interaccions planta- microorganisme, mecanismes útils per ...€¦ · nitrosococcus oceanus 99...
TRANSCRIPT
[
FINANCIACIÓNprOYECTO (CYCYT REN 2003-02185) finançat pel MCYTDiversidad funcional y ecofisiología de las bacterias transformadoras de nitrógeno y aplicación a la gestión de un sistema de humedales de tratamiento (EDAR-Empuriabrava)
Interaccions planta-microorganisme, mecanismes útils per a la eliminació de nitrogen en
sistemes de llacunatge
Institut d’Ecologia AquàticaUniversitat de Girona
[ El cicle del nitrogen
Francis et al. 2007. ISME Journal 1:19-27
Transformacions microbianes del Nitrogen en l’aigua
[ El cicle del nitrogen
Transformacions microbianes del Nitrogen en l’aigua. Interaccions de les plantes
Part aèria: Accumulació N en teixits vegetals (També a altres parts de la planta)
Part submergida: Formació de biofilms microbians, nitrificació (?), desnitrificació(?), fixació de N2 (?)
Part sediment: interacció amb les arrels, nitrificació, desnitrificació, fixació de N2, amonificació
[ SAC-Empuriabrava
Àrea
(m2)
Profunditat promig (m)
Longitud max. (m)
Cel·la tractament 1 8,214 0.5 162.1
Cel·la tractament 2 8,278 0.5 145.2
Cel·la tractament 3 8,226 0.5 173.5
Llac Europa 44,802 0.2
Figueres
Girona
A
CELL 1
CELL 2
CELL 3
Recieving Lagoon
Empuriabrava-WWTPSettlers
Maturatio
n ponds Efflu
ent
N-NH4+
monitori
zation
Empuriabrava-FWS-CW
Ruiz-Rueda et al. 2007. Int Microbiol 10:253-260
[
Year 2005
may jun jul ago sep oct nov
Co
nce
ntr
atio
n(p
pm
)
0
10
20
30
40
50
N-NH4+ (ppm) N-NO
2— (ppm) N-NO
3— (ppm)
Year 2008
jun jul ago sep oct nov
Con
centr
ation (
ppm
)
0
2
4
6
8
10
12
14
SAC-Empuriabrava
Dinàmica d’entrada de nitrogen als SACF
low
(m
3/d
ay)
3000
6000
[ SAC-Empuriabrava
N-N
H4
+ (p
pm
)
0
5
10
15
20
25
30
Year 2005
may jun jul ago sep oct nov
N-N
O3
— (
pp
m)
0
2
4
6
8
Cell 1 Cell 2 Cell 3
% reductionMay 86.2June 88.6July 92.2August 76.6September 18.6October 55.1
Eficiències d’eliminació
Eficiència de la reduccióde N en el SAC
[ SAC-Empuriabrava
Distribució de la vegetació
1 2 3
Cobertura (m2) 3322 2744 3143
Typha (%) 67.0 70.4 37.5
Phragmites (%) 21.9 10.6 62.5
Dades obtingudes I modificades de l’Institut Cartogràfic Catalàwww.icc.es
Phragmites australis Typha sp. Mixed populations
50 m
Inlet canal
Cell 1Cell 2Cell 3
1
2
3
4
5
6
7
Inc
8
9
10
11
1213
14 21
2019
18
17
16
15
Inc
Inc
Inc
Inc
Inc
[ SAC-Empuriabrava
Variació de la concentració de nitrat (����) i amoni (����) (ppm)
Cell 1Cell 2Cell 3
[ Desnitrificació potencial. Assajos al laboratori
MostresÀrees sense vegetació (NV)0 a 3 cm fondària3 a 5 rèpliques
Vegetació (Rhizosfera)Extracció directe de plàntulesNeteja del sediment3 a 5 rèpliques
Activitat potencial de reducció de nitrat
~10 g pes fresc sediment o rizosfera● 1/5 dilució amb solució isotònica● Addició de materia orgànica● Addició de nitrat (2 mM)
• Quantificació de NO3 i NO2 (HPLC)• Quantificació de N2O (GC)
[ Desnirificació potencial. Assajos al laboratori
July
_200
5
Jun
e_200
6
Au
gust_
200
6
Sep
tem
be
r_200
6
NO
2
— +
NO
3
— r
ed
uction
(µ
gN
/gD
W/h
)
0
25
50
75
100
200
250
July
_2005
June_
2006
Augu
st_
2006
Septe
mber_
2006
July
_2005
June_
2006
Augu
st_
2006
Septe
mber_
2006
NO
2
— +
NO
3
— re
du
ctio
n (µ
gN
/gD
W/h
)
0
25
50
75
100
200
250
Desnitrificació potencial (reducció nitrat+nitrit)
Bulk Phragmites sp. Typha sp.
