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Miguel Ángel Jiménez-ClaveroCentro de Investigación en Sanidad Animal
(CISA)-INIA, Valdeolmos, Madrid
XV XV SimposioSimposio anual de AVEDILA, Zaragoza, 18anual de AVEDILA, Zaragoza, 18 --19 de noviembre de 201019 de noviembre de 2010
La peste de los pequeños rumiantes y la fiebre/encefalitis por virus West Nile: Diagnóstico actual y perspectivas de futuro
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Enfermedades infecciosas emergentes (EID): un problema específico para el diagnóstico
� “Enfermedad emergente” (O.I.E.*)� Una nueva infección que resulta de la evolución o cambio
de un agente patogénico ya existente.�Una infección conocida que se disemina a una nueva área
geográfica o población.�Una enfermedad o agente patogénico previamente no
reconocido, diagnosticado por primera vez.
*O.I.E., Código sanitario de los animales terrestres.
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EID-cambio en un patógeno conocido
� Un agente infeccioso conocido que ocurre en una especie no descrita como susceptible hasta ese momento(salto de especie): Los cambios en el rango de huésped, debidos a la alta variabilidad y capacidad de adaptación de los virus, son su principal mecanismo de evolución.� Enfermedad vesicular porcina (China?
1946-1966�CVB5).� Influenza aviar en humanos y felinos.� Exantema vesicular porcino � Virus
del León Marino de San Miguel.� Virus del moquillo canino (CDV).en focas y
felinos � Lyssavirus de los murciélagos.
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EID-expansión geográfica
� Un agente infeccioso conocido, que aparece en una nueva zona geográfica (enfermedad exótica o transfronteriza): Facilitado por fenómenos de movilidad geográfica, tráfico de personas y mercancías (globalización)� Lengua azul en Europa septentrional y central
2006 (BTV-8), 2008 (BTV-6, BTV-11).� Virus West Nile en Norteamérica, 1999-2010.� Virus Usutu en Centroeuropa, 2001.� Fiebre del valle del Rift en la Peninsula Arábiga,
2000.� Peste porcina africana en el Cáucaso, 2007.� Enfermedad re-emergente:� West Nile en Europa, 1997-2010.� Lengua azul en España y Mediterráneo
Occidental, 2000-2010.� Fiebre Aftosa en Reino Unido, 2001.
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EID-nuevos patógenos
�Un agente previamente desconocido, que aparece por primera vez.� Virus SARS (sindrome respiratorio agudo
severo): Guandong, China, 2002.� HIV-SIDA (1981, EE.UU.).� Ebola-Marburg (Marburg, Alemania, 1967; Zaire,
1976).� Hantavirus (HPS: 1993, EE.UU.).� PRSS (sindrome respiratorio y reproductivo
porcino)(EE.UU. 1987).� Enfermedad Hemorrágica del Conejo (China,
1984).� Circovirus porcino (PMWS: Canadá, 1991)� Encefalopatías espongiformes transmisibles
(BSE, vCJD, Reino Unido, 1980’s).
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EID: El laboratorio de diagnóstico ante lo “inesperado”� Los patógenos emergentes son un fenómeno en esencia inesperado,
de difícil previsión. � EID= patógeno nuevo � No existen técnicas para su detección � El
diagnóstico se hace especialmente difícil.� Laboratorio diagnóstico EID � INCERTIDUMBRE
� Conocer la situación epidemiológica de patologías emergentes más acuciantes del entorno, y actualizar frecuentemente esta información.
� Estar preparado ante LO INESPERADO .� En un mundo globalizado los patógenos tienen grandes oportunidades para
invadir un nuevo territorio.
100 Km.
BTV
WNVAHSV
AIV
PPRV
????
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Métodos para detectar “lo desconocido”
van der Hoek L, Pyrc K, Jebbink MF, Vermeulen-Oost W, Berkhout RJ, Wolthers KC, Wertheim-van Dillen PM, Kaandorp J, Spaargaren J, Berkhout B.Identification of a new human coronavirus.Nat Med. 2004 Apr;10(4):368-73. Epub 2004 Mar 21.
