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PROYECTO SIP 20071002 “POSIBLES CAMBIOS EN LA FUNCIÓN TIROIDEA POR LA DESNUTRICIÓN TEMPRANA EN LA RATA” ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DIRECTORA: DRA. LUCÍA QUEVEDO CORONA INFORME FINAL RESUMEN
En estudios recientes se ha mostrado que el estado nutricio
materno puede influir el funcionamiento del sistema endocrino de
las crías a través de la programación metabólica intrauterina.
Este fenómeno es la consecuencia a una restricción crónica de
alimento durante periodos tempranos del desarrollo (gestación) y
provoca modificaciones permanentes en la estructura y función de
los tejidos. En el presente proyecto se estudió la contribución
de una desnutrición moderada (40 % de la ingesta testigo) durante
la gestación y la lactancia y se evaluaron los posibles cambios
permanentes en la funcionalidad de la glándula tiroides de las
crías. La glándula tiroides es un tejido con gran importancia, ya que interviene en el
desarrollo y maduración de diversos órganos, en el metabolismo basal, y en el
crecimiento del organismo. Aunque se han hecho estudios para conocer los efectos de
la desnutrición en etapas tempranas del desarrollo sobre la funcionalidad de diversos
órganos, de la glándula tiroides no se tiene gran información, y se desconoce si las
alteraciones que se pudieran provocar en ésta permanezcan en la edad adulta. Para
lograr tal objetivo en el presente estudio se trabajó con dos grupos de ratas Wistar
hembra, uno de los cuales se le proporcionó alimento y agua a libre demanda (grupo
testigo), al otro grupo se le restringió su alimentación al 60 % (grupo restringido),
tomando como 100 % el alimento consumido por el grupo testigo durante todo el
estudio. A ambos grupos se les apareó con ratas macho de la misma cepa y al
momento del parto se ajustó la camada a 8 crías, 4 hembras y 4 machos. A las crías de
ambos grupos se les alimentó a libre demanda a partir del destete y al momento de
cumplir 90 días se sometieron a una prueba de tolerancia al frío en una cámara aislada
a 4°C, posterormente, las ratas se anestesiaron y se tomaron muestras de sangre de la
cola donde se determinó la concentración de hormonas tiroideas y se disectó la piel de
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la región dorsal a nivel de las escápulas y se extrajo el tejido adiposo café de esta
región. En el proyecto del año pasado, en el estudio morfológico se pudo apreciar que
las glándulas tiroides de las CRR presentaban zonas con desorganización celular, y
folículos tiroideos con una cantidad de células mayor en comparación con las CRT; sin
embargo, estas alteraciones no se ven reflejadas en la funcionalidad de la glándula
tiroides ya que los resultados de este estudio no muestran diferencia en la
concentración de hormonas tiroideas entre ambos grupos. En los resultados del
presente año encontramos que la restricción provocó que los niveles de TSH fueran
menores al compararlos con los del grupo testigo, y durante la prueba de tolerancia al
frío las ratas no mostraron un aumento adecuado en los niveles de T3, T4 ni de TSH,
así como de la actividad de la enzima 5’ desoidaza hepática, mientras que la actividad
simpática en el tejido adiposo café (medida como un aumento en los niveles de
noradrenalina en este tejido) aumentó. En conclusión la glándula tiroides de las CMR
presentó zonas con desorganización folicular, lo que sugiere que esos folículos no son
funcionales y que estas deficiencias se ven compensadas con una mayor cantidad de
tirocitos y una mayor concentración de TSH que mantienen adecuadas las
concentraciones de T4 en estos animales. Cuando el organismo hipotiroideo es
sometido a un estrés térmico agudo, la tiroides es incapaz de aumentar su actividad de
manera suficiente, lo cual es compensado por un aumento en la actividad simpática en
el tejido adiposo café.
I. INTRODUCCIÓN.
El organismo debe ser abastecido de todos los nutrimentos necesarios para su
desarrollo y crecimiento. Los lípidos, las proteínas, y los carbohidratos son los
macronutrimentos que aportan energía suficiente al organismo, mientras que los
micronutrimentos son las vitaminas y minerales necesarios para la actividad enzimática
en todos los tejidos. Ambos, micro y macronutrimentos son obtenidos a través de los
alimentos, y la cantidad de estos que el organismo demanda depende en gran medida
de si el organismo se encuentra en una etapa crítica de desarrollo o no, como la
gestación, la lactancia o la pubertad. Por esto, es importante ingerir en nuestra dieta
alimentos variados en cantidades adecuadas para satisfacer nuestras demandas
energéticas en cada etapa de nuestra vida.
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La desnutrición se presenta en los individuos como consecuencia de una
ingestión y/o utilización deficiente de alimentos. En general se conoce la desnutrición
proteínica, es decir la generada por la ingestión deficiente de proteínas; y a la
energético-proteínica, aquella generada por la ingestión deficiente de todos los
macronutrimentos, siendo la segunda el tipo más común y de mayor importancia como
problema de salud pública a nivel mundial. Al momento de restringir el suministro del
alimento limitamos el aporte de nutrimentos ocasionando efectos adversos en el
organismo en función del tipo de restricción, es decir si se limita el consumo de proteína
o de energía y proteína, y del tiempo en que esta se presenta. Además, cuando la
desnutrición se lleva a cabo en etapas críticas del desarrollo en las cuales el organismo
presenta una mayor demanda de nutrimentos, dichas deficiencias provocarán trastornos
mayores (Cravioto y Arrieta, 1995).
La gestación y la lactancia son periodos críticos durante el desarrollo de los
diferentes órganos del individuo, por lo que en este tiempo la demanda energética que
ejerce el feto o la cría lactante al organismo materno, que es quien aporta los
nutrimentos a la unidad feto-placentaria, o bien a la cría a través de la leche materna, es
muy elevada (Cravioto y Arrieta, 1995). Algunos autores han reportado que una
restricción de proteína y/o de energía y proteína en la dieta materna durante la
gestación afecta el tamaño y peso corporal de la cría y el desarrollo de varios órganos
en el mismo (Ferlatte y Zeman, 1977).
Durante los periodos críticos de desarrollo temprano en la vida de los
organismos, estos tienen la habilidad de responder a situaciones adversas del medio
ambiente que pueden afectar negativamente su desarrollo normal, debido a
adaptaciones que ocurren a nivel celular, molecular y bioquímico. Las adaptaciones que
se presentan en consecuencia del estrés nutricional (desnutrición) pueden cambiar la
fisiología y el metabolismo del organismo y algunas pueden continuar presentes aún en
ausencia del estrés o estímulo que lo inició, dicho evento se ha definido como
“programación metabólica” (Fowden et al., 2006).
