josuÉ ordaz rivera
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TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez
TRABAJO PROFESIONAL
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE:
INGENIERO BIOQUÍMICO
QUE PRESENTA:
JOSUÉ ORDAZ RIVERA
CON EL TEMA:
“EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO, COMPOSICIÓN DE FENOLES, FLAVONOIDES Y ACTIVIDAD ANTIRADICAL
DE LAS HOJAS DE LA PLANTA DE ZARZAMORA (Rubus sp.) CULTIVADA ORGÁNICAMENTE”
MEDIANTE:
OPCION I (TESIS PROFESIONAL)
DIRECTOR DE TESIS:
DR. FEDERICO ANTONIO GUTIÉRREZ MICELI
TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS SEPTIEMBRE 2015
Índice
Índice de figuras ................................................................................................................ 5
Índice de cuadros .............................................................................................................. 5
Resumen ........................................................................................................................... 6
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 7
2. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 9
2.1 Zarzamora (Rubus sp.) ............................................................................................. 9
2.2 Biofertilizantes ........................................................................................................ 11
2.2.1 Hongo micorrízico arbuscular........................................................................... 12
2.2.2 Roca fosfórica .................................................................................................. 17
2.2.3 Vermicomposta ................................................................................................ 22
2.3 Compuestos polifenólicos ....................................................................................... 25
2.3.1 Estructura y clasificación de los compuestos polifenólicos ............................... 28
2.4 Síntesis de compuestos polifenólicos ..................................................................... 32
2.5 Determinación de compuestos polifenólicos ........................................................... 36
2.5.1 Preparación de la muestra ............................................................................... 36
2.5.2 Extracción ........................................................................................................ 37
2.5.3 Análisis y cuantificación de fenoles .................................................................. 40
2.5.4 Análisis y cuantificación de flavonoides ........................................................... 43
2.6 Radicales libres ...................................................................................................... 44
2.6.1 Antioxidantes ................................................................................................... 45
2.6.2 Pruebas utilizadas para detectar y cuantificar antioxidantes en extractos
vegetales .................................................................................................................. 46
3. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................... 49
4. OBJETIVOS ................................................................................................................. 51
4.1 Objetivo General .................................................................................................... 51
4.2 Objetivos específicos.............................................................................................. 51
5. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 52
5.1 MATERIALES ........................................................................................................ 52
5.1.1 Plantas de zarzamora ...................................................................................... 52
5.1.2 Hongo micorrizico arbuscular ........................................................................... 52
5.1.3 Roca fosfórica .................................................................................................. 52
5.1.4 Vermicomposta ................................................................................................ 52
5.2 METODOLOGÍA ..................................................................................................... 53
5.2.1 Siembra de las plantas de zarzamora y diseño experimental ........................... 53
5.2.2 Análisis de la altura y diámetro de la planta. .................................................... 54
5.2.3 Obtención de extracto metanólicos .................................................................. 54
5.2.4 Cuantificación de fenoles totales ...................................................................... 54
5.2.5 Cuantificación de flavonoides........................................................................... 55
5.2.6 Actividad antirradical mediante el radical DPPH (1,1-Difenil-2-picril-hidrazilo) . 55
5.2.7 Análisis estadístico .......................................................................................... 56
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..................................................................................... 57
6.1 Factores de crecimiento ......................................................................................... 57
6.1.1 Altura de tallo ................................................................................................... 57
6.1.3 Diámetro del tallo ............................................................................................. 59
6.2 Fenoles y flavonoides ............................................................................................. 61
6.3 Actividad antiradical ............................................................................................... 64
7. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 66
8. RECOMENDACIONES ................................................................................................ 67
9. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 68
Anexos ............................................................................................................................ 77
5
Índice de figuras
pagina
1. Interacción hongo-planta-suelo 13
2. Estructura de flavonoides, ácidos fenólicos y taninos 27
3. Estructura de estilbenos y lignanos 28
4. Estructura básica de ácidos fenólicos y flavonoides 28
5. Ácidos fenólicos: denzoicos (hidroxibenzoicos), cinamicos
(hidroxicinámicos) y derivados (estilbenos)
30
6. Clasificación de flavonoides 35
Índice de cuadros
pagina
1. Valor nutricional en cada 100g de zarzamora 10
2. Efectos de los tratamientos en la altura de las plantas de
zarzamora en diferentes etapas de crecimiento
59
3. Efectos de los tratamientos en el diámetro del tallo de las
plantas de zarzamora en diferentes etapas de crecimiento
61
4. Datos de fenoles totales y flavonoides totales de las hojas de
la planta de zarzamora
64
5. Efecto de los tratamientos en la actividad antiradical de las
hojas de la planta de zarzamora
65
6
Resumen
En la actualidad existen múltiples reportes que demuestran la capacidad
antioxidante de plantas, frutas y vegetales que han sido utilizadas en tratamientos
médicos tradicionales. El presente trabajo utilizo tres diferentes biofertilizantes
para evaluar su efecto sobre el crecimiento, concentración de compuestos
fenólicos y flavonoides, y la actividad antiradical de las hojas de zarzamora. Se
realizó el método colorimétrico de Folin Ciocalteau para la evaluación de fenoles,
método colorimétrico del tricloruro de aluminio para flavonoides y la actividad
antiradical mediante el radical DPPH, la evaluación del crecimiento consistió en
medir la altura de la planta y el diámetro del tallo a diferentes etapas de
crecimiento.
Durante la evaluación del efecto de los biofertilizantes en el crecimiento, no se
presentó efecto estadístico significativo en los parámetros de crecimiento. Sin
embargo la roca fosfórica promovió mayor altura y diámetro del tallo en
comparación con los otros tratamientos.
Los resultados de fenoles y flavonoides mostraron diferencia estadística en su
cantidad, sin embargo no en la actividad antiradical. Se determinó mayor
contenido polifenólico total de 58.16 mg EAG g-1 (equivalentes a ácido gálico por
gramo de muestra seca) en muestras con hongo micorrízico arbuscular y
vermicomposta, mientras que el contenido de flavonoides fue mayor en el testigo
con 7.83 mg EQ g-1 (equivalentes a quercetina por gramo de muestra seca). La
actividad antiradical se determinó por valor IC50. Los resultados indicaron que la
aplicación del hongo micorrízico arbuscular y vermicomposta fueron los más
influyentes en el contenido de fenoles, en cuanto a los flavonoides no se
mostraron resultados positivos en su síntesis y la actividad antiradical de los
extractos de zarzamora los perfila como una alternativa de interés para su uso
como antioxidante natural.
7
1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad existen múltiples reportes que demuestran la capacidad
antioxidante de plantas, frutas y vegetales que han sido utilizadas en tratamientos
médicos tradicionales durante muchos años en diversas partes del mundo. La
actividad antioxidante de dichas plantas se debe principalmente a compuestos no
nutricionales que presentan una gran actividad biológica, tales como compuestos
fenólicos, vitaminas y minerales. La acción antioxidante presente en estas plantas
es importante debido a que puede ayudar a las personas que las consumen a
combatir enfermedades provocadas por una reacción de radicales libres o
especies reactivas del oxígeno, nitrógeno o hierro. Los radicales libres son
moléculas con un electrón desapareado, capaces de favorecer reacciones en
cadena muy dañinas para el organismo, desencadenando un fenómeno conocido
como estrés oxidativo. Dicho fenómeno ha sido recientemente asociado a
enfermedades tales como Alzheimer, cáncer, además de algunas enfermedades
cardiovasculares, debido a mecanismos de peroxidación lipídica, daño al DNA y
proteínas, entre otros.
Es por esta razón entre otras que los compuestos fenólicos en las plantas han sido
ampliamente estudiados, con el fin de conocer su composición en las plantas, el
tipo de metabolismo que presenta, su relación con otras rutas metabólicas, la
actividad antioxidante que poseen, la forma en que se puede estimular su síntesis,
etc.
En el presente trabajo se utilizaron hojas de zarzamora (Rubus sp.) debido a que
los compuestos fenólicos están en todas partes en todos los órganos de la planta
y a que los frutos presentan propiedades antioxidantes, además de ser una
excelente fuente de vitaminas, en especial de las vitaminas C y A, que la
convierten en un buen antioxidante, por lo que se reconoce que las hojas podrían
tener un nivel considerable de compuestos fenólicos y a su vez de actividad
antioxidante.
8
Por ello se decidió cuantificar el contenido de polifenoles en las hojas de la
zarzamora tratada con tres diferentes biofertilizantes; los hongo micorrizicos
arbusculares debido a que incrementan el grado de crecimiento de las plantas
debido a una mayor absorción de fosforo y otros nutrimentos, así como el agua,
incrementa la salinidad y longevidad de las raíces, incrementa la tolerancia a la
sequía, a altas temperaturas del suelo, a la toxicidad por metales pesados a pH
extremos y al estrés al trasplante; también juega un papel importante en la
nutrición mineral, principalmente mejorando la absorción del fosforo en suelos de
baja fertilidad y otros nutrimentos poco móviles, la roca fosfórica por ser el
segundo fertilizante mineral más influyente para el crecimiento vegetal, y la
vermicomposta por sus características físicas, químicas, microbiológicas y
nutrimentales mejora la estructura del suelo, la aireación, retención de agua,
drenaje, y aumenta el intercambio iónico y disponibilidad de fósforo.
El presente trabajo se realizó con el fin de evaluar los resultados de crecimiento,
compuestos fenólicos, flavonoides y actividad antiradical para distinguir si los
tratamientos son efectivos para el desarrollo de la planta, síntesis de compuestos
fenólicos y su actividad antiradical en las hojas de zarzamora, debido al beneficio
que proporcionan los compuestos fenólicos, la perdida de hojas por el proceso de
poda que se realiza a las plantas para la producción de frutos; para el cual se
pudiese dar un uso extra para las hojas de zarzamora y debido a que no se tienen
reportes del uso de vermicomposta, roca fosfórica y hongo micorrízico arbuscular,
en el efecto que estos biofertilizantes puedan tener sobre la producción de
metabolitos secundarios tales como los compuestos fenólicos; entre ellos
flavonoides y su actividad antiradical en las hojas de zarzamora (Rubus sp.).
9
2. ANTECEDENTES
2.1 Zarzamora (Rubus sp.)
Características:
Nombre común.- zarzamora
Especie.-Rubus sp.
Familia botánica.-Rosaceae
Existen unas 250 especies semejantes del género Rubus repartidas por los cinco
continentes con innumerables subespecies e híbridos, ya sean naturales o
inducidos.
Composición nutrimental
La zarzamora es una fruta con escaso aporte de carbohidratos, es por eso que se
describe como una fruta de bajo valor calórico. Es una excelente fuente de
vitaminas, en especial de las vitaminas C y A. Estas dos vitaminas convierten a
este fruto en un buen antioxidante, además de la abundancia de antocianinas y
carotenoides presentes en esta fruta (Cerón, 2008).
Este tipo de frutas son de las fuentes más importantes de antocianinas en la dieta,
gracias a este tipo de compuestos fenólicos, la zarzamora tiene su color
característico debido a que las antocianinas son de los grupos principales de
pigmentos naturales (Badui, 2006).
Contiene del 75 a 90% de su peso total en agua, mientras que solo alrededor de
uno porciento es proteína careciendo de grasa, como se muestra en cuadro 1
(Cerón, 2008).
10
Cuadro 1. Valor nutricional en cada 100g de zarzamora1.
Valor nutricional por cada 100g
Carbohidratos 11.94g
Azucares 4.42g
Fibra 6.5g
Grasas 0.65g 0.65g
Proteínas 1.2g
Tiamina 0.032mg
Riboflavina 0.038mg
Niacina 0.598mg
Ácido pantoténico 0.329mg
Vitamina B6 0.055mg
Ácido fólico 21µg
Vitamina C 26.2mg
Vitamina E 0.87mg
Vitamina K 7.8µg
Calcio 25mg
Hierro 0.69mg
Magnesio 22mg
Manganeso 0.67mg
Fosforo 29mg
Potasio 151mg
Sodio 1mg
Zinc 0.42mg
Fuente: Base de datos de nutrientes de USDA1
1United States Department of agriculture (2001)
11
Descripción botánica
Para describir las diversas variedades de zarzamoras de forma general, diremos
que son arbustos vigorosos con numerosos tallos arqueados que brotan de la
base de la planta, aristados y con la facultad de emitir raíces. Los tallos poseen
numerosas espinas prominentes como ganchos. Son tallos bianuales que durante
el primer año se desarrollan y durante el segundo florecen. Permanecen erectos
solo durante su primer desarrollo para luego arquearse hasta tocar el suelo donde
pueden enraizar (Morales y Box, 2005).
Las hojas son similares a las del frambueso, trifoliadas y estipuladas con peciolos
más o menos espinosos. Los foliolos son oblongos y con el margen aserrado, de
un verde oscuro y brillante por el haz y blanquecinos por el envés, debido a la
presencia de una vellosidad. Las flores son hermafroditas y autofértiles,
pentámeras con pétalos de color blanco y rosado, agrupadas en inflorescencias en
racimos, panículas o solitarias. Se desarrollan en los tallos de dos años y pueden
ser terminales o axilares (Morales y Box, 2005).
Las infrutescencias o zarzamoras son realmente una polidrupa de 1-2 cm de largo,
que está formada por varias pequeñas drupas carnosas de color verde, que a
medida que maduran pasan al rojo hasta llegar a un negro muy intenso y brillante.
Cada drupilla contiene una diminuta semilla leñosa y cuando están bien maduras
tienen un agradable sabor dulzón (Morales y Box, 2005).