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La investigaciLa investigacióón en enfermedades n en enfermedades emergentes y emergentes y transfronterizastransfronterizas en el CISAen el CISA
��OrbivirusOrbivirus: lengua azul, AHS, EHD: lengua azul, AHS, EHD
��Virus porcinos: EVC, PPA, PPCVirus porcinos: EVC, PPA, PPC
�� Influenza aviarInfluenza aviar
��Fiebre/encefalitis por virus Fiebre/encefalitis por virus WestWest NileNile
��Peste de los pequePeste de los pequeñños rumiantesos rumiantes
��Dermatosis Dermatosis nodularnodular contagiosacontagiosa
��Viruela ovina y caprinaViruela ovina y caprina
��Alertas sanitarias (Convenio INIAAlertas sanitarias (Convenio INIA--MARM)MARM)
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EID: El laboratorio de diagnóstico en alerta
� http://www.oie.int/wahis/public.php?page=home
� http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/home.asp
� http://www.glews.net/ Global Early Warning System for Major Animal Diseases, including Zoonoses (GLEWS)
� http://www.who.int/
� http://www.promedmail.org/
� http://www.ecdc.europa.eu/
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EID: El laboratorio de diagnóstico en alerta
� http://rasve.mapa.es/
� http://ec.europa.eu/food/animal/index_en.htm
� Webs de Sanidad Animal de la CC.AA.
� Webs temáticas: � http://www.offlu.net� http://www.flu-lab-net.eu/� http://eubtnet.izs.it/btnet/inFocus/inFocus.html� etc
� Riec = Red de investigación sobre enfermedades compartidas (Red IRIS).
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Ejemplo de actuaciones en dos epizootias recientes de importancia en sanidad animal
�Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
�Fiebre/encefalitis por virus West Nile, Europa y Mediterráneo, 1996-2010
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Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
� Evolución de la PPR (junio – agosto 2008)(Tomado de Sanz-Alvarez J, Diallo A, de La Rocque S, et al. Peste des petits ruminants (PPR) au Maroc. EMPRES watch 2008 : 1-7).
12 y 26 de junio: 2 brotes epidémicos de campo declarados en 15 días.
30 junio – 19 julio: 24 brotes epidémicos de campo en 20 días
20 – 31 julio: 41 brotes epidémicos de campo en 12 días
31 julio – 4 agosto: 25 brotes epidémicos de campo en 5 días
Primera vez que aparece PPR en Marruecos.Focos: 25736 de las 61 provincias marroquíes, afectadas.
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Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
� Medidas de lucha (OIE):�Cuarentenas.�Serovigilancia.�Desinfección de las estancias infectadas.�Sacrificio.�Vacunación:
�La campaña comenzó el 22 de septiembre de 2008�Se vacunaron 20 millones de cabezas (cabras y
ovejas).�Vacuna empleada: vacuna viva atenuada
monovalente.�Fecha oficial de resolución de la epizootia: 27-1-2009.�No ha habido ningún nuevo brote desde entonces.
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Peste de los pequeños rumiantes: distribución mundial
� Linajes genéticos:� L-I (África
Occidental)
� L-II (África Central)
� L-III (África Oriental)
� L-IV (Asia-Oriente Medio, África oriental, Marruecos).
Tomado de: Minet, C. et al. Virologie 2009, 13 (2) : 103-13
Sudáfrica, 2010
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� Linajes genéticos:� L-I (África
Occidental)
� L-II (África Central)
� L-III (África Oriental)
� L-IV (Asia-Oriente Medio, África oriental, Marruecos).
Tomado de: Banyard et al., J Gen Virol doi:10.1099/vir.0.025841-0
IV
Peste de los pequeños rumiantes: Linajes
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Peste de los pequeños rumiantes: el virus
� Familia Paramyxoviridae� Género Morbillivirus� ssRNA-
Phosphoprotein (P)
Tomado de: Banyard et al., J Gen Virol doi:10.1099/vir.0.025841-0
http://www.virology.net/Big_Virology/EM/pprv.JPG
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Peste de los pequeños rumiantes: el virus
� Familia Paramyxoviridae� Género Morbillivirus� ssRNA-� Especificidad de especie ALTA
Sarampión(humano)
Moquillo canino
Morbillivirusde los delfines
Moquillo de las focas
Peste bovina
Peste de los pequeños rumiantes
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Peste de los pequeños rumiantes: la enfermedad
� Patogenicidad: � Depende de la cepa del virus y de la especie/raza
afectada).� Mortalidad:
� 50%-100% en poblaciones “naïve”.� Afecta a ovejas y cabras principalmente.� Forma grave:
� fiebre alta, conjuntivitis, neumonía, secreciones en los ojos y las fosas nasales, llagas en la boca, lesiones necróticas en las membranas mucosas, dificultades respiratorias y diarrea.