a a a ab
b
cc
c
bc
ab
bc
d
[ Nitrificació potencial. Assajos al laboratori
MostresÀrees sense vegetació (NV)0 a 3 cm fondària3 a 5 rèpliques
Vegetació (Rhizosfera)Extracció directe de plàntulesNeteja del sediment3 a 5 rèpliques
Activitat nitrificant
~10 g pes fresc sediment o rizosfera● 1/5 dilució amb solució isotònica● Addició d’amoni (2 mM)• Condicions aeròbiques
• Quantificació de NO3 i NO2 (HPLC)• Quantificació de N2O (GC)
[ Nitrificació potencial. Assajos al laboratori
July
_200
5
Jun
e_200
6
Au
gust_
200
6
Sep
tem
be
r_200
6
NO
3
— p
rod
uctio
n (
µgN
/gD
W/h
)
0
2
4
6
8
15
20
July
_2005
June_
2006
Augu
st_
2006
Septe
mber_
2006
July
_2005
June_
2006
Augu
st_
2006
Septe
mber_
2006
NO
3
— p
rod
uctio
n (µ
gN
/gD
W/h
)
0
2
4
6
8
15
20
Nitrificació potencial
Bulk Phragmites sp. Typha sp.
a
b b
bc
bcc c
bc
bb
c
d
[ Activitats in situ
Muntatge de sistemes experimentals
Característiques• Acer inoxidable• Volum d’aigua 6,8 litres• Superfície de sediment 0,049 m2
in out
[ Activitats in situ
Muntatge de sistemes experimentals
Comprovació temps per a agitació sobre mostres de sediment.Addició de 10 ml d’àcid HCl. Mesura en continu.Temps d’estabilització <6 min
Comprovació de la difusió cap al sediment.
Addició de tartrazina com a colorant soluble.
Mesura del colorant a les 3 h.<3% de pèrdua en sediment lliure.De 7 a 9 % de pèrdua en sediment
amb vegetació
[ Activitats in situ
Cell 3
May_2008
August_2008
March_20090
20
40
60
80
May_2008
August_2008
March_20090
20
40
60
80
May_2008
August_2008
March_20090
20
40
60
80
Desnitrificació activitat in situ (mg N/h/m2)
May_2008
August_2008
March_20090
20
40
60
80
May_2008
August_2008
March_20090
20
40
60
80
May_2008
August_2008
March_20090
20
40
60
80
[ Activitats in situ
Cell 3
May_2008
August_2008
March_20090
2
4
6
8
10
May_2008
August_2008
March_20090
2
4
6
8
1013,01
May_2008
August_2008
March_20090
2
4
6
8
10
May_2008
August_2008
March_20090
2
4
6
8
10
May_2008
August_2008
March_20090
2
4
6
8
10
May_2008
August_2008
March_20090
2
4
6
8
10
Amonificació activitat in situ (mg N/h/m2)
[ Activitats in situ
Cell 3
Activitat epífits (?)
Activitat
desnitrificant
(µgN/h/cm2
fulla)
EntradaSortida
-0,03
-0,02
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
EntradaSortida
-0,03
-0,02
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
Maig_2008
[ Activitats in situ
Cell 3
Activitat epífits (?)
EntradaSortida
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
EntradaSortida
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
Activitat
desnitrificant
(µgN/h/cm2
fulla)
Agost_2008
[ Conclusions
1) L’activitat potencial de nitrificació i desnitrificació en condicions de laboratori és significativament major en mostres de rizosfera.
2) La normalització dels valors d’activitat per unitat d’àrea redueix significativament el paper de les arrels de les plantes en les activitats mesurades.
3) Les activitats estimades a partir de mesures in situ, ens mostren que no hi ha diferències significatives entre les zones amb vegetació i les lliures de vegetació. Aquests valors són sensiblement més alts als estimats a partir de les determinacions al laboratori.
4) L’amonificació pot arribar a representar entre un 5 i un 20 % de la reducció total de nitrat i nitrit en àrees confinades de sediment.
5) L’activitat dels epífits és important, tant des del punt de vista de la nitrificació, com de la desnitrificació.
[ Estructura de la comunitat. Desnitrificants
Bacteris desnitrificants. Gen nosZ
Group I
June samples
Clone TJ73 (21)Clone PJ41 (20)
Clone PJ14 (18)Clone TJ70 (21)Clone PJ71 (18)Clone TJ5 (19)Clone TJ75 (20)Clone PJ2 (13)Clone TS8 (8)
Clone TJ59 (20)Clone PJ31 (13)Clone PJ4 (18)
Clone PJ6 (20)Clone PJ65 (21)
Clone PJ8 (28)Clone PJ34 (8)Clone TJ80 (18)Clone TJ10 (19)Clone TS2 (18)
Clone TJ34 (18)Clone PJ29 (18)
Clone TJ17 (18)Clone TS23 (30)
Clone TS51 (11)Clone TS92 (13)
Thiobacillus denitrificans CP000116.Azospirillum largimobile AY072228
Burkholderia pseudomallei CP000572.Clone PS36 (28)
Clone TJ74 (22)Ralstonia eutropha X65278Ralstonia eutropha X65278.
