PRACTICA N 2

MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

I. INTRODUCCIN:

Se utiliza una serie de equipos y materiales de los cuales es necesario

conocer como se lo utiliza y de qu manera funciona. Se usa ms el

material de vidrio porque no participa en la reaccin y tiene

especificaciones para usarlo adecuadamente.

II. OBJETIVOS:

Reconocer los equipos y cada uno de los materiales.

Conocer su definicin para el uso adecuado de cada uno.

III. MATERIALES Y EQUIPOS:

MICROSCOPIO:

El microscopio se emplea para aumentar o ampliar las imgenes

de objetos y organismos no visibles a simple vista. Se trata de un

instrumento ptico que contiene una o varias lentes que permiten

obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por

refraccin. El microscopio ptico puede ser monocular, binocular.

La observacin en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular

cuando posee dos tubos. La observacin se hace con los dos ojos.

Esto presenta ventajas tales como mejor percepcin de la imagen,

ms cmoda la observacin y se perciben con mayor nitidez los

detalles.

Autoclave:

Es el equipo ms utilizado para la esterilizacin mediante calor

hmedo. Se realiza en al autoclave durante 15 20 min, segn el

volumen, a 115C 121C, segn la naturaleza del material que se

desee esterilizar.

Auto-clavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a

presin (a 1 atmsfera). Como tiene gran poder de penetracin la

temperatura y el tiempo utilizado son menores que los que se

emplean con el horno Pasteur (121 C, 15-20 minutos).

Horno de Pasteur:

Emplea altas temperaturas (160-180 C) durante un tiempo

prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de

penetracin se usa para esterilizar vidrio y metales. Acta

principalmente desnaturalizando las protenas y

secundariamente oxidando los compuestos celulares.

Estufa o incubadora:

Es una cmara de temperatura controlada para cultivo de

microorganismos.

Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su

temperatura ptima de crecimiento (generalmente 35-37).

Frigorfico o cmaras refrigeradas:

Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo,

reactivos) como microorganismos generalmente estn a una

temperatura fija de 4C.

La balanza:

Se usa para pesar colorante, componentes de medio de cultivo,

animales, etc.

Bao mara:

Tienen salida de aire presentan un termostato que regula la

temperatura del agua presenta un piso para colocar los

materiales que se desea.

Bomba de vaco:

Extrae molculas de gas de un volumen sellado, para crear un

vaco parcial.

Contador de colonias:

Es un aparato que mediante la iluminacin de la placa y una lupa,

nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto

facilita su recuento.

Asas de siembra:

Se utilizan para sembrar. Pueden ser metlicas o de plstico,

curvas o rectas (para la siembra por picadura).

Portas y cubres:

Para realizar las observaciones al microscopio.

Matraces:

Se utiliza para calentar lquidos, con poca perdida de evaporacin,

hacer titulaciones y recristalizar un slido.

Potencimetro:

Miden el pH de los medios de cultivo y de las solucione buffer.

Constituido de un par de electrodos sensible a concentraciones de

hidrogeniones, conectados a un potencimetro que indique las

mediciones, Los potencimetros emplean un electrodo de vidrio,

unido a un electrodo de calomel como estndar.

Probetas:

Recipientes graduados de forma cilndrica y capacidad variable,

con base para la esterilidad. Pueden estar graduadas.

Pipetas:

Tubos cilndricos delgados terminados en punta, graduados al

dcimo o al centsimo de mI. Se emplean en la medicin de

pequeas cantidades de lquidos

Volumtricas, se reconocen por presentar una dilatacin bulbosa

central con unas marcas de aforamiento conocida, en el extremo

proximal angosto de la pipeta, se les llama tambin pipetas de

bola, las medidas ms conocidas son de 10, 25, 50 y 100 ml.

Pipetas Pasteur:

Confeccionados de varillas de vidrio de dimetro de 4 x 20mm de

30 40cm de longitud. La calidad de vidrio debe facilitar

reblandamientos a la accin directa de la llama del mechero,

para conseguir por estiramiento la capilaridad deseada. Se

emplea para la toma de pequeos inculos de siembra.

