestánhaciendoquelafronteraentreamboscamposseacadavezmásborrosa. Dichos avances están permitiendo lograr la obtención de fármacos

biológicosenformadeunaespeciequímicapuraconuncontrolcompletodesu estructura, lo que inevitablemente debe tener consecuencias sobre suspropiedadesterapéuticas.

5.1.VACUNASSINTÉTICAS

Las vacunas se han obtenido tradicionalmente a partir de bacterias o virusenteros, que han sido previamente alterados o inactivados para reducir suvirulencia (Figura22).Sinembargo,estemétodoconduceaunaconsiderable

variabilidadentrelotes,asícomoareaccionesimnunológicasimproductivasy

Antígenos

Proteína transportadora

Carbohidratos

Péptidos

Moléculas pequeñas

Diseño racional

Espaciador

SíntesisVivo o atenuado

Inactivado

Vacunas convencionales Vacunas sintéticas

Figura22.Diferenciaesquemáticaentrevacunasconvencionalesyvacunassintéticas.

-36-

la posibilidad de reversión del organismo a formas virulentas cuando se

emplean patógenos vivos. Estos problemas se pueden evitar, en principio,utilizandovacunassintéticas,enlasqueelantígenoseconjugaaunaproteínatransportadora,permitiendoundiseñoracionaldelproductofinal.84

5.1.1.Vacunassintéticaspeptídicas

Lasíntesisdepéptidosenfasesólida(SPPS),introducidaporMerrifield,supuso

una novedad tecnológica que aceleró notablemente la investigación enquímicaybiologíadelospéptidosypermitióasucreadorsergalardonadoconelpremioNobeldeQuímicaen1982.85,86Sebasaenelanclajedelpéptidoen

crecimiento a una resina, lo que permite emplear grandes excesos de losreactivos y llevar a cabo las etapas depurificaciónpor simple lavado (Figura23).Deestamanera,losrendimientosdecadapasoindividualaumentanhasta

+

Cl

Resina de MerrifieldAnclaje inicial

CO2CsHNBOC

R1

HNBOC

R1O

O CF3CO2H, CH2Cl2

Desprotección

H2N

R1O

O

CO2HHNBOC

R2

DCC

Acoplamiento del segundo aminoácido

HN

R1O

OC

HNBOC

R2

O

Desprotección

CF3CO2H, CH2Cl2

HN

R1O

OCH2N

R2

O

Desanclaje de la resina

HN

R1OH

OCH2N

R2

OF

Dipéptido

Figura 23. Un ejemplo sencillo de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS),consistente en la preparación de un dipéptido utilizando el grupo tert-butiloxocarbonilo (BOC) como protector del grupo amino y DCC como reactivo deactivacióndelcarboxilo

-37-

niveles casi cuantitativos. Esto es crucial para poder producir péptidos de

interés biológico, que suelen contener un número considerable deaminoácidos, ya que la existencia obligatoria de etapas de activación ydesproteccióndespuésde añadir cada aminoácidohacequeel número total

deetapasdesíntesisseamuyelevado.En la figura24se representaesquemáticamenteunavacunapeptídica típica.En este caso, la proteína transportadora es la hemocianina de la lapa

californiana(Megathuracrenulata).Estaglicoproteína,conocidageneralmentecomoKLH,unacrónimodesunombreeninglés(keyholelimpethemocyanin),induce una potente respuesta inmunológica y se emplea a menudo como

elemento de transporte de haptenos. KLH se une al resto de la vacunamediante lareaccióndeunresiduodecisteínaconunaunidaddemaleimidadel fragmentoespaciador, quea su vez se combina condiversos fragmentos

peptídicos inmunogénicos que se unen al espaciador peptídico mediantequímicaclick.

NO

OS

HN

O

NHHO

NH

O

NN N

NNN

F

Proteína transportadora (KLH)

Péptido 1

Péptido 2

Cicloadición 1,3-dipolar

Adición de Michael a maleimida

Figura24.Estructuradeunavacunapeptídicatípica

Como ejemplo representativo una vacuna totalmente sintética obtenida

mediantetécnicasdesíntesisenfasesólida,comentaréelcasodeunpéptido

-38-

utilizadoenel campodel tratamientodeenfermedadesneurodegenerativas.

Hace tiempo que se trabaja en la inmunoterapia de la enfermedad de

Alzheimermediante el empleode anticuerpos contra la proteínaβ-amiloide.

Sin embargo, esta estrategia no ha dado lugar amejoras en las capacidadescognitivas de lamayor parte de los enfermos en los que se ha ensayado, yademás va acompañada de efectos tóxicos de origen autoinmune.87En este

contexto,resultaprometedoralavacunaUB-311,queestáenfaseIIdeestudioclínicoysecomponededospéptidoscatiónicosobtenidosporsíntesisenfase

sólida y formados por el fragmento 1-11 de la proteína β-amiloide y dos

epitopospeptídicosdelinfocitosTcooperadores(Figura25).88

Figura25.EstructuradelavacunatotalmentesintéticaUB-311

5.1.2.VacunassintéticasglucopeptídicasLas células están recubiertas de glicoproteínas, y los oligosacáridospertenecientes a éstas tienen un papel importante en los fenómenos de

reconocimiento e interacción entre células y de células con la matrizextracelular. Una característica universal de las células tumorales es queexperimentan cambios en sus patrones de glicosilación, por lo cual estos

carbohidratos modificados (tumor-associated carbohydrate antigens, TACAs)pueden servir de antígenosenel diseñode vacunas contra el cáncer.89,90Lasdificultadesencontradasenelaislamientoypurificacióndeestosantígenosa

partirdefuentesnaturaleshanllevadoaplantearsuobtenciónportécnicasdesíntesisorgánica.91Inicialmente se obtuvieron vacunas correspondientes a un solo antígeno,

destacando las que desarrolló el grupo del profesor Danishefsky en launiversidad de Columbia y el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center deNueva York a partir de Globo-H, un hexasacárido que se encuentra

sobreexpresado en las superficies de muchos tumores.92Este compuesto seconjugó a la hemocianina KLH, ya mencionada (Figura 26). Otros antígenos

-39-

utilizados en vacunas de este tipohan sido Lewisy (Ley) y fucosilGM1, entre

otros. Algunas de estas vacunas han alcanzado fases avanzadas de ensayoclínico.Porejemplo,Adagloxadsimolenin(OBI-822)estáenfaseIIIparacáncerdemama.

OHO

HO O O

OH

OOH

HOHO

H3C

OHO

NHAcO

OHO

HO

O

OH

HOO

OH

OH

OO

HO

OH

OH

O

NHHN O

N

O

O

S

Globo-H

KLH

Cys

Espaciador

Figura 26. Estructura de una vacuna construida a partir del antígeno hexasacarídicosintético Globo-H y la proteína KLH. La proteína procede de pdb 4bed y se harepresentadoconChimera1.10

Lasvacunasportadorasdeunúnicoantígenotienenel inconvenientedequerespondensoloaunodelosmúltiplesantígenospresentesenlasuperficiedelostumores.Aunque,enprincipio,esteproblemapodríaresolversemediante

la administración conjunta de varios antígenos asociados a un tumordeterminado, esta aproximación tiene las desventajas de suponer laadministracióndeunacantidadmuyelevadade laproteína transportadoray

de ser más compleja desde el punto de vista sintético por requerir variasetapasdeconjugaciónoligosacárido-proteína,queson laetapamásdifícildetodoelproceso.Además,a lahoradecomercializarunavacunadeeste tipo

sería necesaria la validación de cada componente desde el punto de vista

-40-

regulatorio. Por estos motivos, se ha diseñado una segunda generación de

antígenos multidiana, que contienen varios fragmentos oligosacarídicoscapacesdereconocerdiversosantígenos,representándosedosejemplosenlasFiguras 27 y 28. Cabe destacar que la preparación totalmente sintética de

estructuras con semejante nivel de complejidad fue posible únicamentegracias a un largo proceso previo de investigación básica sobre nuevosmétodosdesíntesisdeoligosacáridos,quenocomentarécondetalle.

KLH

O

HO

HO

OO

OH

O

OHHOHO

H3C

O

HO

AcHN O

OH

O

HO

O

OH

HOO

OH

OH

OO

HO

HO

OH

O

Globo-H

NH

HN

OH3C

O

NH

O

OOO

HO

OH

OH

OO

AcHN

OHO

O

O

OHOH

HO

OHO

HO

HOOH

O

HO

OH

OHMe

O

HN

O

HOO

HO

AcHN

O

O

OHHO OH

AcHNHO

CO2H

Ley

STn

O

NH

O

OOH

AcHN

OHO

OH

OH

OH

HO OTF

O

HOO

HO

AcHN

OH

Tn

HN

HN

O

O

S

NO

O

O

Figura27.Estructuradeunavacunamultidiana,construidaapartirdevariosantígenosoligosacarídicosylaproteínaKLH

-41-

Pam3Cys

O

HO

HO

OO

OH

O

OH

HOHO

H3C

O

HO

AcHN O

OH

O

HO

O

OH

HO

O

HO

OH

O

O

HO

HO

OH

O

Globo-H

NH

HN

OH3C

O

NH

O

OOO

HO

OH

OH

OO

AcHN

OHO

O

O

OHOH

HO

O

HO

HO

HOOH

O

HO

OH

OH

MeO

HN

O

HOO

HO

AcHN

O

O

OHHO

OH

AcHNHO

CO2H

Ley

STn

O

NH

O

OOH

AcHN

OHO

OH

OH

OH

HO O

TF

O

HOO

HO

AcHN

OH

Tn

HN

HN

O

NH

HN

S

O

O

OO

H3C OH

NH

O

O

O

H3C

H3C

H3C

Figura 28. Estructura de una vacunamultidiana, construida a partir varios antígenosoligosacarídicosyunpéptidotripalmitoiladocomoestructuratransportadoraLapreparacióndevacunasbasadasenoligosacáridostotalmentesintéticosse

ha aplicado también al caso del síndrome de inmunodeficiencia adquiridaasociada al virus VIH. Para ello, se han diseñado y sintetizado antígenosoligosacarídicoscorrespondientesalaglicoproteínagp120delasuperficiedel

virus,quesecaracterizanporsualtocontenidoenmanosayqueseunencongran afinidad al anticuerpo humano 2G12.93En la Figura 29 se representa launión de dicho anticuerpo a un oligosacárido de estructura Man9GlcNAc2,

presenteenlaglicoproteína.94

-42-

ManosaN-Acetilglucosamina

Figura 29. Unión de la fracción Fab del anticuerpo 2G12 a un oligosacárido deestructuraMan9GlcNAc2.FigurageneradaconChimera1.10apartirdepdb10p5.