� Infecciones asintomáticas: � Ocurren en determinados casos (cepa de virus,
raza/especie de hospedador).� Otros hospedadores:
� Rumiantes silvestres: oryx, gacela, impala, etc.� Ganado doméstico: ¿camellos?¿bovinos?
� Contagio: contacto directo.� Secreciones-excreciones, aerosoles. � Aumenta con la densidad y la tasa de nacimientos. Tomado de: Minet, C. et al.
Virologie 2009, 13 (2) : 103-13
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Peste de los pequeños rumiantes: el diagnóstico� Identificación del agente:
�Muestras: �hisopos (bucales, nasales,
conjuntivales), �Sangre EDTA.�Necropsia: nódulos linfáticos,
pulmón, bazo, mucosa intestinal.�Técnicas de cribado:
�RT-PCR.�AGID.�Contrainmunoelectroforesis. �ELISA de inmunocaptura (Ag).� IF, IHQ.�HA.
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Peste de los pequeños rumiantes: el diagnóstico� Identificación del agente (cont.):
�Confirmación:�Aislamiento vírico:
• Células cultivo 1º riñón de oveja• Vero• CPE: 5 días.• Sincitios• 3 pases ciegos.
� Técnicas serológicas:�Cribado
�cH-ELISA (MAb anti-H)�cN-ELISA competición (MAb anti-N)
�Confirmación�Virus neutralización (VNT)
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Peste de los pequeños rumiantes: las vacunas� Vacunas actuales:
�Vacuna viva atenuada monovalente:� Cepa vacunal más empleada:
• Nigeria 75/1.K6 BK2 Vero70 (linaje II)� Otras cepas (India):
• Sungri/96 (linaje IV)• Arasur/97• Coimbatore/97
� Vacunas de futuro:� DIVA: vacunas quiméricas
� RPV vacunal x genes PPRV (H, F & M)� ELISA DIVA: PPRV cH-ELISA & cN-ELISA� Problema: reacc. cruz. MAb N RPV� Posible solución: Ag C-terminal prot N PPRV
� Vacunas multivalentes marcadas (PPRV+BTV+ SGPV)
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Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� RD 106/2010� LNR = LCV-Algete� Convenio INIA-MARM 2008-11:
�CISA=Laboratorio de apoyo al LNR.
� Técnicas de diagnóstico de la PPR implementadas en el CISA:�Detección del VPPR:
�RT-PCR en tiempo real (Bao, J. et al, 2008).�RT-PCR convencional (Couacy-Hymann et al; 2002, CIRAD)�
¡¡¡INESPECIFICIDAD CON ADN/ARN DE OVEJA!!!
�Aislamiento en cultivos celulares (Vero).
�Detección de anticuerpos frente al virus (suero):� ELISA de competición (CIRAD).� Neutralización (6-7 días).
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Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Viroteca y seroteca PPR: representantes de los linajes del VPPR y sueros de referencia (CIRAD).
� Armonización técnicas diagnósticas:� Participación en ensayo intercomparativo internacional EPIZONE 2009:
� Organizado por el laboratorio de referencia de la OIE para PPR (CIRAD, Montpellier, Francia).
� Participaron 8 laboratorios de otros tantos países.� Objetivos:
• Compartir material de referencia y protocolos para que puedan ser aplicados por los Laboratorios de Referencia Nacionales.
� Test comparativo aplicado a:• Detección del genoma del VPPR.• Detección de anticuerpos de VPPR.
� Armonizar y estandarizar un nuevo desarrollo (real-time RT-PCR).
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Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Ensayo intercomparativo EPIZONE 2009� Panel 1: 15 sueros para serología.� Panel 2: 5 muestras de sobrenadante de
cultivo celular (Vero) para RT-PCR.� Protocolos :
� ELISA (CIRAD-BDSL)� PCR (convencional y/o real time)� Inmunofluorescencia� No se describe el protocolo de VNT
� Resumen:� ELISA (cN): Correcto en todos labs. (sueros de cabras vacunadas).� RT-PCR convenc. (4 labs): resultados aceptables, sensibilidad baja.� RT-PCR en tiempo real (6 labs): No todos los métodos detectan todos los
linajes. Los mejores: CIRAD y Bao et al. (CISA).