En la rata, las consecuencias de la desnutrición proteínica o energético-
proteínica en la rata madre durante la gestación y la lactancia, causan grandes cambios
en la estructura y función de varios órganos de las crías, entre ellos de algunas
glándulas endocrinas, como se ha descrito para el páncreas, lo cual provoca
alteraciones en la secreción de insulina (Patel y Srinivasan, 2002).
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La desnutrición, la hipoxemia y el estrés pueden alterar tanto en la madre como
en el feto las concentraciones de diversas hormonas incluyendo: la hormona del
crecimiento (GH), los factores de crecimiento tipo insulina (IGFs), la insulina, los
glucocorticoides, las catecolaminas, la leptina, las hormonas tiroideas (HT) y las
hormonas placentarias. En general, las condiciones intrauterinas subóptimas
disminuyen las concentraciones de hormonas anabólicas y aumentan los niveles de
hormonas catabólicas.
La manipulación directa de los niveles de HT en el útero alteran el desarrollo fetal
y tienen consecuencias a largo plazo en la función cardiovascular, reproductiva y
metabólica de la cría (Fowden et al., 2006).
En la rata, la glándula tiroides es un tejido endocrino que en la rata empieza a
diferenciarse a partir del día 17-18 de desarrollo fetal (Brown et al., 2000), cuando la
estructura y el coloide folicular aparecen, y la morfología característica que se ha
descrito del tejido tiroideo se presenta hasta después del nacimiento, aproximadamente
a los 10 días postparto en la cría lactante (De Felice et al., 2004).
Se ha reportado que la desnutrición proteínica afecta a la morfogénesis de la
glándula tiroides observándose un retraso en la formación de los folículos tiroideos,
número menor de folículos y de espacio coloidal, en fetos de rata de 17 y 21 días de
edad gestacional (Shrader et al., 1977). Lo anterior sugiere que puede encontrarse
alterada también la síntesis de HT, triyodotironina y tetrayodotironina (T3 y T4
respectivamente).
Cuando la ingestión de alimento de las ratas madre es restringida al 60% con
respecto a la ingestión del grupo testigo, durante todo el período de la gestación y la
lactancia (Oberkotter y Rasmussen, 1992), o bien desde la gestación tardía (día 17 de
gestación) y hasta el día 70 postnatal (Aláez et al., 1992) los niveles de T3 y T4 en las
crías disminuyen. Sin embargo, se desconoce si estos cambios son permanentes, y si
son provocados por las alteraciones en la morfología y la funcionalidad de la glándula
tiroides en la edad adulta.
En el humano también se ha descrito una relación importante entre el bajo peso
al nacimiento que presentan los niños que han sufrido desnutrición in útero, y las
menores concentraciones de HT (Kilby et al., 2001). Además, estos individuos
presentan también durante su infancia un retraso importante en sus curvas de
crecimiento, lo cual puede relacionarse con los cambios en las concentraciones de las
HT, ya que estas regulan el metabolismo de los órganos de casi todo el cuerpo y
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estimulan su crecimiento y desarrollo normal. Lo anterior resalta también la importancia
del estudio de los cambios en la función del tejido tiroideo y de la relación de las HT con
el desarrollo de los individuos con desnutrición temprana.
II. OBJETIVO GENERAL.
Determinar los posibles cambios que produce la desnutrición durante la gestación
y la lactancia en la rata sobre la función de la glándula tiroides de las crías.
III. OBJETIVOS PARTICULARES.
Analizar los efectos de la desnutrición materna durante la gestación y la lactancia
sobre:
1. La morfología de la glándula tiroides de las crías en la edad adulta.
2. La concentración plasmática de las hormonas tiroideas (T3 y T4) y de TSH, al
nacimiento y en la edad adulta.
3. El crecimiento de las crías y su composición corporal.
IV. MÉTODOS
META 1. OBTENCIÓN DE CAMADAS DESNUTRIDAS 1.1 Grupos de estudio.
Se emplearon 12 ratas hembra Wistar con peso de 240 ± 20 g las cuales se
mantuvieron en una cámara aislada con un ciclo de luz-oscuridad 12:12 h y con
temperatura regulada a 22 ± 1°C, con inicio del ciclo a las 8 h. Se formaron 2 lotes de
6 ratas cada uno y se separaron en jaulas individuales con agua ad libitum. Se les
dejó una semana de habituación.
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A un lote de estos animales se les alimentó a libre demanda (lote testigo), y al
otro lote se le restringió el alimento al 60 % (lote restringido) tomando como 100% el
alimento consumido por el lote testigo. La medición del consumo de alimento y el
peso corporal se realizó durante todo el estudio cada tercer día.
A ambos lotes se les mantuvo una semana con machos de la misma cepa
(260 ± 20g) para asegurar el apareamiento, concluida esta semana se separaron los
machos de las hembras.
Las condiciones de alimentación anteriormente mencionadas se mantuvieron
durante la etapa de gestación la cual duró 3 semanas y al momento del parto se ajustó
la camada a 8 crías por rata, dejando preferentemente 4 crías hembra y 4 crías macho
por rata en ambos lotes, se tomaron muestras de sangre a las crías sobrantes para la
determinación de HT. El día del parto se consideró como el día 1 de la lactancia.
1.2 Desarrollo de las crías.
Durante la etapa de lactancia (3 semanas posparto) se mantuvieron las crías
con sus madres bajo las condiciones de restricción de alimento. Durante toda la
lactancia se registró cada tercer día el peso corporal y la longitud de cada cría en
cada una de las camadas para analizar su crecimiento. La longitud se determinó
midiendo la distancia desde la nariz hasta el orificio anal de las crías.
Al concluir la lactancia, las crías fueron destetadas (en el día 21 de edad) y se
separaron crías hembra de crías macho de ambos lotes y a partir de este momento se
les alimentó a libre demanda con una dieta comercial y agua para formar los siguientes
grupos de estudio:
1) Crías nacidas de Rata madre Testigo (CRT): fueron las crías nacidas de las ratas
alimentadas a libre demanda durante la gestación y la lactancia.
2) Crías nacidas de Rata madre Restringida (CRR): fueron las crías nacidas de las
ratas madre alimentadas con el 60% de la cantidad de alimento consumido por las
testigo.