2.2 Biofertilizantes
El término “biofertilizantes” o “inoculantes microbianos” puede ser definido de
manera general como preparaciones que contienen células vivas o latentes de
cepas eficientes para fijar nitrógeno, solubilizar fosfato o microorganismos
celulíticos, usadas para aplicarse en semillas, suelo o áreas de composteo con el
objetivo de aumentar el número de microorganismos y acelerar los procesos
12
microbianos para incrementar la disponibilidad de nutrientes en una forma tal que
puedan ser fácilmente asimilados por las plantas. El término puede usarse para
incluir a todos los materiales orgánicos (abonos) que las plantas pueden utilizar
para crecer y que se encuentren disponibles para su absorción a través de los
microorganismos o de las asociaciones o interacciones planta – microorganismos
(Figueroa y Gutiérrez, 2009).
Los biofertilizantes son tecnologías limpias apropiadas dentro de los esquemas de
certificación nacional e internacional, porque ofrecen soluciones a problemas de
deficiencia de nutrientes en el suelo, permiten la sustitución total o parcial de
fertilizantes de síntesis con restricciones para su uso en tecnologías limpias,
contribuyen con la disminución de los costos de producción y son compatibles con
la protección al ambiente (Gómez y Vélez, 2008).
2.2.1 Hongo micorrízico arbuscular
Micorrizas
La simbiosis micorrícica
La micorriza es una simbiosis mutualista que se establece entre ciertos hongos del
suelo y las raíces de muchas plantas. Los organismos asociados pertenecen al
reino fungí (basidiomicetos, ascomicetos y zigomicetos) y a la mayor parte de las
plantas vasculares (Silvano, 2010). Por lo que estas asociaciones micorrícicas
involucran interacciones entre los hongos, la planta y los factores del suelo
(figura1).
13
Figura 1. Interacción hongo-planta-suelo (Silvano, 2010).
La asociación micorrizica probablemente surgió como un mecanismo de
supervivencia para ambos socios en ambientes terrestres de baja fertilidad,
sequia, enfermedades y temperaturas extremas donde no hubieran podido
establecerse solos (Silvano, 2010).
La importancia agronómica de la micorriza vesículo-arbuscular radica en el papel
que juega en el crecimiento de las plantas de interés agrícola, frutícola, forestal y
en los ecosistemas naturales (Pérez, 1998).
Hasta hace pocos años, el uso de hongos formadores de micorrizas arbusculares
(HMA) se encontraba restringido a aquellos cultivos que necesitan de una fase
inicial de establecimiento y crecimiento antes de quedar definitivamente
establecidos en el campo, tales como los semilleros de hortalizas, los viveros en
frutales y la fase de adaptación en vitroplantas. En esos casos, los volúmenes de
inóculos eran aceptables; sin embargo, no se recomendaban para los cultivos de
siembra directa aun cuando los efectos eran positivos. Se puede considerar que
una de las principales causas que limitan la obtención de micorrizas por los
productores, puede estar dada por su forma de reproducción, ya que el fertilizante
biológico se obtiene a partir de la inoculación previa de una determinada cepa de
HMA a plantas hospederas (ya sea en el momento de la siembra o por
recubrimiento de sus semillas), que incluyen por lo general las especies de
14
Sorghum vulgare y Brachiaria decumbens, entre otras, y su posterior desarrollo en
el sistema radical. El inoculante está listo cuando se cumple el ciclo reproductivo
de dichas plantas y es extraído conjuntamente con el sustrato, el cual incluye
todos los propágulos infectivos del hongo micorrizógeno (esporas, raicillas
infectadas y fragmentos de hifas). No obstante, este puede ser extraído en
cualquier otro momento, en dependencia de la cantidad de propágulos existentes
en el sustrato (Noda, 2009).
Principales tipos de micorrizas
Aproximadamente unas 5 000 especies de hongos (principalmente
Basidiomycetes) están asociadas a los árboles forestales en las regiones boreales
y templadas, estableciendo un tipo de micorrizas. Las raíces de los árboles de las
selvas tropicales, de los árboles frutales y de casi la totalidad de las demás plantas
verdes, están asociadas a hongos inferiores, la mayoría microscópicos. Estos
hongos, aunque presentes en casi todo el Planeta, asociados con casi todas las
plantas verdes, establecen otro tipo de micorrizas y pertenecen a seis géneros y
alrededor de un centenar de especies (Noda, 2009).
Las micorrizas se han agrupado tradicionalmente, sobre la base de la anatomía de
las raíces que colonizan; en:
a) Ectomicorrizas: Se caracterizan por la penetración intracelular del micelio
fúngico en la corteza radicelar, que forma la “red de Harting” y el “manto”
que se desenvuelve alrededor de los segmentos de raíces colonizados,
provocando cambios anatómicos evidentes que producen el crecimiento
dicotómico de estas raíces (Pérez, 1998).
b) Ectendomicorrizas: Son generalmente ectomicorrizas con penetración
intracelular. Existen diferencias anatómicas en función de la planta
hospedera, de manera que se diferencian los subgrupos de las pinaceae y
de las Ericales (géneros Arbutus y monótropas, micorrizas arbutoides)
(Pérez, 1998).
15
c) Endomicorrizas: Se caracterizan por la inter e intracelular pero sin
formación del manto ni modificaciones morfológicas evidentes en las raíces.
Cumplan con estas condiciones los tipos de micorrizas ericoides,
orquidoides y las vesículo arbusculares, siendo las micorrizas vesículo
arbusculares las de más amplia distribución, tanto geográfica como
florística (Pérez, 1998).
Los dos tipos más comunes y más conocidos son las ectomicorrizas y las
endomicorrizas. Cada tipo se distingue sobre la base de la relación de las hifas del
hongo con las células radicales del hospedero. Plantean que en las ectomicorrizas
el micelio invade la raíz sin entrar en el interior de las células; en el caso de las
endomicorrizas el micelio invade la raíz, inicialmente es intercelular, pero luego
penetra en el interior de las células radicales, desde la rizodermis hasta las células
corticales. Se señala que este tipo de micorrizas es muy frecuente y están
extendidas en todo el Planeta. Se distribuyen además, en la mayoría de los
árboles de las zonas tropicales y algunos árboles de bosques templados (Noda,
2009).
Estos hongos inferiores que forman endomicorrizas vesículo arbusculares
pertenecen a un solo grupo, las Glomales (Zygomycetes), con seis géneros y
muchas especies distribuidas en todos los continentes; son estrictamente
simbióticos y no pueden ser cultivados en cultivo puro, o sea en ausencia de su
hospedero, contrariamente a los hongos ectomicorrícicos (Noda, 2009).
Los arbúsculos de las endomicorrizas son estructuras altamente ramificadas,
típicamente intracelulares, que se localizan en las células cercanas al cilindro
vascular, y su función es la transferencia de nutrimentos desde el suelo hasta el
huésped; las vesículas son protuberancias que quedan revestidas por la
membrana plásmatica. Las hifas, por otra parte, se extienden varios centímetros
por fuera de la raíz, incrementando la cantidad de nutrientes absorbidos. En este
sentido, las hifas no están septadas, es decir, ausentes de tabiques que separan
16
las células y las asociaciones hongo/ hospedante no son muy específicas. Muchas
gramíneas las presentan: Andropogon, Bromus, Festuca, Panicum, Poa,
Saccharum, Sorghum, Sporobolus, Stipa y Zea mays. El intercambio entre el
hongo y el hospedante tiene lugar en los arbúsculos, que se llenan de gránulos de
fosfatos (Noda, 2009).
La utilización de las micorrizas como biofertilizante no implica que se puede dejar
de fertilizar, sino que la fertilización se hace más eficiente y que puede disminuirse
la dosis a aplicar hasta en un 100% (Pérez, 1998).
Entre los factores que han estimulado el interés en la micorriza es que incrementa
el grado de crecimiento de las plantas debido a una mayor absorción de fosforo y
otros nutrimentos, así como el agua, incrementa la salinidad y longevidad de las
raíces, incrementa la tolerancia a la sequía, a altas temperaturas del suelo, a la
toxicidad por metales pesados a pH extremos y al estrés al trasplante; también
juega un papel importante en la nutrición mineral, principalmente mejorando la
absorción del fosforo en suelos de baja fertilidad y otros nutrimentos poco móviles.
Además se ha mostrado que tienen un efecto en la formación de agregados
semiestables en suelos sueltos, induce a la tolerancia a patógenos y favorece la
adaptación de las plantas a condiciones limitantes así como al estrés ambiental
(Pérez, 1998).
En el ámbito mundial, se reportan múltiples experiencias acerca de los beneficios
de las micorrizas arbusculares en especies frutales, donde frecuentemente se
compara el crecimiento de las plantas micorrízicas con las no micorrízicas; estas
diferencias son atribuibles a una mayor absorción de nutrientes, una producción
de hormonas más alta y mayores contenidos de clorofila. Estas diferencias se han
observado en especies tropicales como Mora excelsa, Prioria copaifera en el
Caribe (Trinidad y Tobago, y Panamá) y en múltiples árboles tropicales de la
familia Fabaceae. Otros autores reportan beneficios en especies como la
chirimoya, Tamarindus indica, Parkia biglobosa, Sclerocarria birrea, Balanites
17
aegiptica, Adansonia digitata, Codyla pinnata, Saba senegalensis, Landolfia
heudelotti, Dialium guineensis, Anacardium occidentale, Afsellia africana y Aphala
senegalensis (Noda, 2009).
2.2.2 Roca fosfórica
Después de nitrógeno, el fósforo (P) es el fertilizante mineral más influyente para
el crecimiento vegetal, y es el segundo mayor producto químico agrícola del
mundo (Fateh et al., 2011).
Roca fosfórica es un nombre colectivo utilizado para denominar todos los
minerales que contienen fosfatos. Las rocas fosfóricas constituyen un recurso
natural finito, no renovable y los depósitos geológicos de diferente origen se
encuentran en todo el mundo. En la actualidad son explotados pocos yacimientos
de roca fosfórica y cerca del 90 por ciento de la producción mundial es utilizada
por la industria para la fabricación de fertilizantes fosfatados, mientras que el resto
se emplea para la producción de alimentos para animales, detergentes y otros
productos químicos.
Además es uno de los principales elementos nutritivos para las plantas y animales
que restringe en mayor grado la producción agropecuaria. Este problema puede
corregirse mediante la aplicación de abonos químicos fosfatados de alta
solubilidad como el súper fosfato simple (SFS) o el súper fosfato triple (SFT) o con
la aplicación de fuentes menos solubles, pero al mismo tiempo, más económicas,
como es el caso de las rocas fosfóricas. Solucionado la deficiencia de P en el
suelo, la producción de biomasa incrementará y por ende la productividad (Arévalo
et al., 2003).
Las rocas fosfóricas son la materia prima básica para la producción de los
fertilizantes fosfatados. El compuesto fosfatado en las rocas fosfóricas es algún
18
tipo de apatita. Según el origen del depósito de la roca fosfórica y su historia
geológica, las apatitas pueden presentar propiedades físicas, químicas y
cristalográficas diferentes. Con las rocas fosfóricas se hallan asociados grupos
definidos de minerales accesorios de diversos orígenes y edades geológicas. Por
lo tanto, es imperativo establecer procedimientos simples para la caracterización
normalizada de las rocas fosfóricas, definir las normas de calidad para fines de la
aplicación directa y luego clasificarlas. Las fuentes de roca fosfórica de calidad
conocida pueden ser utilizadas como materiales de referencia para los fines de
comparación.
Las características mineralógicas, químicas y texturales de los minerales de
fosfatos y sus concentrados determinan: i) su conveniencia para los diversos tipos
de procesos de «beneficio» o enriquecimiento para mejorar la calidad de los
minerales y eliminar las impurezas, ii) su adecuación a los varios tipos de
procesamiento químico y, iii) su capacidad para ser utilizada como roca fosfórica
para la aplicación directa. Los factores más importantes en su evaluación para la
aplicación directa son: el grado o ley, la conveniencia para el beneficio y la
reactividad de la apatita. Una matriz completa de caracterización basada en la
integración de todos los datos obtenidos por varios métodos analíticos determina
el potencial de beneficio y los mejores usos posibles de la roca fosfórica en la
producción de los fertilizantes fosfatados solubles o como fertilizante de aplicación
directa.
La aplicación de roca fosfórica al suelo como fuente de fósforo requiere de un
ambiente apropiado que facilite el proceso de disolución de la misma, este
proceso ha sido descrito, por Khasawneh y Doll (1978) de acuerdo a la siguiente
ecuación:
Ca10(PO4)6F2 + 12h+ ↔ 10Ca + 6H2PO4
− + 2F−
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De acuerdo a esta ecuación la disolución de la roca puede ser favorecida por la
remoción de los productos de disolución, en particular los iones calcio y fosfato, o
bien por la suplencia de protones.