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Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Ensayo intercomparativo EPIZONE 2009�Panel 1: 15 sueros para análisis de anticuerpos.�Panel 2: 5 muestras de sobrenadante de cultivo celular (Vero)
para análisis por RT-PCR.�Protocolos :
� ELISA (CIRAD-BDSL)� PCR (Convencional-Real Time)� Inmunofluorescencia� No se describe el protocolo de VNT
�Resumen:� ELISA (cN): Correcto en todos labs. (sueros de cabras vacunadas).� RT-PCR convenc. (4 labs): resultados aceptables, sensibilidad baja.� RT-PCR en tiempo real (6 labs): No todos los métodos detectan
todos los linajes. Los mejores: CIRAD y Bao et al. (CISA).
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Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
� Mejoras en las técnicas serológicas de detección de anticuerpos frente a VPPR:�Para la vigilancia seroepidemiológica
es IMPRESCINDIBLE contar con una técnica de ELISA robusta y fiable.
�ELISA disponibles comercialmente:� BDSL cN-ELISA, desarrollado por
CIRAD (laborioso, caro, difícil de validar…).
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� Por ello es muy necesario desarrollar nuevos kits de ELISA de Ac anti-VPPR.
� Trabajos que se llevan a cabo actualmente en el CISA:�Producción de antígeno (virus inactivado).�Antisueros monoespecíficos.�Clonaje proteinas víricas recombinantes.
para su uso como antígenos.
� 2 estrategias:�Antígeno= superficie / MAb= Anti-H o – F.�Antígeno= N recombinante / MAb= Anti-N.
Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA
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Ejemplo de actuaciones en dos epizootias recientes de importancia en sanidad animal
�Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008
�Fiebre/encefalitis por virus West Nile, Europa y Mediterráneo, 1996-2010
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Virus West Nile (Nilo Occidental, WNV)
� WNV: flavivirus del grupo de la encefalitis japonesa.� Transmitido (no solo) por artrópodos, principalmente (no solo)
mosquitos, sobre todo (no siempre) del género Culex.� Principales reservorios: aves.� Éstas pueden acarrear el virus en sus migraciones,
translocándolo de unas zonas a otras.� Patogénico ocasionalmente en aves, dependiendo de la
especie de ave y de la variante del virus de que se trate.� Patogénico ocasionalmente en algunos mamíferos.� Eco-epidemiología compleja.
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Virus West Nile : un flavivirus epizootico, epornitico y zoonotico
Aves: >300
especies
susceptibles
Mosquitos: >60
especies
portadoras
Muchos otros
vertebrados susceptibles
(mamíferos, ranas,
caimanes…)
¿todos “dead-end hosts”?
¿Otros
vectores
(garrapatas
p.ej.)?¿Contacto
directo?
¿Transmisión
transovárica?
¿Persistencia?
¿Transmisión oral?
¿Inmunidad cruzada?
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Virus West Nile : un flavivirus emergente
19992004
2006
![Page 32: La peste de los pequeños rumiantes y la … · del León Marino de San Miguel. Virus del moquillo canino (CDV).en focas y felinos Lyssavirus de los murciélagos. ... Fiebre del valle](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022013107/5bafc82f09d3f2dd708d140a/html5/thumbnails/32.jpg)
Distrito de Distrito de WestWest NileNileUganda, 1937Uganda, 1937
Out of Out of AfricaAfrica……
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� Hasta hace poco, WNV era considerado un virus de poca importancia (“fiebres africanas”).
� Pero en los últimos años del siglo XX produjo brotes cada vez más graves:�Rumanía, 1996, 1000 casos, 396 graves (17 muertes).�Volgogrado (sur de Rusia), 1999, 1000 casos de
meningitis/encefalitis confirmados, 40 muertes.� Israel, 1998-2000: 400 casos, 35 muertes.
� Hasta que en 1999 cruzó el Atlántico…
WNV: historia reciente
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WNV: historia reciente
� ¡…apareciendo en Nueva York!� Desde entonces no ha parado de
extenderse por toda América, de costa a costa y desde Canadáhasta Argentína.