5.2.SÍNTESISQUÍMICADEBIOMOLÉCULASNATURALES

Un buen ejemplo de la capacidad de la química sintética de generarbiomoléculas complejas es la síntesis total de la eritropoyetina (EPO), unaglicoproteína de gran importancia por su papel en la regulación de la

producción de eritrocitos y que supone un mercado de 1010 €/año. Laeritropoyetina aislada de fuentes naturales presenta una elevadaheterogeneidaden loquese refiereasupatróndeglicosilación, loquehace

quelasEPOscomercialessondiferentesentresí,difiriendoensusglicanosenfuncióndelascélulasutilizadasensuproducciónydeotrosfactores.Además,estosfactoreshacequeseanmezclasdevariasespeciesquímicas.

-43-

Eldesarrollodeunmétododesíntesispuramentequímicadelaeritropoyetina

permitiríadisponerdelasdiversasvariantesdelaeritropoyetinaenformadeuna especie química única y estudiar las propiedades de cada una de ellas.Todoellodaría lugaralestablecimientoderelacionesestructura-actividadde

laporciónoligosacarídica,conlaposibilidaddeproducirlaespeciemásactiva,así como preparar análogos no naturales que contribuirían, a su vez, a lasrelacionesestructura-actividad.Lagrandificultaddeestatareaquedapatente

al considerar que, además de los fragmentos de oligosacárido, laeritropoyetina se compone de 166 aminoácidos. Como prueba visual de sucomplejidad, se muestran en la Figura 30 los fragmentos peptídicos y

glucídicosdeunadelasglicoformasdelaeritropoyetinahumana.

3 x

Fracción peptídica (60% de M) Fracción glucídica (40% de M) Figura 30. (a) Estructura del fragmentopeptídicode la eritropoyetina, generada conChimera1.10apartirdepdb1buy.(b)Estructuradelosfragmentosglicosídicosdelaglicoforma1delaeritropoyetinahumana.

La síntesis de péptidos del tamaño de la eritropoyetina no puede abordarse

porlastécnicasconvencionalesyaque,aunquelasíntesisdepéptidosenfasesólida fue revolucionaria en su momento y ha permitido avanzarenormementeenelestudiodeestasbiomoléculas,suaplicaciónestálimitada

porel enormenúmerodepasosde reacción implicados, teniendoen cuentaque la incorporación de cada aminoácido implica etapas de activación,acoplamiento y desprotección. Por ejemplo, la síntesis de un péptido de 16

aminoácidossupone50pasosdereacción,yaunadmitiendoquecadaunode

-44-

ellostranscurraconunexcelenterendimientodel95%,el rendimientoglobal

delprocesoseríatansolodel7,7%(0,9550x100).Ademásdelalongituddelasecuencia de aminoácidos, influyenotros factores. Por ejemplo, los péptidoscon tendenciaa la agregación (porejemplo, lospéptidosamiloides) sonmás

difícilesdesintetizar.El descubrimiento de una técnica sintética conocido como ligadura químicanativa (native chemical ligation, NCL) ha ampliado espectacularmente las

posibilidades de la síntesis química de péptidos (Figura 31).95Este métodopermiteenlazarcongraneficacia fragmentospeptídicosnoprotegidosenunmedioacuoso,contaldequeelextremoN-terminaldeunodeellosseauna

cisteína.

200

100

nº de aminoácidos

Año1906 1932 1962 1992

LIgadura químicaCbz

SPPS

Proteínas más pequeñas

Figura 31. Evolución histórica del tamaño de los polipéptidos accesibles por síntesis

(adaptadadelareferencia95)

Elmétodode ligaduraquímicanativasebasaen larápidareaccióndelgrupo

mercaptodelacisteínaN-terminaldeunodelosfragmentospeptídicosconungrupoéstersituadoenelextremoC-terminaldelotropéptido.Lareacciónescompletamente regioselectiva respectoa lasdemás cisteínasde la secuencia

aminoacídica, lo queprobablemente indica la existencia de un fenómenodeasistencia por parte del grupo amino libre. Una vez enlazados los dosfragmentospeptídicospor la formacióndeungrupotioéster, tiene lugaruna

reaccióndetransposición,conparticipacióndelgrupoaminolibre,quegenera

-45-

el enlacepeptídicodeseadoy liberael grupomercaptode la cisteína (Figura

32).

H2N

SPPS

O

OR

SPPS

O

OHH2N

HS

Tampón acuoso, pH 7

H2NO

O

OHH2N

S

H2NO

HN O

OH

SH

NCL

MFD

H2NO

HN O

OH

CH3

Cys

Ala

Cys

Figura32.Fundamentodelmétodode ligaduraquímicanativa(NCL)acompañadodedesulfuracióndelacisteína(MFD)La aplicación de esta metodología ha permitido al grupo de SamuelDanishefsky la síntesis de la eritropoyetina humana en su glicoforma 1,

utilizando exclusivamente técnicas de síntesis orgánica.96,97Tras obtener, porunlado,losfragmentosdesignadoscomopéptido1apéptido5porquímicaenfasesólidaylosfragmentosoligosacarídicos,éstosseacoplaronalosprimeros

con técnicas de síntesis de glucósidos (Figura 33). Después, como serepresentaenlaFigura34,98losfragmentospeptídicosglucosiladosseunieronsecuencialmentepor técnicasde ligaduraquímicanativa, con transformación

enalaninadealgunosdelosresiduosdecisteínaimplicados,quepudohacerseselectivamente por medio del uso de grupos protectores. Finalmente, se

-46-

procedió al plegamiento de la estructura para dar lugar a eritropoyetina

plenamentefuncional.Otrosgruposdeinvestigaciónestánllevandoacaboestudiossobrelasíntesisde eritropoyetina y otras glicoproteínas pormétodos puramente químicos o

quimioenzimáticos.99,100

Fucosa

Ácido siálico

Galactosa N-Ac-glucosamina

Manosa

N-Ac-Galactosamina

Sitios de desconexión

Ala-60

Ala-125

Cys-29

Ala-98

Aminoácidos protegidos

SPSS

Péptido 11 28

Péptido 229 59

Péptido 39760

Péptido 498 124

Péptido 5125 166

Glicopéptidos para NCL (Figura 32)

Figura33.Etapasinicialesdelasíntesisdelaglicoforma1delaeritropoyetina

-47-

Péptido 5Cys

O

125166

Péptido 4Cys98 124

NCL

Péptido 3Cys60 97

NH

NCL

Péptido 11 28

NH

NCL

NCLPéptido 2Cys

29 59

NH

MFD

Péptido 11 28

NH

Cys Péptido 229 59

NH

Ala Péptido 360 97

NH124

Cys Péptido 5

O

125 166AlaPéptido 4

98

Fucosa

Ácido siálico

Galactosa

N-Ac-glucosamina

Manosa

N-Ac-Galactosamina

Plegamiento

Glicoforma 1 de la eritropoyetina

Figura34.Representaciónesquemáticade lasetapas finalesde la síntesis totalde la

glicoforma1delaeritropoyetina.Adaptadadelareferencia98

-48-

5.3.SÍNTESISQUÍMICADEBIOMOLÉCULASARTIFICIALES

Lacapacidaddeobtenerproteínaspormétodospuramentesintéticospermiteplantear la preparación de estructuras proteicas imposibles de aislar de lanaturaleza, como por ejemplo proteínas enantiómeras de las naturales.

