sandec aislamiento y determinación de huevos de helmintos y salmonella en lodos cloacales lodos de...

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Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Lodos de plantas de tratamiento de líquidos

sépticos

Bioq. Graciela Sanguinetti

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Generación de los lodos

Red cloacal

PLANTA DE TRATAMIENTO

LODOS

EFLUENTE TRATADO

Líquido cloacal

Pozo absorbente

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BarrosDefiniciones

(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)

Barros crudos: Barros generados como consecuencia de operaciones de tratamiento de efluentes líquidos y que constituyen subproductos de ese proceso.

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BarrosDefiniciones


Barros tratados: Productos originados en el tratamiento de barros crudos con el propósito de modificar su contenido de humedad y su capacidad de atraer vectores.

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BarrosDefiniciones


Barros orgánicos: Barros con contenido de materia orgánica total igual o mayor al 20% sobre materia seca.

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BiosólidosDefinición


Productos originados en la transformación de barros orgánicos a través de tratamientos destinados a reducir su nivel de patogenicidad, su poder de fermentación y su capacidad de atracción de vectores y a otorgarles aptitud para su utilización agrícola y para la recuperación de suelos y sitios degradados.

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Disposición inadecuada de lodos con riesgo sanitario


LODOS SIN

TRATAR

EFLUENTE TRATADO

SueloCanales

Cuerpo receptor

Cuerpos de agua

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Alternativas de disposición final de lodos sin riesgo sanitario


LODOS

TRATADOS

EFLUENTE TRATADO

Disposición oceánica

“Land farming”

Cuerpo receptor

Uso agrícola Incineración

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Reuso de lodos en agricultura

Factores a considerar:Presencia de metales pesadosMicroorganismos patógenos Bacterias Virus Parásitos

Otros tóxicos

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Guías nacionales para el Uso y Disposición Final de Biosólidos

(Ministerio de Desarrollo Social y Medio Ambiente de la Nación)

ParámetroValor límite

Nivel AValor límite

Nivel B

Escherichia coli (*) < 1000 NMP/g MS< 2.000.000 NMP/g MS

Salmonella (*) < 3 NMP / 4 g MS

Huevos de helmintos viables

< 1 / 4 g MS

Indicadores virales

Reducción del 99,9% de la densidad de bacteriófagos

somáticos de Escherichia coli

(*) Se exige el cumplimiento de uno de los 2 límites

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Indicador apropiado para garantizar la inactivación de

patógenos ¿ Coliformes fecales?

¿Salmonella sp.?

HUEVOS DE HELMINTOS

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Huevo de Trichuris

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Huevos de Hymenolepis

H. diminuta H. nana

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Huevo de Tenia saginata

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Huevos de parásitos resistentes a condiciones ambientales adversas

ASCARIS LUMBRICOIDES

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Huevo de Ascaris

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Ascaris

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AscarisCiclo

biológico

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Bolo de Ascaris

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Proyecto de Investigación Investigación sobre tratamiento de

lodos sépticos: Proyecto colaborativo entre UNR / CIS (Argentina) y EAWAG / SANDEC (Suiza)

Fase B2 del Proyecto: Investigación de la inactivación de

patógenos en lodos sometidos a deshidratación natural

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Investigación en el CIS

Plantas de tratamiento: Alcorta: planta existente.

Tratamiento con ciclos largos de acumulación y deshidratación de barros.

Máximo Paz: planta nueva. Tratamiento con ciclos cortos de acumulación y deshidratación de barros.

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Objetivos de la investigación Huevos de helmintos

Determinar el tiempo de almacena-miento necesario para la inactivación de huevos de helmintos en lodos sometidos a procesos de deshidratación natural dentro de la Planta de Tratamiento

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Objetivos de la investigaciónSalmonella sp.

Establecer una técnica para aislamiento de Salmonella y determinar el die-off.

