la peste de los pequeños rumiantes y la … · del león marino de san miguel. virus del moquillo...
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Miguel Ángel Jiménez-ClaveroCentro de Investigación en Sanidad Animal
(CISA)-INIA, Valdeolmos, Madrid
XV XV SimposioSimposio anual de AVEDILA, Zaragoza, 18anual de AVEDILA, Zaragoza, 18 --19 de noviembre de 201019 de noviembre de 2010
La peste de los pequeños rumiantes y la fiebre/encefalitis por virus West Nile: Diagnóstico actual y perspectivas de futuro
Enfermedades infecciosas emergentes (EID): un problema específico para el diagnóstico
� “Enfermedad emergente” (O.I.E.*)� Una nueva infección que resulta de la evolución o cambio
de un agente patogénico ya existente.�Una infección conocida que se disemina a una nueva área
geográfica o población.�Una enfermedad o agente patogénico previamente no
reconocido, diagnosticado por primera vez.
*O.I.E., Código sanitario de los animales terrestres.
EID-cambio en un patógeno conocido
� Un agente infeccioso conocido que ocurre en una especie no descrita como susceptible hasta ese momento(salto de especie): Los cambios en el rango de huésped, debidos a la alta variabilidad y capacidad de adaptación de los virus, son su principal mecanismo de evolución.� Enfermedad vesicular porcina (China?
1946-1966�CVB5).� Influenza aviar en humanos y felinos.� Exantema vesicular porcino � Virus
del León Marino de San Miguel.� Virus del moquillo canino (CDV).en focas y
felinos � Lyssavirus de los murciélagos.
EID-expansión geográfica
� Un agente infeccioso conocido, que aparece en una nueva zona geográfica (enfermedad exótica o transfronteriza): Facilitado por fenómenos de movilidad geográfica, tráfico de personas y mercancías (globalización)� Lengua azul en Europa septentrional y central
2006 (BTV-8), 2008 (BTV-6, BTV-11).� Virus West Nile en Norteamérica, 1999-2010.� Virus Usutu en Centroeuropa, 2001.� Fiebre del valle del Rift en la Peninsula Arábiga,
2000.� Peste porcina africana en el Cáucaso, 2007.� Enfermedad re-emergente:� West Nile en Europa, 1997-2010.� Lengua azul en España y Mediterráneo
Occidental, 2000-2010.� Fiebre Aftosa en Reino Unido, 2001.
EID-nuevos patógenos
�Un agente previamente desconocido, que aparece por primera vez.� Virus SARS (sindrome respiratorio agudo
severo): Guandong, China, 2002.� HIV-SIDA (1981, EE.UU.).� Ebola-Marburg (Marburg, Alemania, 1967; Zaire,
1976).� Hantavirus (HPS: 1993, EE.UU.).� PRSS (sindrome respiratorio y reproductivo
porcino)(EE.UU. 1987).� Enfermedad Hemorrágica del Conejo (China,
1984).� Circovirus porcino (PMWS: Canadá, 1991)� Encefalopatías espongiformes transmisibles
(BSE, vCJD, Reino Unido, 1980’s).
EID: El laboratorio de diagnóstico ante lo “inesperado”� Los patógenos emergentes son un fenómeno en esencia inesperado,
de difícil previsión. � EID= patógeno nuevo � No existen técnicas para su detección � El
diagnóstico se hace especialmente difícil.� Laboratorio diagnóstico EID � INCERTIDUMBRE
� Conocer la situación epidemiológica de patologías emergentes más acuciantes del entorno, y actualizar frecuentemente esta información.
� Estar preparado ante LO INESPERADO .� En un mundo globalizado los patógenos tienen grandes oportunidades para
invadir un nuevo territorio.
100 Km.
BTV
WNVAHSV
AIV
PPRV
????
Métodos para detectar “lo desconocido”
van der Hoek L, Pyrc K, Jebbink MF, Vermeulen-Oost W, Berkhout RJ, Wolthers KC, Wertheim-van Dillen PM, Kaandorp J, Spaargaren J, Berkhout B.Identification of a new human coronavirus.Nat Med. 2004 Apr;10(4):368-73. Epub 2004 Mar 21.