Resulta ilustrativa larecienteobtenciónporsíntesistotaldelenantiómerodela proteína Ras. En su forma natural, Ras es una GTPasa formada por 166aminoácidos, existiendomutaciones de Ras en un 30% de los tumores. Esta

proteínaformapartedeunavíadeseñalizacióncrucialparalaregulacióndelaproliferaciónysupervivenciacelular(Figura35).101

Aunque el objetivo de la inhibición directa de Rasmediante fármacos se ha

perseguidodurantedécadasporconstituirunadelasmáximasaspiracionesenel campo de los fármacos antitumorales, hasta la fecha no se conoceninhibidoresdirectosdeestaproteína,loqueseatribuyeasuelevadaafinidad

TK TKP P

Protein tirosina quinasas

Grb SOS Ras

Raf

MEK

MAPK

Productos de genes específicos

Ciclina D

RNA ribosómico (rRNA)

Activación de la transcripción

Núcleo

GDP GTPRas

Figura35.Representaciónesquemáticade lavíadeseñalizacióndependientedeRas

(adaptadadelareferencia101)

-49-

por su sustrato endógeno y a la carencia de bolsillos hidrófobos a los que

pueda dirigirse un inhibidor potencial. La proteína enantiómera de Ras seconsidera un buen sustrato en el que ensayar agentes peptidomiméticosportadores de residuos D-aminoacídicos, y se espera que su disponibilidad

permitael descubrimientode fármacos capacesde inhibirRasdirectamente.DichaproteínadeRasfuesintetizada,enunaformamarcadaconbiotinayenparalelo con la versión natural formada por L-aminoácidos marcada de la

misma forma, mediante la preparación de cinco segmentos peptídicos porsíntesisenfasesólidaysucombinaciónposteriorporligaduraquímica(Figura36).102

Cys-51

Ala-146

Cys-118

Cys-80

Péptido 11 50

Cys51

Péptido 279

Cys80

Péptido 3117

Cys118

Péptido 4145

Ala146

Péptido 5166

Marcador

SPPS

NCL

Figura36.Resumende lasíntesisde laproteínaKRasenel sentidoretrosintético.La

representacióndelaproteínasegeneróconChimera1.10apartirdepdb5p21.

-50-

6. MOLÉCULAS ORGÁNICAS PEQUEÑAS QUE LLEVAN A CABO LAFUNCIÓNDEFÁRMACOSBIOLÓGICOS

Utilizando técnicas adecuadas, pueden conseguirse efectos terapéuticos queparecenenprincipioreservadosatécnicasbiológicas,comolaterapiagénicaolaedicióngenética,medianteelusodemoléculasorgánicaspequeñas.Como

ejemplo, voy a resumir brevemente la estrategia emergente conocida comoPROTAC (proteolysis-targeting chimera), cuya finalidad es la de promover lahidrólisis de una proteína diana marcándola para su degradación por el

proteasoma.103Ladestruccióndeladianapresentaventajaspotencialessobresu bloqueo, que es la aproximación tradicional, ya que de esta forma no senecesitaqueladianaestépermanentementeencontactoconel ligandopara

queexista laactividadbuscada.Ladegradaciónde laproteínadianaes,en lapráctica, equivalente al bloqueo de la producción de la proteína actuando anivel genético, como puede lograrse con ARN de silenciamiento (small

interfering RNA, siRNA) o bien mediante la edición genética con la técnicaCRISPR-Cas9. Debe señalarse que estas terapias biológicas presentaninconvenientes serios de toxicidad por la posibilidad de afectar a genes

distintosalpretendidooporotrosmotivos.Así,sehademostradounaelevadatasa de mortalidad en ratones tratados con siRNA asociada a toxicidadhepática, 104 lo que produjo una alta tasa de mortalidad en los ratones

experimentales. Por otra parte, se ha demostrado recientemente quetratamientos de tipo CRISPR–Cas9 ocasionan daños en el ADN asociados adefectosderegulacióndel“guardiándelgenoma”p53,asícomodetencióndel

ciclo celular, lo que implica riesgos evidentes de carcinogénesis asociados aestaterapia.105

Enlafigura37secomparanambostiposdeestrategiasterapéuticas.

-51-

Figura37.Comparacióndelasestrategiasterapéuticasconvencionales,basadasenelbloqueodedianasterapéuticas,conlasquesebasanensusupresión.

El proteasoma es un gran complejo proteico formado por 28 subunidades

proteicas agrupadas en cuatro anillos de siete unidades cada una más dosregionesreguladoras(“pestañas”)enlosextremos.Sumisiónesladedegradarproteínasqueyanoseanfuncionalesporhabersufridodaños,conobjetode

quelacélulapuedareciclarlosfragmentospeptídicosresultantes.

Para que una proteína sea sustrato del proteasoma, debe ser marcadapreviamenteporuniónaunidadesdeubiquitina,ylosdetallesdeesteproceso

seresumenenlaFigura38.LaubiquitinanecesitaseractivadaporunaenzimallamadaE1(ubiquitin-activatingenzyme)enunareaccióndependientedeATP.En una segunda etapa, la ubiquitina es transferida a un resto de cisteína de

una segunda enzima llamada E2 (ubiquitin-conjugating enzyme). Finalmente,unaubiquitinaligasa(E3)catalizalatransferenciadelamoléculadeubiquitinadesdeE2hasta laproteínaquevaasersustratodelprocesodedegradación.

Una vez que ha sido poliubiquitinilada tras varios ciclos como el descrito, laproteínasustratoesdegradadaporelproteasoma.Obviamente,paraeléxito

-52-

deesteprocesoescrucialquelaproteínasustratomuestreunabuenaafinidad

porlaligasaE3,yaqueessupuntodeentradaenelciclo.

UbUbUbUb

ATP

Ub

Ub

Ub

E1

E3

E2E3

Ub

E2

Sustrato

Sustrato

ProteasomaADP

E1

E2

E1E3E2

Fragmentos del sustrato

Sustrato

Figura38.Degradacióndeunaproteínaporelsistemaubiquitina-proteasona

LaestrategiaPROTACsebasaenlograrquelaproteínaquesedeseaeliminar

con fines terapéuticos sea sustrato del proteasoma. Los fármacos de tipoPROTACsonagentesmultidiana,diseñadosparaquepresentenafinidadconla

dianaquesedeseadegradary tambiénconunade lasproteínasE3.Deestaforma,sirvendeenlaceentreelcomplejoE3-E2-ubiquitinaylaproteínadiana,quedeesta formapuedeserubiquitiniladayportantoactuarcomosustrato

delproteasoma(Figura39).

-53-

E3

Ub

E2

Protac

Ub Ub UbUb

Proteasoma

Diana

Ub

Diana

Figura39.ResumendelaestrategiaPROTAC

Se conocen más de 600 ligasas E3 humanas, algunas de las cuales sonespecíficasdedeterminadostejidos,loquepermite,enprincipio,eldesarrollode un gran número de estructuras PROTAC. Aunque el diseño de estos

compuestos se complica por la necesidad de actuar en dos dianas, 106 elmecanismodeacciónresumidoanteriormentepresentaunaventaja,yesquesolamente es necesario encontrar compuestos quemuestren afinidad por la

diana,loqueesmuchomássencilloqueencontrarinhibidores.Portanto,estatécnica podría permitir actuar terapéuticamente sobre cientos de proteínaspotencialmente interesantes como dianas y de las que no se ha conseguido

localizar ningún inhibidor por los métodos tradicionales. Además, tambiénpueden ser de gran interés en investigación biológica porque debería daracceso de unamanera rápida y económica amodelos de animales o células

knockdown.

Aunqueesuncampotodavíaensusinicios,seconocenyaalgunoscompuestosprometedores basados en la estrategia PROTAC, uno de los cuales se

representa en la Figura 40 a modo de ejemplo ilustrativo. Este compuestocontiene casi íntegramente la estructura del foretinib, un inhibidor poco

selectivodequinasas.SeconstruyóunPROTACapartirdeestaestructura,ala

-54-

queseincorporóunacadenaespaciadoraunidaaunamoléculadetalidomida,

unbuenligandodelaligasaE3conocidacomocereblon(CRBN).Comocabríaesperar, este compuesto tiene afinidadpor un elevadonúmerodequinasas,aunqueconunpatróndiferentealdelforetinib.Además,elPROTACdemostró

capacidad de causar la degradación de la principal diana del fármaco departida,c-Met,tambiénllamadaHGFR(hepatocytegrowthfactorreceptor).Esinteresante destacar que, cuando se examinó el comportamiento frente a

otrasquinasas,laselectividaddelprocesodedegradaciónfuesuperioraladelasimpleinhibición,loqueresultamuyprometedor.

ForetinibO

N

H3CO

OF

HN

O

HN O

F

O

OHN

OO

NNH

O

O

O

O

Talidomida (ligando de E3)

Espaciador

Figura40.UncompuestoPROTACrepresentativo

Desde el punto de vista del diseño de fármacos, uno de los defectos de losPROTACes que sonmoléculas excesivamente grandes, dada la necesidaddeque contengan fragmentos capaces de unirse a dos dianas, además de un

espaciador. Esto puede traer consigo una baja biodisponibilidad y otrosproblemasfarmacocinéticos.Mencionaré,portanto,elrecientedesarrollodeprofármacosqueactúancomoprecursoresdelosPROTAC.Estoscompuestos,

que se activan gracias a una reacción click intracelular, han sido designados

-55-

como CLIPTAC (click-formed proteolysis-targeting chimeras). Se administran

por separado los dos ligandos, uno de ellos portador de un anillo de trans-ciclohexenoyotrodeunatetrazina,paraquetengalugardeformaintracelularunareacciónheteroDiels-AlderquegenereelPROTAC(Figura41).