En este orden de ideas se ha sugerido que la aplicación de diversos materiales
orgánicos, el estiércol de diversos orígenes, entre éstos, en forma conjunta a la
roca fosfórica (RF) permite incrementar los niveles de fósforo liberados por ésta,
con relación a eso He et al., (1997) muestran resultados según los cuales la
solubilidad de la roca se incrementó notablemente con la aplicación de celulosa;
efecto que sería posible cuando se incorpora estiércol de bovino dado sus
elevados contenidos de celulosa. Una de las teorías propuestas para explicar tal
efecto supone que, el calcio liberado por la roca durante su proceso de disolución
puede ser quelatado por los compuestos orgánicos (CO) gracias a grupos
funcionales o aniones como el citrato y el oxalato (Chien, 1979; Tan, 1986). La
reacción general sería la siguiente:
Ca2+ + CO Quelación→ Quelatos de Ca2+
Amberger y Singh (1994), señalan que en el caso de la materia orgánica (MO)
estable del suelo, la fracción correspondiente a los ácidos fúlvicos es en gran
medida, responsable de los procesos de quelación. Este mecanismo, sea mediado
por la MO estable o por productos orgánicos de incorporación reciente, permite
“eliminar” del sistema uno de los productos de la reacción de disolución de la RF,
ello conducirá a un desplazamiento de los equilibrios y en consecuencia al
incremento de la disolución de la misma. La producción de este fenómeno
requiere, según estimaciones hechas, periodos de dos a cuatro semanas (Chien,
1979).
Otro enfoque importante es aquel que sostiene que es la producción de ácidos
orgánicos de cadena corta, durante las primeras etapas de descomposición de los
CO añadidos (Christ y Davies, 1996; Baziramakenga y Simard, 1998), la
20
responsable del incremento del proceso de disolución. En este caso se considera
que los mencionados ácidos suministran los H+ necesarios para el ataque de
fosfatos altamente insolubles tales como la RF (Fox et al., 1990; Gerke et al.,
2000). Es evidente que existe la posibilidad de que ambos fenómenos ocurran y
que el predominio de uno u otro dependerá de la combinación de suelo, clima y
CO incorporados, así como de las características de la roca utilizada. Existe, no
obstante otro enfoque, que no ha sido considerado, y es el hecho de que el
estiércol constituye un inóculo rico en un gran número de cepas bacterianas que
han sido señaladas como solubilizadoras de fósforo, tal es el caso de bacterias de
los géneros Bacillus y Xanthomonas (De Freitas et al., 1997; Sahn y Jana, 2000).
El fósforo en el sistema suelo-planta
El fósforo es un elemento ampliamente distribuido en la naturaleza y ocurre
conjuntamente con el nitrógeno y el potasio como constituyente primario de los
seres vivos, vegetales y animales. El fósforo posee una serie de funciones en el
metabolismo vegetal y es uno de los nutrientes esenciales requeridos para el
crecimiento y el desarrollo de las plantas. Desempeña funciones estructurales en
las macromoléculas como los ácidos nucleicos y de transferencia de la energía en
los procesos metabólicos de biosíntesis y degradación. A diferencia de los nitratos
y sulfatos, los fosfatos no son reducidos en la planta y permanecen en su forma
más altamente oxidada (Marschner, 1993).
El fósforo es absorbido principalmente durante el crecimiento vegetativo y luego la
mayoría del fósforo absorbido es movilizado a los frutos y semillas durante las
etapas reproductivas. Las plantas con deficiencias de fósforo tienen un
crecimiento retardado (reducción del crecimiento celular y de la expansión foliar
así como de la fotosíntesis y de la respiración) y a menudo presentan un color
verde oscuro (más alta concentración de clorofila) y rojizo (aumento de la
formación de antocianinas). Se ha indicado que el nivel de abastecimiento de
fósforo durante los estados reproductivos regula el fraccionamiento entre las hojas
21
y los órganos reproductivos, siendo este efecto esencial para las leguminosas
fijadoras de nitrógeno (Marschner, 1993). Los animales y los seres humanos en
buena salud requieren también cantidades adecuadas de fósforo en sus alimentos
para que sus procesos metabólicos sean normales (FAO, 1984, 1995).
Este elemento nutritivo es absorbido por las plantas a partir de la solución suelo
como aniones ortofosfato monovalente (H2PO4) y divalente (HPO4), cada uno
representando un 50 por ciento del fósforo total en la solución a un pH cercano a
la neutralidad (pH 6-7). A un pH entre 4 y 6, el anión ortofosfato monovalente
(H2PO4) representa casi el 100 por ciento del fósforo total en la solución. A un pH
8, el anión monovalente (H2PO4) constituye el 20 por ciento y el divalente (HPO4)
el 80 por ciento del fósforo total en la solución (Black, 1968).
La físico-química del fósforo en los suelos minerales es bastante compleja debido
a la ocurrencia de una serie de reacciones simultáneas e instantáneas tales como
solubilización, precipitación, adsorción (retención)/desorción y oxido-reducción.
Los compuestos solubles del fósforo presentan reactividad muy alta, solubilidad
baja y movilidad reducida. La mineralización e inmovilización son procesos
importantes del ciclo del fósforo en los suelos con alto contenido de materia
orgánica (Black, 1968; FAO, 1984).
Cuando se aplica al suelo un fertilizante fosfatado soluble en agua, este reacciona
rápidamente con los compuestos del suelo. Los productos resultantes son
compuestos de fósforo menos solubles y el fósforo que es adsorbido sobre las
partículas coloidales del suelo (FAO, 1984). Una pequeña concentración de
fósforo en la solución del suelo es por lo general adecuada para el desarrollo
normal de las plantas. Por ejemplo, Fox y Kamprath (1970) y Barber (1995) han
sugerido que una concentración de 0.2 ppm de fósforo es suficiente para un
crecimiento óptimo. Sin embargo, para que las plantas absorban las cantidades de
fósforo necesarias para producir buenos rendimientos, la concentración de fósforo
22
en la solución suelo que está en contacto con las raíces debe ser renovada
continuamente durante todo el ciclo de crecimiento.
2.2.3 Vermicomposta
La vermicultura es el cultivo de las lombrices, en donde la meta es incrementar
continuamente el número de lombrices para obtener una cosecha sustentable. El
vermicomposteo es el proceso por el cual las lombrices son usadas para convertir
materiales orgánicos (generalmente desechos) en un material parecido a humus
conocido como vermicomposta (Náfate, 2006). Una meta del proceso es que el
material sea producido tan rápida y eficientemente como sea posible. Estos
procesos son similares pero diferentes. Si lo que se desea es producir
vermicomposta, es necesario tener una densidad poblacional máxima de las
lombrices en todo el tiempo del proceso. Si la meta es producir lombrices, debe
mantener la densidad poblacional de las lombrices en niveles bajos de tal manera
que la tasa reproductiva sea optimizada (Mandujano, 2006).
La vermicomposta se considera uno de los abonos orgánicos de fácil adquisición,
manejo y producción rápida. Tiene buenas características físicas, químicas,
microbiológicas y nutrimentales, y su uso mejora la estructura del suelo, la
aireación, retención de agua, drenaje, y aumenta el intercambio iónico y
disponibilidad de fósforo. Por ello, se ha utilizado como fertilizante orgánico con
efectos favorables sobre el desarrollo de los cultivos hortícolas y las plantas
ornamentales en invernaderos (Náfate, 2006).
La vermicomposta es el producto de una serie de transformaciones bioquímicas y
microbiológicas que sufre la materia orgánica al pasar a través del tracto digestivo
de las lombrices; al utilizar este biofertilizante puede reducirse el uso de
fertilizantes químicos (Velasco et al., 2001).
23
La descomposición de la materia orgánica bajo condiciones ambientales variables
es una característica fundamental de los ecosistemas terrestres. En el caso del
vermicomposteo, las interacciones complejas entre residuos orgánicos,
microorganismos, lombrices y otros animales de la fauna del suelo provocan la
bioxidación y estabilización de dichos residuos. Una gran variedad de
microorganismos y organismos invertebrados del suelo proliferan e interactúan
contribuyendo al “ciclo de la materia” dentro del vermicomposteo. El sistema de
vermicomposteo soporta complejas cadenas alimenticias, y al mismo tiempo,
modifica diferentes formas químicas de diversos elementos nutritivos contenidos
en los compuestos orgánicos, los cuales son importantes para la dinámica de los
elementos nutritivos (Mandujano, 2006).
La vermicomposta o lombricompuesto, es un material de color oscuro, limpio,
suave al tacto, con un agradable olor a mantillo de bosque y debido a su
bioestabilidad no sufre de procesos de fermentación y putrefacción, contiene
además, una elevada carga enzimática y bacteriana que aumenta la solubilización
de los nutrientes haciendo que puedan ser fácilmente absorbidos por las raíces y
asimilables por las plantas evitando la lixiviación; con el agua de riego
manteniéndolos disponibles por más tiempo en el suelo e influye en forma efectiva
en la germinación de las semillas y en el desarrollo de las plantas, árboles y
arbustos en comparación con otros ejemplares de la misma edad (Náfate, 2006).
Incrementa la superficie activa de las partículas minerales favoreciendo la
capacidad de intercambio catiónico (CIC) de los suelos. Favorece e incrementa la
actividad biótica del suelo.
También se ha demostrado que provoca aumento en la biomasa, en la actividad
microbiana y modifica la estructura de la comunidad bacteriana, estimulando el
aumento de grupos bacterianos de acción favorable, que disminuyen el impacto de
fitopatógenos. Estos efectos en la comunidad varían según la materia prima
utilizada para elaborar la composta, el periodo de curado (tiempo transcurrido
24
luego de ser cosechada la composta) y la dosis de aplicación (Robledo et al.,
2010).
Su acción antibiótica aumenta la resistencia de las plantas en contra de plagas,
enfermedades y organismos patógenos. Se puede utilizar sin inconvenientes en
estado natural y se encuentra libre de nematodos. Los ácidos húmicos y fúlvicos
que contiene regeneran las características químicas del suelo y, al igual que cierto
tipo de hormonas de crecimiento, favorecen el desarrollo de las especies
vegetales. Posee un pH neutro. Mejora las características estructurales del
terreno, desliga suelos arcillosos y agrega suelos arenosos. Durante el transplante
previene enfermedades y evita el choque por heridas o cambios bruscos de
temperatura y humedad. Amortigua el efecto de los compuestos químicos
aplicados al suelo. Aumenta la retención hídrica de los suelos (4-27%)
disminuyendo el consumo de agua por los cultivos (Mandujano, 2006).
Neutraliza eventuales presencias contaminadoras (herbicidas, ésteres fosfóricos),
evita, facilita y aumenta la eficacia del trabajo mecánico del terreno, favorece e
incrementa la actividad biótica del suelo y aumenta la retención hídrica de los
suelos dismminuyendo el consumo de agua por los cultivos (Náfate, 2006).
La vermicomposta se caracteriza por estar conformada por materiales que facilitan
la aireación, drenaje y capacidad de retención de humedad. Además presentan
una gran área superficial, la cual le permite adsorber y retener fuertemente los
elementos nutritivos, los cuales se encuentran en formas que son fácilmente
asimilables para las plantas tales como los nitratos, el fósforo intercambiable,
potasio, calcio y magnesio solubles. En consecuencia, las vermicomposta pueden
tener un gran potencial en las industrias hortícolas y agrícolas como sustrato para
el crecimiento de la planta (Mandujano, 2006).
25
Papel de las lombrices en el vermicomposteo
Las lombrices de tierra son consumidores voraces de residuos orgánicos aun
cuando sólo utilizan una pequeña porción para la síntesis de sus cuerpos, ellas
excretan una gran parte de los residuos consumidos en una forma medio digerida.
Puesto que los intestinos de las lombrices contienen una amplia gama de
microorganismos, enzimas, hormonas, etc., éstos materiales medio diferidos se
descomponen rápidamente y son transformados a una forma de vermicomposta
en un período de tiempo corto (Mandujano, 2006).
Las familias de lombrices comúnmente utilizadas para realizar el vermicomposteo
son Eisenia foetida y Lumbricus rebellus. La crianza de estos animales requiere de
un esfuerzo mínimo por parte de quienes se interesan en su manejo y
reproducción, ya que, en ausencia de los riesgos que habitualmente enfrentan los
organismos dentro de sus hábitats naturales, estas lombrices crecen más rápido,
se mantienen más saludables, viven más tiempo, y se reproducen a una mayor
velocidad siempre y cuando las lombrices se coloquen sobre los materiales
requeridos para su óptimo desarrollo. La actividad de las lombrices transforma los
residuos orgánicos en una fuente nutritiva para las especies vegetales
(Mandujano, 2006).
2.3 Compuestos polifenólicos
Los fenoles son compuestos que se distribuyen ampliamente en el reino de las
plantas y son los metabolitos secundarios más abundantes de las plantas, con
más de 8,000 estructuras fenólicas actualmente conocidas, que van desde simples
moléculas tales como ácidos fenólicos hasta sustancias altamente polimerizadas
tales como taninos. Los fenoles vegetales son generalmente involucrados en la
defensa contra radiación ultravioleta o agresión por patógenos, parásitos y
predadores, así como contribuye a los colores de plantas (Dai y Mumper, 2010),
atracción de polinizadores (Nascimiento et al., 2013) e insectos para la dispersión
26
de semillas, pueden actuar como controladores de hormonas vegetales (Cartea et
al., 2011) y en el fortalecimiento de las paredes celulares de la planta durante el
crecimiento por polimerización en lignanos y ligninas (Ibrahim y Jaafar, 2012).
Están en todas partes en todos los órganos de la planta y son por lo tanto una
parte integral de la dieta humana (Dai y Mumper, 2010) y han sido reportados por
poseer múltiples efectos biológicos tales como antioxidante y actividad
antimicrobiana (Proestos y Komaitis, 2006). Los fenoles son constituyentes
generalizados de alimentos vegetales (frutas, verduras, cereales, aceites de oliva,
legumbres, chocolate, etc.) y bebidas (te, café, cerveza, vino, etc.) y parcialmente
responsables de las propiedades organolépticas globales de alimentos vegetales.