La investigaciLa investigacióón en enfermedades n en enfermedades emergentes y emergentes y transfronterizastransfronterizas en el CISAen el CISA
��OrbivirusOrbivirus: lengua azul, AHS, EHD: lengua azul, AHS, EHD
��Virus porcinos: EVC, PPA, PPCVirus porcinos: EVC, PPA, PPC
�� Influenza aviarInfluenza aviar
��Fiebre/encefalitis por virus Fiebre/encefalitis por virus WestWest NileNile
��Peste de los pequePeste de los pequeñños rumiantesos rumiantes
��Dermatosis Dermatosis nodularnodular contagiosacontagiosa
��Viruela ovina y caprinaViruela ovina y caprina
��Alertas sanitarias (Convenio INIAAlertas sanitarias (Convenio INIA--MARM)MARM)
EID: El laboratorio de diagnóstico en alerta
� http://www.oie.int/wahis/public.php?page=home
� http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/home.asp
� http://www.glews.net/ Global Early Warning System for Major Animal Diseases, including Zoonoses (GLEWS)
� http://www.who.int/
� http://www.promedmail.org/
� http://www.ecdc.europa.eu/
EID: El laboratorio de diagnóstico en alerta
� http://rasve.mapa.es/
� http://ec.europa.eu/food/animal/index_en.htm
� Webs de Sanidad Animal de la CC.AA.
� Webs temáticas: � http://www.offlu.net� http://www.flu-lab-net.eu/� http://eubtnet.izs.it/btnet/inFocus/inFocus.html� etc
� Riec = Red de investigación sobre enfermedades compartidas (Red IRIS).
Ejemplo de actuaciones en dos epizootias recientes de importancia en sanidad animal
�Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
�Fiebre/encefalitis por virus West Nile, Europa y Mediterráneo, 1996-2010
Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
� Evolución de la PPR (junio – agosto 2008)(Tomado de Sanz-Alvarez J, Diallo A, de La Rocque S, et al. Peste des petits ruminants (PPR) au Maroc. EMPRES watch 2008 : 1-7).
12 y 26 de junio: 2 brotes epidémicos de campo declarados en 15 días.
30 junio – 19 julio: 24 brotes epidémicos de campo en 20 días
20 – 31 julio: 41 brotes epidémicos de campo en 12 días
31 julio – 4 agosto: 25 brotes epidémicos de campo en 5 días
Primera vez que aparece PPR en Marruecos.Focos: 25736 de las 61 provincias marroquíes, afectadas.
Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
� Medidas de lucha (OIE):�Cuarentenas.�Serovigilancia.�Desinfección de las estancias infectadas.�Sacrificio.�Vacunación:
�La campaña comenzó el 22 de septiembre de 2008�Se vacunaron 20 millones de cabezas (cabras y
ovejas).�Vacuna empleada: vacuna viva atenuada
monovalente.�Fecha oficial de resolución de la epizootia: 27-1-2009.�No ha habido ningún nuevo brote desde entonces.
Peste de los pequeños rumiantes: distribución mundial
� Linajes genéticos:� L-I (África
Occidental)
� L-II (África Central)
� L-III (África Oriental)
� L-IV (Asia-Oriente Medio, África oriental, Marruecos).
Tomado de: Minet, C. et al. Virologie 2009, 13 (2) : 103-13
Sudáfrica, 2010
� Linajes genéticos:� L-I (África
Occidental)
� L-II (África Central)
� L-III (África Oriental)
� L-IV (Asia-Oriente Medio, África oriental, Marruecos).