Placas Petri:

Cajas cilndricas, se emplean como recipientes de medios de

cultivo para el cultivo y aislamiento de microorganismos. Las ms

usadas son las de 10, 15 20 mm x 100 mm.

Tubos:

IV. CONCLUSIONES:

La mayora de los instrumentos usados deben pasar por el

autoclave donde son esterilizados para recin poder lavarlos y

acondicionarlos en otras palabras no es limpieza si no pasa por el

autoclave.

Todo material para darle un buen acondicionamiento debe estar

protegido del polvo el cual tambin contiene microorganismos

esto se hace al envolverle ya sea el papel Kraft, algodn al

colocarle como tapones o papel.

Adems se debe asegurar que antes de empezar a acondicionar el

material, este debe estar limpio y seco.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

Olivares A., Escalona L. (2.005). Asesoramiento para la

Elaboracin del Trabajo Especial de Grado e Informe de Pasantias

de los Tcnicos superiores Universitarios.

Qumica 9 , Ediciones Eneva Caracas, autor: REGULO

RODRIGUEZ GIMON

PRACTICA N 3

PRCOCESO DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIN:

La esterilizacin es un proceso a travs del que se logra la destruccin

total de los microorganismos viables presentes en un determinado

material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo

farmacutico, ya que existen muchos procesos que requieren la

utilizacin de materiales estriles. Entre stos podemos destacar: La

esterilizacin de equipos quirrgicos y otros materiales de uso mdico

con el propsito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes. El

acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas,

etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiologa.

Tipos bsicos de medios de cultivo

Atendiendo a su estado fsico:

lquidos

semislidos

slidos

Atendiendo a su utilidad prctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad

de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos

con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u

otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar

Sangre, Schaeadler, etc. Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta

selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos

grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras.

Variando la sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad

(Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) enriquecidos:

ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal

potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con

Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales

que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias,

ayudando a su identificacin (Lowenstein).

Medios para identificacin: Diferenciales: formulaciones especiales en

las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin

sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios

adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria

(Oxidacin-Fermentacin)

II. OBJETIVOS:

La preparacin de medios de cultivo que sern empleados con

diferentes propsitos (cultivo de microorganismos, control de

ambiente, equipos o personal, anlisis microbiolgico de

medicamentos, alimentos, etc.)

La descontaminacin de material utilizado.

III. DISCUSIN:

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se

ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en

algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica

ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y

sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas

vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han

de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de

donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas

que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de

infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin

embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los

medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos

lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a

los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente

fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los

microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas

naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros

compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que

se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido

asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos

y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o

potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de

naturaleza vitamnica.

Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien

como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus

capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos

microorganismos.

2- Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia

aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que

obtendramos medios en estado semislido o slido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de

que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a

temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de

que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su

versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios

lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.

3- Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con

tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno

directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos

anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una

atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los

microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones

atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy

reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un

metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas

condiciones.

4- Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la

atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas

vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el

mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de

cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que

mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos

y evitar as que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la

oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes

como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

6- pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el

crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se

desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que

requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la

presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el

crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso

alterar sus procesos metablicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a

temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a

0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores

(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen

en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y

los saproftos tienen rangos ms amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles

para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar,

enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del

o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico

para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza

vapor de agua a presin como agente esterilizante)

La evolucin de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo

como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y

comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es

indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la

utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes

puntos de inflexin en su evolucin.

Al almacenar los materiales estriles se deben tomar una serie de

precauciones, tales como:

IV. CONCLUSIONES:

Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales

estriles.

Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio

e insectos.

Controlar la temperatura y la humedad de las reas de

almacenamiento.

La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26C y la

humedad relativa entre 30 y 60%.

Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y

hmedos, pueden producir condensacin de humedad sobre el

material de empaque.

Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el

material.

Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave

alcancen la temperatura ambiente antes de ser almacenados; de

esta forma se evita la condensacin dentro del empaque.

V. REFERENCIAS:

Murray, P. 1999. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition.

American Society for Microbiology. Washington, DC.