Por ejemplo, los fenoles contribuyen a la acidez y astringencia de fruta y jugos de
fruta, debido a la interacción entre fenoles, principalmente procianidina, y la
glicoproteína en saliva (Dai y Mumper, 2010).
Los fenoles son antioxidantes con propiedades redox, que les permiten actuar
como agentes reductores, donadores de hidrogeno (Proestos y Komaitis, 2006),
extintores de oxigeno singlete y triplete o descomponiendo peróxidos (Cartea et
al., 2011). También tienen propiedades de quelacion de metales. Los fenoles
vegetales incluyen ácidos fenoles, flavonoides, taninos y los menos comunes
estilbenos y lignanos (figura 2 y 3) (Dai y Mumper, 2010).
27
Figura 2. Estructura de flavonoides, ácidos fenólicos y taninos.
28
Figura 3. Estructuras de estilbenos y lignanos.
2.3.1 Estructura y clasificación de los compuestos polifenólicos
La estructura básica característica de los compuestos fenólicos es un anillo
aromático que porta uno o más grupos hidroxilo (figura 4). Los compuestos
fenólicos vegetales son clasificados como fenoles simples o polifenoles basado en
el número de unidades fenol en la molécula. Así, los fenoles vegetales
comprenden fenoles simples, cumarinas, ligninas, lignanos, taninos condensados
e hidrolizables, ácidos fenólicos y flavonoides (Khoddami et al., 2013).
Figura 4. Estructura básica de ácidos fenólicos y flavonoides (Khoddami et al.,
2013).
Los fenoles van desde simples, moléculas de bajo peso molecular, compuestos de
anillos aromáticos individuales a largos y complejos taninos y derivados
29
polifenoles. Se pueden clasificar en base al número y disposición de sus átomos
de carbono en flavonoides (flavonoles, flavonas, flavan-3-oles, antocianidinas,
flavanonas, isoflavonas y otros) y no flavonoides (ácidos fenólicos,
hidroxicinamatos, estilbenos y otros) y que comúnmente se encuentran
conjugados con azucares y ácidos orgánicos (Cartea et al., 2011).
Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos están caracterizados
por un núcleo bencénico que lleva uno o varios grupos hidroxilos, es decir, están
formados por un esqueleto carbonado C6-C3; esta denominación abarca a los
ácidos fenólicos, que a su vez se dividen en ácidos benzoicos (ácido gálico) (C6-
C1) y ácidos cinámicos (ácidos cinámico, caféico y cumárico) quienes portan una
cadena lateral insaturada (C6-C3), pero también incluyen a otros derivados
fenólicos como estilbenos (Figura 5). La reactividad de este tipo de molécula es
debida tanto a la presencia de la función fenol que, por la movilidad de su átomo
de hidrógeno, presenta un carácter ácido, como al núcleo bencénico que puede
sufrir substituciones electrófilas (Flanzy, 2003).
Pueden estar también en formas conjugadas (glucósidos) con uno o más restos de
azúcares unidos a grupos hidroxilo o directamente al anillo aromático; forma más
común de hallar a esta clase de compuestos. Los azúcares asociados a los
polifenoles pueden ser monosacáridos, disacáridos o incluso oligosacáridos. Los
azúcares más comunes son la glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa, xilosa y
ácidos glucorónico y galacturónico. Aunque también pueden encontrarse unidos a
ácidos carboxílicos o ácidos orgánicos (ácidos fenil-acéticos), aminas, lípidos y a
otros compuestos fenólicos (Hernández, 2013).
30
Figura 5. Ácidos fenólicos: benzoicos (hidroxibenzoicos), cinámicos
(hidroxicinámicos) y derivados (Estilbenos) (Hernández, 2013).
Flavo proviene del latín flavus y significa de color entre amarillo y rojo, como el de
la miel o el del oro; y flavonoide, se refiere a un grupo aromático, pigmentos
heterocíclicos que contienen oxígeno ampliamente distribuido entre las plantas,
constituyendo la mayoría de los colores amarillo, rojo y azul de las plantas y frutas
(Jiménez et al., 2009). Los flavonoides son metabolitos secundarios, cuya
concentración en las plantas depende, en gran medida, del estado en que ésta se
encuentre y de las condiciones climatológicas (Escalona et al., 2001). Son los más
numerosos de los fenoles y se encuentran en todo el reino vegetal. Están
presentes en altas concentraciones en la epidermis de las hojas y frutos, y tienen
papeles importantes y variados como metabolitos secundarios (Cartea et al.,
2011).
Los flavonoides absorben muy fuertemente la luz UVB y se consideran, que
pueden jugar un papel muy importante en la prevención de daños en los tejidos de
las hojas por las radiaciones ultravioleta sirviendo de defensa a las plantas. Ellos
son reproducidos relativamente en grandes cantidades en las plantas y tienen
efectos significativos en la composición de los suelos después de separar el
vegetal de su medio de desarrollo (Márquez y García, 2007). Además participan
en los procesos de estimulación de nódulos fijadores de nitrógeno y resistencia a
enfermedades (Cartea et al., 2011).
La estructura básica del flavonoide es el núcleo flavano, que contiene 15 átomos
de carbono organizados en 3 anillos (C6-C3-C6), los cuales son designados como
31
A, B y C (Dai y Mumper, 2010), los tres anillos consistentes en dos centros
aromáticos (Anillos A y B) y un heterociclo oxigenado central (anillo C), y están
típicamente conjugados a azúcares (Gutiérrez, 2002).
Los flavonoides se dividen en 6 subgrupos: flavonas, flavonoles, flavanoles,
flavanonas, isoflavonas y antocianinas, conforme al estado de oxidación del anillo
central. Su variación estructural en cada subgrupo se debe en parte al grado y
patrón de hidroxilación, metoxilación, prenilacion o glicosilacion. Algunos de los
flavonoides más comunes incluyen la quercetina, un flavonol abundante en la
cebolla, brócoli y manzana, catequina, un flavanol encontrado en el té y severas
frutas; naringenina la principal flavanona en la toronja; cianidina-glucósido, una
antocianina abundante en bayas (grosella negra, frambuesa, zarzamora, etc.); y
daidzeína, genistenía, gliciteina, las principales isoflavonas en soya (Dai y
Mumper, 2010).
La capacidad antioxidante de los flavonoides está relacionada con el número y
posición de los grupos hidroxilo en la molécula; un incremento en el número de
grupos hidroxilos conduce a una mayor actividad antioxidante. Los compuestos
con tres grupos hidroxilo en el anillo B de los flavonoides tienen una alta actividad
antioxidante. La pérdida de un grupo hidroxilo decrece la actividad ligeramente,
mientras que la pérdida de dos grupos hidroxilo decrece significativamente la
actividad. Además, la glicosilación resulta en una baja actividad antioxidante para
algunos flavonoides tales como quercetina, la adición de una fracción de azúcar
disminuye la actividad de la aglicona y la adición de una segunda fracción decrece
más la actividad, probablemente debido al impedimento estérico por la adición de
fracciones de azúcar (Cartea et al., 2011).
32
2.4 Síntesis de compuestos polifenólicos
Los compuestos fenólicos son sintetizados en plantas principalmente en respuesta
a presiones ecológicas y fisiológicas como ataque de patógenos e insectos,
radiación UV e hiriendo (Khoddami et al., 2013). Entre ellos la irradiación
(densidad de flujo de fotones fotosintética, PFFD; 400-700nm) es conocido que
regula no solo el crecimiento y desarrollo de la planta, sino también la biosíntesis
de ambos metabolitos primarios y secundarios (Ibrahim y Jaafar, 2012).
Los fenoles son metabolitos secundarios basados en el carbono, primariamente
producidos a través de la ruta de las pentosas fosfato (PPP), fenilpropanoide y
rutas del ácido shikímico. La PPP proporciona el precursor oxidativo eritrosa-4-
fostato para la vía de shikimato. Esta ruta convierte estos fosfatos de azúcar en
amino ácidos aromáticos tales como fenilalanina, el cual se convierte en el
precursor para la ruta de fenilpropanoides que sintetiza polifenoles (Ibrahim y
Jaafar, 2012).
La enzima fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) cataliza la conversión de fenilalanina
en ácido trans-cinámico, causando de este modo el flujo de metabolitos primarios
en metabolitos secundarios en la ruta de fenoles. La actividad de PAL y otras
enzimas fenilpropanoides son principalmente reguladas por síntesis del novo
(Ibrahim y Jaafar, 2012).
La síntesis de los flavonoides tiene lugar en las plantas a partir de unidades
acetato y aminoácidos aromáticos como la fenilalanina y tirosina. Después, estas
dos últimas, dan lugar a los ácidos cinámico y parahidroxicinámico; siendo que al
condensarse con las unidades de acetato dan origen a la estructura cinamol de los
flavonoides. Más tarde se forman los derivados glicosilados o sulfatados (Jiménez
et al., 2009).
33
La biosíntesis de los flavonoides comienza cuando la fenilalanina, por acción de la
enzima fenilalanina amonioliasa (PAL) se transforma en ácido cinámico, que luego
es transformado en ácido p-cumarínico por incorporación de un grupo hidroxilo a
nivel del anillo aromático y la acción de una CoA ligasa lo transforma en cumaril-
SCoA, el precursor de la mayoría de los fenoles de origen vegetal, entre los que
se encuentran los flavonoides.
El primer paso de la ruta metabólica es catalizada por la chalcona sintetasa (CHS),
en donde tres moléculas de malonil-CoA y una molécula de p-cumaril-CoA son
condensadas para generar una tetrahidroxichalcona. En ciertas especies, la
acción coordinada de CHS y una enzima reductasa dependiente de NADPH
generan una 6-desoxichalcona. Ambas chalconas pueden entonces ser
convertidas en auronas, una subclase de flavonoides encontrada en ciertas
especies de plantas. El siguiente paso compartido por la mayoría de las rutas de
biosíntesis de flavonoides es catalizada por la chalconas isomerasa (CHI), que
cataliza una reacción estereoespecifica de ciclación de un anillo para formar
flavanonas, naringenina y liquirigenina. Las flavanonas pueden representar el
punto más importante en el metabolismo de flavonoides porque la isomerización
de estos compuestos produce fitoalexinas isoflavonoides; la introducción de
dobles enlaces en C2-C3 produce flavonas y flavonoles y la hidroxilación en la
posición 3 genera dihidroflavonoles. La entrada a la rama de los isoflavonoides
ocurre por la vía de dos enzimas, la primera la isoflavona sintetasa (IFS) que
cataliza una migración inusual del aril de C2 a C3 y la segunda, que es una enzima
dependiente de NADPH y de citocromo P450, causando una hidroxilación que da 2-
hidroxiflavonas. La deshidratación de la 2-hidroxi isoflavanona, catalizada por la 2-
hidroxi isoflavanona deshidratasa (IFD) forma los isoflavonoides genisteína y
daidzeina.
El segundo punto en el metabolismo general de flavonoides implica la
deshidratación de naringenina en la posición C2-C3 que produce abundantes
34
flavonoides tales como apigenina. Esta conversión es catalizada por la enzima
flavona sintetasa (FNS) y varía según la especie.
El tercer punto importante es la hidroxilación estereoespecifica en la posición 3 de
la naringenina y el eriodictiol produciendo dihidroflavonoles como dihidrokaemferol
y dihidroquercetina respectivamente. La enzima involucrada es la flavanona 3
hidroxilasa (FHT) que es una dioxigenasa dependiente de Fe2+ y de 2-
oxoglutarato. Los dihidroflavonoles, convertidos a flavonoles (kaemferol y
quercetina) por la flavonol sintetasa (FLS) catalizan la formación del doble enlace
en C2-C3, la FLS es una dioxigenasa dependiente de α-cetoglutarato.
Alternativamente, los dihidroflavonoles pueden ser reducidos por una
dihidroflavonol reductasa (DFR) que nos da los correspondientes 3, 4 flavandioles
los cuales son los sustratos para la biosíntesis de antocianinas y taninos (Abadía,
2007) (Figura 6).
35
Figura 6. Clasificación de flavonoides (Mierziak et al., 2014).
36
2.5 Determinación de compuestos polifenólicos
El aislamiento de antioxidantes de un material vegetal puede llevarse a cabo
utilizando diferentes técnicas y solventes debido a la diversidad de la naturaleza
química de estos componentes y a menudo de distribución única de estos
compuestos en la matriz de la planta. Entre ellos la extracción es la técnica más
frecuentemente usada para recuperar los antioxidantes de la planta (Anwar y
Przybylski, 2012).
Los pasos más importantes para el análisis de compuestos fenólicos son la
preparación de muestra y la extracción, seguido por la clasificación y
cuantificación utilizando métodos de espectrofotometría, cromatografía de gas
(GC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o electroforesis capilar
(CE) (Khoddami et al., 2013).
2.5.1 Preparación de la muestra
La preparación y la extracción de compuestos fenólicos a partir de su amplia gama
de muestras dependen en su mayoría de la naturaleza de la matriz de la muestra y
de las propiedades químicas de los fenoles, incluyendo la estructura molecular,
polaridad, concentración, numero de anillos aromáticos y grupos hidroxilo. La
variación en la química de los fenoles en una muestra está relacionada con la
concentración de compuestos polifenólicos simples y complejos y las diferentes
proporciones de ácidos fenólicos, flavonoides, antocianinas y proantocianinas
(entre otros). Por lo tanto, es difícil elegir un solo método de preparación y
extracción de fenoles para muchos productos vegetales.