Tomado de: Banyard et al., J Gen Virol doi:10.1099/vir.0.025841-0
IV
Peste de los pequeños rumiantes: Linajes
Peste de los pequeños rumiantes: el virus
� Familia Paramyxoviridae� Género Morbillivirus� ssRNA-
Phosphoprotein (P)
Tomado de: Banyard et al., J Gen Virol doi:10.1099/vir.0.025841-0
http://www.virology.net/Big_Virology/EM/pprv.JPG
Peste de los pequeños rumiantes: el virus
� Familia Paramyxoviridae� Género Morbillivirus� ssRNA-� Especificidad de especie ALTA
Sarampión(humano)
Moquillo canino
Morbillivirusde los delfines
Moquillo de las focas
Peste bovina
Peste de los pequeños rumiantes
Peste de los pequeños rumiantes: la enfermedad
� Patogenicidad: � Depende de la cepa del virus y de la especie/raza
afectada).� Mortalidad:
� 50%-100% en poblaciones “naïve”.� Afecta a ovejas y cabras principalmente.� Forma grave:
� fiebre alta, conjuntivitis, neumonía, secreciones en los ojos y las fosas nasales, llagas en la boca, lesiones necróticas en las membranas mucosas, dificultades respiratorias y diarrea.
� Infecciones asintomáticas: � Ocurren en determinados casos (cepa de virus,
raza/especie de hospedador).� Otros hospedadores:
� Rumiantes silvestres: oryx, gacela, impala, etc.� Ganado doméstico: ¿camellos?¿bovinos?
� Contagio: contacto directo.� Secreciones-excreciones, aerosoles. � Aumenta con la densidad y la tasa de nacimientos. Tomado de: Minet, C. et al.
Virologie 2009, 13 (2) : 103-13
Peste de los pequeños rumiantes: el diagnóstico� Identificación del agente:
�Muestras: �hisopos (bucales, nasales,
conjuntivales), �Sangre EDTA.�Necropsia: nódulos linfáticos,
pulmón, bazo, mucosa intestinal.�Técnicas de cribado:
�RT-PCR.�AGID.�Contrainmunoelectroforesis. �ELISA de inmunocaptura (Ag).� IF, IHQ.�HA.
Peste de los pequeños rumiantes: el diagnóstico� Identificación del agente (cont.):
�Confirmación:�Aislamiento vírico:
• Células cultivo 1º riñón de oveja• Vero• CPE: 5 días.• Sincitios• 3 pases ciegos.
� Técnicas serológicas:�Cribado
�cH-ELISA (MAb anti-H)�cN-ELISA competición (MAb anti-N)
�Confirmación�Virus neutralización (VNT)
Peste de los pequeños rumiantes: las vacunas� Vacunas actuales:
�Vacuna viva atenuada monovalente:� Cepa vacunal más empleada:
• Nigeria 75/1.K6 BK2 Vero70 (linaje II)� Otras cepas (India):
• Sungri/96 (linaje IV)• Arasur/97• Coimbatore/97
� Vacunas de futuro:� DIVA: vacunas quiméricas
� RPV vacunal x genes PPRV (H, F & M)� ELISA DIVA: PPRV cH-ELISA & cN-ELISA� Problema: reacc. cruz. MAb N RPV� Posible solución: Ag C-terminal prot N PPRV
� Vacunas multivalentes marcadas (PPRV+BTV+ SGPV)
Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� RD 106/2010� LNR = LCV-Algete� Convenio INIA-MARM 2008-11:
�CISA=Laboratorio de apoyo al LNR.
� Técnicas de diagnóstico de la PPR implementadas en el CISA:�Detección del VPPR:
�RT-PCR en tiempo real (Bao, J. et al, 2008).�RT-PCR convencional (Couacy-Hymann et al; 2002, CIRAD)�
¡¡¡INESPECIFICIDAD CON ADN/ARN DE OVEJA!!!
�Aislamiento en cultivos celulares (Vero).
�Detección de anticuerpos frente al virus (suero):� ELISA de competición (CIRAD).� Neutralización (6-7 días).
Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Viroteca y seroteca PPR: representantes de los linajes del VPPR y sueros de referencia (CIRAD).
� Armonización técnicas diagnósticas:� Participación en ensayo intercomparativo internacional EPIZONE 2009:
� Organizado por el laboratorio de referencia de la OIE para PPR (CIRAD, Montpellier, Francia).