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Planta de Tratamiento enAlcorta, Santa Fe

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AlcortaEsquema de la Planta de Tratamiento

Líquidos sépticos

Efluente

Líq

uid

o c

loacal

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Alcorta - Descarga de camiones

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Alcorta - Laguna de sedimentación (C1)

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AlcortaDistribución de líquido séptico en la laguna

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Alcorta - Laguna de lodos (C2)

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AlcortaDeshidratación de lodos en pilas

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Caracterización del lodo de la Planta de Tratamiento de

Alcorta

Monitoreo:Muestras: (envases, volumen, extracción, cantidad de muestras)Frecuencia de muestreo: quincenalDuración del Estudio: 2 años

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Caracterización de lodos Parámetros analizados

Humedad Sólidos totales, fijos y volátiles pH Coliformes fecales Huevos de helmintos Salmonella sp.

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Caracterización del lodo de la Planta de Tratamiento de

Alcorta Humedad: 80% Sólidos totales: 200.000 mg/l

Sólidos fijos: 60% Sólidos volátiles: 40%.

Coliformes fecales: se han detectado concentraciones entre 2 y 130.000 NMP /gramo de materia seca.

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AlcortaMonitoreo: Humedad

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400 500 600 700

Time (days)

Hu

mid

ity

(%

)

Piles' samples

Humedad inicial = 87% Humedad final = 32%

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AlcortaMonitoreo: Sólidos fijos y volátiles

Sólidos Fijos y Volátiles en la laguna de sedimentación

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

0 100 200 300 400 500 600 700

T (días)

Fra

cció

n d

e S

óli

do

s (%

)

SANDEC



AlcortaMonitoreo: Coliformes fecales

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

0 100 200 300 400 500 600 700

Tiempo (días)

Co

lifo

rme

s f

ec

ale

s (

NM

P p

or

gra

mo

)

SANDEC



Caracterización de lodos Parámetros analizados

Humedad Sólidos totales, fijos y volátiles pH Coliformes fecales Huevos de helmintos Salmonella sp.

Investigación de

patógenos

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Etapas de la investigación de patógenos en lodos

Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos

acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados en

tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de

la aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.

Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales

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Viabilidad de huevos de helmintos en lodo acumulado en

laguna de sedimentación

Aplicación de técnica de recuperación de huevos (EPA 1992 modificada por J. Schwatzbrod)

Determinación de viabilidad: Incubación a 26 ºC, durante 4 semanas.

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Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Filtración:

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Sedimentación:

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Flotación con Zn SO4, densidad 1,32 g/cm³:

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Centrifugación:

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Flotación con Zn SO4, densidad 1,32 g/cm³:

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Purificación en solución ácida de alcohol-éter:

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Incubación a 26 ºC, 21 días:

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Detección de huevos viables:

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Planta de Tratamiento en Alcorta

Resultados de la investigación de patógenos

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Patógenos en laguna de sedimentación

Huevos de helmintos

0,0

4,0

8,0

12,0

16,0

20,0

0 100 200 300 400 500 600 700

Tiempo (días)

Hu

ev

os

de

He

lmin

tos

To

tale

s(N

º h

ue

vo

s p

or

gra

mo

)

SANDEC




Huevos viables de Ascaris

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 100 200 300 400 500 600 700

Días de almacenamiento

Hu

ev

os

Via

ble

s d

e A

sc

ari

s (

Nº

po

r g

ram

o)

SANDEC




Salmonella: no se detectó en ninguna de las muestras analizadas.

Huevos de helmintos: se han detectado en concentraciones variables entre 0 y 17 huevos totales / gramo. Se detectaron huevos viables en muy pocas muestras.

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acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados

en tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de la

aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.