N

N N

N

NHN

N

N N

N

PROTAC

Click

Figura41.FundamentodelaestrategiaCLIPTAC

Estaideasehaaplicadoaladegradacióndeoncoproteínas,comoposiblebasede un futuro tratamiento antitumoral. Como ejemplo, se representa en laFigura 42 la estructura de un PROTAC generado in situ y capaz de inducir la

degradacióndelaproteínaBDR4(bromodomain-containingprotein4).107

-56-

Click

E3 (CRBN)

BDR4 NHN

NN

S

NN

Me Me

Me

Cl

HNO

HN O

O

Me

O

N

NH

O

OO

O

NH

O

Figura42. EstrategiaCLIPTACpara ladegradaciónde laproteínaBDR4,basadaen laformaciónintracelulardeunPROTACatravésdeunareacciónheteroDiels-AlderLos compuestos PROTAC están todavía en las fases iniciales de su estudio, y

todavíanosehademostradosuseguridadalargoplazonisutolerabilidadporpacientes humanos. La estrategia terapéutica consistente en la supresión deuna diana es muy diferente de la basada en su inhibición y no se conocen

todas sus implicaciones, aunque esta es una limitación que afecta no solo aPROTACsinotambiénalastécnicasbasadasensiRNAyenedicióngenéticaporel método CRISPR-Cas9. No obstante, es una metodología sumamente

innovadoraen laquehaydepositadasmuchasesperanzasparaelestudiodelossistemasbiológicosyparaeltratamientodeenfermedadespocoaccesiblesalarsenalterapéuticoactual.

-57-

7.OBSERVACIONESFINALES

Con esto concluye la parte científica de este discurso. Espero haberles

transmitido mi pasión por las inmensas y todavía poco exploradasposibilidadesdelasíntesisorgánica,asícomomiconvencimientodequeesyseráenelfuturounaspectocrucialdeldescubrimientodenuevosfármacos.

Lacienciaesunatareadeequipoysoyconscientedequeyonoestoyaquípormis únicosméritos y que habría logradomuy poco sin el apoyo de tantos ytantoscolaboradoresyamigos,nacionalesyextranjeros,profesores,alumnos

de máster, doctorado y postdoctorales. No puedo en este momentonombrarlos individualmente, comomerecerían,peroquiero concluirdejandoconstanciademimásprofundoagradecimientohaciatodosellos.

Hedicho

DISCURSODECONTESTACIÓNDELAEXCMA.SRA.

DÑA.CARMENAVENDAÑOLÓPEZ

-61-

Excmo. Sr. Presidente, Excmos. Señoras y Señores Académicos, Señoras y

Señores:

ComomiembrodeestaRealAcademiaNacionaldeFarmaciadel Institutode

España,me cabe hoy la privilegiada tarea que representa la contestación alDiscursodeIngresodelDr.JoséCarlosMenéndezRamoscomoAcadémicodeNúmero.Esteencargomesatisfaceenormemente,yaquemepermiteresaltar

anteustedes losméritosque loavalanycomentarbrevemente latrayectoriavital y científica deun compañero en los quehaceres de la investigación y ladocencia.

TRAYECTORIAVITAL

El Dr. José Carlos Menéndez nació en Madrid, el 25 de junio de 1960. Sus

padres, Carlos y Mercedes, fueron compañeros de curso y, como otrosmiembros de su familia, eran Licenciados en Farmacia. Su padre,recientementefallecido,fueunexcelentedocentequeejerciócomoProfesor

AdjuntoInterinoenlaCátedradeQuímicaOrgánicadelaFacultaddeFarmaciadelaUCMtrascompletarsuTesisDoctoralcuandoJoséCarlostenía14años.Era tal sudevociónpor lamateriaypor ladocencia,quenosparecíaposible

quesuhijohubieraaprendidolaestructuradelbencenoantesdequesupieraescribirestapalabra.Unacaracterísticadenuestroprotagonistadehoyessurechazo nunca explicitado a comentar asuntos personales, lo que contrasta

consufacilidadparacomentaryparticiparendiferentesproyectoscientíficoscongranentusiasmoyeficacia.

Sus años de formación en el Colegio Calasancio deMadrid fueronmuy bien

aprovechados, y lo convirtieron en un chico de gran cultura y sensibilidadartística.Comoeradeesperar,ensuetapauniversitariasedecantóporseguirlos estudios de Farmacia, obteniendo la Licenciatura y el Grado (modalidad

tesina) en la Facultad de Farmacia de la UCM en los años 1982 y 1984,respectivamente, complementándolas casi simultáneamente con laLicenciaturaenQuímica,quecursóenlaUNEDyculminóen1986.

-62-

Realizó su tesis doctoral en el grupo del Profesor González Trigo bajo la

inmediata dirección de la Dra.Mónica Söllhuber Kretzer, obteniendo tras sudefensaen1988elPremioExtraordinarioyelPremioSantosRuizdelaRANFdeesemismoaño.Enlosaños1988-1989realizósusestudiospostdoctorales

conelProfesorStevenV.LeyenelImperialCollegeofScienceandTechnologyde Londres, trabajando en la síntesis total del antibiótico ionófororoutienocina.AsuvueltaloesperabaenMadridunacompañeradecursoque

sería suesposay suapoyo:MªAntoniaMartínCarmona,Dra.enFarmaciayProfesoraTitulardeUniversidad.Elmatrimoniotienedoshijos:MiguelyPilar.

ACTIVIDADDOCENTEYPROFESIONAL

Primero como Profesor Ayudante de Clases Prácticas y luego como ProfesorTitular, elDr.Menéndez impartiódocencia teórica yprácticaen lasmaterias

relacionadas con la Química Orgánica, Química Farmacéutica y SíntesisOrgánicaenlalicenciatura,gradoytercerciclodeFarmaciaenlaUCM,siendocoordinador del Máster interuniversitario en Descubrimiento de fármacos y

del programa de Doctorado interuniversitario en Química Médica en laUniversidadComplutense.

Ha sido autor o coautor demás de 30 capítulos en enciclopedias, libros de

textoomonografías,ProfesorVisitanteen laUniversitéPaulCezannedeAix-MarseilleIIIenelaño2007yenelInstitutodiStudiAvanzatidelaUniversidaddeBoloniaen2014.Hacolaboradotambiénendiversosciclosdeconferencias

organizados en España por los laboratorios Upjohn (1994), por la AgenciaEspañola deMedicamentos y Productos Sanitarios (2007), la Universidad deMarsella(2007),elCentralLeatherResearchInstitutedeChennaiylaMadurai

Kamaraj University en India (2013), la Universidad de Bolonia (2014) y laPharmaceutical Business School de la Fundación ESAME (2015). Además, hatrabajado activamente en la elaboración de proyectos de innovación y de

nuevosmaterialesdocentes.

Es Director desde su creación en 1995 del Centro de Asistencia a laInvestigación deMicroanálisis Elemental de la Universidad Complutense, ha

-63-

sido miembro del grupo de expertos en nomenclatura química de la Real

Farmacopea Española, ha colaborado en la traducción al castellano de laFarmacopeaEuropea,enlaelaboracióndeestudiosoinformesparaempresasfarmacéuticas o para la Agencia Española de Medicamentos y Productos

Sanitarios,yesmiembrodesde2017delgrupodeexpertosdelMinisteriodeSanidadencargadodelaelaboracióndelaspruebasdeaccesoalasplazasdeFarmacéutico Interno Residente. Desde febrero de 2017 es Catedrático de

Universidad.

IngresócomoAcadémicoCorrespondientedelaRANFenelaño2004.Enestainstitución ha impartido conferencias, ha presentado libros y ha sido

reconocidoconvariospremiosdeinvestigaciónenlosaños1986,2008y2014.

ACTIVIDADINVESTIGADORA

Suintensaactividaddocenteydeinvestigaciónbibliográficaesinseparabledesuprincipalactivo:laactividadinvestigadoraexperimental,quesehacentradofundamentalmente en el desarrollo de nuevas metodologías de síntesis de

compuestosfarmacológicamenteactivos,enbuenaparteproductosnaturaleso análogos de los mismos. En las líneas de trabajo actuales del grupo deinvestigación que dirige, destaca el desarrollo de nuevas reacciones

multicomponente y de reacciones dominó orientados a la síntesis decompuestos bioactivos relacionados con alcaloides, así como eldescubrimiento de nuevos candidatos a fármacos mediante la metodología

denominadasíntesisorientadaaladiversidad,comomencionaensuDiscurso.Entre estos candidatos encontramos antituberculosos, antileishmania yanticáncer,nuevosteranósticosyagentesmultidianadiseñadosracionalmente

paraqueseancapacesdemodularvariasdianasterapéuticasasociadasaunaenfermedad.

Estaintensaactividadinvestigadorasehareflejadohastaelmomentoen245

publicaciones originales y 12 patentes. Ha recibido unas 6.100 citas, con uníndice h de 37. Varias publicaciones han sido seleccionadas por los editorespara ilustrar la portada o contraportada del número correspondiente. Ha

-64-

dirigidoocodirigido30tesinasotrabajosfindegrado,35trabajosdeDEAofin

de máster y 19 Tesis Doctorales (más otras 7 en curso), habiendo tuteladotambién a 6 investigadores postdoctorales. Ha presentado unas 300comunicaciones a congresos ymás de 30 conferencias invitadas en distintas

UniversidadesycentrosdeinvestigaciónenEspañayenelextranjero.

El rigor científico y la productividad del Dr. Menéndez se refleja en otrasmúltiples facetas. Ha sido evaluador de publicaciones para unas 90 revistas

científicas internacionales, incluidas lasmásprestigiosasenQuímicaOrgánicayenQuímicaFarmacéutica,perteneceavariosconsejoseditorialesderevistasindexadas,yesademásevaluadordeproyectosdeinvestigaciónparadiversos

organismos oficiales en España y en otros países (Francia, Italia, Rumanía,Austria,RepúblicaCheca,Croacia,Portugal,Holanda, Israel,ArgentinayHongKong).

En cuanto a la financiación de este trabajo, ha participado en casi 100proyectos competitivos y contratos de investigación con diversas empresasquímicas y farmacéuticas, siendo el Investigador principal en

aproximadamenteun75%deellos.