� Participaron 8 laboratorios de otros tantos países.� Objetivos:
• Compartir material de referencia y protocolos para que puedan ser aplicados por los Laboratorios de Referencia Nacionales.
� Test comparativo aplicado a:• Detección del genoma del VPPR.• Detección de anticuerpos de VPPR.
� Armonizar y estandarizar un nuevo desarrollo (real-time RT-PCR).
Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Ensayo intercomparativo EPIZONE 2009� Panel 1: 15 sueros para serología.� Panel 2: 5 muestras de sobrenadante de
cultivo celular (Vero) para RT-PCR.� Protocolos :
� ELISA (CIRAD-BDSL)� PCR (convencional y/o real time)� Inmunofluorescencia� No se describe el protocolo de VNT
� Resumen:� ELISA (cN): Correcto en todos labs. (sueros de cabras vacunadas).� RT-PCR convenc. (4 labs): resultados aceptables, sensibilidad baja.� RT-PCR en tiempo real (6 labs): No todos los métodos detectan todos los
linajes. Los mejores: CIRAD y Bao et al. (CISA).
Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Ensayo intercomparativo EPIZONE 2009�Panel 1: 15 sueros para análisis de anticuerpos.�Panel 2: 5 muestras de sobrenadante de cultivo celular (Vero)
para análisis por RT-PCR.�Protocolos :
� ELISA (CIRAD-BDSL)� PCR (Convencional-Real Time)� Inmunofluorescencia� No se describe el protocolo de VNT
�Resumen:� ELISA (cN): Correcto en todos labs. (sueros de cabras vacunadas).� RT-PCR convenc. (4 labs): resultados aceptables, sensibilidad baja.� RT-PCR en tiempo real (6 labs): No todos los métodos detectan
todos los linajes. Los mejores: CIRAD y Bao et al. (CISA).
Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Mejoras en las técnicas serológicas de detección de anticuerpos frente a VPPR:�Para la vigilancia seroepidemiológica
es IMPRESCINDIBLE contar con una técnica de ELISA robusta y fiable.
�ELISA disponibles comercialmente:� BDSL cN-ELISA, desarrollado por
CIRAD (laborioso, caro, difícil de validar…).
� Por ello es muy necesario desarrollar nuevos kits de ELISA de Ac anti-VPPR.
� Trabajos que se llevan a cabo actualmente en el CISA:�Producción de antígeno (virus inactivado).�Antisueros monoespecíficos.�Clonaje proteinas víricas recombinantes.
para su uso como antígenos.
� 2 estrategias:�Antígeno= superficie / MAb= Anti-H o – F.�Antígeno= N recombinante / MAb= Anti-N.
Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
Ejemplo de actuaciones en dos epizootias recientes de importancia en sanidad animal
�Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
�Fiebre/encefalitis por virus West Nile, Europa y Mediterráneo, 1996-2010
Virus West Nile (Nilo Occidental, WNV)
� WNV: flavivirus del grupo de la encefalitis japonesa.� Transmitido (no solo) por artrópodos, principalmente (no solo)
mosquitos, sobre todo (no siempre) del género Culex.� Principales reservorios: aves.� Éstas pueden acarrear el virus en sus migraciones,
translocándolo de unas zonas a otras.� Patogénico ocasionalmente en aves, dependiendo de la
especie de ave y de la variante del virus de que se trate.� Patogénico ocasionalmente en algunos mamíferos.� Eco-epidemiología compleja.
Virus West Nile : un flavivirus epizootico, epornitico y zoonotico
Aves: >300
especies
susceptibles
Mosquitos: >60
especies
portadoras
Muchos otros
vertebrados susceptibles
(mamíferos, ranas,
caimanes…)
¿todos “dead-end hosts”?
¿Otros
vectores
(garrapatas
p.ej.)?¿Contacto
directo?
¿Transmisión
transovárica?
¿Persistencia?
¿Transmisión oral?
¿Inmunidad cruzada?