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Viabilidad de huevos de Ascaris

Experiencias en Tanque Experimental y

“Playa de Secado”Alcorta, Santa Fe

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Viabilidad de huevos de Ascaris suum sembrados en lodos

acumulados

Se estudió en dos etapas: Tanque experimental: 8 meses Playa de secado experimental: 12

meses

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Parámetros adicionales determinados en tanque/playa

de secado

Coliformes fecales

Sólidos totales, fijos y volátiles

Humedad

SANDEC



Preparación de Suspensión de huevos de Ascaris suum

Se extraen huevos del útero de helmintos hembras

Se prepara suspensión de huevos en solución fisiológica estéril con una concentración aproximada de 3 x 105 huevos/l

Se agrega la suspensión de huevos al lodo del tanque experimental (20 huevos/g materia seca)

Se realizan tests control con la suspensión de huevos incubada a 20ºC, 4 semanas (confirman viabilidad)

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Helmintos Ascaris

SANDEC



Extracción de huevos de Ascaris

Preparación

SANDEC




Disección del Ascaris

SANDEC




Disección del útero

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Extracción de huevos de Ascaris Ruptura del útero y liberación de huevos

SANDEC



Extracción de huevos de Ascaris Huevos de Ascaris en la suspensión

preparada

SANDEC



Tanque experimentalDiseño del experimento

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Tanque experimental

Preparación: Siembra de

huevos

SANDEC



Tanque experimentalUbicación del tanque experimental

SANDEC



Tanque experimentalComienzo de la experiencia

SANDEC



Tanque experimentalCuarto mes de deshidratación

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“Playa de secado”

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AlcortaResultados de la experiencia

en tanque experimental y playa de secado

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Tanque experimental / playa de secado

Monitoreo de la humedad

20

30

40

50

60

70

80

0 120 240 360 480 600 720

Tiempo (días)

Hu

me

da

d (

%)

Tanque Experimental Playa de secado

SANDEC




Viabilidad de Ascaris

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 120 240 360 480 600 720

Tiempo (días)

Hu

evo

s d

e Ascaris

(N

º p

or

gra

mo

)

Huevos totales Huevos viables

SANDEC




Huevos viables de Ascaris vs. humedad

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

20 30 40 50 60

Humedad (%)

Hu

evo

s d

e Ascaris

via

ble

s (N

º p

or

gra

mo

)

SANDEC






tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través

de la aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.


SANDEC



Investigación de un método apropiado para aislamiento de Salmonella sp. en lodo séptico ¿Cuáles son los inconvenientes que se

plantean en el laboratorio para la detección de Salmonella en lodos sépticos?

La presencia de una importante flora indígena puede enmascarar el desarrollo de Salmonella, especialmente cuando se encuentra en bajas concentraciones

SANDEC



METODOLOGIA Según Standard Methods (1999)

Se procesaron 9 muestras del lodo de la laguna de sedimentación de la Planta de Tratamiento de Alcorta Medios de enriquecimiento: caldo Selenito - CistinaMedios de aislamiento: agar XLDTests de identificación: TSI, LIS, ureasaConfirmación: Pruebas serológicas (Antígeno grupo “0”)

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y Salmonella en lodos cloacalesSalmonellaen presencia de flora

competidora

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Resultados obtenidos aplicando técnica del “Standard Methods”

Ausencia de Salmonella en todas las muestras de lodo analizadas

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El resultado < 3 NMP/4g materia seca, ¿significa realmente que Salmonella está por debajo de

dicha concentración?

¿O podría encontrarse en mayor concentración y no detectarse por

quedar enmascarada por la abundante flora competidora presente en el lodo cloacal?

SANDEC



Objetivos de la investigación Salmonella sp.

Establecer una técnica apropiada para el aislamiento de Salmonella en presencia de flora indígena.

Determinar el die-off (en tanque experimental).

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Selección de la metodología más apropiada para aislamiento

de Salmonella en lodo

1. Se contaminaron 5 muestras de lodo con Salmonella enteritidis. Concentración final: 1,5 x 103 - 1,5 x 105/g materia seca

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Selección de la metodología más apropiada para aislamiento

de Salmonella en lodo (cont.)