A partir del destete y hasta la edad adulta (90 días), ambos grupos fueron
alimentados con una dieta comercial (Nutricubos de Purina) a libre demanda, con el fin
de que estos animales tuvieran la oportunidad de recuperarse de la desnutrición que
sufrieron exclusivamente durante la gestación y la lactancia. Cada tercer día se registró
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el peso corporal, la longitud y la ingestión de alimento de cada cría. Estos dos lotes de
animales, restringidos y bien alimentados, fueron utilizados para las mediciones
hormonales y para la prueba de tolerancia al frío.
META 2. Cuantificación de T3, T4 y TSH plasmáticas.
2.1. Obtención de las muestras de plasma.
Después de ajustar las camadas, las crías restantes de las camadas de cada
grupo fueron sacrificadas por decapitación para obtener las muestras de sangre (1 ml)
que se colocaron en tubos previamente heparinizados, y posteriormente se
centrifugaron a 3500 rpm por 15 min para obtener el plasma que se almacenó en
congelación (-70°C), para posteriormente determinar las concentraciones de T3, T4 y
TSH.
En la edad adulta, también se tomaron muestras de sangre de 1 ml en las CC y
CR (90 días de edad). Estas muestras se tomaron de la vena de la cola y fueron
tratadas en las condiciones antes descritas para la obtención del plasma y la posterior
medición de las concentraciones de T3, T4 y TSH.
2.2. Determinación de la concentración plasmática de T3, T4 y TSH.
La concentración de T3, T4 y TSH en el plasma se determinó por radioinmunoanálisis
(RIA) homólogo para rata. El método se basa en la ley de acción de masas en donde
dos antígenos (Ag) con las mismas características compiten en la misma proporción por
el sitio del anticuerpo (Ab). La concentración fija de un anticuerpo en el sistema limita el
número de sitios por los que compite el antígeno radioactivo (Ag*), el cual se encuentra
presente en concentraciones limitadas y escasa masa, con el antígeno no marcado (Ag)
que se agrega en cantidades conocidas (puntos de la curva estándar) o con cantidades
desconocidas de las muestras problema. A medida que se incrementa la concentración
del antígeno Ag, disminuye la posibilidad de que el Ag* se acople al anticuerpo y forme
el complejo Ag*- Ab, lo que da lugar a una menor radioactividad cuantificable en el
complejo. Posteriormente se realizó la separación de los complejos Ag-Ab y Ag*-Ab de
los antígenos libres no unidos al anticuerpo, mediante la adsorción de los antígenos
libres en moléculas de carbón activado cubierto por dextranos. Las dos fracciones se
separaron por centrifugación a 2500 rpm durante 30 min a 4°C, y se cuantificó la
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radiactividad en ambas fracciones, utilizando un contador de emisiones gamma (Cobra
II de A. Cabrera Company).
Una vez obtenida la radiactividad de las fracciones se calculó la proporción
porcentual de T3 (T4 o TSH) radioactiva unida al anticuerpo, con respecto a la
radioactividad total (% U/T).
Los resultados se graficaron en papel semilogarítmico disponiendo en el eje de las
ordenadas el % U/T y en las abscisas la concentraciones de las soluciones estándar de
T3 (T4). La concentración de las muestras se calculó interpolando en la gráfica el % U/T
correspondiente.
META 3. Prueba de tolerancia al frío.
El análisis de la funcionalidad del tejido tiroideo se realizó mediante la exposición de
las ratas a una prueba de tolerancia al frío, para someter a la GT ante una situación de
estrés que aumenta el estímulo a este tejido y de esta forma el animal pueda conservar
la temperatura corporal. Para esta prueba se utilizaron dos grupos de 6 animales cada
uno, un grupo de CC y otro de CR ambos de 140 días de edad. Se colocó a 2 animales
en cada una de las jaulas para rata, que luego permanecieron en un cuarto frío de
temperatura controlada durante 24 h a una temperatura de 4 ± 1 °C.
3.1 Respuesta tiroidea a la prueba de tolerancia al frío. Después de este tiempo se tomaron muestras de sangre (1 mL) de la vena de la
cola, para obtener el plasma en el cual se determinaron nuevamente las
concentraciones de T3, T4 y TSH como se describió antes. Después de tomar las
muestras de sangre se anestesió a los animales con pentobarbital sódico (45 mg/kg) por
vía intraperitoneal, para obtener muestras de 0.15 - 0.2 g de hígado que se congeló en
nitrógeno líquido y se almacenó (-70°C) para determinar posteriormente la actividad de
la hD1, en las condiciones antes descritas.
META 4. Actividad específica de la 5′′′′ desyodasa I en hígado (hD1). 4.1. Obtención de las muestras de hígado. En los días 1 y 90 de edad, se tomaron muestras de hígado de ambos grupos de
estudio para determinar la actividad enzimática de la hD1.
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Los animales de 1 día de edad se sacrificaron por decapitación, mientras que los
animales de 90 días se anestesiaron por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico (45
mg/kg), y posteriormente se tomaron muestras de 0.15-0.2 g de hígado que fueron
congeladas inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a –70°C hasta la
preparación de los homogeneizados en los cuales se determinó la actividad enzimática.
4.2. Preparación de los homogeneizados de hígado. Las muestras de tejido se mezclaron con un amortiguador (HEPES 10mM, sacarosa
0.32M, EDTA 1.0 mM, pH 7.0), en una proporción 1:10 (p/v) y se homogeneizaron en un
Politrón. Posteriormente, se centrifugaron a 12000 rpm por 2 min y se tomó una alícuota
del sobrenadante para realizar una dilución con amortiguador HEPES (1:400), en la cual
se determinó finalmente la actividad enzimática.
4.3. Determinación de la actividad de la 5′ desyodasa I. Para determinar la actividad desyodativa en los homogeneizados de hígado, se
utilizó una mezcla radiactiva preparada con el sustrato para la enzima (rT3 marcada con 125 I), DTT (13mM) como cofactor y amortiguador HEPES; posteriormente el
homogeneizado y la mezcla radiactiva se colocaron en tubos Eppendorf y se incubaron
en un baño con agitación a 37°C por 1 h. Al finalizar la incubación, la reacción se detuvo
con la adición de suero de bovino al 50% y de ácido tricloroacético (10%). Las muestras
se centrifugaron a 1200 rpm durante 2 min y el sobrenadante se pasó por una columna
cromatográfica de intercambio catiónico previamente equilibrada con ácido acético al
10% para separar la hormona del yodo liberado. La columna se eluyó con ácido acético
y el eluído se contó en un contador de rayos gamma (Cobra II, A. Cabrera Company).