Virus West Nile : un flavivirus emergente
19992004
2006
Distrito de Distrito de WestWest NileNileUganda, 1937Uganda, 1937
Out of Out of AfricaAfrica……
� Hasta hace poco, WNV era considerado un virus de poca importancia (“fiebres africanas”).
� Pero en los últimos años del siglo XX produjo brotes cada vez más graves:�Rumanía, 1996, 1000 casos, 396 graves (17 muertes).�Volgogrado (sur de Rusia), 1999, 1000 casos de
meningitis/encefalitis confirmados, 40 muertes.� Israel, 1998-2000: 400 casos, 35 muertes.
� Hasta que en 1999 cruzó el Atlántico…
WNV: historia reciente
WNV: historia reciente
� ¡…apareciendo en Nueva York!� Desde entonces no ha parado de
extenderse por toda América, de costa a costa y desde Canadáhasta Argentína.
� En Norteamérica WNV es considerado ya endémico.
� En EE.UU. desde 1999 ha habido unos 29.000 casos humanos, de ellos unos 1200 han sido mortales.
� Las aves silvestres son muy sensibles a la infección, produciéndose en ellas una gran mortalidad.
� Una de las arbovirosis zoonóticas, epizoóticas y eporníticas más importantes de la historia.
� Por todo ello, el WNV se ha convertido en uno de los virus con más repercusión pública.
Casos WNV en EE.UU. 1999-2007*(*Hasta el 6 de noviembre)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007
Año
nº c
asos
Muertes
Otras m. clin./No especif.
Fiebre
Encef/mening
Israel, 1951, 1957
Egypt, 1950
Tunisia, 1997
Algeria, 1994
Portugal, 1971
Czech Rep. 1997 y 1999
Morocco, 1996
Russia, 1999-2002
Romania, 1996-98
Israel, 1998-2000
France, 1962-65Italy, 1998
France 2000
WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010
Israel, 1951, 1957
Egypt, 1950
Tunisia, 1997
Algeria, 1994
Portugal, 1971
Czech Rep. 1997 y 1999
Morocco, 1996
Spain, 2007, 2010
Russia, 1999-2002
Romania, 1996-98
Israel, 1998-2000
Italy, 2008-2010
Austria, 2008-2010 Hungary
2004-2010
France, 1962-65
France 2000
Morocco2003, 2010
France, 2003, 2004, 2006
Italy, 1998
Russia, 2005-2008,
2010
Israel, 2000-2010
Tunisia, 2003
Greece, 2010
WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010
Bulgaria, 2010
Romania, 2010
Portu-gal,
2004, 2010
Spain, 2007, 2010
Italy, 2008-2010
Austria, 2008-2010 Hungary
2004-2010
Morocco2003, 2010
Russia, 2005-2008,
2010
Israel, 2000-2010
Greece, 2010
Bulgaria, 2010
Romania, 2010
Lineage 2
Lineage 1Portu-gal,
2004, 2010
WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010
Virus West Nile: tendencias
� Cada vez más frecuente en Europa y cuenca mediterránea.
� Más casos humanos.� Mayor afección en aves silvestres.� Nuevo linaje en Europa (L2).� Clima: básico para entender la
epidemiología.� Cuestiones:
�¿WNV persiste en Europa o es introducido cada vez desde África?
�¿Son los virus recientes más patogénicos?
Ejemplo de rutas migratorias de aves entre Europa y Africa
Virus West Nile en España: hitos
100 Km.
Y
� 70’ -80’ del s. XX : anticuerpos hemaglutinantes vs. flavivirus en roedores y humanos .
� 2001: Seroprevalencia en humanos en Sevilla (0.6%) y Delta del Ebro (0.2%).
� 2000-05: Alta seroprevalencia en rapacesde Castilla-La Mancha. Detección de genoma vírico.
� 2003-2006: Seroprevalencia significativa en determinadas especies de aves en el bajo Guadalquivir. Seroconversiones .
� 2005-07: Seroprevalencia significativa en caballos en libertad en Doñana.