2. Se seleccionaron los siguientes medios de cultivo y condiciones de incubación:

a. Caldos de enriquecimiento: Selenito-cistina: 24, 48, 72 horas a 41 ºC Rappaport Vassiliadis: 24, 48, 72 horas a

43ºC

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Selección de la metodología más apropiada para

aislamiento de Salmonella en lodo (cont.)

b. Medios selectivos de aislamiento: Agar XLD: 24 horas a 35 ºC y a 40 ºC Agar SS: 24 horas a 35 ºC y a 40 ªC

c. Pruebas bioquímicas: TSI, LIA, Ureasa

d. Pruebas serológicas: Realizadas en Servicio de Enterobacterias

del Instituto Dr. Carlos Malbrán

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Resultados obtenidos en el estudio de la selección de metodología para

aislamiento de Salmonella

#

Caldo Selenite-Cistina (41ºC) Caldo Rappaport-Vassiliadis (43ºC)

Salmonella Flora indígena Salmonella Flora indígena

24 hs

48 hs

72 hs24 hs

48 hs

72 hs24 hs

48 hs

72 hs

24 hs

48 hs

72 hs

1 ** ** * * ** ** ** *** ** * * **

2 ** * * * ** *** ** *** ** * * *

3 * * * * ** *** * ** ** * * *

4 ** * * * ** ** * ** ** * * **

5 ** ** * * ** ** ** *** ** * ** **

* Desarrollo escaso - ** Desarrollo moderado - *** Desarrollo abundante

SANDEC



Resultados obtenidos en el estudio de la selección de metodología para

aislamiento de Salmonella

#

Agar Salmonella-Shigella (SS) Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD)

Salmonella Flora indígena Salmonella Flora indígena

35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC

1 * ** ** * ** *** ** *

2 ** ** ** * ** *** * *

3 * ** ** ** * ** * *

4 ** ** ** * * ** ** *

5 * ** ** ** ** *** ** *

* Desarrollo escaso - ** Desarrollo moderado - *** Desarrollo abundante

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Aislamiento e identificaciónde Salmonella

Método modificado (Sanguinetti et al) Enriquecimiento

Caldo Rappaport-Vassiliadis

43 ºC – 48 hs.

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Aislamiento:

Agar XLD40 ºC 24 hs.

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Aislamiento en Agar XLD:

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Aislamiento en agar XLD

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Aislamiento e identificación de Salmonella

TSI (alcalino/ácido)

LIA (positivo)

Ureasa (negativo)

Tipificación por pruebas bioquímicas

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tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de la

aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.


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Supervivencia de Salmonella en lodo de tanque experimental

LODOConcentración final:

7,0 x 106 NMP/g ST

Duración experiencia: 4 meses

Salmonella enteritidis

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Aplicación de la técnica propuesta para aislamiento

Cuantificación: técnica de tubos múltiples

Expresión de resultados: índice NMP / gramo de materia seca

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Parámetros adicionales pH entre 6,5 y 7,5 Humedad entre 30% y 70% Sólidos fijos entre 75% y 80% de ST Sólidos volátiles entre 20% y 25% de ST Coliformes fecales entre 10² y 104 NMP/g ST Temperatura ambiente entre 13ºC y 27ºC Temperatura del lodo entre 14ºC y 30ºC

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Salmonella sp.Die–off en lodos

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CONCLUSIONES

AB

C

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Los huevos de Ascaris presentes en lodos almacenados

durante 2 años permanecen viables, aún con 35% de humedad

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Un método apropiado para el aislamiento de Salmonella en lodos, que inhibe el desarrollo de flora indígena es:

Enriquecimiento: caldo Rappaport-Vassiliadis, 48 horas a 43 ºCAislamiento: Agar XLD, 24 horas a 40 ºCTests de identificación: TSI, LIA, ureasa, pruebas serológicas

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El decaimiento de Salmonella durante 115 días en tanque

experimental con lodos puede expresarse por la ecuación:

Y = log NMP Salmonella/g materia seca = 6,67 x t-

0,086

t: tiempo transcurrido en días

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