La actividad enzimática se calculó determinando la cantidad de yodo radiactivo liberado
con respecto a la cantidad de substrato total por mg de proteína por hora.
Para determinar la cantidad total de radioactividad presente en cada ensayo se
incluyeron dos tubos con la mezcla radioactiva sin homogeneizado que fueron
sometidos al mismo tratamiento que las muestras problema, excepto que no se pasaron
por las columnas de intercambio catiónico.
El yodo liberado no específico representa la cantidad de yodo que puede llegar a
liberarse por daños en el sustrato y no por la acción enzimática. Para cuantificar este
porcentaje de yodo se incluyeron cuatro tubos con la mezcla radioactiva sin
homogenizado a los cuales se les aplicó el mismo tratamiento que a las muestras
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problema y que se pasaron por las columnas de intercambio catiónico. El porcentaje de
yodo liberado no específico se restó a cada muestra problema.
META 5. Determinación de la concentración de proteínas en homogeneizado de hígado.
Se realizó una dilución del homogeneizado de hígado con agua destilada (1:25), que
sirvió para cuantificar la concentración de proteínas solubles empleando el método de
Bradford. Para la elaboración de la curva patrón se utilizó albúmina de suero bovino. En
este método los residuos de aminoácidos básicos y aromáticos reaccionan con el
reactivo de Bradford para obtener un producto colorido cuya absorbancia se determina
en un espectrofotómetro a 595 nm.
META 6. Respuesta simpática en el tejido adiposo café a la prueba de tolerancia al frío.
Adicionalmente se analizó la respuesta simpática a la prueba de frío en los mismos
animales, de los cuales se extrajo también el TAC para determinar la concentración de
catecolaminas (CA), adrenalina (A), noradrenalina (NA) y dopamina (DA), después de
las 24 h de frío. En este experimento se utilizaron muestras de TAC de 0.2 - 0.25 g que
fueron homogeneizadas en 2 mL de ácido perclórico frío (0.4 N) y centrifugadas durante
10 min a 3000 rpm. Se tomó 1 mL del sobrenadante obtenido para extraer las CA por
adsorción en una columna de alúmina utilizando una solución amortiguadora de Trizma
(0.5 M, pH=8.6). La columna se lavó con agua desionizada repetidas veces y
posteriormente se eluyeron las CA adicionando a las columnas 200 µL de ácido
perclórico (0.1N) en agitación leve durante 5 min. La solución obtenida se utilizó para
determinar las concentraciones de CA por cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC). Se inyectaron alícuotas de 30 µL a través de una columna de fase reversa a
una tasa de flujo de 0.4 mL/min con una fase móvil desgasificada. Para verificar la
sensibilidad del sistema y como patrón de concentración, se inyectaron periódicamente
estándares externos de concentraciones conocidas (NA= 500 µg/mL; A=500 g/mL; DA=
) y un estándar interno de 3,4-dihidrobenzilamina.
META 7. Análisis de datos obtenidos. Análisis estadístico.
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Los datos obtenidos fueron analizados empleando la prueba t-Student, o bien por
análisis de varianza bifactorial para medidas repetidas, utilizando la prueba de
Bonferroni para comparar las medias de cada grupo. En todos los casos se consideró
un valor de significación de p<0.05.
RESULTADOS META 1. OBTENCIÓN DE CAMADAS DESNUTRIDAS. Las crías de las ratas que se mantuvieron en las condiciones antes mencionadas de
restricción de alimento tuvieron un desarrollo inadecuado, crecieron menos y ganaron
menos peso que las crías nacidas de ratas madre bien alimentadas (lote testigo). Estos
resultados confirman lo encontrado en el proyecto del año pasado y se muestran en la
tabla 1.
Tabla 1. Peso y longitud corporal de las crías nacidas de madres bien alimentadas o
desnutridas en los días del nacimiento, destete y edad adulta.
Parámetro
día 1
día 21
día 90
Peso corporal (g)
Testigo
6.81 ± 0.22
36.17 ± 1.7
239.7 ± 1.58
Restringido
5.83 ± 0.21*
20.61 ± 1.0*
215.2 ± 2.32*
Longitud corporal (cm)
Testigo
5.7 ± 0.11
11.5 ± 0.15
21.5 ± 0.13
Restringido
5.6 ± 0.15
9.5 ± 0.28*
20.2 ± 0.18*
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Los datos son la media ± el error estándar de las ratas nacidas de madres testigo o restringidas durante la gestación y la lactancia * Indica diferencia significativa con respecto a su testigo (P<0.05).
META 2. Cuantificación de T3, T4 y TSH plasmáticas.
En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos de los niveles de hormonas tiroideas
T3 y T4 y de TSH. Las crías nacidas de ratas con restricción de alimento durante la
gestación y la lactancia, tuvieron los niveles de TSH aumentados; sin embargo, no
mostraron alteraciones en los niveles de T3 y T4. Estos resultados nos hacen suponer
que el aumento en TSH provocó que aumentara la actividad de la tiroides, secretando
más hormonas tiroideas para mantenerlas en sus niveles normales.
0
1 0
2 0
TS
H e
n p
lasm
a (
ng
/mL
)
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
T 4 e
n p
lasm
a (
ng
/mL
)
0
1 0 0
2 0 0
T 3 e
n p
lasm
a (
ng
/dL
)
Te s ti g o Re s tri n g id o
TSH T4T3
*
Figura 1. Niveles de TSH, T4 y T3 en plasma de ratas crías hembra de 90 días de
edad. Los grupos corresponden a animales nacidos de ratas testigo o restringidos al
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60% de la cantidad de alimento ingerido. Los datos son la media (n=6) ± el error
estándar. * indica diferencia significativa entre grupos P<0.05.
META 3. Prueba de tolerancia al frío. Respuesta tiroidea a la prueba de tolerancia al frío.
Para analizar la respuesta tiroidea al estrés provocado por la disminución de la
temperatura ambiental, comparamos las concentraciones de T3, T4 y TSH, así como la
hD1 en condiciones de temperatura ambiente (22 ± 1 °C) y luego de 24 h de la
exposición al frío (5 ± 1 °C/24 h) en animales de 90 días de edad (tabla 5). Los
resultados mostraron que la disminución de la temperatura ambiental provocó en las CC
el incremento significativo de la concentración plasmática de TSH (67%) y de T4 (58%).