Los complejos con proteínas, carbohidratos u otros elementos que dificultan la
extracción completa de algunos fenoles. Para algunas técnicas de preparación, las
muestras de plantas necesitan ser secadas utilizando secado por congelación,
37
secado por aire o secado en horno. Por ejemplo, Sejali y Anuar, (2001) indicaron
que cantidades más altas de fenoles pueden ser extraídas en secado por aire en
sombra en la hoja neem que muestras secadas por horno (Khoddami et al., 2013).
Generalmente, el secado por congelación retiene altos niveles de contenido
fenólico en muestras de planta que el secado al aire. Sin embargo, los procesos
de secado, incluyendo el secado por congelación, pueden causar efectos
indeseables en los perfiles constituyentes de las muestras vegetales, por lo tanto,
se debe tener cuidado en la planificación y el análisis de los estudios de
investigación en las propiedades de las plantas (Dai y Mumper, 2010).
Las muestras secas son molidas o pulverizadas para obtener cierto tamaño de
partícula, mientras que las muestras liquidas son tratadas por centrifugación,
filtración y purificación usando un sistema de separación cuando se requiere. Los
rendimientos de extracción más altos de fenoles son conseguidos por la molienda
de la muestra en tamaños de partículas más pequeñas, lo que mejora la acción
enzimática y la extracción. Los procesos desengrasantes pueden ser aplicados
para eliminar el aceite de las muestras que contienen lípidos. Por ejemplo,
Weidner et al., (2012) desengrasa las semillas pulverizadas de la uva para
simplificar la extracción de fenoles utilizando hexano. En general, la molienda en
tamaño de partícula pequeño (en combinación con el secado y el desengrasado
en su caso) se aconseja para la preparación de muestra más completa antes de la
extracción (Khoddami et al., 2013).
2.5.2 Extracción
Los fenoles se pueden extraer de muestras de plantas frescas, congeladas o
secas. Usualmente antes de extraer las muestras vegetales son tratadas por
molienda, rectificado y homogenización, la cual puede ser precedida por secado al
aire o secado por congelación.
38
Las extracciones de solventes son los procedimientos más comúnmente usados
para preparar extractos de plantas debido a su fácil uso, eficiencia, y amplia
aplicabilidad. Es generalmente conocido que el rendimiento de la extracción
química depende del tipo de solvente con diferentes polaridades, tiempo de
extracción y temperatura, relación muestra-solvente, así como de las
composiciones químicas y físicas características de las muestras. La solubilidad
de fenoles es regida por la naturaleza química de la muestra vegetal, así como de
la polaridad de los solventes utilizados. Los materiales vegetales pueden contener
compuestos fenólicos variando desde simples (por ejemplo, ácidos fenólicos,
antocianinas) a sustancias altamente polimerizadas (por ejemplo, taninos) en
diferentes cantidades. Por otra parte, los fenoles pueden también ser asociados
con otros componentes vegetales tales como carbohidratos y proteínas. Por lo
tanto, no hay procedimiento de extracción universal adecuado para la extracción
de todos los fenoles vegetales. Dependiendo del sistema de solvente utilizado
durante la extracción, una mezcla de fenoles solubles en el solvente deberá ser
extraída del material vegetal. También puede contener algunas substancias no
fenólicas como azúcar, ácidos orgánicos y grasas. Como resultado, adicional a los
pasos puede ser requerido eliminar esos componentes no deseados.
Los solventes, como metanol, etanol, acetona, acetato de etilo, y sus
combinaciones se han utilizado para la extracción de fenoles de materiales
vegetales, a menudo con diferentes proporciones de agua. La selección del
solvente adecuado afecta la cantidad y velocidad de extracción de polifenoles. En
particular, el metanol ha sido generalmente encontrado ser más eficiente en la
extracción de polifenoles de bajo peso molecular mientras los flavonoides de
mayor peso molecular son mejor extraídos con acetona acuosa. El etanol es otro
buen solvente para extracción de polifenoles y es seguro para el consumo
humano.
En la preparación de extractos fenólicos ricos de antocianina de materiales
vegetales, un solvente orgánico acidificado, más comúnmente usado es el metanol
39
y etanol. Este sistema de solvente desnaturaliza las membranas celulares,
simultáneamente disuelve las antocianinas, y las estabiliza. Sin embargo, se debe
tener cuidado para evitar la adición de exceso de ácido lo cual puede hidrolizar
lábiles, acilos, y residuos de azúcar durante las etapas de concentración. Para
obtener el mejor rendimiento de extracción de antocianinas, ácidos orgánicos
débiles, tales como ácido fórmico, acético, cítrico, tartárico y fosfórico, y bajas
concentraciones de ácidos fuertes, tales como 0,5-3,0% de ácido trifluoroacético y
<1,0% de ácido clorhídrico se recomiendan. Además el agua sulfurada también ha
sido utilizada como solvente de extracción en la búsqueda de una reducción de
uso de solventes orgánicos así como el costo de extracción. La recuperación de
compuestos fenólicos de materiales vegetales también es influenciada por el
tiempo de extracción y la temperatura, la cual refleja las acciones conflictivas de
solubilización y la degradación del analito por oxidación. Un incremento en la
temperatura de extracción puede promover mayor solubilidad del analito mediante
el incremento de solubilidad y velocidad de trasferencia de masas. Además, la
viscosidad y la tención superficial de los solventes disminuyen en altas
temperaturas, lo cual ayuda al solvente para alcanzar las matrices de la muestra,
mejorando la tasa de extracción. Sin embargo, muchos compuestos fenólicos se
hidrolizan y oxidan fácilmente. Los largos tiempos de extracción y alta temperatura
incrementan la posibilidad de oxidación de fenoles lo cual disminuye el
rendimiento de fenoles en los extractos. Por ejemplo, la extracción convencional y
la concentración de antocianinas se realiza típicamente a temperaturas que
oscilan de 20 a 50 °C, porque temperaturas >70°C han mostrado que causan la
degradación rápida de antocianina. Por lo tanto, es de importancia crítica para
seleccionar el procedimiento/método de extracción eficiente y mantener la
estabilidad de los compuestos fenólicos. Los métodos de extracción convencional
tales como la maceración y extracción de soxhlet han mostrado baja eficiencia y
potencial de contaminación del medio ambiente, debido a los grandes volúmenes
de solvente orgánico utilizado y de largo tiempo de extracción requerida en estos
métodos. Un número de métodos se han desarrollado en años recientes tales
como microondas, extracción asistida por ultrasonido, y técnicas basadas en el
40
uso de fluidos comprimidos como agentes de extracción, tales como extracción de
agua subcrítica (SWE), extracción de fluido supercrítico (SFE), extracción de fluido
presurizado (PFE) o extracción con solvente acelerado (ASE) fueron también
aplicados en la extracción de compuestos fenoles de materiales vegetales.
La extracción de compuestos fenólicos de materiales vegetales también puede ser
influenciada por otros factores tales como la relación solvente-sólido y el tamaño
de partícula de la muestra. El aumento de la relación solvente-solido fue
encontrado que trabaja positivamente para mejorar los rendimientos de fenoles.
Sin embargo, un equilibrio entre el uso de relaciones altas y bajas de solvente-
sólido, involucra un equilibrio entre el alto costo y desechos de solventes y evitar
los efectos de saturación, respectivamente, ha de ser encontrado para obtener de
un valor optimizado. Bajando el tamaño de partícula también mejora el rendimiento
de compuestos fenólicos. Para aumentar la liberación de límite de fenoles, un
número de procedimientos enzimáticos que involucran el uso de varias mezclas
pectinolíticas y preparaciones enzimáticas degradadores de polisacáridos de
pared celular en extracción de fenoles se ha descrito. El tamaño de partícula de
las muestras trituradas se encontró que era un factor principal para aumentar la
acción enzimática y la eficiencia de la extracción de compuestos fenólicos de
muestras en estas extracciones de enzimas asistida (Dai y Mumper, 2010).
2.5.3 Análisis y cuantificación de fenoles
Los fenoles naturales son de interés desde muchos puntos de vista (antioxidantes,
astringencia, amargura, reacciones de pardeamiento, etc.). La selección de la
estrategia analítica apropiada para el estudio de fenoles en materia vegetal
depende del propósito del estudio, así como de la naturaleza de la muestra y el
analito. Los ensayos utilizados para el análisis de fenoles son generalmente
clasificados ya sea como contenido de fenoles totales, la cuantificación de un
grupo o clase específica de compuestos fenólicos. La cuantificación de
41
compuestos fenólicos en el extracto vegetal es influenciada por la naturaleza
química del analito, así como el método de ensayo, la selección de las normas y la
presencia de sustancias interferentes.
Debido a la heterogeneidad de los fenoles naturales y la posible interferencia de
otras sustancias fácilmente oxidables en los materiales vegetales, no es
sorprendente que tengan varios métodos utilizados para la determinación de
fenoles totales y ninguno es perfecto. Entre tales métodos están los métodos
Folin-Denis (FD), método Folin-Ciocalteu (F-C), titulación permanganato,
colorimetría con sales de hierro, y absorbancia ultravioleta. En la mayoría de los
casos, F-C ha sido encontrado preferible en comparación con los otros métodos.
El ensayo F-C se basa en la transferencia de electrones en medio alcalino de
compuestos fenoles a complejos de ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico para
formar complejos azules (posiblemente (PMoW11O40)4-) que son determinados
espectrofotométricamente en aproximadamente 760nm. El ácido gálico es
ampliamente utilizado como el estándar de comparación y los valores
generalmente son comparados como miligramos de ácido gálico equivalente por
kilogramo o litro de extracto entre muestras. Debido a la naturaleza general de la
química del F-C, es de hecho una medida de fenoles totales y otros substratos de
oxidación. El otro sustrato de oxidación presente en un extracto de muestra dada
puede interferir la medición de fenoles totales en una manera de inhibición, aditiva
o de mejora. Los efectos inhibidores podrían ser debido a los de los oxidantes que
compiten con el reactivo F-C y/o la oxidación del aire después de que la muestra
se hizo alcalina. Por esta razón, el reactivo F-C es agregado antes de
alcalinizarse. Los efectos aditivos se producen de fenoles imprevistos, aminas
aromáticas, altos niveles de azúcar o ácido ascórbico en la muestra. Los efectos
aditivos se pueden medir antes de añadir el álcali o por un ensayo más específicos
de una interferencia conocida y después restar del valor del F-C. Los sulfatos y
dióxido de azufre que es un aditivo común para el vino pueden causar efectos de
mejora. Sin embargo, a pesar de estas desventajas, el ensayo F-C es simple y
42
reproducible y ha estado ampliamente utilizado para la cuantificación de
compuestos fenólicos en materiales vegetales y extractos.
En general, los tradicionales ensayos espectrofotométricos proporcionan métodos
simples y rápidos de detección para cuantificar las clases de compuestos fenólicos
en muestras vegetales crudas. Sin embargo, debido a la complejidad de los
fenoles vegetales y diferente reactividad de fenoles hacia reactivos de ensayo, un
amplio espectro de métodos es usado para el ensayo de componentes, dando
lugar a resultados diferentes y a menudo no comparables.
Dada la existencia intrínseca de dobles enlaces conjugados y aromáticos, cada
fenol exhibe una absorción mayor o menor en ultravioleta (UV) o región
ultravioleta/visible (UV/VIS). Por lo tanto, los medios más comunes de detección,
junto a la cromatografía liquida (LC), son los de UV/VIS, matriz de fotodiodos
(PDA), y detectores de fluorescencia UV. El PDA es el método más frecuente ya
que permite el escaneo en tiempo real del espectro UV/VIS de todos los solutos
que pasan a través del detector, dando más información de los compuestos en
mezclas complejas tales como un extracto vegetal crudo. Otros métodos
empleados para la detección de compuestos fenólicos incluyen detección
electroquímica (ECD), la técnica voltametría, técnica de voltametría en línea
conectada a PDA y la matriz de detección electro (EAD), las técnicas de detección
de reacciones químicas, espectrofotometría de masa (MS) y la resonancia
magnética nuclear (NMR) de detección. Las detecciones MS y NMR son más de
confirmación de estructura que métodos de cuantificación.
Las técnicas de electromigración incluyendo electroforesis capilar (CE),
electroforesis de zona capilar (CZE), y cromatografía electrocinética micelar
acoplada con UV, y en menor medida la detección EC y MS son también
empleadas para el análisis de fenoles (Dai y Mumper, 2010).
43
2.5.4 Análisis y cuantificación de flavonoides
Los flavonoides son compuestos altamente bioactivos encontrados tanto en
plantas comestibles y no comestibles. Son a menudo extraídos con metanol,
etanol, acetona, agua o mesclas de estos solventes usando métodos de
extracción de reflujo caliente (Khoddami et al., 2013).
El método colorimétrico con tricloruro de aluminio (AlCl3) y el de 2,4-
Dinitrofenilhidrazina (2,4NFH) han sido utilizados para la determinación
complementaria de flavonoides. El tricloruro de aluminio forma complejos ácidos
estables con el grupo ceto en C-4 o en grupos hidroxil libres en C-3 o C-5 de
flavonas y flavonoles, y aunque también puede reaccionar con el grupo hidroxilo
C-5 de flavanonas, las absorbencias de los complejos generados son casi
insignificantes. Además, el tricloruro forma complejos ácido-lábiles con los grupos
orto-dihidroxilo en los anillos A o B de los flavonoides; estos complejos muestran
un máximo de absorbencia entre 415-440 nm; producto del efecto batocrómico del
complejo con tricloruro de aluminio.