PRACTICA N 4

METODODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO

I. INTRODUCCIN:

En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se

encuentran diversos microorganismos, el primer paso para proceder a

su estudio es el aislamiento, es decir la separacin de cada uno de los

posibles integrantes microbianos de la muestra.

Existen diversos mtodos para conseguir esta separacin, la mayora de

ellos basados en la inmovilizacin de las clulas microbianas en la

superficie de los medios de cultivo slidos. Al depositar una clula

bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, sta

quedar inmovilizada en ese punto y en l se reproducir por absorcin

de los nutrientes del medio. Las nuevas clulas generadas

permanecern igualmente inmviles y tras sucesivas generaciones

conformarn lo que denominamos una "colonia" que no es ms que un

montn de clulas derivadas de una sola clula madre inicial, es decir,

un clon de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es

visible al ojo humano y presenta diferentes caractersticas segn el

microorganismo que la genera. Esto nos permite distinguir las

diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra

sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un

nuevo medio de cultivo estril, a estos cultivos los consideraremos

"puros" por poseer un slo tipo de microorganismo. (El fundamento es

vlido teniendo en cuenta slo microorganismos cultivables).

II. OBJETIVOS:

Aislar bacterias por siembra en estras.

Aprender a caracterizar bacterias por sus colonias.

Conocer las tcnicas de siembra y cultivo de bacterias.

Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulacin de materiales biolgicos.

Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiologa y los procedimientos para su utilizacin en la siembra y esterilizacin de cultivos

III. MATERIALES

Mechero Asa de siembra Placas de agar Dilucin de rhyzobion Incubadora

A. Aislamiento

Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo solido adecuado dispuesto en una placa de Petri. Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao, consistencia, etc. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original son visible como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa contina de microorganismos. En las estras finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inoculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.

Incubacin y observacin Se llevan las placas a incubar a 37C (temperatura corporal), durante 24 horas. Tras este perodo se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento bacteriano.

B. SIEMBRA Es el acto de colocar el material bacteriolgico en el medio de cultivo para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicacin. El resultado de una siembra se llama: Cultivo Las siembras pueden ser:

- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez - Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria

B.1. Mtodo de siembra por estra en placa

Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para

ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a

continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido

preparado en una placa Petri. Conforme se van haciendo estras en zigzag

con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio de

microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin

donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la

misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este

proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin,

las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas

aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar

colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon

derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas

quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia

mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo

axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien

aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez,

sern, casi con toda seguridad, cultivos axnicos.

Medio de cultivo: agar base inclinado

Instrumento: asa o aguja bacteriolgica

B.2. Mtodos de vertido en placa y extensin en placa

En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes

de su siembra en placa.

Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos

microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa.

Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe

ser diluida 10 veces para obtener una suspensin con un centenar de

clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias

etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.

Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin

bacteriana a 9 ml (de medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se

agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas

veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos maneras

diferentes.

En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos

axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axnico mediante este mtodo:

Hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener una muestra con slo unos pocos cientos de bacterias.

verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter el contenido en una placa Petri.

Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms pequeas) y en su superficie (ms grandes).

Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa, Para obtener un cultivo axnico:

Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.

Introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra. sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en

una placa Petri. volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y

hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas.

Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa.

Siembra por dilucin: Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material bacteriolgico, se agita, con movimientos moderados.

Medio de cultivo: Liquido Instrumento: Asa Finalidad: poner la bacteria en suspensin

Siembra por estra por agotamiento: Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las colonias y aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estras. Esto puede realizarse de varias formas: a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operacin sin tomar con el asa nuevo material. b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estra luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el ltimo cuadrante aparecern las colonias aisladas. c- El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as sucesivamente. Medio de cultivo: solido en placa de Petri Instrumento. Asa Finalidad. Obtener colonias aisladas

Siembra por estras en superficie: Se siembra el material en la superficie del agar inclinado en un tubo de ensayo, all se extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la parte ms cerca de la boca del tubo. Medio de cultivo: Agar base inclinado Instrumento: Asa o aguja bacteriolgica.