Estos cambios se relacionaron con un importante incremento de la actividad hD1
(300%), lo que provocó que la concentración plasmática de T3 aumentara más de dos
veces. Mientras tanto, las CR que ya mostraban una elevada concentración de TSH con
respecto a los animales control en condiciones de temperatura ambiente, la condición
de frío sólo provocó un incremento del 15% en la concentración de esta hormona, pero
el tejido tiroideo ya no incrementó la concentración plasmática de T4. Adicionalmente, la
actividad hD1 solo se incrementó en 73% y la concentración de T3 en 49%.
Tabla 2. Respuesta tiroidea ante la exposición al frío en crías de 90 días de edad.
Grupo
Condición
T4 (ng/mL)
T3 (ng/dL)
TSH (ng/mL)
Actividad específica de hD1 (µmol 125I/ mg●h)
CC
T. ambiente
34.8 ± 4.0 a
(n=4)
94.5 ± 3.0 a
(n=13)
7.7 ± 0.4 a
(n=5)
5.6 ± 0.4 b
(n=7)
5°C
55.1 ± 8.0b
(n=4)
203.4±17.4 b
(n=5)
12.9 ± 0.3 b
(n=5)
14.7 ± 2.6 b
(n=7)
CR
T. ambiente
32.7 ± 5.9 a
(n=4)
93.3 ± 5.0 a
(n=11)
9.4 ± 0.04 c
(n=5)
5.3 ± 0.2 b
(n=9)
14
5°C
36.9 ± 1.7 c
(n=4)
139.3 ± 4.8 c
(n=7)
10.8 ± 0.8 c
(n=6)
9.2 ± 0.7 c
(n=4)
Los datos se muestran como la media ± el error estándar. Las letras distintas indican diferencia significativa al realizar las comparaciones entre las crías nacidas de madre control (CC) y las crías nacidas de madre
restringida (CR), y entre las diferentes condiciones de temperatura (ANOVA bifactorial, p <0.05).
META 4. Actividad específica de la 5′′′′ desyodasa tipo 1 en hígado (hD1). La T4 secretada por la tiroides es desyodada en los tejidos periféricos de forma
específica, una de las cuales es la enzima hepática hD1 que es la fuente principal de la
T3 circulante, hormona más potente. El aumento en la actividad de esta enzima se
interpreta como una vía de activación, debido a que aumenta los niveles de T3 y por lo
tanto los efectos de esta hormona sobre el metabolismo celular. Como se puede
observar en la figura 2, la exposición al frío produjo aumento significativo en la actividad
de la enzima, el cual fue menor en el grupo de ratas restringidas con respecto al
aumento observado en el grupo testigo.
2 2 ° C 4 ° C0
1 0
2 0
hD
1 a
ctiv
ity
(µm
ol
125 I/
mg
/h
*
Figura 2. Actividad enzimática de la 5’deyodasa hepática en las CHMC y CHMR
antes y después de la prueba de frío. Los datos se muestran omo la media ± el EE.
* Indica diferencia significativa al comparar cada grupo en la
de temperatura ambiental (p<0.01, ANOVA bifactorial para m
META 5. Determinación de la concentración de proteínas enhígado y peso de tejido adiposo café. El análisis de contenido de proteínas por mg de hígado se re
relación entre la actividad de la enzima hD1 con respecto al pes
muestran en la figura 2.
Por otro lado, las ratas anestesiadas se sometieron a una dise
tejido adiposo café de la región escapular y se pesó. Los resultad
c
15
s diferentes condiciones
edidas repetidas).
homogeneizado de
alizó para calcular la
o, resultados que se
cción para obtener el
os se muestran en la
16
figura 3. No hubo diferencia significativa entre grupos. Este mismo tejido se utilizó para
la determinación de catecolaminas.
0.084
0.106
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
%
CHMC
CHMR
Figura 3. Peso del tejido adiposo café en las CHMC y CHMR de 90 días de edad
después de la prueba de tolerancia al frío. Los datos se muestran como el porcentaje de
peso del tejido con respecto al peso corporal del animal, y como la media ± el error
estándar para una n=6 animales por grupo.
META 6. Respuesta simpática en el tejido adiposo café a la prueba de tolerancia al frío.
Los resultados anteriores sobre la prueba de frío, se relacionan con la capacidad
de las hormonas tiroideas para regular la temperatura corporal a través del aumento de
la termogénesis en el tejido adiposo café de la rata. Sin embargo, las CHMR no fueron
capaces de responder de forma similar a los controles, por lo que decidimos determinar
la participación de las catecolaminas, quienes tienen un efecto importante en la
termogénesis generada en el tejido adiposo café, bajo las mismas condiciones de frío.
Para ello realizamos la extracción del tejido adiposo café y la cuantificación de
adrenalina (A), noradrenalina (NA) y dopamina (DA) en el mismo, utilizando dos grupos
de animales adultos, nacidos de madre control bien alimentada y crías sometidas a un
tratamiento similar de desnutrición temprana, observando los resultados que se
muestran en las figuras 3 y 4.
Estos resultados indican que el peso del tejido adiposo café, no se modificó
después de la prueba de tolerancia al frío (figura 3). Sin embargo, al analizar el
contenido de catecolaminas observamos que sólo la concentración de NA se incrementó
17
significativamente en las CHMR (figura 4), siendo esta catecolamina la de mayor
participación en el tejido adiposo café para estimular la termogénesis facultativa. Se
sabe que la NA tiene un efecto sinérgico con las HT en el tejido adiposo café, al
estimular la oxidación de lípidos en dicho tejido para aportar suficiente energía, que
posteriormente se pierde como calor gracias a que las HT aumentan la expresión de la
proteína desacopladora (UCP) de la cadena de transporte de electrones, lo cual
aumenta la pérdida de la energía en forma de calor para mantener la temperatura
corporal en condiciones de frío. De modo que, si bien las CHMR no compensan el frío a
través del aumento en la producción de T3 circulante debido al menor aumento en la
desyodación hepática que al observado en los animales control, sí tienen la capacidad
de aumentar la actividad simpática en el tejido adiposo café, con lo que suponemos que
aumenta el aporte de sustratos energéticos en dicho tejido para favorecer la
termogénesis facultativa, de modo que estos animales puedan soportar las condiciones
de frío a que fueron expuestos durante 24 h. El análisis de la respuesta simpática a la
disminución de la temperatura ambiental, demostró que si bien las CR tienen una menor
respuesta tiroidea al frío, su respuesta simpática se incrementó significativamente ya
que la concentración de NA cuantificada en el TAC después de la exposición al frío fue
68% mayor con respecto a la determinada en las CC.
