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Jornada Práctica
Determinación deHuevos de Helmintos en Aguas
según método Bailengermodificado por la OMS
Meritxell Mas
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Introducción
•Toma de muestras:
• Objetivos
• Tipos de muestras
• Control y vigilancia
• Punto de muestreo
• Medidas de seguridad
• Volumen de muestra
• Materiales y equipos
• Muestreo
• Etiquetado
• Transporte y conservación
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Introducción
•Técnica analítica:
• Selección del método
• Equipos y material
• Reactivos
• Concentración por sedimentación
• Concentración por centrifugación
• Concentración por método difásico
• Concentración por flotación
• Observación
• Identificación
• Artefactos
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TOMA DE MUESTRAS
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Toma de muestrasObjetivos
• Obtener una muestra de agua que sea representativa del agua que queremos ensayar.
• La muestra debe ser suficientemente pequeña para poder ser transportada y manipulada con facilidad en el laboratorio.
• El personal encargado de la toma de muestras debe garantizar la validez e integridad de la toma de muestra, de su transporte y su conservación.
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Toma de muestrasTipos de muestras
• Muestras simples: Muestras tomadas en un lugar y momento determinados para su posterior análisis individual.
• Muestras compuestas: Muestras formadas por varias muestras simples tomadas en un lugar determinado y en tiempos distintos, las cuales se mezclan y homogenizan.
• Muestras integradas: Muestras formadas por varias muestras simples tomadas simultáneamente en distintos lugares, las cuales se mezclan y se homogenizan.
Para el análisis de huevos de helmintos pueden tomarse muestras simples o compuestas
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Toma de muestrasControl y vigilancia
• Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:• El laboratorio debe disponer de un plan de muestreo que incluya:
• Objetivo• Antecedentes• Tipo de muestreo• Ubicación y descripción del sitio de muestreo• Medio de transporte• Personal• Lista de verificación de materiales, reactivos y equipos• Plan de seguridad• Control de calidad
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Toma de muestrasControl y vigilancia
• Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:• El muestreo debe estar debidamente documentado y debe ser
trazable.• El control del muestreo debe incluir:
• Recipientes para el muestreo• Reactivos y equipos necesarios• Condiciones de toma de la muestra• Preservación• Codificación• Transporte• Entrega de la muestra al laboratorio
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Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Identificar la muestra con la etiqueta
correspondiente
•Sellar la muestra con cinta adhesiva para evitar adulteraciones
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Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Elaborar un libro de campo donde anotar todas las observaciones
que procedan durante el muestreo
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Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Establecer un registro de control y vigilancia de la muestra
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Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Acompañar la muestra con una solicitud del análisis• Entrega de la muestra al laboratorio en el menor tiempo posible• Registrar la recepción de la muestra en el laboratorio
Laboratorio
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Toma de muestrasPunto de muestreo
• Consideraciones generales:• Punto de muestreo accesible• Posibles fuentes de contaminación• Caudal• Velocidad de la corriente
En general, tomar las muestras en zonas de mayor turbulencia o en el centro de la corriente
MUESTRA REPRESENTATIVA
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Toma de muestrasPunto de muestreo
• Tipo de masa de agua:• Embalse• Lago natural• Lago artificial• Balsa• Río• Efluente tratamiento secundario EDAR• Efluente tratamiento terciario EDAR• Industrial:
• Tipo de industria• Tratamientos aplicados• Posibles contaminantes
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Toma de muestrasPunto de muestreo
• Tipo de agua:• Agua corriente• Agua estancada superficial• Agua estancada de profundidad
• Uso al que se va a destinar (RD 1620/2007):• Urbano• Agrícola• Industrial• Recreativo• Ambiental
Medidas de seguridadEquipos y materiales necesarios
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Toma de muestrasMedidas de seguridad
• El personal debe recibir formación e información sobre las medidas de seguridad y del uso de equipamiento adecuado.
•Si procede, debe recibir la inmunizaciónapropiada y someterse a un examen médicopara verificar que la actividad no supone riesgo para él ni para sus compañeros.
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Toma de muestrasMedidas de seguridad
• Es recomendable que el personal vaya acompañado cuando la zona de muestreo se considere de riesgo e informar a otros de la ubicación del punto de muestreo.
•Debe disponer de radio o teléfono, y de un botiquín de primeros auxilios, así como de un plan de emergencia.