� 2004: Primer caso clínico en humanos .� 2004-2008: Genoma vírico en mosquitosmosquitos,
Huelva y Doñana.� 2007: Primer aislamiento del WNV en
España, aves silvestres (águila real), Castilla-La Mancha.
� 2010: Cádiz, primeros casos clínicos en caballos . Dos casos clínicos en humanos .
Y
YY
Y
Y
Y
Y
Y
Y∞∞∞∞++++
Y++++++++Y
✱
∞∞∞∞∞∞∞∞
WNV en España: situación actual
� 26 y 30 de agosto de 2010: primeros casos sospechosos en caballos, Jerez de la Frontera.
� 2 septiembre: cELISA+� 10 septiembre: IgM+� Notificación
a la OIE.� Primera caracterización molecular:
linaje 1a, “cluster” mediterráneo occidental.
� Inicio de investigación epidemiológica, serovigilancia.
� Aislamiento y secuenciación molecular completa (en curso).
WNV en España: situación actual
� Focos (equinos) a 16-11-2010:�33 focos, 40 caballos
afectados, 10 muertos.
WNV en España: situación actual
� Casos humanos:� 1º, Varón, 60 años,
residente en Chiclana de la Frontera. Ingreso en el Hospital de Puerto Real el 20-9-2010 con signos de meningitis. Evolución favorable.
� 2º, Varón 77 años, residente en Benalup-Casas Viejas. Ingresó en el hospital de Puerto Real el 28 de septiembre con signos de meningitis. Evolución favorable.
++
Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� Moleculares: RRT-PCR multiplex para la detección simultánea y
diferencial de WNV L1, WNV L2 y USUV en la misma reacción.
FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5
Tres sondas marcadas con tres fluoróforos que emiten señales a valores de λ no solapantes
FAM: 492-516 nm
JOE-VIC: 535-555 nm
Cy5: 635-665 nm
Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� Moleculares: RRT-PCR multiplex para la detección simultánea y
diferencial de WNV L1, WNV L2 y USUV en la misma reacción.WNV L1 NY´99 equine WNV L2
B956
USUV SAAR 1776
-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
1.26x103DICT50/mL
1.26x102DICT50/mL
1.26x10DICT50/mL
1.26 DICT50/mL
-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
1.26x103DICT50/mL
1.26x102DICT50/mL
1.26x10DICT50/mL
1.26 DICT50/mL
-0.009
0.011
0.031
0.051
0.071
0.091
0.111
0.131
0.151
0.171
0.191
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
6.3x104DICT50/mL
6.3x103DICT50/mL
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6.3 DICT50/mL
-0.009
0.011
0.031
0.051
0.071
0.091
0.111
0.131
0.151
0.171
0.191
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
6.3x104DICT50/mL
6.3x103DICT50/mL
6.3x102DICT50/mL
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6.3 DICT50/mL
-0.005
0.005
0.015
0.025
0.035
0.045
0.055
0.065
0.075
0.085
0.095
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
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cenc
e (d
Rn)
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3.03x105DICT50/mL
3.03x104DICT50/mL
3.03x103DICT50/mL
3.03x102DICT50/mL
3.03x10 DICT50/mL
-0.005
0.005
0.015
0.025
0.035
0.045
0.055
0.065
0.075
0.085
0.095
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Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
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3.03x105DICT50/mL
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3.03x102DICT50/mL
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-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
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-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
1.26x103DICT50/mL
1.26x102DICT50/mL
1.26x10DICT50/mL
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-0.009
0.011
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0.191
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
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6.3x103DICT50/mL
6.3x102DICT50/mL
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6.3 DICT50/mL
-0.009
0.011
0.031
0.051
0.071
0.091
0.111
0.131
0.151
0.171
0.191
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
6.3x104DICT50/mL
6.3x103DICT50/mL
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6.3 DICT50/mL
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0.005
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Cycles
Flu
ores
cenc
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3.03x105DICT50/mL
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Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
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3.03x106DICT50/mL
3.03x105DICT50/mL
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3.03x103DICT50/mL
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Standard Curve
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
10.00 1000.00 100000.00 10000000.00
TCID50/mLC
t (dR
n)
CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
16
18
20
22
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0.10 100.00 100000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
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TCID50/mL
Ct (
dRn)
JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%
(Equivalentes)
Standard Curve
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10.00 1000.00 100000.00 10000000.00
TCID50/mLC
t (dR
n)
CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%
(Equivalentes)
Standard Curve
20
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10.00 1000.00 100000.00 10000000.00
TCID50/mLC
t (dR
n)
CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
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TCID50/mL
Ct (
dRn)
FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%
(Equivalentes)
Standard Curve
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TCID50/mL
Ct (
dRn)
FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
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1.00 100.00 10000.00 1000000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%
(Equivalentes)
Standard Curve
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1.00 100.00 10000.00 1000000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%
(Equivalentes)
<1 DICT50/ RT-PCR para los tres aislados
Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� ELISA de detección de anticuerpos frente a WNV
� Desarrollado en colaboración con la empresa INGENASA.