Por picadura o puncin: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semislido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de puncin, trayecto por el cual la

retiraremos luego. Este mtodo se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias. Medio de cultivo. Semislido Instrumento: aguja bacteriolgica Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias

Siembra en TSI: (Por picadura y estras en superficie): El TSI (Triple Sugar Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un indicador que es el rojo fenol. En este medio sembraremos por picadura y estras en superficie, como ya conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirn en superficie y profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y segn lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarn indicando su comportamiento frente a los azucares, los cambios indican lo siguiente:

Siembra en agar inclinado. Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el crecimiento de colonias en la superficie.

Siembra en profundidad. Marque la caja de Petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero.

Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de Petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Embebido de un cultivo lquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.

Desarrollo de la prctica

Mtodo de siembra por estras

Procedimiento

Prender el mechero

Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo vivo.

Realiza el sembrado de los microorganismos (rysobium) por el mtodo

de estra utilizando el asa y como se muestra en la figura. Evita destapar

completamente la tapa de los medios de cultivo.

Incubar a 37C y dentro de unos das observar los resultados.

Resultados de la prctica

Formacin de colonias de estreptomicetos

IV. CONCLUCIN

Aprender a realizar la prctica de forma ordenada para obtener buenos

resultados

E aprendido a sembrar bacterias en un medio solido nuestro caso la

bacteria rhizobium

V. BIBLIOGRAFA

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Mtodos de siembra Generales (2da edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

Difco y BBL. 2003. Manual de Mtodos de Siembra Microbiolgicos. Merck. 2002. Microbiologa Manual de Siembra y Aislamiento Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Mtodos y tcnicas de siembra en

laboratorios de Microbiologa

PRACTICA N 5

COLORANTES Y TCNICAS DE COLORACIN

I.- INTRODUCCIN

Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa,

definida por el tamao, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias

en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilndrica, denominadas

bacilos y una tercera morfologa como son las que tienen forma de espirales,

denominadas espirilos. A su vez cada categora puede sub clasificarse con base

a diferentes arreglos.

Estas caractersticas pueden determinarse examinando muestras al

microscopio. Las clulas no teidas son prcticamente transparentes, pero

pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lmina

y laminilla o con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de

fases o de campo oscuro.

Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teir las bacterias para

facilitar su visualizacin.

Si se tie una muestra del cultivo extendida y fijada en una lmina portaobjeto

con un colorante dado, las clulas adquirirn el color del colorante aadido y

podr observarse la forma, tamao y el arreglo de las mismas. Este tipo de

coloracin se conoce con el nombre de coloracin simple.

Para obtener mayor informacin sobre la morfologa y composicin qumica

de las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso

de varios reactivos y stas pueden diferenciarse con base al color que retienen.

Ej. Tincin de Gram y Tincin de Ziehl Neelsen.

II.- OBJETIVOS

Al finalizar el ejercicio prctico el estudiante estar en capacidad de:

Preparar una lmina con la muestra, realizar una tincin de Gram, observar al

microscopio con el objetivo de 100X y reportar el resultado.

III.- MATERIALES

Mechero

Fosforo

Alcohol

Porta objetos

Asa de siembra

Cristal de violeta

Lugol

Alcohol acetona

Safranina

Aceite de cedro

Microscopio

Colonia de bacterias

IV. MARCO TERICO

Cristal violeta

El violeta de metilo, comnmente denominado cristal violeta o violeta de

genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos qumicos empleados

como indicadores de pH y colorantes.

En la forma pura, el violeta de cristal se presenta como lustrosos cristales azul

verdosos que funden a 137 Celsius (279Fahrenheit). Los violeta de metilo son

solubles en agua, etanol, di etilenglicol, y dipropilenglicol. En particular, el

violeta de metilo 6B es soluble en agua al 2.93% y soluble en etanol al 15.21%.