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Toma de muestrasMedidas de seguridad
• Deben usarse los equipos necesariosque garanticen la seguridad del personal, y una vez finalizada la toma de muestras, deshacerse de los residuos generadosde forma adecuada (papel secante, guantes desechables…), lavarse bien las manos y desinfectar.
•Está prohibido comer, beber o fumardurante el muestreo.
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Toma de muestrasMedidas de seguridad
• Equipo obligatorio:• Ropa cómoda• Bata• Guantes• Gafas de protección• Mascarilla con válvula• Calzado antideslizante
• Otros equipos/accesorios:• Casco de seguridad• Lámparas (muestreo nocturno)• Detector de gases• Arnés de seguridad
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Toma de muestrasVolumen de muestra
• Según RD 162072007, la técnica de referencia para el análisis de huevos de helmintos en aguas és el método Bailenger modificado por Bouhoum & Schwartzbrod (OMS, 1989), que dispone que el volumen inicial de muestra es de:
• 1 litro para aguas residuales crudas o parcialmente tratadas• 10 litros para aguas tratadas
• La Agencia de Protección Ambiental (EPA) establece para lodos de clase A:
• Huevos de helmintos viables: < 1 huevo 7 4 gramos de SST
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Toma de muestrasMateriales y equipos
• Envases de polietileno, con paredes lisas
• Etiquetas de identificación de la muestra
• Rotulador resistente al agua
• Cinta adhesiva para precintar la muestra
• Formol 4% si se requiere fijar la muestra
• Neveras para transporte a 4ºC
• Documentos que deben acompañar la muestra
10 L 1 L
4ºC
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Toma de muestrasMuestreo
• Consideraciones previas:
• Lavar el recipiente con detergente (Tween al 80% o Tritón X-100) o con lejía.
• Enjuagar varias veces con agua destilada o desionizada.
• Antes de tomar la muestra, lavar varias veces con el agua que seva a muestrear (algunos autores consideran que para análisis de huevos de helmintos no es necesario).
• En caso de que no se pueda tomar las muestras directamente, se pueden tomar con muestreadores, cubeta y cuerda, o con una botella Van Dorn.
Van Dorn
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Toma de muestrasMuestreo
• Muestreo en descarga libre:
• Colocar el recipiente directamente en el chorro de agua, destaparlo, dejar que se llene hasta el volumen deseado y tapar sacándolo del chorro.
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Toma de muestrasMuestreo
• Muestreo en canales y colectores:
• Introducir el recipiente cerrado entre 15 y 30 cm de profundidadprocurando que la abertura esté a contracorriente del canal. Destapar y llenar hasta el volumen deseado. Cerrar y extraer.
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Toma de muestrasEtiquetado
• Tomada la muestra:
• Se sella
• Se colocan las etiquetas identificativas
• Se rellena el cuaderno de campo y los documentos pertinentes
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Toma de muestrasTransporte y conservación
• Muestras de agua:
• Transporte en neveras a 4ºC.
• Conservación a temperatura ambiente y sin fijar: hasta 4 días desde de la toma de muestras.
• Conservación refrigeradas a 4ºC en oscuridad: hasta 6 meses desde de la toma de muestras.
• Fijadas con formaldehído al 4%: hasta 6 meses desde la toma de muestras.
• Muestras de lodo:
• Transporte en neveras a 4ºC.
• Idealmente el análisis debe realizarse inmediatamente después de la toma de muestras.
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TÉCNICA ANALÍTICA
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Técnicas analíticasSelección del método
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Técnicas analíticasSelección del método
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Técnicas analíticasSelección del método
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Técnicas analíticasSelección del método
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Técnicas analíticasSelección del método
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Equipos:•Bomba peristáltica•Centrífuga de 0 a 3.000 rpm•Microscopio de campo claro (Köheler)y objetivos de 10x y 40x
•Balanza•Agitador magnético•Densímetro
Método Bailenger modificado
Material:•Bomba de sifón•Tubos de centrífuga•Pipetas Pasteur de 3 ml•Cámara de McMaster•Probeta graduada de 1 litro•Matraz aforado de 1000 ml•Espátula•Guantes de látex•Varilla de agitación•Recipientes de plástico inerte con paredes lisas de 2000 ml•Pipetas graduadas de 5 y 10 ml
Equipos y Material
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Método Bailenger modificadoReactivos
• Reactivos comerciales:• Acido acético glacial• Sodio acetato anhidro• Etil Acetato• Zinc Sulfato 7-hidrato• Agua destilada
• Preparación de soluciones:• Solución amortiguadora ácido-acética (pH 4,5): Disolver 15 g de
acetato sódico y 3,6 ml de ácido acético glacial; enrasar a 1 litro con agua destilada.