� En Norteamérica WNV es considerado ya endémico.
� En EE.UU. desde 1999 ha habido unos 29.000 casos humanos, de ellos unos 1200 han sido mortales.
� Las aves silvestres son muy sensibles a la infección, produciéndose en ellas una gran mortalidad.
� Una de las arbovirosis zoonóticas, epizoóticas y eporníticas más importantes de la historia.
� Por todo ello, el WNV se ha convertido en uno de los virus con más repercusión pública.
Casos WNV en EE.UU. 1999-2007*(*Hasta el 6 de noviembre)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007
Año
nº c
asos
Muertes
Otras m. clin./No especif.
Fiebre
Encef/mening
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Israel, 1951, 1957
Egypt, 1950
Tunisia, 1997
Algeria, 1994
Portugal, 1971
Czech Rep. 1997 y 1999
Morocco, 1996
Russia, 1999-2002
Romania, 1996-98
Israel, 1998-2000
France, 1962-65Italy, 1998
France 2000
WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010
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Israel, 1951, 1957
Egypt, 1950
Tunisia, 1997
Algeria, 1994
Portugal, 1971
Czech Rep. 1997 y 1999
Morocco, 1996
Spain, 2007, 2010
Russia, 1999-2002
Romania, 1996-98
Israel, 1998-2000
Italy, 2008-2010
Austria, 2008-2010 Hungary
2004-2010
France, 1962-65
France 2000
Morocco2003, 2010
France, 2003, 2004, 2006
Italy, 1998
Russia, 2005-2008,
2010
Israel, 2000-2010
Tunisia, 2003
Greece, 2010
WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010
Bulgaria, 2010
Romania, 2010
Portu-gal,
2004, 2010
![Page 37: La peste de los pequeños rumiantes y la … · del León Marino de San Miguel. Virus del moquillo canino (CDV).en focas y felinos Lyssavirus de los murciélagos. ... Fiebre del valle](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022013107/5bafc82f09d3f2dd708d140a/html5/thumbnails/37.jpg)
Spain, 2007, 2010
Italy, 2008-2010
Austria, 2008-2010 Hungary
2004-2010
Morocco2003, 2010
Russia, 2005-2008,
2010
Israel, 2000-2010
Greece, 2010
Bulgaria, 2010
Romania, 2010
Lineage 2
Lineage 1Portu-gal,
2004, 2010
WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010
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Virus West Nile: tendencias
� Cada vez más frecuente en Europa y cuenca mediterránea.
� Más casos humanos.� Mayor afección en aves silvestres.� Nuevo linaje en Europa (L2).� Clima: básico para entender la
epidemiología.� Cuestiones:
�¿WNV persiste en Europa o es introducido cada vez desde África?
�¿Son los virus recientes más patogénicos?
Ejemplo de rutas migratorias de aves entre Europa y Africa
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Virus West Nile en España: hitos
100 Km.
Y
� 70’ -80’ del s. XX : anticuerpos hemaglutinantes vs. flavivirus en roedores y humanos .
� 2001: Seroprevalencia en humanos en Sevilla (0.6%) y Delta del Ebro (0.2%).
� 2000-05: Alta seroprevalencia en rapacesde Castilla-La Mancha. Detección de genoma vírico.
� 2003-2006: Seroprevalencia significativa en determinadas especies de aves en el bajo Guadalquivir. Seroconversiones .
� 2005-07: Seroprevalencia significativa en caballos en libertad en Doñana.
� 2004: Primer caso clínico en humanos .� 2004-2008: Genoma vírico en mosquitosmosquitos,
Huelva y Doñana.� 2007: Primer aislamiento del WNV en
España, aves silvestres (águila real), Castilla-La Mancha.
� 2010: Cádiz, primeros casos clínicos en caballos . Dos casos clínicos en humanos .
Y
YY
Y
Y
Y
Y
Y
Y∞∞∞∞++++
Y++++++++Y
✱
∞∞∞∞∞∞∞∞
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WNV en España: situación actual
� 26 y 30 de agosto de 2010: primeros casos sospechosos en caballos, Jerez de la Frontera.
� 2 septiembre: cELISA+� 10 septiembre: IgM+� Notificación
a la OIE.� Primera caracterización molecular:
linaje 1a, “cluster” mediterráneo occidental.