El violeta de metilo se obtiene por reaccin de condensacin de la cetona de

Michler (4,4'-Bis-dimetilamino-benzofenona) con N, N-dimetilanilina en

presencia de clorato de fosforilo

Frmula: C24H28N3Cl

Punto de fusin: 137 C

Lugol

El lugol o disolucin de Lugol es una disolucin de yodo molecular I2 y yoduro

potsico KI en agua destilada. Se prepar por primera vez en 1829 y recibe su

nombre en honor al mdico francs J.G.A. Lugol

Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antisptico,

para la desinfeccin de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba

del yodo en anlisis mdicos y de laboratorio.

Alcohol acetona

Usos: para usos de laboratorio, anlisis, investigacin y qumica fina.

Safranina

La safranina (tambin llamada Safranina O o rojo bsico 2), es un colorante

biolgico, de contraste que se utiliza en la Tincin de Gram para proporcionar

un color violeta ms intenso a las bacterias Gram+ y tie de rosa a las bacterias

G- ; en histologa y en citologa. La safranina se usa como lquido de contraste

en algunos protocolos de tincin, coloreando el ncleo celular de rojo.

Tambin para detectar cartlago, mucina y grnulos de mastocitos.

Frmula qumica C20H19ClN4

Asa de siembra El asa bacteriolgica o asa de platino es un instrumento de laboratorio tipo

pinza que consta de una base que puede estar hecha de platino, acero,

aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que

termina o en un arito de 5 mm o en punta.

Se emplea para transportar o arrastrar o trasvasar inculos (pequeo volumen

que contiene microorganismos en suspensin) desde la solucin de trabajo

tambin llamada solucin madre al medio de cultivo (slido o lquido) o de

un medio a otro (resiembra). Tambin sirve para la realizacin de frotis.

Microscopio compuesto

Un microscopio compuesto tiene ms de una lente objetiva. Los microscopios

compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o

cortados en lminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar

o ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El

microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:

El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar.

El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos, dispuestos de tal manera que producen las ranuras de luz.

El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".

Colonias de bacterias

Una colonia es un trmino utilizado ampliamente como un grupo de seres

vivos organizados bajo bases cooperativas

Aceite de cedro

El Aceite de cedro se utiliz como base para las pinturas de los antiguos

sumerios. Se molan los compuestos de cobalto en un mortero para producir

un pigmento azul. Podran obtener el color verde del cobre, el amarillo de

antimoniato de plomo, el negro del carbn de lea, y el blanco de yeso.

Nosotros lo utilizamos en las muestras que se va a observar con el objetivo de

inmersin del microscopio

Tcnica para realizar una preparacin coloreada

Una preparacin coloreada exige la sucesin de tres pasos: preparacin del

extendido, fijacin y coloracin.

1.- Preparacin del extendido

Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Si el cultivo proviene

de un medio lquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se extiende

hasta formar una fina pelcula que cubra el centro del porta objetos. Si el

cultivo proviene de un medio slido, se procede as de la siguiente manera:

Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos

Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y luego

se extiende la suspensin bacteriana hasta formar una fina pelcula sobre el

portaobjetos sin tocar los bordes.

Se deja secar al aire, o se seca al aire caliente de la llama, si los

microorganismos lo admiten.

2.- Fijacin

Este segundo paso se efecta para que los microorganismos queden adheridos

al vidrio y no sedes prendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que

someterlos posteriormente. La fijacin coagula las sustancias proteicas de las

clulas, lo cual hace que los microorganismos queden pegados al portaobjetos.

Con este procedimiento no mueren todas las bacterias. Existen dos tipos de

fijacin: con calor o mtodo de Koch y fijacin qumica. Mtodo Koch El

procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por

la llama del mechero 3 veces seguidas, con la precaucin de llevar el extendido

hacia arriba. El inconveniente de este mtodo es que los microorganismos

pueden deformarse demasiado si el calentamiento resulta excesivo.

Despus del procedimiento, el portaobjetos debe notarse caliente pero no

debe quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano. Fijacin

qumica La coagulacin del protoplasma microbiano con sustancias qumicas

es lo ideal pues las clulas no resultan deformadas. Existen varios mtodos:-

Se inunda el preparado con alcohol metlico, se deja actuar 3 minutos y se lava

con agua. Es el ms usado.- Idem con formalina al 5 % (v/v).- se inunda el

extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y ter

sulfrico) y se deja actuar hasta su evaporacin completa.