Las concentraciones de A y DA, así como el peso del TAC expresado en porcentaje
con respecto al peso corporal de los animales no fueron diferentes entre los grupos
(figura 4 y tabla 3).
313.8
16.3 8.3
526.95
23.6 15.2
0
100
200
300
400
500
600
NA A DA
(ng/
g de
tejid
o)
CHMCCHMR
Figura 4. Contenido de catecolaminas en el tejido adiposo café de las CHMC y CHMR de
90 días de edad después de la prueba de tolerancia al frío. Los datos se muestran como la
18
media ± error estándar para n=6 animales por grupo. NA: noradrenalina, A: adrenalina;
DA: dopamina.
Tabla 3. Contenido de catecolaminas y peso del tejido adiposo café en crías de 90 días después de la prueba de tolerancia al frío.
Grupo
Peso del TAC1
Concentraciones de catecolaminas en TAC1 (ng/g tejido)
(%) 2 A NA DA
CC
0.08 ± 0.018 a
16.3 ± 2.2 a
313.8 ± 35.5 a
8.3 ± 2.9 a
CR
0.11± 0.015 a
23.6 ± 4.3 a
527.0 ± 32.5 b
15.2 ± 4.8 a 1 TAC: Tejido adiposo café. 2 El peso del tejido adiposo café se expresa como porcentaje de tejido con
respecto al peso corporal del animal. A: adrenalina, NA: noradrenalina, DA: dopamina. Los resultados se
expresan como la media ± el error estándar para n=6 animales por grupo, después de ser mantenidos 24 h
a 5°C. Las letras distintas indican diferencia significativa entre las crías nacidas de madre control (CC) y las
crías nacidas de madre restringida (CR) (t-Student, p<0.002).
META 7. Análisis de datos obtenidos.
A todos los resultados obtenidos se les aplicó el análisis de varianza bifactorial, seguido
por el análisis de diferencia de medias de Bonferroni; excepto en los resultados de peso
y longitud corporal, y en el peso de tejido adiposo café donde se analizaron por una t de
Student. En todos los casos la diferencia significativa se estableció cuando la
probabilidad obtenida fue menor a 0.05.
DISCUSIÓN
El estudio de los efectos de la desnutrición en el período perinatal (gestación y
lactancia) ha tomado especial atención a nivel mundial, no solo por su relación con el
aumento de la morbilidad y mortalidad infantil, y con sus efectos irreversibles sobre el
crecimiento y desarrollo de los individuos, sino por sus efectos sobre la funcionalidad de
algunos tejidos, que también pueden permanecer en la edad adulta. Lo anterior se ha
19
descrito en el caso del hígado, del tejido adiposo blanco, del músculo esquelético
(Robinson, 2006; Byrne y Phillips, 2006), y de algunos tejidos endocrinos como el
páncreas (Cameron y Demerath, 2002). Dichos cambios se han relacionado con el
desarrollo de enfermedades metabólicas que se presentan en la edad adulta como, la
hipertensión, las enfermedades coronarias, la intolerancia a la glucosa y la obesidad.
Una explicación a estos fenómenos es la “hipótesis de origen fetal”, la cual sugiere que
el menor aporte de nutrimentos al feto durante la gestación puede hacer que los
sustratos energéticos sean dirigidos especialmente a los tejidos más importantes para la
sobrevivencia fetal, como el cerebro y los pulmones, mientras que otros tejidos pueden
tener un menor aporte de energía, afectando así su desarrollo (Lucas, 1991 y 1998).
Además, se ha propuesto que si la desnutrición continúa durante el período de la
lactancia, la maduración de algunos tejidos del recién nacido puede también alterarse
en mayor o menor medida, dependiendo del grado de madurez que cada órgano
alcanza al momento del nacimiento (Krishnaswamy et al, 2002; Oken y Gillman, 2003;
Robinson, 2006; Byrne y Phillips, 2006).
En el caso de la glándula tiroides, los estudios reportados hasta el momento indican
que la desnutrición materna durante la gestación y la lactancia pueden afectar
negativamente la concentración de HT en la cría en el tiempo inmediato a la
desnutrición, es decir en la cría lactante; sin embargo, no se ha demostrado si estos
cambios pueden permanecer en la edad adulta.
En este estudio demostramos que los efectos negativos de la desnutrición temprana
observados en las CR recién nacidas no fueron permanentes, ya que en la edad adulta
estos animales presentaron concentraciones plasmáticas de T3, T4 y TSH, así como una
hD1 similar a las CC (tablas 2 y 3). Sin embargo, para demostrar que la función tiroidea
de las CR no presentó alteraciones, se realizó una prueba de tolerancia al frío. En esta
prueba los animales fueron sometidos a una baja temperatura ambiental, la cual es
detectada por los termorreceptores hipotalámicos del animal para activar los
mecanismos de termorregulación, en los cuales participan de forma importante las HT.
La termogénesis o generación de calor, en estas condiciones se conoce como
termogénesis facultativa, y en la rata se lleva a cabo en el TAC. La acción de la T3 en el
TAC consiste en aumentar la expresión de una proteína capaz de desacoplar la cadena
de transporte de electrones de la síntesis de ATP, que se conoce como proteína
desacopladora mitocondrial (UCP1). La UCP1 puede disipar el gradiente de protones a
través de la membrana interna de la mitocondria, aumentando así la liberación de la
20
energía en forma de calor. Adicionalmente, la noradrenalina estimula en el TAC la
oxidación de lípidos para proveer moléculas de Acetil-CoA que entran al ciclo de Krebs,
aumentado la producción de coenzimas reducidas que van a la cadena de transporte de
electrones. La T3 tiene un efecto permisivo con la noradrenalina porque aumenta la
expresión de sus receptores en el TAC, lo cual finalmente aumenta la termogénesis
(Silva, 1993; Ribeiro et al, 2001; Silva, 2003). Así, la respuesta termogénica al frío
depende de forma muy importante de la función tiroidea.