Losmagníficosresultadosquehaobtenidoensuactividad investigadorasoloson posibles con una gran capacidad de gestión de recursos económicos y

humanos. Su relación con grupos de investigación de Francia, Italia, ReinoUnido,ArabiaSaudíeIndia,fundamentalmente,iniciadahabitualmenteconlaestancia en el Departamento de doctorandos, postdoctorandos o profesores

visitantesdedichospaíses,sehaidoincrementandoconeltiempoapesardelacrisis.Puedoasegurarlesquenoesfácilencontrarennuestroentornoenlasáreas de Química Orgánica o Química Farmacéutica una productividad tan

grandeyrelevante.

Nuestro trabajo conjunto a lo largo de los años, continúa de alguna formadespuésdemi jubilación, yaque lasdosprimerasedicionesdenuestro libro

“MedicinalChemistryofAnticancerDrugs”,publicadasen2008yen2015porla editorial Elsevier, se completarán con una tercera edición actualmente enmarcha.

-65-

COMENTARIOSASUDISCURSODEINGRESO

En su discurso de ingreso, titulado ”La síntesis orgánica en la era de losfármacosbiológicos”,elDr.Menéndeznoshamostradosuampliaexperienciayconocimiento. Ensuprimeraparte,hadestacado larelevanciaquesupone

ampliar las regiones conocidas del espacio químico desarrollando nuevasmetodologías sintéticas que permitan generar de forma cada vez mássofisticadayeficienteestructurasmuydiferentesalaspreviamenteconocidas,

uncampoalquehaaportadocontribucionesinteresantes.

Segúnelconocimientoactual,ademásdelasdiversasycomplejasestructurasque nos seguirá proporcionando la naturaleza, solo a través de su síntesis

previa se podrán encontrar moléculas orgánicas con actividad biológica queden lugar a fármacos novedosos o a herramientas para el estudio de lasfunciones celulares y de los procesos biológicos. La necesidad de sintetizar

nuevas moléculas para su posterior estudio se debe a la dificultad parapredecirpropiedadesmolecularesoactividadesbiológicas,unasuntoquefuetratadoporelDr.ArturoMosqueiraToribioensuDiscursodeIngresoenesta

Academiatitulado“Lateoríadelosorbitalesmolecularesyeldiseñodenuevosmedicamentos”(año1974),asícomoenlosdeaperturadeloscursos1975y1998. Esta es la razónpor la que la síntesis orgánicahaprotagonizadootros

DiscursosdeRecepcióndeAcadémicosenestainstitución.Laencontramosenel del Dr. RamónMadroñero Peláez, titulado “La variación estructural en laselección de nuevos fármacos” (año 1971), en el del Dr. Gregorio González

Trigo,titulado“LasconquistasdelaSíntesisOrgánica”(año1985),oenelmíopropio, titulado “Repercusión de la síntesis química en la investigación ydesarrollo de nuevos fármacos” (año 2000). En el Discurso de Ingreso como

AcadémicodeHonordelDr.JoséElgueroBertolini,leídoelaño2009ytitulado“Lafarmaciaylaquímica:unpaís,dosculturas”,ésteafirmabaquelaquímicanoalcanzarásumadurezhastaquelasíntesisorgánicasedirijayseapliquea

compuestos cuyas propiedades se hayan predicho con anterioridad.Desgraciadamente,comoafirmabaelDr.Mosqueira,predecirconseguridadlaactividadbiológicadeunamoléculatodavíanoesposible.

-66-

En el resto de su Discurso, el Dr. Menéndez nos muestra como la síntesis

orgánica,ademásdeserimprescindibleparadisponerdemoléculaspequeñas,tieneimportanciaenelterrenodelosfármacosbiológicosy,engeneral,delabiología. La síntesis y manipulación de biomoléculas está permitiendo, por

ejemplo, monitorizar procesos celulares, vectorizar fármacos a lugaresespecíficos, conocer cómo se distribuyen las proteínas y cómo funcionan lasenzimas,ysintetizarfármacosbiológicos.

Como se ha dicho, el desarrollo de una química compatible con entornoscelularesnoestrivial,porquerequiereutilizarelaguacomomediodereaccióncuandoengeneralloscompuestosorgánicossonmuypocosolublesenella,y

porque muchas especies organometálicas utilizadas como catalizadores nosuelen ser estables en este medio. Además, han de utilizarse “reaccionesortogonales”quenointerfieranconlasreaccionesbioquímicas.Aunqueporel

momento se conocen pocas reacciones que cumplan estos requisitos, lascicloadiciones 1,3-dipolares entre azidas y alquinos y las reacciones heteroDiels-Alder de demanda electrónica inversa, se están utilizando con éxito y

aplicandoadiversosobjetivos.

La síntesis de inmunonanopartículas sigue la estela de la de otrosinmunoconjugados más simples, en los que un anticuerpo monoclonal se

enlaza a fármacos para lograr una distribución más específica de éstos. ElconjugadoKadcyla®, por ejemplo, aprobadoen2013parael tratamientodelcáncerdemamametastásicoHER-2positivo, está constituidopor el potente

agenteantimicrotubularmaitansinayelanticuerpomonoclonal trastuzumab,cuyaacciónantitumoralsedebeasuinteracciónconlaregiónextracelulardelantígeno HER-2 y con los receptores Fc del sistema complementario.

Análogamente, la conjugación de fragmentos de anticuerpos, como elfragmento Fab de trastuzumab, con nanopartículas que pueden encapsularmoléculas, permite incrementar la selectividad y especificidad de la

distribucióndeéstas.

Elempleodelaquímicabioortogonalhadadopasotambiénaladenominadaproteómicaquímica,querepresentaunmaridajeperfectoentrelabiologíayla

química.Enella,lasmoléculasorgánicasseutilizancomosondasparalocalizar

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lasdianasintracelularesdelosfármacosmedianteelmarcajefluorescentede

proteínasunidasafármacosconvenientementemodificados.Deestaforma,sepuede investigar la distribución y función de las proteínas, obtenerinformaciónsobresusinteracciones,yvalidarnuevasdianasfarmacológicas.

EnlatercerapartedesuDiscurso,elDr.Menéndeznosmuestraconejemplosquelasíntesisorgánicanosolopuederealizarseconbiomoléculas,sinoquelosfármacos biológicos (proteínas, polisacáridos o glicoproteínas) pueden ser

sintetizadospormétodosquímicosenvezdeobtenerseapartirdeseresvivosutilizando técnicas de ingeniería genética. La síntesis de oligosacáridosconvenientementeconjugados,análogosalasglicoproteínasquerecubrenlas

paredesdelascélulastumoralesodeciertosvirus,puedeservirparaeldiseñode vacunas en las que los glicosacáridos sintetizados funcionan comoantígenos. Esta química permite incorporar diferentes fragmentos de

oligosacáridosparaqueéstosfuncionencomoantígenosmultidiana.

En el caso de los péptidos, la preparación de fragmentos por las ya clásicassíntesis en fase sólida, combinadas a veces con la unión de fragmentos en

disolución, ha permitido la obtención a escala industrial de péptidos de untamañoconsiderable,comoenfuvirtida,uninhibidordelprocesodefusióndela membrana del virus VIH con la de los linfocitos TCD4, que previene la

entrada en ellos del ARN viral. Enfuvirtida es un péptido formado por 36aminoácidos que corresponden a los residuos 127-162 de la porciónextracelular del segmento transmembrana gp41 de la glicoproteína de la

cubiertadelVIH-1.

Además de estos métodos clásicos para la síntesis de péptidos opeptidomiméticos, se están desarrollando técnicas muy eficaces, como la

“ligaduraquímicanativa”,quepermitenenlazarcongraneficaciaenunmedioacuoso fragmentos peptídicos no protegidos. Estos procedimientos se hanempleadoen lasíntesistotaldeeritropoyetinahumana,unaglicoproteínade

granimportanciaporsupapelenlaregulacióndelaproduccióndeeritrocitosque tiene un patrón de glocosilación muy heterogéneo y un fragmentopeptídico compuesto por 166 aminoácidos. La síntesis puramente química o

quimioenzimáticade laeritropoyetinapermitiríadisponerdeestructuras con

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unúnicopatróndeglicosilaciónyestudiar suspropiedadesa findeproducir

industrialmentelaespeciemásactiva.

En el discurso se ha comentado también, como ejemplo de síntesis debiomoléculasartificiales,ladelamoléculaenantiómeradelaproteínaRas,una

GTPasaquecontiene166aminoácidos.AunqueRasformapartedeunavíadeseñalización crucial para la regulación de la proliferación y supervivenciacelular, y se encuentra mutada en muchos tumores, no se conoce hasta el

momentoningúninhibidordirectodebidoposiblementeasugranafinidadporsu sustrato endógeno (GTP) y a que su estructura tridimensional carece delugares adecuados para su interacción con otrasmoléculas. Su enantiómero

tiene gran interés porque puede ser útil para descubrir peptidomiméticoscapacesdeinhibirdirectamentelaproteínaRasnatural.

La“intrusión”delasíntesisquímicaenlosterrenosbiológicosescadavezmás

atrevidae intentamanipular laactividadde lascélulasconnuevosobjetivos,como poner en funcionamiento rutas metabólicas artificiales a fin de curarciertasenfermedades. La consecucióndeestosobjetivospuedeparecermuy

lejana, pero cada vez se van conociendo más reacciones que superan laslimitaciones mencionadas previamente y empiezan a utilizarse enzimasartificialesobtenidaspormanipulacióndeproteínas.