3.- Coloracin

En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de

colorantes de acuerdo al mtodo de tincin que se realice. Para la observacin

microscpica existen diferentes tipos de coloraciones segn las caractersticas

morfolgicas que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican en simples y

compuestas.

A) Coloracin simple

Se entiende por coloracin simple al teido de los microorganismos aplicando

slo una solucin colorante. Pueden ser

Positivas o negativas.

A.1. La coloracin positiva.- Es la tincin de los microorganismos, efectuada

con colorantes bsicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los

constituyentes celulares y se combinan qumicamente con el citoplasma

microbiano. Tcnica: Se cubre el frotis, despus de fijado, con la solucin

colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja

secar.

Con fucsina bsica: se diluye 1/10 la solucin de uso (fucsina fenicada de

Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos.

Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solucin de uso y se deja actuar

30 a 60segundos.

Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solucin de uso (azul de

metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. El azul

de metileno es el colorante ms dbil de los tres, razn por la cual se usa ms

concentrado y se deja actuar durante ms tiempo. Tambin a la solucin de

azul de metileno de uso se le agrega un lcali (KOH) como intensificante, que

acta haciendo ms rpida e intensa la reaccin de coloracin. Generalmente

como intensificante se usa un lcali para un colorante bsico y un cido para

un colorante cido. Debido a que el protoplasma bacteriano tiene una dbil

carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios

alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan ms intensas.

El azul de metileno se utiliza para observacin de levaduras y protozoos

intestinales

A.1.La coloracin negativa es lo contrario del procedimiento de tincin usual:

los microorganismos quedan sin teir y se colorea el medio que los rodea. Por

lo tanto, lo que se ve es el perfil de las clulas. La sustancia usada para la tincin

negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por los constituyentes

celulares y que simplemente rodea a las clulas, tal como:

Tinta china (suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado

grandes como para penetrar en la bacteria)

Colorantes cidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El

ms utilizado es la nigrosina dado que es el que ms contraste ofrece por ser

negro. La coloracin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el

contraste de los microorganismos en microscopa ptica, pero su mxima

utilidad est en revelar estructuras como cpsulas tanto bacterianas como de

levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas

que, por su pequeo dimetro transversal, resulta difcil ponerlas en evidencia;

por medio de la coloracin negativa se observan sin dificultad. Mtodo de

Burri (con tinta china o nigrosina): Se coloca en un extremo del portaobjetos

una gota de tinta china o nigrosina y otra de la suspensin microbiana y se

mezclan bien con el ansa. Luego, con otro porta se apoya sobre la mezcla y se

hace un extendido a lo largo del porta.

Con este procedimiento el espesor del frotis va disminuyendo a medida que

se extiende, con lo cual se conseguir una zona donde el contraste sea el

adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersin.

B) Coloraciones compuestas

Aunque existen mltiples tipos de tinciones, vamos a referirnos aqu a los dos

mtodos de coloracin especiales ms comn mente empleados en la prctica

corriente del laboratorio de microbiologa: la tincin de Gram y la de Ziehl

Neelsen.

B.1. Tincin de Ziehl-Neelsen

El fundamento de esta tcnica diferencial, se basa en la propiedad de a cido-

alcohol resistencia de algunas bacterias del orden Actinomycetales, si bien no

es privativa de ellas. Estos microorganismos se consideran gram positivos,

pero se colorean difcil e irregularmente, de ah que emplee este tipo de

tincin (Ziehl- Neelsen) o su variante (Kinyoun). Cualquiera delas dos tcnicas

citadas consiguen, ya sea por el calor o aumentando el tiempo de contacto,

que la fucsina penetre profundamente y pueda resistir la accin decolorante

de una solucin de cido-alcohol, apareciendo los bacilos de color rojo sobre

un fondo azul.