• Solución de sulfato de zinc al 33% de densidad relativa 1,18: Disolver 330 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4·7H2O) en 1000 ml de agua destilada; mezclar en el agitador magnético hasta homogeneizar totalmente. Medir la densidad con el densímetro. Ajustar la densidad a 1,18 agregando sulfato de zinc o agua destilada según sea el caso.
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• Dejar decantar mínimo 24 horas• Eliminar el sobrenadante• Recoger 2 litros de sedimento• Dejar decantar mínimo 24 horas• Eliminar el sobrenadante• Recoger de 50-200 ml de sedimento
25 o 10 L
Agua
Decantar mín. 24 h
Decantar mín. 24 h
50-200 mL
Método Bailenger modificadoConcentración por sedimentación
2 L
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50-200 mL
• Centrifugar a 1000g durante 15 min• Eliminar el sobrenadante• Recoger el sedimento
1000 g15 min
Centrifgar Eliminarsobrenadante
Concentración por centrifugaciónMétodo Bailenger modificado
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• Adicionar Tampón aceto-acético (a mín 10 mL)• Adicionar Acetato de etilo (a mín 5 mL)• Homogenizar y centrifugar a 1000g durante 15 min
1000 g15 min
1.Homogenizar
2.Centrifgar
-Tampón aceto-acético (mín.10 mL)
- Acetato de etilo (mín.5 mL)
Tapón lipófilo
Fase acuosaSedimento
Fase etérea
Método Bailenger modificadoConcentración por método difásico
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• Eliminar el sobrenadante• Recoger el sedimento• Addicionar Sulfato de Zinc (densidad mín 1,18)
Eliminarsobrenadante
Sulfato de Zinc (densidad mín 1,18)
Método Bailenger modificadoConcentración por flotación
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• Homogenizar la muestra• Transferir la muestra a la cámara McMaster• Dejar reposar durante 5 min• Observar al microscopio óptico (campo claro) a 10x• Repetir las operaciones anteriores hasta haber analizado toda la muestra
Homogenizar
Detectar, Identificar y Cuantificar
Método Bailenger modificadoObservación
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IdentificaciónMétodo Bailenger modificado
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ArtefactosMétodo Bailenger modificado
Ascaris fértilGrano de polen
TaeniaGrano de polen
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ArtefactosMétodo Bailenger modificado
AnquilostómidoTecameba (Arcella)
Grano de polen Diphyllobothrium
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ArtefactosMétodo Bailenger modificado
TaeniaGrano de polen
AnquilostómidoGrano de polen
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ArtefactosMétodo Bailenger modificado
TrichurisAlga
TrichurisEspora de hongo
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ArtefactosMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Anquilostómido
Grano de polen
AnquilostómidoHuevo de metazoo
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ArtefactosMétodo Bailenger modificado
Ascaris fértilQuiste de protozoo
Ascaris infértilFlóculo
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ArtefactosMétodo Bailenger modificado
AnquilostómidoBurbuja de aire
Dipylidium caninumGránulos de almidón
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EJERCICIOS PRÁCTICOS
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Trichuris
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Trichuris
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Burbuja de aireAscaris fértil
Grano de polenAscaris decorticado
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25um
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Taenia
Quistes de protozoos Ascaris infértil
Flóculo compacto
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Anquilostómido
Granos de polen(Euphorbia pulcherrima)
Trichuris
Granos de polen
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
TaeniaAscaris
Anquilostómido
Tecamebas(Centropyxis)
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Trichuris Tecamebas(Arcella)
Huevo de rotífero(Macrotrachella)
Ascaris
Anquilostómido
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Hymenolepis
Huevo de rotífero
Fasciola
Paragonimus
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris Diphyllobothrium
Taenia
Schistosoma
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Clonorchis
Hymenolepis
Capillaria
Toxocara
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Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Dicrocoelium
Opistorchis
Enterobius
Fasciola
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Jornada Práctica
Determinación deHuevos de Helmintos en Aguas
según método Bailengermodificado por la OMS