El Dr. Menéndez se ha referido en la última parte de su discurso a unaestrategia sumamente innovadora en la que hay depositadas muchasesperanzas.ConocidacomoPROTAC(proteolysis-targetingchimera)pretende

promover lahidrólisisdeunaproteínadianamarcándolaconubiquitinaparasu posterior degradación por el proteasoma. Aunque los fármacos actúantradicionalmente bloqueando una o más dianas (generalmente proteínas),

parece más rentable su destrucción, ya que no se requeriría que ambasentidadesestuvieranpermanentementeencontacto.

Actualmente, puede impedirse o limitarse la producción de una proteína

específica a través del knockdown de genes utilizando estrategias biológicascomo el ARN de silenciamiento (small interfering RNA, siRNA) o la edicióngenética con la técnica CRISPR-Cas9, pero éstas pueden afectar a genes

distintos del que se pretende, por lo que tienen problemas de toxicidad y

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riesgodecarcinogénesis.LosfármacosdetipoPROTACsirvendeenlaceentre

el complejo E3-E2-ubiquitina y la proteína diana. Son agentes multidiana,diseñadosparaquepresentenafinidadcon ladianaquesedeseadegradaryconunaligasadeubiquitina(E3)queseacapazdecatalizarlatransferenciade

lamoléculadeubiquitinaa laproteínaquevaaserdegradada.EncontrarunfármacoPROTACpareceunatareamássencillaqueencontraruninhibidor,yaquesoloserequierequepresenteafinidadconestaproteína.Deestaforma,

podríanobtenerse fácilmentemodelosdeanimaleso célulasknockdown. Sinembargo, dado que la estrategia terapéutica consistente en la supresión deuna diana es muy diferente de la basada en su inhibición, no se conocen

todavía las posibles limitaciones que puede implicar el uso de fármacosPROTAC o de las técnicas basadas en siRNA o en la edición genética por elmétodoCRISPR-Cas9.

CONSIDERACIONESFINALES

Parece que el términoQuímicaOrgánica fue propuesto por Berzelius (1779-1848) al observar que sus compuestos provenían de seres “organizados”.

Berzelius opinaba que, a diferencia de los inorgánicos, estos compuestoshabíanadquiridouna“fuerzavital”porprovenirdeseresvivos,yesta fuerzaimpedíasusíntesisporlastécnicasconocidashastaelmomento.Hoysabemos

quemuchos compuestosestudiadosenquímicaorgánicanoestánpresentesen los seres vivos mientras que existen numerosos compuestos inorgánicosqueformanpartedeimportantesprocesosvitales.

LaposibilidaddesintetizarmoléculasorgánicasseaceptócuandoelayudantedeBerzeliusFriedrichWöhler(1800-1882)que,porcierto,considerabaquelahipótesis del vitalismo era muy hermosa, sintetizó urea a partir de cloruro

amónicoycianatodeplata.LacomunicacióndesudescubrimientoaBerzeliusponedemanifiestosusorpresa:“Debodecirlequesoycapazdesintetizarureasin la necesidad de un riñón, ya sea de hombre o perro; la sal amónica del

ácidocianhídricoeslaurea".

La química que ha desplegado ante nosotros el Dr. Menéndez refleja elasombroso desarrollo que han experimentado los métodos de síntesis

orgánicaycómoestosavanceshanfacilitadolacasieliminacióndelasbarreras

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que separan la química y la biología, una revolución que guarda cierta

semejanza con la caídadelmurodeBerlín en1989.Ami juicio, debería irsedesechandoladivisiónentrefármacosbiológicosobiotécnológicosyfármacosquímicosodesíntesis.Sinembargo,noseríahonestopormiparteobviarque

competirenellaboratorioconlaquímicadelavida,optimizadadurantesiglosatravésdelaevolución,noesfácil.Dejandoaparteelproblemadelprecio,hayque tener en cuenta que el desarrollo de algunos de estos complejos y

altamente sofisticados procesos de síntesis a escala de fabricación puedeencontrarsecondificultades,aunqueporotraparteconlautilizacióndeADNrecombinante u otros métodos de ingeniería genética el proceso de

purificaciónpuedeafectarsignificativamentealacalidad,seguridadyeficaciadelmedicamento.

Espero no haber abusado de su paciencia, y termino con el protocolo de

despedidadirigiéndomealDr.MenéndezRamos:

“En este acto tomáis posesión de una plaza de Académico Numerario de laRealAcademiaNacionaldeFarmacia,yamímecabelasatisfaccióndedarosla

enhorabuenaennombredetodossusmiembros.Estacorporacióntienecomoobjetivotrabajardeformaaltruistapormejorarelbienestarpersonalysocialatravésdelcultivoyladivulgacióndelascienciasfarmacéuticasydelasafinesa

la farmacia. En vuestras manos está que esta ambiciosa tarea se veapotenciadaapartirdeestemomentoconvuestraaportación.”

Hedicho.

Madrid,11deoctubrede2018

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BIBLIOGRAFÍA

1 Ribas, B.; Lacadena, J. R.; Sentandreu, R.;González dePosada, F. SesiónNecrológica en memoria del Excmo. Sr. D. Román de Vicente Jordana,Madrid,25demayode2017.Anal.RealAcad.Nac.Farm.2018,84,86-95.

2 http://historiasdeboticarios.blogspot.com/2012/11/vicente-jordana-roman.html

3 Cornforth,J.W.Thetroublewithsynthesis.Aust.J.Chem.1993,46,157-170.

4 Nicolaou, K. C.; Sorensen, E. J. Classics in Total Synthesis: Targets,Strategies,Methods.Wiley-VCH,1996.

5 Nicolaou,K.C.; Snyder, S.A.Classics inTotal Synthesis II:MoreTargets,Strategies,Methods.Wiley-VCH,2003.

6 Nicolaou,K.C.;Chen, J. S.Classics inTotalSynthesis III: FurtherTargets,Strategies,Methods.Wiley-VCH,2011.

7 Carreira, E. M.; Kvaerno, L. Classics in Stereoselective Synthesis. Wiley-VCH,2009.

8 Gaich,T.;Baran,P.S.Aimingforthe idealsynthesis.J.Org.Chem.2010,75,4657–4673.

9 Wender,P.A.Towardtheidealsynthesisandmolecularfunctionthroughsynthesis-informeddesign.Nat.Prod.Rep.,2014,31,433-440.

10 Blakemore, D. C.; Castro, L.; Churcher, I.; Rees, D. C.; Thomas, A. W.;Wilson, D. M. Wood, A. Organic synthesis provides opportunities totransformdrugdiscovery.Nat.Chem.2018,10,383–394.

11 Newhouse,T.;Baran,P.S.;Hoffmann,R.W.Theeconomiesofsynthesis.Chem.Soc.Rev.2009,38,3010–3021.

12 Candeias,N.R.;Branco,L.C.;Gois,P.G.P.;Afonso,C.A.M.;Trindade,A.F.MoresustainableapproachesforthesynthesisofN-basedheterocycles.Chem.Rev.2009,109,2703–2802.

13 Menéndez,J.C. (Ed.)Multibondformingreactions.Anewfrontier inthesynthesisofheterocycles.Curr.Org.Chem.2013,17,1919-2064.

14 Rodriguez, J.; Bonne, D. (Eds.) Stereoselective multiple bond-formingtransformationsinorganicsynthesis.Wiley,2015.

-72-

15 Ley, S. V.; Fitzpatrick, D.; Ingham, R. J.;Myers, R.M. Organic synthesis:Marchofthemachines.Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,3449-3464.

16 Ley, S. V.; Fitzpatrick, D.; Myers, R. M.; Battilocchio, C.; Ingham, R. J.Machineassistedorganicsynthesis.Angew.Chem.Int.Ed.2015,5,10122-10136.

17 Fitzpatrick,D.E.;Ley,S.V.Engineeringchemistryforthefutureofchemicalsynthesis.Tetrahedron2018,74,3087-3100.

18 Ley, S.V. The engineering of chemical synthesis: Humans and machinesworkinginharmony.Angew.Chem.Int.Ed.2018,57,5182-5183.

19 Michaudel, Q.; Ishihara, Y.; Baran, P. S. Academia−industry symbiosis inorganicchemistry.Acc.Chem.Res.2015,48,712-721.

20 Nielsen,T.E.;Schreiber,S.L.Towardstheoptimalscreeningcollection:Asynthesisstrategy.Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,48-56.

21 Finan, C.; Gaulton, A.; Kruger, F. A.; Lumbers, T.; Shah, T.; Engmann, J.;Galver,L.;Kelley,R.;Karlsson,A.;Santos,R.;Overington,J.P.;Hingorani,A. D.; Casas, J. P. The druggable genome and support for targetidentificationandvalidationindrugdevelopment.Sci.Transl.Med.2017,9,artículoeaag1166.

22 O’Connor, C. J.; Beckmann, H. S. G.; Spring, D. R. Diversity-orientedsynthesis:producingchemicaltoolsfordissectingbiology.Chem.Soc.Rev.2012,41,4444-4456.

23 Trabocchi,A.(Ed.)Diversity-orientedsynthesis.Basicsandapplicationsinorganicsynthesis,drugdiscovery,andchemicalbiology.Wiley,2013.

24 Schreiber.,S.Target-orientedanddiversity-orientedorganicsynthesisindrugdiscovery.Science2000,287,1964-1969.

25 Galloway,W.R.J.D.; Spandl, R.J.; Bender, A.; Thomas, G.L.; Díaz-Gavilán,M.; O’Connell, K.M.G.; Spring, D.R., en Fu, H. (ed.) Chemical Genomics,capítulo4,p.39.CambridgeUniversityPress,2012.