Los flavonoides en general poseen una coloración amarilla, cuya intensidad está
relacionada al pH de la solución; mientras más básica sea ésta, la coloración será
más intensa; característica que se aprovecha en su determinación. Una
característica de los flavonoides que es de gran utilidad en su análisis, es la
presencia del anillo aromático. Este es un excelente cromóforo, y por consiguiente,
absorbe en la región UV del espectro electromagnético, proveyéndonos de valiosa
información estructural, con lo que se distingue el tipo de fenol y grado de
oxidación en su estructura (Andersen y Markham, 2006).
44
2.6 Radicales libres
Un radical libre tiene un electrón desapareado que es producido por la radiación o
es un sub-producto de los procesos metabólicos. Ellos empiezan a desintegrar las
membranas celulares y compuestos celulares por daño a los componentes de la
biomembrana como lípidos, proteínas y ADN interno y decrece la fluidez de
membrana.
Dos especies de estos radicales libres son las especies reactivas de oxigeno
(ROS) como el anión superoxido (O2·), el hidroxilo (OH·), el hidroperóxilo (OOH·),
peroxilo (ROO·), alcoxilo (RO·), los radicales no libres son el peróxido de
hidrógeno (H2O2), ácido hipocloroso (HOCl), ozono (O3), oxigeno singlete (1O2) y
especies reactivas de nitrógeno (RNS) similar a un óxido nítrico (NO·), peroxinitrito
(ONOO·), dióxido de nitrógeno (NO2) (Tajalli, 2014).
Los RNS son comúnmente generados en compartimentos sub-celulares tales
como los gránulos secretores que contienen peroxidasa de neutrófilos y
eosinófilos, la mitocondria y el retículo endoplásmico endotelial y células del
musculo liso, y la vasculatura. En condiciones fisiologías, las células producen
ROS a través del transporte de electrones mitocondrial de la respiración aeróbica.
A bajos niveles, ROS son bien tolerados por las células gracias a sistemas de
desintoxicación enzimática como las superóxido dimutasas (SOD) y glutatión S-
transferasa, que neutraliza los radicales libres. Bajo contextos patológicos (por
ejemplo, durante la inflamación sostenida), ROS alcanza altas concentraciones y
se convierte toxico, lo que afecta el metabolismo celular por cualquiera de las
oxidaciones directas de macromoléculas o después se combinar con el NO para
generar RNS (Sanctis et al., 2014).
Las especies reactivas del oxígeno, derivados de los procesos de oxidación, son
una importante parte de los mecanismos de defensa contra la infección, pero la
generación excesiva de radicales libres de oxigeno puede dañar el tejido. Cuando
hay un desequilibrio entre ROS y mecanismos de defensa antioxidante, las ROS
45
llevan a la modificación oxidativa en las membranas celulares o moléculas
intracelulares y dar lugar a la peroxidación de los lípidos de membrana, lo que
lleva a la acumulación de peróxidos de lípidos.
2.6.1 Antioxidantes
Los antioxidantes son agentes y moléculas que pueden reducir y limitar el daño
oxidativo a estructuras biológicas por eliminación de radicales libres, neutralizando
los perjudiciales radicales libres ROS y RNS que pueden atacar las células y evitar
daño a células vivas, proteínas, enzimas, DNA, daños en alimentos, carbohidratos
y también degradar materiales como la goma, gasolina y aceite lubricante. Ellos
rompen las reacciones en cadena a través de la eliminación de radicales libres e
inhibe otras reacciones de oxidación. Además estos se clasifican en dos clases
principales enzimáticas y no enzimáticas (Tajalli, 2014).
El sistema enzimático antioxidante endógeno es importante para proteger al
organismo contra altas concentraciones de ROS. Este sistema está compuesto
principalmente por las enzimas superoxido dimutasa (SOD), catalasa (CAT), y
peroxidasas (POD) (Zhang et al., 2014).
Los antioxidantes no enzimáticos consisten en compuestos nutrientes y no
nutrientes. Algunos antioxidantes no nutrientes como el glutatión y la coenzima Q
son principalmente de origen endógeno, mientras que la mayoría de los tipos de
nutrientes y no nutrientes de antioxidantes no enzimáticos se derivan de los
alimentos que consumimos.
Mientras que las vitaminas como la vitamina A, tales como C, tales como E y
minerales tales como zinc y selenio son algunos de los nutrientes importantes con
actividad antioxidante (AOA), hay una variedad de substancias no nutritivas tales
como carotenoides, flavonoides, fenoles, polifenoles y ácido úrico que son
46
potentes antioxidantes. Hay muchos más componentes menores en alimentos
vegetales, tales como sulfuros, tioles, saponinas, lignanos e inositol, que tienen
excelente actividad antioxidante (Saxena et al., 2007).
Totalmente, las plantas y animales se protegen ellos mismos por un complejo
sistema de múltiples antioxidantes, tales como glutatión, tocoferoles, carotenoides,
ácido ascórbico, flavonoides y taninos, y vitamina E junto con algunas enzimas
como catalasa, superóxido dimutasa y varios peróxidasas. Por otra parte, hay
antioxidantes sintéticos tales como el hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol
butilado (BHA), terbutilhidroquinona y esteres de ácido gálico los cuales son
usados en la industria de alimentos y otros materiales que provocan efectos
negativos para la salud (Tajalli, 2014).
2.6.2 Pruebas utilizadas para detectar y cuantificar antioxidantes en
extractos vegetales
Para evaluar la actividad antioxidante de plantas y vegetales primero es necesario
realizar una extracción de los compuestos presentes. Existen diversos métodos
para obtener tales compuestos, desde una simple maceración hasta la utilización
de fluidos súper críticos y ultrasonido; no obstante, independientemente de la
técnica utilizada, el primer paso de separación estará basado en la destrucción
celular para extraer el compuesto de interés, y en la compatibilidad de polaridades
entre el compuesto a extraer y la solución a usar como solvente, es decir, se
utilizan soluciones polares para extraer compuestos hidrófilos y solventes apolares
para los compuestos hidrófobos.
Entre las pruebas químicas que se utilizan para la detección y cuantificación de
antioxidantes destacan las siguientes:
47
Actividad antioxidante usando el radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH). Se
evalúa la capacidad que presenta el extracto para neutralizar o ceder un electrón
al radical DPPH. (Para determinar la eficacia que tendrá el extracto para detener
una reacción en cadena formada a partir de un radical libre) (Aguirre-Joya et al.,
2012). Se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) la
cual se atribuye a la deslocalización del electrón desapareado, esta
deslocalización también le otorga una coloración violeta caracterizada por una
banda de absorción, en solución etanólica, centrada alrededor de 520 nm 3.
Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que puede
donar un átomo de hidrógeno o con otra especie radical (R.) se produce la forma
reducida DPPH-H ó DPPH-R con la consecuente pérdida del color y por lo tanto la
pérdida de la absorbancia (Molyneux, 2004).
Reducción del hierro. La prueba está basada en la capacidad del extracto para
reducir el complejo férrico 2,4,6-tripiridil-s-triazina (Fe3+ -TPTZ) a su forma ferrosa
(Fe2+ -TPTZ). La capacidad de reducir los metales es importante debido a que
estos están involucrados en los procesos de propagación de la cadena radicalaria
extendiendo el proceso de daño celular en el organismo.
Contenido polifenólico total. Los polifenoles son unos de los compuestos
antioxidantes más importantes en la naturaleza, tanto por su acción como por su
abundancia, por lo que su medición es ampliamente utilizada. Esta prueba se
realiza agregando reactivo de Folin-Ciocalteau para dar lugar a una reacción
colorimétrica que puede ser medida mediante espectroscopia; la relación se
compara con una curva de calibración que se realiza con un polifenol conocido
(generalmente ácido galico o catequina) y se extrapolan los datos. Así mismo se
pueden caracterizar los antioxidantes presentes en las plantas por sistemas como
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
48
Dosis efectiva media (DE50). La dosis efectiva media o concentración efectiva
media (DE50) se refiere a la concentración mínima requerida para inhibir la
actividad radicalaria en el 50% de la población (Aguirre-Joya et al., 2012).
49
3. JUSTIFICACIÓN
Se escogió la zarzamora porque es una planta cuyo fruto posee una excelente
fuente de vitaminas; en especial de A y C, además de contener compuestos
fenólicos, convirtiéndolo en una buena fuente de antioxidantes. Debido a la
pérdida de hojas ocasionada por la poda que recibe la planta para la temporada
de fructificación, el trabajo desea conocer si existe mayor crecimiento de la planta
y presencia de compuestos fenólicos en las hojas por la adición de los
biofertilizantes, para incrementar su valor comercial, debido a que tales
compuestos han sido reportados por poseer propiedades antioxidantes.
Debido al interés en el cultivo de zarzamora por la identificación de metabolitos
secundarios de alto valor agregado, es necesario dar a conocer a los agricultores
que existen varias alternativas de cultivo distintas a lo tradicional, ya que el empleo
de fertilizantes químicos erosiona el suelo. Por lo que es necesario sustituir y
promover el uso de biofertilizantes, ya que algunos de estos pueden ser
producidos por los mismos agricultores o adquirirlos a bajos costos.
Las principales justificantes científicas es que no se tienen reportes del uso de
vermicomposta, roca fosfórica y hongo micorrízico arbuscular, en el efecto que
estos biofertilizantes pueden tener sobre el crecimiento de la planta y la
producción de metabolitos secundarios tales como compuestos fenólicos; entre
ellos flavonoides y su actividad antiradicar en las hojas de zarzamora (Rubus sp.),
ya que se desean utilizar en la actualidad en la industria de alimentos para su
conservación, debido a que los antioxidades artificiales empleados en la
actualidad tienen a causar efectos perjudiciales a la salud como son el
hidroxitolueno butilado (BHT) e hidroxianisol butilado (BHA) que son comúnmente
utilizados en alimentos procesados, los cuales han sido reportados por causar
inducción de daño al DNA y ser cancerígenos. Además de la presión ejercida por
los consumidores en la actualidad por ser proveídos de productos saludables.
Agregando que son compuestos utilizados en la medicina para tratar
50
enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas, cáncer y poseer efecto
antidiarreico, antiviral, antialérgica, entre otros.
51
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General:
Evaluar el efecto de la roca fosfórica, vermicomposta y hongo micorrízico sobre el
crecimiento, concentración de compuestos fenólicos y flavonoides, y la actividad
antiradical de las hojas de zarzamora (Rubus sp.).
4.2 Objetivos específicos:
Analizar el efecto del hongo micorrízico, la roca fosfórica y la
vermicomposta; sobre la altura y diámetro del tallo de la planta de
zarzamora (Rubus sp.).
Inferir la concentración de fenoles en los extractos metanólicos de las
hojas de zarzamora (Rubus sp.) biofertilizadas con roca fosfórica,
vermicomposta y hongo micorrízico.
Inferir la concentración de flavonoides en los extractos metanólicos de
las hojas de zarzamora (Rubus sp.) biofertilizadas con roca fosfórica,
vermicomposta y hongo micorrízico.
Evaluar la capacidad antiradical de los extractos metanólicos de las
hojas de zarzamora (Rubus sp).
52
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 MATERIALES
5.1.1 Plantas de zarzamora
Las 160 plantas de zarzamora se obtuvieron de una plantación de zarzamora
ubicada en la autopista a Coatzacoalcos Km. 184, perteneciente al municipio de
Berriozábal, Chiapas entre los paralelos 16°43’ y 17°20’ de latitud norte y los
meridianos 93°12’ y 93°26’ de longitud oeste, con un clima cálido subhúmedo con
lluvias en verano. La zona de experimentación fue en la empresa Luanda planta
de vermicomposta, ubicada en el Km 10.5 carretera Ocozocoautla – Villaflores,
Chiapas, con 16°40’44 de latitud norte y 93°24’47 de longitud oeste.
5.1.2 Hongo micorrízico arbuscular
Glomus mosseae fue obtenido de la colección microbiana del Cinvestav-Irapuato
(México) (León et al., 2011).
5.1.3 Roca fosfórica
La roca fosfórica fue obtenida de una compañía con el nombre de Calizas
Industrializadas de Hidalgo S. A. de C.V., México. Con una densidad de 1700g/cc,
soluble en agua, utilizado por su alto contenido en fósforo.
5.1.4 Vermicomposta
La vermicomposta fue obtenida en la empresa Luanda, planta de vermicomposta,
ubicada en Km 10.5 carretera Ocozocoautla – Villaflores, Chiapas. Con las
características del compost de lombriz con un pH de 8.25, una conductividad
eléctrica 1,44 dS m-1, la capacidad de intercambio catiónico (CIC) de 98.6 kg-1
cmol, fósforo total 341,4 mg kg-1, fósforo extraíble 472 mg kg-1, la materia orgánica
20,17% y el nitrógeno total 132 mg kg -1. La densidad aparente fue 0,69 g mL-1, la
concentración de ácido húmico 4,34% y la concentración de ácido fúlvico 3,99%
53
del contenido total de C de la vermicomposta. El humus de proporción de ácidos
fúlvicos fue de 1,08 (León et al., 2011).