Clone TJ26 (30)Clone PJ25 (30)
Clone PJ87 (17)Clone TJ22 (18)Clone PJ33 (28)
Clone PJ21 (18)Clone TJ16 (18)
Clone TS32 (30)Clone TJ36 (20)
Clone TJ37 (16)Clone TJ71 (21)Clone PJ7 (30)
Clone TJ2 (19)Clone TJ40 (25)
Clone PJ68 (18)Clone TJ64 (18)Clone PJ13 (18)Clone PJ1 (18)Clone PJ50 (18)
Clone TS4 (4)Clone TS22 (30)
Pseudomonas aeruginosa X65277.Clone TS46 (36)Clone PS100 (30)
Clone TS79 (36)Clone PS111 (30)
Clone TJ4 (7)Clone TS3 (22)
Clone TS43 (22)Sinorhizobium meliloti AE007253.1Sinorhizobium meliloti U47133
Clone TS12 (15)Brucella suis NC 004311.
Clone PS11 (9)Bradyrhizobium japonicum AJ002531.Clone TS37 (30)
Clone PS74 (5)Clone TS20 (12)Achromobacter xylosoxidans AY072227
Silicibacter pomeroyi CP000032.Clone TJ47 (25)
Clone TS81 (35)Clone TS24 (30)Clone TS62 (22)
Clone TS53 (8)Rhodobacter sphaeroides AF125260
Clone PJ61 (8)P.denitrificans X74792.1|
Achromobacter cycloclastes Y15161Clone TS9 (20)Clone TS33 (20)
99
99
99
99
91
99
99
63
52
50
99
99
94
95
7366
61
57
52
54
52
50
53
93
84
99
9961
66
84
99
98
95
77
88
85
19
79
99
0.05
Group II
September samples
Deduced amino-acid sequences (145 aa)Neighbor-joining phylogenetic tree, pair-wise
deletion 1000 bootstrap replications
• Les seqüències s’agrupen en general en funció de la data de mostreig.
• Elevat nombre de seqüències sense similitud amb espècies de bacteris desnitrificants cultivades.
Ruiz-Rueda et al. 2009. FEMS Microbiol Ecol 67:308-319
[cto_20
cto_23
cto_13
cto_14
cto_3
cto_11
cto_22
cto_24
cto_27
cto_10
cto_21
cto_6
cto_26
cto_9
Nitrosomonas marina
Nitrosomonas ureae
cto_30
cto_7
cto_19
Nitrosomonas europaea
Nitrosomonas eutropha
Nitrosospira III2
Nitrosospira D11
Nitrosospira A4
Nitrosospira sp.
Nitrosospira briensis
Nitrosospira multiformis
Nitrosospira Nsp2
Thiobacillus thioparus
Thiobacillus denitrificans
Methylobacillus glycogenes
Methylobacillus flagellatum
Methylophilus methylotrophus
cto_2
cto_18
cto_1
Escherichia coli
Nitrosococcus oceanus
Nitrosococcus halophilus99
91
99
92
100
99
65
99
80
98
99
98
70
95
77
78
60
95
63
73
63
0.02
Nitrosococcus mobilis
Ic
Estructura de la comunitat. Nitrificants
Bacteris oxidadors de amoni
• Les bandes es distribueixen en 5 grups diferenciats. Totes emparentades amb Nitrosomonas spp.
• Bandes específiques per a les mostres de Setembre (1, 2 i 18) es relacionen amb Methylobacteria, I probablement són productes inespecífics de la PCR.
Phylogenetic analysisNeighbor joining, pair wise deletion,
1000 bootstrap replicates
Ia
Ib
II
III
Ruiz-Rueda et al. 2009. FEMS Microbiol Ecol 67:308-319
[ Participants i agraïments
Olaya Ruiz-RuedaArantxa García-LledóAriadna Sanz-VilarLluís Bañeras
Sara Hallin
Aquest treball s’ha finançat amb un contracte de col·laboracióentre el CCB i la UdG i amb el projecte de recerca Ref. CGL2006-02382 de l’actual Ministeri de Ciència i Innovació.
Jordi SalaLluís Sala
[ Estructura de la comunitat: Desnitrificants
NO3– NO2
– NO N2O N2
Aproximació molecular a l’estudi de la diversitat microbiana
• Reaccions enzimàtiques cap a productes gasosos (NO i N2)
• Especificitat enzimàtica
• Bases de dades molt complertes
nirK
nirS
nosZ
Nitrit reductases
Oxid nitrós reductasa
[ Estructura de la comunitat: Desnitrificants
Bacteris desnitrificants. Bacteris que contenen nitrit reductases depenent de citocrom (nirS)
•Mostres de 2004 i 2005 (estiu)
•L’anàlisi revela una elevada heterogeneitat, malgrat que les mostres semblen agrupar-se en funciódel temps
EFECTE DE LES VARIABLES AMBIENTALS?
NMS plot based on Sorensen indexT-RFLP based analysis. AluI, MspI, HhaI digestions(Ruiz-Rueda et al. 2009. Ecol. Eng. Submitted)
[ Estructura de la comunitat: Desnitrificants
NH4+ NO2
– NO3–
Aproximació molecular a l’estudi de la diversitat microbiana
amoA
16S rRNA
Amoni monooxigenasa subunitat A
Marcador filogenètic. Grup metabòlic molt compacte