Etapas en la tincin de Ziehl-Neelsen

Pasos Mtodo Acido-alcohol

resistente

No cido alcohol

resistente

Colorante bsico Fucsina Se tie de rojo Se tie de rojo

Mordiente Calor Permanece rojo Permanece rojo

Decolorante Alcohol-clorhdrico Permanece rojo Se decolora

Contraste Azul de metileno Permanece rojo Se tie de azul

B.2. Tincin de Gram

Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la ms empleada en

bacteriologa. Permite diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual

forma y tamao, por esta razn es una tincin diferencial. Las etapas a seguir

se detallan en la Tabla 1.Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la

Gram positividad depende de la naturaleza y composicin qumica de la pared

o parte de ella. Se han propuesto varias teoras para su explicacin, pero la

ms aceptada es la que sostiene que las bacterias gram negativas son ms

permeables al alcohol debido a su alto contenido en lpidos. Cuando la bacteria

se tie con el complejo colorante bsico-mordiente, ste queda atrapado en

las bacterias gram positivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a

causa de la naturaleza fsico-qumica de su pared. Por el contrario, en las gram

negativas es arrastrado debido a su alto contenido lipdico.

A travs de la tincin de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y

agrupaciones de las bacterias.

-Afinidad tintorial. Permite dividir a las bacterias en:

1) Gram positiva (violetas) que retienen el colorante principal tras la

decoloracin con alcohol o alcohol-acetona

2) Gram negativa (rojas) que pierden el colorante principal tras la

decoloracin por lo que es necesario aplicar un colorante de contraste para

visualizarlas.

Esta diferencia de coloracin est basada en la diferencia estructural de la

pared. En las Gram positivas el colorante se fija fuertemente al peptidoglicano

que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En las gramnegativas

el colorante es retenido con menos fuerza al ser ms delgada la capa de

peptidoglicano. Adems la mayor cantidad de lpidos presentes hace que el

colorante se elimine al solubilizarse los lpidos en el alcohol.

Pueden tener diferentes formas:

- esfricas: cocos (Streptococcus spp., Staphylococcus spp., etc)

- cilndricas: bacilos (enterobacterias, Pseudomonasspp., etc...)

- espiroquetas: Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi

- Pueden aparecer aisladas o asociarse en parejas [diplococcos: (Neisseria

gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae)], cadenas (estreptococcos),

tetradas, sarcinas, racimos (estafilococos), "letras chinas" (corinebacterias),

etc

- Tamao: las bacterias se miden en metros (1metro = 10-3 mm) y, en

general y como ejemplo, las bacterias esfricas tienen un dimetro de 1m

y las bacterias alargadas 1.5-8 m de longitud, aunque este parmetro vara

en funcin de los diferentes gneros bacterianos.

Etapas en la tincin de Gram

Pasos Mtodo Gram(+) Gram (-)

Colorante bsico Cristal de bioleta Se tie de violeta Se tie de violeta

Mordiente Lugol Permanece violeta Permanece violeta

Decoloracin Alcohol de 95% o

Alcohol-acetona

Permanece violeta Se decolora

transparente

Contraste Fucsina o

Safranina

Permanece violeta Se tie de rosa

EN LA PRCTICA HEMOS UTILIZADO LA TINCIN DE GRAM

Procedimiento

Prender el mechero

Esterilizar el asa de siembra

Coger una gota de agua con la asa de siembra y depositar en el

portaobjetos

Coger una colonia de bacterias y depositar en el portaobjetos

Calentar y hacer una extensin

Fijar la muestra

Cubrir con cristal violeta, despus de dos minutos eliminar el exceso de

colorante

Agregar lugol y despus de dos minutos lavar con agua.

Agregar alcohol acetona para eliminar el color.

Agregar safranina y lavar

Llevar al mechero para secar

Colocar una gota de aceite de inmersin sobre las lminas teidas y

secas y examinarlas bajo un microscopio de luz, utilizando el objetivo

de inmersin.

IV. OBSERVACIONES:

Explicacin de la prctica

El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violetas.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).

V. CONCLUSIONES

Hemos aprendido a colorear las bacterias mediante el mtodo de

Gram.

E aprendido a observar en el microscopio utilizando aceite de cedro.

Hemos observado las bacterias de diferentes formas.

VI. BIBLIOGRAFA

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