26 Lenci, E.;Guarna,A.; Trabocchi,A.Diversity-oriented synthesis as a toolforchemicalgenetics.Molecules2014,19,16506-16528.

27 Heidebrecht,R.W.;Mulrooney,C.;Austin,C.P.;Barker,R.H.;Beaudoin,J.A.;Cheng,K.C.-C.;Comer,E.;Dandapani,S.;Dick,J.;Duvall,J.R.;Ekland,E. H.; Fidock, D. A.; Fitzgerald, M. E.; Foley, M.; Guha, R.; Hinkson, P.;Kramer,M.;Lukens,A.K.;Masi,D.;Marcaurelle,L.A.;Su,X.-Z.;Thomas,

-73-

C. J.;Weïwer,M.;Wiegand, R. C.;Wirth, D.; Xia,M.; Yuan, J.; Zhao, J.;Palmer,M.;Muñoz,B.;Schreiber.,S.Diversity-orientedsynthesisyieldsanovel lead for the treatment ofmalaria.ACSMed. Chem. Lett.2012,3,112−117.

28 Avendaño,C.Análisisde“Diversity-orientedsynthesisyieldsanovel leadfor the treatmentofmalaria”.An.RealAcad.Nac. Farm.2012,78, 418-424.

29 Morton, D.; Leach, S.; Cordier, C.; Warriner, S.; Nelson, A. Synthesis ofnatural-product-likemoleculeswithovereightydistinctscaffolds.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,104-109.

30 Bohacek, R. S.; McMartin, C.; Guida, W. C. The art and practice ofstructure-baseddrugdesign:Amolecularmodelingperspective.Med.Res.Rev.1999,1,3–50.

31 https://www.cas.org/about/cas-content.Consultadoel16-09-18.

32 Yet, L. Privileged structures in drug discovery. Medicinal chemistry andsynthesis.Wiley,2018.

33 Sridharan, V.; Maiti, S.; Menéndez, J. C. A very efficient cerium(IV)ammonium nitrate-catalyzed, four-component synthesis oftetrahydropyridines and its application to the concise generation offunctionalizedhomoquinolizineframeworks.Chem.Eur.J.2009,15,4565-4572.

34 Maiti,S.;Menéndez,J.C.Amildprotocolfortheefficientsynthesisof5,6-unsubstituted1,4-dihydropyridines.Synlett2009,2249-2252.

35 Raja,P.V.A.;Tenti,G.;Perumal,S.;Menéndez, J.C.Aheavymetal-andoxidant-free,one-potsynthesisofpyridinesandfusedpyridinesbasedona Lewis acid-catalyzedmulticomponent reaction.Chem. Commun.2014,50,12270-12272.

36 Suryavanshi, P. A.; Sridharan, V.; Maiti, S.; Menéndez, J. C. Fullydiastereoselectivesynthesisofpolysubstituted,functionalizedpiperidinesand decahydroquinolines based on multicomponent reactions catalyzedbycerium(IV)ammoniumnitrate.Chem.Eur.J.2014,20,8791–8799.

37 Maiti, S.; Sridharan, V.; Menéndez, J. C. Synthesis of a library of 5,6-unsubstituted 1,4-dihydropyridines based on a one-pot 4CR/eliminationprocess and their application to the generation of structurally diversefusednitrogenheterocycles.J.Comb.Chem.2010,12,713–722.

-74-

38 Sridharan, V.; Maiti, S.; Menéndez, J. C. Efficient generation of highlyfunctionalized fused oxazepine frameworks based on a CAN-catalyzedfour-component tetrahydropyridine synthesis/ring closing metathesissequence.J.Org.Chem.2009,74,9365–9371.

39 Suryavanshi, P. A.; Sridharan, V.; Menéndez, J. C. Expedient, one-potpreparationoffusedindolesviaCAN-catalyzedthree-componentdominosequences and their transformation into polyheterocyclic compoundscontainingpyrrolo[1,2-a]azepinefragments.Org.Biomol.Chem.,2010,8,3426–3436.

40 Suryavanshi,P.A.;Sridharan,V.;Menéndez,J.C.Aβ-enaminone-initiatedmulticomponent domino reaction for the synthesis of indoloquinolizinesand benzoquinolizines from acyclic precursors. Chem. Eur. J. 2013, 19,13207-13215

41 Estévez,V.;Villacampa,M.;Menéndez, J. C. Three-componentaccess topyrroles promoted by the CAN-silver nitrate system under high-speedvibration milling conditions. A generalization of the Hantzsch pyrrolesynthesis.Chem.Commun.2013,49,591-593

42 Estévez, V.; Sridharan, V.; Sabaté, S.; Villacampa, M.; Menéndez, J. C.Three-componentsynthesisofpyrrole-relatednitrogenheterocyclesbyaHantzsch-type process: Comparison between conventional and high-speedvibrationmillingconditions.AsianJ.Org.Chem.2016,5,652–662.

43 Leonardi, M.; Villacampa, M.; Menéndez, J. C. Multicomponentmechanochemicalsynthesis.Chem.Sci.2018,9,2042-2064.

44 Leonardi,M.;Villacampa,M.;Menéndez,J.C.Mildandgeneralsynthesisof pyrrolo[2,1-a]isoquinolines and related frameworks from pyrroleprecursorsderivedfromamechanochemicalmulticomponentreaction.J.Org.Chem.2017,82,2570-2578.

45 MacBeath,G.;Koehler,A.N.;Schreiber,S.L.Printingsmallmoleculesasmicroarrays and detecting protein-ligand interactions en masse. J. Am.Chem.Soc.1999,121,7967-7968.

46 Menéndez,J.C.;Villacampa,M.Péptidos, lagartosydiseñodefármacos.Agentes antidiabéticos relacionados con las incretinas. An. Real Acad.Nac.Farm.2013,79,580-612.

47 Avendaño,C.Químicabioortogonal.RealAcademiaNacionaldeFarmacia,Monografía34.Madrid,2012.

-75-

48 Lang, K.; Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACSChem.Biol.2014,9,16−20

49 Kolb,H.C.;Finn,M.G.;Sharpless,K.B.Clickchemistry:Diversechemicalfunction from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40,2004–2021.

50 Huisgen,R.1,3-Dipolarcycloadditions.Pastandfuture.Angew.Chem.Int.Ed.1963,2,565–598.

51 Huisgen,R.Kineticsandmechanismof1,3-dipolarcycloadditions.Angew.Chem.Int.Ed.1963,2,633–645.

52 Tomøe,C.W.;Christensen,C.;Meldal,M.Peptidotriazolesonsolidphase:[1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolarcycloadditionsofterminalalkynestoazides.J.Org.Chem.2002,67,3057-3064.

53 Rostovtsev, W.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. A stepwiseHuisgencycloadditionprocess: copper(I) catalyzed regioselective ligationof azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599.

54 Zhang,L.;Chen,X.G.;Xue,P.;Sun,H.H.Y.;Williams,I.D.;Sharpless,K.B.;Fokin, V. V.; Jia,G. C. Ruthenium-catalyzed cycloadditionof alkynes andorganicazides.J.Am.Chem.Soc.2005,127,15998−15999.

55 Johansson,J.R.;Beke-Somfai,T.;Stålsmeden,A.S.;Kann,N.;Ruthenium-catalyzed azide alkyne cycloaddition reaction: Scope, mechanism, andapplications.Chem.Rev.2016,116,14726−14768.

56 Meldal,M.;Tornoe,C.W.Cu-catalyzedazide-alkynecycloaddition.Chem.Rev.2008,108,2952−3015.

57 Hein, J. E.; Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition(CuAAC) and beyond: New reactivity of copper(I) acetylides. Chem. Soc.Rev.2010,39,1302−1315.

58 Liang, L.Y.;Astruc,D.Thecopper(I)-catalyzedalkyne-azidecycloaddition(CuAAC) “click” reactionand itsapplications.Anoverview.Coord.Chem.Rev.2011,255,2933−2945.

59 Haldon, E.; Nicasio, M. C.; Pérez, P. J. Copper-catalysed azide- alkynecycloadditions (CuAAC): An update. Org. Biomol. Chem. 2015, 13,9528−9550.

-76-

60 Li, L.; Zhang, Z. Development and applications of the copper-catalyzedazide-alkyne cycloaddition (CuAAC) as a bioorthogonal reaction.Molecules2016,21,1393.

61 Li,S.;Wang,L.;Yu,F.;Zhu,Z.;Shobaki,D.;Chen,H.;Wang,M.;Wang,J.;Qin, G.; Erasquin, U.J.; Ren, L.; Wang, Y.; Cai, C. Copper-catalyzed clickreactionon/inlivecells.Chem.Sci.2017,8,2107-2114.

62 Agard, N. J.; Baskin, J. M.; Prescher, J. A.; Lo, A.; Bertozzi, C. R. Acomparative study of bioorthogonal reactions with azides. ACS Chem.Biol.2006,1,644–648.

63 Shi, M.; Wosnick, J. H.; Ho, K.; Keating, A.; Shoichet, M. S. Immuno-polymeric nanoparticles byDiels-Alder chemistry.Angew. Chem. Int. Ed.2007,46,6126–6131.

64 Moellering, R. E.; Cravatt, B. F. How chemoproteomics can enable drugdiscoveryanddevelopment.ChemBiol.2012,19,11–22.

65 Doyle,S.K.;Pop,M.S.;Evans,H.L.;Koehler,A.N.Advancesindiscoveringsmall molecules to probe protein function in a systems context. Curr.Opin.Chem.Biol.2016,30,28–36.