� Inicio de investigación epidemiológica, serovigilancia.
� Aislamiento y secuenciación molecular completa (en curso).
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WNV en España: situación actual
� Focos (equinos) a 16-11-2010:�33 focos, 40 caballos
afectados, 10 muertos.
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WNV en España: situación actual
� Casos humanos:� 1º, Varón, 60 años,
residente en Chiclana de la Frontera. Ingreso en el Hospital de Puerto Real el 20-9-2010 con signos de meningitis. Evolución favorable.
� 2º, Varón 77 años, residente en Benalup-Casas Viejas. Ingresó en el hospital de Puerto Real el 28 de septiembre con signos de meningitis. Evolución favorable.
++
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Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� Moleculares: RRT-PCR multiplex para la detección simultánea y
diferencial de WNV L1, WNV L2 y USUV en la misma reacción.
FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5
Tres sondas marcadas con tres fluoróforos que emiten señales a valores de λ no solapantes
FAM: 492-516 nm
JOE-VIC: 535-555 nm
Cy5: 635-665 nm
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Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� Moleculares: RRT-PCR multiplex para la detección simultánea y
diferencial de WNV L1, WNV L2 y USUV en la misma reacción.WNV L1 NY´99 equine WNV L2
B956
USUV SAAR 1776
-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
1.26x103DICT50/mL
1.26x102DICT50/mL
1.26x10DICT50/mL
1.26 DICT50/mL
-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
1.26x103DICT50/mL
1.26x102DICT50/mL
1.26x10DICT50/mL
1.26 DICT50/mL
-0.009
0.011
0.031
0.051
0.071
0.091
0.111
0.131
0.151
0.171
0.191
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
6.3x104DICT50/mL
6.3x103DICT50/mL
6.3x102DICT50/mL
6.3x10 DICT50/mL
6.3 DICT50/mL
-0.009
0.011
0.031
0.051
0.071
0.091
0.111
0.131
0.151
0.171
0.191
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
6.3x104DICT50/mL
6.3x103DICT50/mL
6.3x102DICT50/mL
6.3x10 DICT50/mL
6.3 DICT50/mL
-0.005
0.005
0.015
0.025
0.035
0.045
0.055
0.065
0.075
0.085
0.095
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
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3.03x105DICT50/mL
3.03x104DICT50/mL
3.03x103DICT50/mL
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3.03x10 DICT50/mL
-0.005
0.005
0.015
0.025
0.035
0.045
0.055
0.065
0.075
0.085
0.095
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
3.03x106DICT50/mL
3.03x105DICT50/mL
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3.03x103DICT50/mL
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3.03x10 DICT50/mL
-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
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1.26 DICT50/mL
-0.03
0.07
0.17
0.27
0.37
0.47
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
1.26x105DICT50/mL
1.26x104DICT50/mL
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1.26x102DICT50/mL
1.26x10DICT50/mL
1.26 DICT50/mL
-0.009
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0.151
0.171
0.191
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Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
6.3x104DICT50/mL
6.3x103DICT50/mL
6.3x102DICT50/mL
6.3x10 DICT50/mL
6.3 DICT50/mL
-0.009
0.011
0.031
0.051
0.071
0.091
0.111
0.131
0.151
0.171
0.191
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
6.3x104DICT50/mL
6.3x103DICT50/mL
6.3x102DICT50/mL
6.3x10 DICT50/mL
6.3 DICT50/mL
-0.005
0.005
0.015
0.025
0.035
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0.055
0.065
0.075
0.085
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Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
3.03x106DICT50/mL
3.03x105DICT50/mL
3.03x104DICT50/mL
3.03x103DICT50/mL
3.03x102DICT50/mL
3.03x10 DICT50/mL
-0.005
0.005
0.015
0.025
0.035
0.045
0.055
0.065
0.075
0.085
0.095
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Cycles
Flu
ores
cenc
e (d
Rn)
3.03x106DICT50/mL
3.03x105DICT50/mL
3.03x104DICT50/mL
3.03x103DICT50/mL
3.03x102DICT50/mL
3.03x10 DICT50/mL
Standard Curve
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
10.00 1000.00 100000.00 10000000.00
TCID50/mLC
t (dR
n)
CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
0.10 100.00 100000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
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1.00 100.00 10000.00 1000000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%
(Equivalentes)
Standard Curve
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
10.00 1000.00 100000.00 10000000.00
TCID50/mLC
t (dR
n)
CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%
(Equivalentes)
Standard Curve
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
10.00 1000.00 100000.00 10000000.00
TCID50/mLC
t (dR
n)
CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
16
18
20
22
24
26
28
30
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36
38
0.10 100.00 100000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
0.10 100.00 100000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
16
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22
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26
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1.00 100.00 10000.00 1000000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%
(Equivalentes)
Standard Curve
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
1.00 100.00 10000.00 1000000.00
TCID50/mL
Ct (
dRn)
JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%
(Equivalentes)
<1 DICT50/ RT-PCR para los tres aislados
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Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� ELISA de detección de anticuerpos frente a WNV
� Desarrollado en colaboración con la empresa INGENASA.