5.2 METODOLOGÍA
5.2.1 Siembra de las plantas de zarzamora y diseño experimental
El diseño experimental se llevó acabo en el software estadístico Minitab 16;
consistió en tres factores: roca fosfórica, vermicomposta, y hongo micorrízico
arbuscular, 8 tratamientos de forma aleatorizada para disminuir los factores ruido,
veinte repetición, dos niveles (testigo y variables independientes), dando como
resultado el uso de 160 plantas para la investigación. De manera aleatoria se
designaron 8 tratamientos; tomando al azar y el orden quedo de la manera
siguiente:
1. Hongo micorrízico arbuscular (HMA)
2. Roca fosfórica (RF)
3. Vermicomposta (V)
4. HMA + RF + V
5. HMA + RF
6. HMA + V
7. V + RF
8. Testigo
Estos tratamientos se anotaron en papelitos se colocaron en una tómbola y se
designó el orden de los 4 bloques al azar. Cada bloque tiene 40 plantas y la
aplicación de los tratamientos fue de la siguiente manera.
Bloque 1: 4, 8, 6, 1, 7, 2, 3, 5
Bloque 2: 5, 4, 1, 7, 2, 6, 3, 8
Bloque 3: 6, 5, 4, 7, 8, 1, 3, 2
Bloque 4: 1, 7, 4, 8, 2, 5, 3, 6
54
Las cantidades de fertilizantes orgánicos se pesaron en balanza analítica en el
laboratorio de Biología Molecular del Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez,
Chiapas. Se pesaron 80 bolsas con 1 g de roca fosfórica, 80 bolsas con 10 g de
vermicomposta, y 80 bolsas con 1 g de hongo micorrízico arbuscular.
5.2.2 Análisis de la altura y diámetro de la planta
Para la evaluación de la altura se utilizó un flexómetro y para la determinación del
diámetro del tallo por medio de un vernier. Las mediciones se realizaron en un
periodo de cinco meses.
5.2.3 Obtención de extracto metanólicos
Para la recolección de las muestras, se descartó cualquier hoja que estuviera
maltratada, seca o contaminada con algún tipo de microorganismo. El material
vegetal recolectado fue secado bajo sombra a temperatura ambiente,
posteriormente se trituro empleando un molino eléctrico hasta obtener un polvo
fino. Los extractos crudos se obtuvieron pesando 1 gramo de cada muestra
vegetal y se adicionan 20 mL de metanol, posteriormente se sometió a una
sonicación en baño maría durante 2 horas controlando la temperatura con hielo.
Las muestras se centrifugaron a 4000 rpm a 10º C durante 20 minutos. El extracto
crudo se concentró en un rotaevaporador (Buchi) y se resuspendio en 2 mL de
metanol. Los extractos se almacenaron a -18º C.
5.2.4 Cuantificación de fenoles totales
El análisis del contenido polifenólico total se determinó de acuerdo al método
colorimétrico de Folin Ciocalteau (Singleton et al., 1999), diluyendo el extracto
metanolico a una concentración de 1:50, empleando ácido gálico como estándar.
Una alícuota de 50 μL de muestra se transfirió a un tubo de ensaye junto a 2.1 mL
de agua y 250 μL del reactivo de Folin Ciocalteau (2N). La mezcla se agitó
55
vigorosamente durante 1 minuto para luego agregar 500 μL de una solución
acuosa de carbonato de sodio al 20% y 2.1 mL de agua destilada. La mezcla se
dejó en reposo cubierto de la luz durante 2 horas, para luego leer su absorbencia
a 765 nm en un espectrofotómetro. Los resultados se expresaron como mg
equivalentes de ácido gálico por gramo de hoja seca de zarzamora (mg EAG/g)
empleando una curva estándar de ácido gálico de 0.0 a 1000 mg·mL-1 (ANEXO I).
5.2.5 Cuantificación de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinó mediante el método colorimétrico del
tricloruro de aluminio (Chang et al., 2002) diluyendo el extracto metanolico a una
concentración de 1:50, empleando quercetina como estándar. Una alícuota de 250
μL de muestra se mezcla con 750 μL de EtOH al 95% y 50 μL de tricloruro de
aluminio (AlCl3 6·H2O) al 10%, luego de agitar se agregaron 50 μL de acetato de
potasio 1M y 1.4 mL de agua destilada. La mezcla se dejó en reposo cubierto de la
luz durante 30 minutos para luego medir su absorbencia a 415 nm en un
espectrofotómetro. El volumen de tricloruro de aluminio se reemplazó por agua
destilada en la preparación del blanco. Los resultados se expresaron como mg
equivalentes de quercetina por gramo de hoja seca de zarzamora (mg EQ/g)
empleando una curva estándar de quercetina de 0.0 a 100 ug·mL-1 (ANEXO II).
5.2.6 Actividad antirradical mediante el radical DPPH (1,1-Difenil-2-picril-
hidrazilo)
La actividad antiradical de los extractos se determinó en términos de la habilidad
de donar hidrógeno o de atrapar radicales utilizando el radical estable DPPH· (1,1-
difenil-2-picril-hidrazilo) de acuerdo a la metodología empleada por Mensor et al.,
(2001), empleando ácido gálico como testigo. A 2.5 mL de muestra a diferentes
concentraciones (0.1, 0.15, 0.25, 0.35, 0.45, 0.5 µg/mL) se adicionaron 1 mL de
una solución etanólica de DPPH (0.3 mM), luego de 30 minutos de reacción se
leyó la absorbencia a 518 nm en un espectrofotómetro que se calibro con etanol y
56
se convirtió en porcentaje de actividad antiradicar (AA) usando la siguiente
formula:
𝐴𝐴% = 100 − {[(𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜) × 100]
𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙}
El blanco fue una de solución de extracto de 2.5 mL más 1 mL de etanol. Una
solución de DPPH (1 mL; 0.3 mM) con etanol (2.5 mL) fue usada como control
negativo. El control positivo fueron las soluciones estándar. El experimento se
llevó a cabo en una habitación con iluminación tenue y temperatura ambiente (~25
°C). Los resultados se expresaron como índice de concentración media (IC50
[ug/ml]). Se empleó una curva de actividad antiradical con ácido gálico como
comparación de la efectividad de los extractos metanolicos de 0.0 a 100 ug·mL-1
(ANEXO II).
5.2.7 Análisis estadístico
Los resultados obtenidos se analizaron para determinar si existen diferencias
significativas entre tratamientos y variables evaluadas, realizándose un análisis de
varianza y la prueba de comparación de medidas de DMS (Diferencia Mínima
Significativa) para las variables registradas. El análisis estadístico se realizó con el
programa SAS System para Windows 7 en lo correspondiente a altura y diámetro
del tallo, en el caso de la concentración de compuestos fenólicos, flavonoides y
actividad antiradical se utilizó el statgraphic.
57
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Factores de crecimiento
6.1.1 Altura de tallo
La altura de las plantas obtenidas durante los cinco meses de evaluación se
muestra en el cuadro 2. Los resultados fueron analizados estadísticamente con un
ANOVA (p<0.05) y se observó que la biofertilización empleada no tuvo efecto
estadístico significativo. Durante los primeros dos meses las plantas biofertilizadas
con la mezcla de HMA, RF y vermicomposta (tratamiento 4) promovieron una
mayor altura del tallo, mientras que el tratamiento 7 (V + RF) en el cuál no está
presente el HMA se observó que la altura del tallo fue menor. Este
comportamiento se puede atribuir a que el HMA facilita la incorporación y
asimilación de los nutrientes en la planta.
Bagyaraj et al. (2015), menciona que los hongos micorrízicos arbusculares
mejoran el crecimiento de las plantas, lo que se atribuye principalmente a la
facilitación de la llegada de nutrientes a la planta de elementos como P, Zn, Cu,
etc. en el suelo. Además en el mismo estudio Bagyaraj et al. (2015), discute que el
fosforo es el segundo elemento más importante en el crecimiento de las plantas,
en especial en forma de roca fosfórica, puesto que las plantas lo requieren
principalmente en las primeras etapas de crecimiento para un cultivo óptimo. En
cuanto a la vermicomposta; Duran y Enríquez (2010), mencionan que el aporte de
N y C al suelo puede ser muy significativo y favorece la humificación, además de
N y C también aporta otros elementos como P, Ca, Mg y K.
En el tercer mes, la altura de planta fue de 34.22 cm en promedio y de acuerdo al
ANOVA (p<0.05) no hay diferencia estadística significativa entre los tratamientos
(Cuadro 2).
58
Durante los últimos dos meses la roca fosfórica (tratamiento 2) fue el tratamiento
que promovió mayor altura. Este efecto se atribuye a que el fosforo se mantiene
en la concentración adecuada para un óptimo crecimiento. Según Ramírez (2006),
el proceso de liberación del P de la roca fosfórica es lento, por lo que su efecto en
la planta se observa de manera tardía. Además Fox y Kamprath (1970) y Barber
(1995) mencionan que la concentración de fosforo suficiente para alcanzar un
crecimiento optimo en las plantas es de 0.2 ppm. Además, si se considera que las
plantas sólo fueron biofertilizadas al momento del trasplante en suelo, es posible
que los nutrientes provenientes de la vermicomposta se hayan agotado durante
este tiempo y por ende la acción del HMA también se haya visto disminuida.
También se observó que a partir del 4 mes de monitoreo, la presencia de HMA en
los tratamientos tenía un efecto negativo en el crecimiento de la planta,
posiblemente porque el HMA en ese tiempo ya desempeñaba una función
parasitaria en la planta en lugar de una actividad simbiótica, en donde el HMA
consume nutrientes provenientes de la planta. Seguel (2014), menciona que los
HMA reciben compuestos carbonados provenientes de la fotosíntesis de la planta,
necesarios para su metabolismo por tratarse de un simbionte obligado.
59
Cuadro 2. Efectos de los tratamientos en la altura de las plantas de zarzamora en
diferentes etapas de crecimiento.
Altura de las plantas (cm.)
Tratamiento Primer mes Segundo mes Tercer mes Cuarto mes Quinto mes
1. HMA 27.9 ± 6.3 ab 29.4 ± 6.8 ab 35.8 ± 10.5 a 68.7 ± 17.9 ab 96.7 ± 18.1 ab
2. RF 27.4 ± 10.2 ab 30.6 ± 10.3 a 36.1 ± 9.5 a 70.4 ± 16.7 a 105.5 ± 17.3 a
3. V 25.2 ± 8.9 ab 27.4 ± 6.4 ab 32.3 ± 8.5 a 62.6 ± 12.7 ab 91.4 ± 11.7 b
4.HMA + RF + V 30.2 ± 8.6 a 32.0 ± 8.4 a 35.6 ± 8.1 a 65.0 ± 14.5 ab 93.7 ± 16.5 b
5. HMA + RF 29.0 ±6.6 ab 28.6 ± 7.2 ab 32.9 ± 11.2 a 59.9 ± 13.6 b 98.2 ± 18.8 ab
6. HMA+V 29.0 ± 9.5 ab 31.5 ± 10.7 a 36.4 ± 11.1 a 63.6 ± 12.9 ab 94.1 ± 11.5 b
7. V + RF 24.2 ± 9.9 b 24.4 ± 6.9 b 30.6 ± 10.2 a 64.7 ± 18.7 ab 95.5 ± 20.4 ab
8.TESTIGO 27.0 ± 7.9 ab 28.5 ± 7.9 ab 34.1 ± 11.8 a 68.5 ± 11.6 ab 97.9 ± 17.5 ab
DMS (0.05) 5.4 5.1 6.4 9.4 10.5
Letras iguales dentro de una misma columna denotan que no existió diferencia estadística
significativa entre los tratamientos (P<0.05).
HMA, hongo micorrízico arbuscular; RF, roca fosfórica; V, vermicomposta; DMS, diferencia mínima
significativa.
6.1.3 Diámetro del tallo
El diámetro del tallo de las plantas durante los cinco meses se muestra en el
cuadro 3. El ANOVA realizado mostró que la biofertilización aplicada no tuvo
efecto estadístico significativo en el diámetro del tallo. Durante los primeros dos
meses las plantas suministradas con el tratamiento de HMA con roca fosfórica
(tratamiento 5) promovieron mayor diámetro del tallo.
Esto es ocasionado al igual que en la altura, por la presencia del HMA debido a
que las plantas con mayor crecimiento fueron suministradas con él, además de la
adición de otro biofertilizante ya sea vermicomposta o roca fosfórica que
proporciona nutrientes para la planta. Por lo que, el HMA promovió a la planta
60
mayor absorción de nutrientes y la roca fosfórica aporto el fosforo necesario para
el crecimiento de la planta.
Treseder (2013), menciona que el HMA facilita el crecimiento de muchas plantas
por mejoramiento de adquisición de nutrientes sólidos. Además Fateh et al.
(2011), menciona que el fosforo es el segundo fertilizante mineral más influyente
para el crecimiento vegetal. Y Ali et al. (2012), menciona que la aplicación de
fosforo promueve características de crecimiento como la altura y diámetro de tallo.
En el tercer mes, el diámetro de la planta fue de 0.53 cm en promedio y de
acuerdo al ANOVA (p<0.05) no hay diferencia estadística significativa entre los
tratamientos (cuadro 3).
Durante el cuarto mes la roca fosfórica (tratamiento 2) fue el tratamiento que
promovió mayor diámetro del tallo. Probablemente ocasionado a que en etapas
tardías la roca fosfórica tiene mejor efecto entre los tratamientos suministrados,
debido a que el fosforo se mantiene en la cantidad adecuada para su crecimiento
y la planta necesita cierta concentración de fosforo para un crecimiento óptimo,
ocasionado por una menor consumo debido a la falta de un medio que facilite su
absorción o porque el fosforo en la roca empezó a consumirse.
Como ha reportado Ramírez (2006), donde menciona que el proceso de liberación
del P de la roca fosfórica es lento.
En el quinto mes, el diámetro de la planta fue de 1.33 cm en promedio y de
acuerdo al ANOVA (p<0.05) no hay diferencia estadística significativa entre los
tratamientos (Cuadro 3).