66 Jones, L. H.; Neubert, H. Clinical chemoproteomics—Opportunities andobstacles.Sci.Transl.Med.2017,9,artículoeaaf7951.

67 Garbaccio,M. R.; Parmee, E. R. The impact of chemical probes in drugdiscovery: A pharmaceutical industry perspective.Cell Chem. Biol.2016,23,11-17.

68 Tsien,R. Y. Constructing andexploiting the fluorescentproteinpaintbox(Nobellecture).Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,5612–5626.

69 Cañeque,T.;Müller, S.;Rodriguez,R.Visualizingbiologicallyactive smallmoleculesincellsusingclickchemistry.Nat.Rev.Chem.2018,1,201-215.

70 Kang, K.; Park, J.; Kim, E. Tetrazine ligation for chemical proteomics.ProteomeSci.2017,15,15.

71 Devaraj,N.K.;Hilderbrand,S.;Upadhyay,R.;Mazitschek,R.;Weissleder,R.Bioorthogonalturn-onprobesforimagingsmallmoleculesinsidelivingcells.Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,2869–72.

72 Reiner, T.; Earley, S.; Turetsky, A.; Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.ChemBioChem.2010,11,2374–2377.

-77-

73 Kim,E.;Yang,K.S.;Weissleder,R.Bioorthogonalsmallmolecule imagingagentsallowsingle-cellimagingofMET.PLoSOne.2013,8,e81275.

74 Kim,Y.-R.;Kim,Y.H.;Kim,S.W.;Lee,Y.J.;Chae,D.-E.;Kim,K.–A.;Lee,Z.-W.;Kim,N.D.;Choi,J.-S.;Choi,I.S.;Lee,K.-B.Abioorthogonalapproachfor imaging thebindingbetweendasatinib and its targetproteins insidelivingcells.Chem.Commun.2016,52,11764–11767.

75 Rebelein,J.G.;Ward,T.R.Invivocatalyzednew-to-naturereactions.Curr.Opin.Biotechnol.2018,53,106–114.

76 Yang, M.; Chen, R. P. Transition metal-mediated bioorthogonal proteinchemistryinlivingcells.Chem.Soc.Rev.2014,43,6511–6526.

77 Chankeshwara, S. V.; Indrigo, E.; Bradley, M. Palladium-mediatedchemistryinlivingcells.Curr.Opin.Chem.Biol.2014,21,128–135

78 Vinogradova, E. V. Organometallic chemical biology: An organometallicapproachtobioconjugation.Pure.Appl.Chem.2017,89,1619–1641

79 Jbara,M.;Maity, S. K.; Brik, A. Palladium in the chemical synthesis andmodificationofproteins.Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,10644–10655.

80 Martínez, M.; Mascareñas, J. L. Organometallic catalysis in biologicalmediaandlivingsettings.Coord.Chem.Rev.2018,359,57–79.

81 Tomás-Gamasa,M.;Martínez-Calvo,M.;Couceiro,J.R.;Mascareñas,J.L.Transitionmetalcatalysis in themitochondriaof livingcells.Nat.Comm.2016,7,artículo1253.

82 Vidal, C.; Tomás-Gamasa, M.; Destito, P.; López, F.; Mascareñas, J. L.Concurrentandorthogonalgold(I)andruthenium(II)catalysisinsidelivingcells.NatureComm.2018,7,1253.

83 Jeschek,M.;Reuter,R.;Heinisch,T.;Trindler,C.;Klehr,J.;Panke,S.;Ward,T.T.Directedevolutionofartificialmetalloenzymesforinvivometathesis.Nature2016,537,661–665

84 Jones,L.H.Recentadvancesinthemoleculardesignofsyntheticvaccines.NatureChemistry2015,7,952-960.

85 Amblard, M.; Fehrentz, J.-A.; Martinez, J.; Subra, G. Methods andprotocolsofmodernsolidphasepeptidesynthesis.Mol.Biotechnol.2006,33,239-254.

86 Behrendt, R.;White, P.; Offer, J. Advances in Fmoc solid-phase peptidesynthesis.J.Pept.Sci.2016,22,4-27.

-78-

87 Liu,Y.-H.;Giunta,B.;Zhou,H.-D.;Tan,J.;Wang,Y.-J. ImmunotherapyforAlzheimer disease - the challenge of adverse effects.Nat. Rev. Neurol.2012,8,465-469.

88 Wang,C.Y.;Wang,P.-N.;Chiue,M.-J.;Finstada,C.-L.;Lin,F.;Lynn,S.;Tai,Y.-H.;Fanga,X.D.;Zhao,K.;Hung,C.-H.;Tseng,Y.;Peng,W.-J.;Wang,J.;Yu, C.-C.; Kuo, B.-S.; Frohn, P. A. UB-311, a novel UBITh® amyloid βpeptidevaccineformildAlzheimer’sdisease.AlzheimersDement.Transl.Res.Clin.Intervent.2017,3,262-272

89 Avendaño,C.;Menéndez,J.C.Medicinalchemistryofanticancerdrugs,2ªedición,capítulo12.Elsevier,2015.

90 Keding,S.J.;Danishefsky,S.J.Prospectsfortotalsynthesis:avisionforatotallysyntheticvaccinetargetingepithelialtumors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004,101,11937-11942.

91 Fernández-Tejada, A.; Cañada, F. J.; Jiménez-Barbero, J. Recentdevelopmentsinsyntheticcarbohydrate-baseddiagnostics,vaccines,andtherapeutics.Chem.Eur.J.2015,21,10616-10628.

92 Danishefsky,S.J.;Shue,Y.-K.;Chang,M.N.;Wong,C.-H.DevelopmentofGlobo-HCancerVaccine.Acc.Chem.Res.2015,48,643−652.

93 Fernández-Tejada, A.; Baynes, B. F. Danishefsky, S. Designing syntheticvaccinesforHIV.ExpertDes.Vaccin.2015,14,815-831.

94 Calarese,D.A.;Scanlan,C.N.;Zwick,M.B.;Deechongkit,S.;Mimura,Y.;Kunert,R.; Zhu,P.;Wormald,M.R.; Stanfield,R. L.;Roux,K.H.;Kelly, J.W.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Katinger, H.; Burton, D. R.; Wilson, I. A.Antibodydomainexchangeisanimmunologicalsolutiontocarbohydrateclusterrecognition.Science2003,300,2065-2071.

95 Sunjic, V.; Parnham, M. Signposts to chiral drugs: Organic synthesis inaction,capítulo12.SpringerVerlag,2011.

96 Wang,P.;Dong,S.;Shieh,J.-H.;Peguero,E.;Hendrickson,R.,Moore,M.A.S.;Danishefsky,S.J.Erythropoietinderivedbychemicalsynthesis.Science2013,342,1357-1360.

97 Wilson,R.M.;Dong,S.;Wang,P.;Danishefsky,S.J.Thewindingpathwaytoerythropoietinalong thechemistry–biology frontier:Asuccessat last.Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,7646–7665.

-79-

98 Hsieh-Wilson, L. C.; Griffin, M. E. Improving biologic drugs via totalchemicalsynthesis.Science2013,342,1332-1333.

99 Hirano, K.; Macmillan, D.; Tezuka, K.; Tsuji, T.; Kajihara, Y. Design andsynthesis of a homogeneous erythropoietin analogue with two humancomplex-type sialyloligosaccharides: Combined use of chemical andbacterial protein expression methods. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48,9557-9560.

100Wang, L.-X.; Amin, M. N. Chemical and chemoenzymatic synthesis ofglycoproteinsfordecipheringfunctions.Chem.Biol.2014,21,51–66.

101Avendaño,C.;Menéndez,J.C.Referencia84,capítulo10.Elsevier,2015.

102Levinson, A. M.; McGee, J. H.; Roberts, A. G.; Creech, G. S.; Wang, T.;Peterson,M.T.;Hendrickson,R.C.;Verdine,G.L.;Danishefsky,S.J.Totalchemical synthesis and folding of all‑L and all‑D variants of oncogenicKRas(G12V).J.Am.Chem.Soc.2017,139,7632−7639.

103Gu, S.; Cui, D.; Chen, X.; Xiong, X.; Zhao, Y. PROTACs: An emergingtargeting technique forproteindegradation indrugdiscovery.BioEssays2018,40,1700247.

104Grimm,D.;Streetz,K.;Jopling,C.;Storm,T.;Pandey,K.;Davis,C.;Marion,P.; Salazar, F.; Kay,M. Fatality inmice due to oversaturation of cellularmicroRNA/shorthairpinRNApathways.Nature2006,441,537-541.

105 Haapaniemi, E.; Botla, S.; Persson, J.; Schmierer, B.; Taipale, J. CRISPR–Cas9genomeeditinginducesap53-mediatedDNAdamageresponse.Nat.Med.2018,24,927–930.

106 Bondeson,D.P.;Smith,B.E.;Burslem,G.M.;Buhimschi,A.D.;Hines,J.;Jaime-Figueroa, S.;Wang, J.;Hamman,B.D.; Ishchenko,A.; Crews,C.M.LessonsinPROTACdesignfromselectivedegradationwithapromiscuouswarhead.CellChem.Biol.2018,25,78–87.

107Lebraud, H.; Wright, D. J.; Johnson, C.N.; Heightman, T. D. Proteindegradationbyin-cellself-assemblyofproteolysistargetingchimeras.ACSCent.Sci.2016,2,927−934.