� Válido para anticuerpos en suero de amplio rango de especies hospedadoras, desde aves hasta mamíferos.
� Ventajas:� Bajo consumo de muestra (10 ml de
suero).� Alta sensibilidad y especificidad.� Detecta Ac a 3 dpi en aves infectadas
experimentalmente.� Detecta Ac frente a distintos linajes
de WNV.
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Estudios sobre WNV en el CISA: Estudios serológicos en aves y caballos.
� Doñana y marismas del Guadalquivir:� Seroprevalencias por especies.
� Seroprevalencia en pollos de aves migratorias que crian en España.
� Migración y seroprevalencia en paseriformes.
� Seroprevalencia en aves que ingresan en los CREAS.
� Seroprevalencia en caballos en libertad.
� Castilla-La Mancha:� Rapaces protegidas
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Estudios sobre WNV en el CISA: Estudios virológicos, primeros aislados virales españoles.
100 Km.
EspaEspa ñña, 2007a, 2007
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Estudios sobre WNV en el CISA
�Estudios de patogénesis�En modelo murino:
Cepa NS3249 DL50 (PFU)Tiempo medio de
supervivencia ± SD (días)
SP`07 Pro 17,78 9,38 ± 1,51
M0`03 Thr 1,78 9,93 ± 1,86
NY`99 Pro 2,31 8,83 ± 1,17
B956 His 39,32 10,55 ± 1,5
NS3249Pro
NS3NS3249249ProPro no es un determinante de no es un determinante de
patogenicidadpatogenicidad consistenteconsistente
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0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Days postinoculation
% o
f Sur
vivo
rs
Virulencia en un modelo aviar autóctono del Sur de Europa: la perdiz roja (Alectoris rufa)
� Ambas cepas del MediterráneoOccidental son patogénicas en la perdizroja.
� La cepa Morocco/2003 (NS3249Thr) esmás virulenta que Spain/2007 (NS3249Pro).(Sotelo et al, Vet Res, en prensa).
1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
1,0E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Days postinoculation
PF
U/m
L1,0E+00
1,0E+02
1,0E+04
1,0E+06
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Days postinoculation
PF
U/m
L
WNV SPA/2007(NS3249Pro)
WNV Mor/2003(NS3249Thr)
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0
20
40
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0 2 4 6 8 10
Days postinoculation
% o
f Sur
vivo
rs
Virulencia en un modelo aviar eurasiáticoabundante en los humedales españoles: la focha común (Fulica atra).
1,0E+00
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1,0E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Days postinoculation
PF
U/m
L
b)
1,0E+00
1,0E+02
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Days postinoculation
PF
U/m
L
b)
WNV SPA/2007(NS3249Pro)
WNV NY99(NS3249Pro)
Estudio pendiente de anEstudio pendiente de anáálisis de resultadoslisis de resultados
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Days postinoculation
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f Sur
vivo
rs
Virulencia en un modelo aviar peridoméstico: el gorrión común (Passer domesticus).
1,0E+00
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Days postinoculation
PF
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L
b)
1,0E+00
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Days postinoculation
PF
U/m
L
b)
WNV SPA/2007(NS3249Pro)
WNV NY99(NS3249Pro)
Estudio en curso actualmente en el CISAEstudio en curso actualmente en el CISA
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Colaboraciones del CISA en investigación sobre WNV
IZSLER
OVI
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¡Muchas gracias!