� Válido para anticuerpos en suero de amplio rango de especies hospedadoras, desde aves hasta mamíferos.
� Ventajas:� Bajo consumo de muestra (10 ml de
suero).� Alta sensibilidad y especificidad.� Detecta Ac a 3 dpi en aves infectadas
experimentalmente.� Detecta Ac frente a distintos linajes
de WNV.
Estudios sobre WNV en el CISA: Estudios serológicos en aves y caballos.
� Doñana y marismas del Guadalquivir:� Seroprevalencias por especies.
� Seroprevalencia en pollos de aves migratorias que crian en España.
� Migración y seroprevalencia en paseriformes.
� Seroprevalencia en aves que ingresan en los CREAS.
� Seroprevalencia en caballos en libertad.
� Castilla-La Mancha:� Rapaces protegidas
Estudios sobre WNV en el CISA: Estudios virológicos, primeros aislados virales españoles.
100 Km.
EspaEspa ñña, 2007a, 2007
Estudios sobre WNV en el CISA
�Estudios de patogénesis�En modelo murino:
Cepa NS3249 DL50 (PFU)Tiempo medio de
supervivencia ± SD (días)
SP`07 Pro 17,78 9,38 ± 1,51
M0`03 Thr 1,78 9,93 ± 1,86
NY`99 Pro 2,31 8,83 ± 1,17
B956 His 39,32 10,55 ± 1,5
NS3249Pro
NS3NS3249249ProPro no es un determinante de no es un determinante de
patogenicidadpatogenicidad consistenteconsistente
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Days postinoculation
% o
f Sur
vivo
rs
Virulencia en un modelo aviar autóctono del Sur de Europa: la perdiz roja (Alectoris rufa)
� Ambas cepas del MediterráneoOccidental son patogénicas en la perdizroja.
� La cepa Morocco/2003 (NS3249Thr) esmás virulenta que Spain/2007 (NS3249Pro).(Sotelo et al, Vet Res, en prensa).
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Days postinoculation
PF
U/m
L1,0E+00
1,0E+02
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1,0E+06
1,0E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Days postinoculation
PF
U/m
L
WNV SPA/2007(NS3249Pro)
WNV Mor/2003(NS3249Thr)
0
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0 2 4 6 8 10
Days postinoculation
% o
f Sur
vivo
rs
Virulencia en un modelo aviar eurasiáticoabundante en los humedales españoles: la focha común (Fulica atra).
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
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L
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PF
U/m
L
b)
WNV SPA/2007(NS3249Pro)
WNV NY99(NS3249Pro)
Estudio pendiente de anEstudio pendiente de anáálisis de resultadoslisis de resultados
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vivo
rs
Virulencia en un modelo aviar peridoméstico: el gorrión común (Passer domesticus).
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L
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Days postinoculation
PF
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WNV SPA/2007(NS3249Pro)
WNV NY99(NS3249Pro)
Estudio en curso actualmente en el CISAEstudio en curso actualmente en el CISA
Colaboraciones del CISA en investigación sobre WNV
IZSLER
OVI
¡Muchas gracias!