Nuestros resultados sugieren que la disminución de la temperatura ambiental no
estimuló en la adenohipófisis la secreción de TSH, debido a que no se encontraron
cambios en la concentración plasmática de TSH y de T4 en ninguno de los animales
(tabla 4). Por otra parte, la condición de frío aumentó la actividad de la hD1, lo cual
puede explicar el incremento de la concentración circulante de T3 en ambos grupos. Sin
embargo, las CR no lograron incrementar la actividad de la hD1, ni la concentración de
T3 a los niveles presentados por las CC (tabla 4). Esto indica que, aunque en
condiciones normales las CR pueden mantener una función tiroidea similar a las CC,
cuando los animales son expuestos a una condición que genera un estímulo adicional
para la respuesta tiroidea, no son capaces de responder adecuadamente, sugiriendo
que la capacidad del hígado (hD1) para responder adecuadamente a las alteraciones
fisiológicas puede ser afectada de forma “irreversible” por la desnutrición temprana.
Nuestros resultados sugieren que la respuesta termogénica provocada por las HT en
los animales sometidos al frío, puede tener una relación importante con la ingestión de
alimento, ya que las CC que presentaron una mayor ingestión de alimento (figura 10),
tuvieron una mayor actividad termogénica (tabla 4), en comparación con las CR. Lo cual
se observa también en individuos con hipertiroidismo o en ratas administradas con HT
(Oppenheimer et al, 1991). Esto sugiere que una adecuada ingestión de alimento puede
ser importante para mantener la respuesta termogénica al frío, ya que en esta condición
la lipólisis en el tejido adiposo blanco aumentaría para aportar sustratos energéticos a la
circulación, que posteriormente serían oxidados en el TAC para aumentar la producción
de calor (Silva, 2003), lo cual disminuiría las reservas si no fuera compensada con una
mayor ingesta. Por otra parte, la menor respuesta termogénica al frío y el menor GER
que presentaron las CR, pudo ser consecuencia de la menor ingestión de alimento, y del
menor contenido de depósitos grasos (figuras 15 y 16), para evitar que en esta situación
se agoten las reservas de lípidos y de proteínas corporales de estos animales. Se ha
descrito una respuesta similar en animales adultos a los cuales se les restringió el
21
consumo de alimento (65% por 17 días), y disminuyeron su respuesta termogénica a la
noradrenalina, el peso del TAC, y el GER (Rothwell y Stock, 1982). El menor GER que
presentaron las CR, también sugiere que las HT pueden tener un efecto
compartimentalizado en el consumo de oxígeno, ya que se sabe que muchos tejidos
tienen desyodasas específicas en el citoplasma que regulan la cantidad de T3 que cada
uno necesita para realizar sus funciones. De modo que, si algunos tejidos disminuyen la
desyodación de T4 a T3, o bien aumentan la desyodación de T3 a 3,3′-diyodotoronina
(forma inactiva) intracelularmente, pueden disminuir el efecto de las HT sobre el
consumo de oxígeno, lo cual estaría representando un ahorro de energía específico de
algunos tejidos, que se refleja en el menor GER.
Adicionalmente, se sabe que las HT regulan el metabolismo de lípidos, proteínas y
carbohidratos. Nuestros resultados indicaron que la desnutrición durante la gestación y
la lactancia, provocó que las CR presentaran menores cantidades de grasa corporal,
sólo en la carcasa y en el tejido adiposo retroperitoneal. El depósito de lípidos en el
tejido adiposo blanco, depende del balance energético, es decir de que la cantidad de
energía ingerida fuera mayor al gasto energético, lo que sugiere que las CR no
acumularon mayor cantidad de grasa corporal porque si bien el GER fue menor, también
lo fue el consumo de alimento. Por otra parte, el aumento de los depósitos grasos
depende de la regulación hormonal. Se sabe que en la rata, la T3 estimula la lipogénesis
hepática al incrementar la síntesis de las enzimas lipogénicas, especialmente de la
enzima málica (Strait et al, 1989; Oppenheimer et al, 1991). Otro estudio en el cual se
analizó la lipogénesis “in vivo” por la incorporación de agua tritiada, se demostró que las
ratas hipotiroideas presentan una disminución significativa de la lipogénesis en el
hígado, y el tejido adiposo blanco de las regiones retroperitoneal y epididimal
(Blennemann et al, 1992); lo que sugiere que a pesar de que las CR presentaron
concentraciones de T3 y T4 similares a las CC, el efecto lipogénico de estas hormonas
fue menor en el tejido adiposo retroperitoneal y de la carcasa. Podemos pensar que la
desnutrición materna durante la gestación y la lactancia, provocó un efecto lipogénico
específico en los tejidos grasos corporales.
CONCLUSIONES.
1. Los efectos negativos generados por la desnutrición materna, en la
concentración de T3 y la actividad hD1 de las CR, son reversibles en la edad
22
adulta si los animales se alimentan a libre demanda con una dieta
balanceada.
2. La desnutrición temprana afectó negativamente la capacidad de la hD1 para
responder adecuadamente a un estímulo de frío en las CR adultas. La menor
respuesta termogénica, puede ser una estrategia del organismo para evitar la
disminución de los depósitos de grasa corporal, cuando la ingesta de alimento
y la reserva energética de lípidos es menor.
3. El menor en la actividad simpática en el tejido adiposo café de las crías de
ratas desnutridas, nos muestra que, la participación simpática es fundamental
para conservar la temperatura en los organismos hipotiroideos.
VIII. IMPACTO DEL PROYECTO EN EL SECTOR PRODUCTIVO O DE BIENES Y SERVICIOS.
La desnutrición en México es un problema reconocido y de amplia extensión sobretodo
en las regiones rurales del país. Resulta entonces fundamental que la población general
conozca el impacto que tiene una alimentación deficiente durante la etapa perinatal
(gestación y lactancia) sobre el desarrollo del sistema endocrino del nuevo ser. Esta
población de mujeres en etapa reproductiva se le debe considerar como vulnerable,
dado que el óptimo desarrollo de su descendencia puede verse afectado de forma
importante y de manera probablemente irreversible, simplemente por desconocimiento y
falta de tomar las medidas preventivas, como sería una buena alimentación.
IX. BIBLIOGRAFÍA Alaéz C. Calvo R. Obregón y Pascual –Leone. Thyroid hormones and 5” deiodinase activity in
neonatal undernourished rats. Endocrinology 25:145-151; 1992.
Anderson D. Effect of maternal dietary restriction during pregnancy on maternal weight gain and
fetal birth weight in the rat. Journal of Nutrition 110:883-890; 1980.