61
Cuadro 3. Efectos de los tratamientos en el diámetro del tallo de las plantas de
zarzamora en diferentes etapas de crecimiento.
Diámetro del tallo de las plantas (cm.)
Tratamiento Primer mes Segundo mes Tercer mes Cuarto mes Quinto mes
1. HMA 0.42 ± 0.09 b 0.45 ± 0.11 b 0.51 ± 0.14 a 1.06 ± 0.36 ab 1.34 ± 0.37 a
2. RF 0.42 ± 0.09 b 0.48 ± 0.09 ab 0.57 ± 0.12 a 1.10 ± 0.27 a 1.44 ± 0.35 a
3. V 0.41 ± 0.08 b 0.45 ± 0.09 b 0.51 ± 0.15 a 1.00 ± 0.24 ab 1.38 ± 0.35 a
4.HMA + RF + V 0.46 ± 0.12 ab 0.47 ± 0.13 ab 0.52 ± 0.14 a 0.92 ± 0.25 b 1.37 ± 0.34 a
5. HMA + RF 0.51 ± 0.14 a 0.54 ± 0.17 a 0.58 ± 0.19 a 1.03 ± 0.24 ab 1.34 ± 0.28 a
6. HMA+V 0.46 ± 0.11 ab 0.50 ± 0.13 ab 0.55 ± 0.14 a 0.91 ± 0.23 b 1.26 ± 0.20 a
7. V + RF 0.44 ± 0.09 b 0.47 ± 0.16 ab 0.51 ± 0.16 a 0.9 ± 0.18 b 1.26 ± 0.23 a
8.TESTIGO 0.46 ± 0.10 ab 0.46 ± 0.08 ab 0.52 ± 0.1 a 0.95 ± 0.27 ab 1.32 ± 0.31 a
DMS (0.05) 0.06 0.08 0.09 0.16 0.19
Letras iguales dentro de una misma columna denotan que no existió diferencia estadística
significativa entre los tratamientos (P<0.05).
HMA, hongo micorrízico arbuscular; RF, roca fosfórica; V, vermicomposta; DMS diferencia mínima
significativa.
6.2 Fenoles y flavonoides
En el cuadro 4 se presentan los resultados de fenoles y flavonoides totales de las
hojas de la planta de zarzamora biofertilizadas con diferentes abonos. Se observó
que los tratamientos con HMA, HMA con roca fosfórica, HMA con roca fosfórica y
vermicomposta, roca fosfórica y vermicomposta (tratamientos 1, 2, 3, 5 y 7) no
presentaron diferencia estadística significativa en comparación al HMA con
vermicomposta, el testigo y la vermicomposta con roca fosfórica (tratamientos 4, 6
y 8).
Respecto a los fenoles totales en las hojas de las plantas de zarzamora, el
tratamiento que presento una mayor síntesis de compuestos fenólicos en
comparación con el testigo fue el HMA con vermicomposta (tratamiento 4). El
62
resultado se podría explicar por un mayor porcentaje de la raíz colonizada por el
HMA.
Pérez (1998), menciona que el HMA provoca un aumento de absorción de fosforo
y otros nutrimentos así como el agua, debido a la existencia de raíces largas. Lo
cual es favorecido por la presencia de la vermicomposta, ya que Treseder (2013),
comenta que algunos factores que afectan la existencia de raíces largas es la
disponibilidad de nutrientes y la humedad del suelo. Y Náfate (2006), reporto que
la vermicomposta aumenta la retención de agua y la disponibilidad de fosforo,
además contiene una elevada carga enzimática y bacteriana que aumenta la
solubilización de los nutrientes haciendo que puedan ser fácilmente absorbidos
por las raíces y asimilables por las plantas evitando la lixiviación. Asimismo Fateh
et al. (2011), menciona que la vermicomposta contiene nitrógeno y fosforo, los
cuales son los fertilizantes minerales más influyentes para el crecimiento vegetal.
Otro factor podría ser la presencia de ácidos húmicos y fúlvicos, ya que
Mandujano (2006), menciona que favorecen el desarrollo de las especies
vegetales. La más baja concentración de fenoles se obtuvo con vermicomposta y
roca fosfórica (tratamiento 8). Esta baja concentración posiblemente fue
ocasionada porque la roca fosfórica promueve el crecimiento de la planta y no la
estimulación de compuestos fenólicos, debido a que el fosforo es un elemento
esencial en el crecimiento de la planta, siendo un componente requerido para
ácidos nucleicos y fosfolípidos, además de ser fundamental en la transferencia y
almacenamiento de energía (Rotaru y Sinclair, 2009). Estos resultados muestran
que el HMA con vermicomposta causó un incremento en la síntesis de fenoles, sin
embargo la roca fosfórica con roca fosfórica causó el efecto contrario.
En cuanto a la razón por la cual el testigo presento una mayor cantidad de
compuestos fenólicos en comparación con el resto de los tratamientos, podría ser
ocasionado porque los tratamientos le proporcionaron un ambiente adecuado para
su desarrollo, por lo que no presento la necesidad de sintetizar dichos
63
compuestos, debido a que los fenoles vegetales son generalmente involucrados
en la defensa contra radiación ultravioleta o agresión por patógenos, parásitos y
predadores (Dai y Mumper, 2010).
En flavonoides totales (cuadro 4) los tratamientos que no presentaron diferencia
estadística significativa fueron el HMA, HMA con roca fosfórica y vermicomposta,
HMA con vermicomposta, roca fosfórica y vermicomposta con roca fosfórica
(tratamientos 1, 3, 4, 5, y 8), presentando diferencia estadística significativa el
HMA con RF (tratamiento 2), cuyas muestras fueron las que tuvieron menos
contenido de flavonoides, posiblemente por la asimilación de fosforo de la planta,
debido a que el HMA incrementa su absorción y a la roca fosfórica que le
proporciona una mayor cantidad de fosforo.
Ya que se ha encontrado con Malu’sa et al. (2006), reportes donde muestran que
la deficiencia de fosforo induce a un incremento en el contenido de antocianina, en
cultivos de células de tabaco los niveles de fenoles totales incrementan
sustancialmente cuando el medio se agota de fosforo y en investigaciones previas
se ha reportado un incremento sigmoidal de fenoles asociado con el tiempo de
inanición de fosforo.
Esto podría ser ocasionado al rol de protección y promoción del desarrollo de
micorrizas e interacción con bacterias fijadoras de nitrógeno y al tener un estado
adecuado de nutrientes la planta no se ve en la necesidad de sintetizar
metabolitos como flavonoides, que le proporcionen mayor disponibilidad de
nutrientes o relaciones con otros organismos para dicho fin, por lo que el testigo
(tratamiento 6) fue el tratamiento con mayor cantidad de fenoles y la
vermicomposta (tratamiento 7), que resulto el segundo tratamiento con menos
contenido de flavonoides en las hojas. Debido a que la baja producción de
flavonoides en el tratamiento de vermicomposta podría ser ocasionada por el
contenido de fosforo y nitrógeno que posee la vermicomposta.
Como menciona Mierziak et al. (2014), donde encontraron que bajas
concentraciones de nitrógeno solido induce a la acumulación de flavonoides, la
64
cual actúa como atrayentes para diazótrofos, lo que resulta en el transporte de las
formas de nitrógeno reducido a las células vegetales.
Cuadro 4. Datos de fenoles totales y flavonoides totales de las hojas de la planta
de zarzamora.
Fenoles totales (mg EAG g-1) Flavonoides totales (mg EQ g-1)
Tratamiento
1. HMA 42.50 ± 1.43 cd 6.89 ± 0.25 bc
2. HMA+RF 43.55 ± 2.77 cd 5.62 ± 0.44 d
3. HMA+RF+V 45.12 ± 0.12 bc 7.52 ± 0.49 ab
4. HMA+V 58.16 ± 3.83 a 7.65 ± 0.34 ab
5. RF 41.86 ± 2.45 cd 6.98 ± 0.02 abc
6. T 50.32 ± 2.90 b 7.83 ± 0.66 a
7. V 46.45 ± 6.16 bc 5.88 ± 1.02 d
8. V+RF 37.10 ± 2.03 d 6.38 ± 0.35 cd
DMS (0.05) 5.73 0.91
Letras iguales dentro de una misma columna denotan que no existió diferencia
estadística significativa entre los tratamientos (P<0.05).
HMA, hongo micorrízico arbuscular; RF, roca fosfórica; V, vermicomposta; DMS,
diferencia mínima significativa.
6.3 Actividad antiradical
Como se observó anteriormente en los resultados de fenoles totales el tratamiento
de HMA + V fue el más alto (cuadro 4), por lo cual se hubiera podido suponer que
estaría correlacionado con una mayor actividad antiradical al contener una mayor
cantidad de compuestos fenólicos, sin embargo esto no sucedió. Los efectos
ejercidos por los tratamientos en las hojas de zarzamora en cuanto a la actividad
antiradical en el tratamiento más alto, más bajo y el testigo no mostraron diferencia
estadística mínima significativa (cuadro 5). Esto podría ser ocasionado porque la
65
actividad antiradical no solo depende de la cantidad de compuestos capaces de
neutralizar los radicales libres, sino también de la calidad de estos.
Como menciona Cartea et al. 2011, donde encontraron que la capacidad
antioxidante de los flavonoides está relacionada con el número y posición de los
grupos hidroxilo en la molécula, además de las glicosilaciones que presenta.
También se observó una mayor actividad antiradical de los extractos metanólicos
en comparación con el ácido gálico (2.1 µg/ml), probablemente ocasionado por
una mayor presencia de compuestos con mayor actividad antiradical en las hojas
de zarzamora (cuadro 5).
Cuadro 5. Efectos de los tratamientos en la actividad antiradical de las hojas de la
planta de zarzamora.
Tratamiento Promedio IC50 (µg/ml)
1. HMA + V 0.082 ± 0.006 a
2. RF + V 0.076 ± 0.004 a
3. Testigo 0.072 ± 0.009 a
DMS (0.05) 0.013
Ácido gálico 2.1
Letras iguales dentro de una misma columna denotan que no existió diferencia
estadística significativa entre los tratamientos (P<0.05).
HMA, hongo micorrízico arbuscular; RF, roca fosfórica; V, vermicomposta; DMS,
diferencia mínima significativa; IC50, índice de concentración media.
66
7. CONCLUSIONES
Con base en los resultados obtenidos se puede concluir lo siguiente:
Las plantas de zarzamora suministradas con vermicomposta, hongo micorrízico
arbuscular y roca fosfórica no tuvieron efecto estadístico significativo sobre la
altura y diámetro del tallo. Sin embargo la roca fosfórica de forma individual
promovió mayor altura y diámetro del tallo en comparación con los otros
tratamientos.
Respecto a la concentración de fenoles, el tratamiento con hongo micorrízico
arbuscular (HMA) y vermicomposta (V) promueve la síntesis de compuestos
fenólicos en las hojas de la planta de zarzamora.
En cuanto a la concentración de flavonoides, los tratamientos aplicados no
promueven la síntesis de flavonoides en las hojas de la planta de zarzamora.
Respecto a la actividad antiradical, los extractos metanólicos de las hojas de
zarzamora no mostraron una correlación positiva entre el contenido de fenoles y
flavonoides, sin embargo su actividad antiradical los perfila como una alternativa
de interés para su uso como antioxidante natural.
67
8. RECOMENDACIONES
La experiencia obtenida durante el desarrollo de este trabajo de investigación,
aunada a la literatura revisada durante el mismo proceso, permite dar las
siguientes recomendaciones:
Para poder conocer el porcentaje en que afecta los tratamientos la colonización
del HMA a la raíz sería de gran interés realizar una medición de HMA en las raíces
de las plantas y a su vez poder reafirmar la conclusión propuesta en el trabajo
respecto a los compuestos fenólicos.
Debido a la relación en deficiencias de fosforo y nitrógeno de la planta con la
cantidad de compuestos fenólicos en la misma, sería útil conocer la proporción,
por lo cual se sugiere que se proceda a realizar una cuantificación del fosforo y
nitrógeno de las plantas, con el fin de obtener un relación y confirmar los
resultados obtenidos, o bien una evaluación de las enzimas principalmente
involucradas en la síntesis de los fenoles y flavonoides, con el fin de identificar si
la concentración de fosforo tiende a afectar dichas enzimas.
En la actividad antiradical la sugerencia de una cromatografía es muy aconsejada
para poder analizar la composición de fenoles y flavonoides, y posteriormente
evaluar el perfil de dichos metabolitos con la actividad antiradical que presentan.
68
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77
Anexos
ANEXO I. Curva estándar de ácido gálico (Método de Folin Ciocalteau):
Cuantificación de Fenoles Totales.
ANEXO II. Curva estándar de Quercetina (Método de tricloruro de aluminio):
Cuantificación de flavonoides.
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0.900
1.000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Ab
so
rban
cia
(765n
m)
Concentración (mg/mL)
Curva Estándar: Acido gálico
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
Ab
sorb
anci
a (4
15
nm
)
Concentración(mg/mL)
Curva Estándar: Quercetina
y = 0.8716x
R² = 0.9887
y = 3.8351x
R² = 0.9824
78
ANEXO III. Curva de actividad antiradical de ácido gálico (Método de Actividad
antirradical mediante el radical DPPH): Cuantificación de actividad antirradical.
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
0 1 2 3 4 5 6
AA
%
Concentración (µg/mL)
Curva actividad antiradical: Acido gálico