Armitage J. A., Khan I. Y., Taylor P. D., Nathanielsz P. W., Poston L. Developmental
programming of the metabolic syndrome by maternal nutritional imbalance: how strong is
the evidence from experimental models in mammals? Journal of Physiology 561:355-377;
2004.
Berne R., Levy M. La glándula tiroides En Fisiología. Editorial Elsevier, S.A. 3ª edición , España
p.p. 548-557; 2004.
23
Behrends J., Clement S., Pajak B., Pohl V., Maenhaut C., Dumont J. E., Schurmans S. Normal
thyroid structure and function in rhophilin 2 deficient mice. Molecular and Cellular Biology
25:7 2846-2852; 2005.
Byrne C. and Phillips D. Fetal origins of adult disease: epidemiology and mechanisms. British
Medical Journal 53:822-828; 2006.
Brown, R.S., Salhoub V., Coulter S., Alex S., Joris I.,De Vito W.,Lian J., Stein G.S.
Developmental Regulation of thyrotropin Receptor Gene Expresión in the Fetal and
Neonatal Rat Thyroid: Relatión to Thyroid Morphology and to Thyroid-specific Gene
Expression. Endocrinology 141:340-345; 2000.
Clement, S., Refetoff S., Robaye B., Dumont J.E., Schurmans S. Low TSH requirement and
goiter in transgenic mice overexpressing IGF-I and IGF-I receptor in the thyroid gland.
Endocrinology 142:5131-5139; 2001.
Cravioto M, Ortega E, Arrieta M. Desnutrición en la infancia. En: La nutrición y la salud de las
madres y los niños mexicanos. Editorial. Fondo de Cultura Económica. México 251-126;
1995.
De Felice M., Pia P. M., Di Lauro R. Minireview: thyrotropin receptor signaling in development and
differentiation of the thyroid gland: insights from mouse models and human diseases.
Endocrinology 145:4062-4067; 2004.
Escobar M. H. F., Escobar Del Rey F., Morreale De Escobar G. Cápitulo 68. La glándula tiroides
en Tresguerres J.A.F. Fisiología Humana ed. Mc Graw-Hill Interamericana 2ª edición p.p
912-915 España; 1999.
Ferlatte, M.I., Zeman, F.J. The effects of prenatal protein deprivation on thyrotroph development.
Endocrinology Research Communication 4: 379-389; 1977.
Fowden A. L., Giussani D.A., Forhead A.J. Intrauterine programming of physiological systems:
causes and consequences Physiology 21:29-37; 2006.
Fowden A.L., Forhead A.J. Endocrine mechanisms of intrauterine programming. Reproduction
515-526; 2004.
Garofano A., Czernichow P., Bréant B. Postnatal somatic growth and insulin contents in moderate
or severe intrauterine growth retardation in the rat Biology of Neonate 73:89-98; 1998.
Guyton M. D. Arthur. Hormonas tiroideas en Tratado de fisiología médica ed. Mc Graw-Hill
Interamericana 10ª edición p.p 1031-1033 México 2000.
Ingbar S.H., Woeber K.A. La glándula tiroides en Williams R.H. Tratado de Endocrinología Ed.
Interamericana 6ª edición p.p. 129-136 1984.
Kawaoi A., Tsuneda M. Functional development and maturation of the rat thyroid gland in the
foetal and newborn periods: an immunohistochemical study Acta Endocrinologica
108(4):518-524; 1985.
24
Kilby MD, Gittoes N, McCabe C, Verhaeg J y Franklyn JA Expression of thyroid receptor
isoforms in the human fetal central nervous system and the effects of intrauterine growth
restriction. Clinical Endocrinology 53:469-477; 2000.
Köhrle, J. Thyrotropin (TSH) action on thyroid hormone deiodination and secretion : one aspecto
of thyrotropin regulation of thyroid cell biology Abteilung Klinische Endocrinology p.p. 18-
28; 1990.
Krishnaswamy K, Naidu A.N., Prasad M.P., Reddy G., A. Fetal malnutrition and adult chronic
disease. Nutrition Review 60:S53-S59; 2002.
LaFranchi S. Thyroid function in the preterm infant. Thyroid 9:71-78; 1999.
Leon M. y Woodside B. Energetic limits on reproduction: maternal food intake.
Physiology and Behavior 30:945-957; 1983.
Lucas A. Programming by early nutrition in man. In: The Childhood Enviroment and Adult
Disease. CIBA Found Symp 156. Wiley, Chichester, U.K. pp 38-55; 1991.
Oberkotter L.V., Rasmussen K.M. Changes in plasma thyroid hormone concentrations in
chronically food-restricted female rats and their offspring during suckling Journal of
Nutrition ;122(3):435-441; 1992.
Oken E. y Gillman M.W. Fetal origins of obesity. Obesity Research 11:496-506; 2003
Patel M.S., Srinivasan M. Metabolic Programming: causes and consequences The Journal of
Biological Chemistry Vol. 277 p.p.1629-1632, 2002.
Postiglione, M. P., Parlato R., Rodriguez-Mallon A., Rosica A., Mithbaokar P., Maresca M.,
Marians R.C., Davies T.F., Zannini M.S., De Felice M., Di Lauro R. Role of the thyroid-
stimulating hormone receptor signaling in development and differentiation of the thyroid
gland. Proccedings of the National Academy of Sciences 99 :15462-15467; 2002.
Radetti G., Renzullo L., Gottardi E., D′Addato G. y Messner H. Altered thyroid and adrenal
function in children born at term and preterm, small for gestational age. Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism 89:6320-6324; 2004
Robinson R. The fetal origins of adult disease. B M J 322:375-376; 2006.
Shrader, R.E., Ferlatte, M.I., Hastings-Roberts, M.H., Schoenborne, B.M., Hoernicke, C.A.,
Zeman,F.J. Thyroid function in prenatally proteín-deprived rats The Journal of Nutrition
Vol. 107 p.p. 221-229 1977.
Shraeder, R.E., Hastings-Roberts M.M., Zeman, F.J. Effect of prenatal proteín deprivation on fetal
and neonatal thyroid morphology in the rat Journal of Nutrition Vol. 107 p.p. 213-220
1977.
Tulp, Ol., Krupp, P.P., Danforth, E. Jr., Horton, E. S. Characteristics of thyroid function in
experimental protein malnutrition Nutriology Vol. 109 p.p. 1321-1332 1979.
Withers, C. P. Comparative Animal Physiology. Ed. Saunders College Publishing U.S.A. p.p. 560-
562; 1992.