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CINTICA ENZIMTICA ..................................................................................................... 4 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS .................................................................................................................. 5-8 LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO AFECTA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS...................................................................................... 9 CARACTERSTICAS PARA MEDIR LA VELOCIDAD DE REACCIN FUNCIN DE SUSTRATO ........................................................................................................................ 10 PARMETROS CINTICOS ............................................................................................. 11-15 REACCIONES CATALIZADAS POR LAS TRASAMINASAS ............................................... 16-17 TRANSAMINASAS DE INTERS CLNICO ....................................................................... 17-18 NOMENCLATURA Y NMERO DE CDIGO ...................................................................... 18 COFACTORES REQUERIDOS POR LAS TRASAMINASAS .....................................................19 FUNDAMENTOS ...............................................................................................................20 OBJETIVOS .......................................................................................................................20 PROCEDIMIENTO ........................................................................................................21-22 RESULTADOS ................................................................................................................... 23 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 24-25 BIBLIOGRAFA ................................................................................................................ 26

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CINTICA ENZIMTICA

Estudia la velocidad de reaccin, los mecanismos y factores que los modifican. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificad de la enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS

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Concentracin de la enzima Concentracin del sustrato Activadores e inhibidores Fuerza inica del medio pH del sistema de reaccin

CONCENTRACIN DE SUSTRATOMantiene constante: la concentracin de enzima, pH y temperatura ptima de la enzima, en ausencia de inhibidores enzimticos es posible medir la velocidad de reaccin en funcin de concentraciones variables de sustrato. El efecto de saturacin de la E por el S ha permitido la determinacin de los parmetros cinticos: Km y Vmax

CONCENTRACIN DE LA ENZIMASi se aaden cantidades crecientes de enzima a un sistema de reaccin en el que se han establecido las condiciones ptimas de pH y To y en el que hay cantidades suficientes de sustrato y cosustrato, se observa que la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la cantidad de enzima utilizada (relacin lineal entre ambos parmetros)

La reaccin general se puede representar as:E+S K1 ES K3 E+P

K2

K4

Sin embargo podemos representar la reaccin globalmente:E+S

K1 K2

E+P

El complejo ES normalmente es muy pequeo y los valores K2 y K3 son prcticamente iguales, pero de signos opuestos resulta: V1 = K1 E S y V2 = K4 E P EFECTO DE LA TEMPERATURAEn determinado margen la velocidad de las reacciones aumentan cuando se aumenta la temperatura. Grficamente el aumento de temperatura versus velocidad de reaccin = respuesta llega a lmite por encima de la cual disminuye.

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La temperatura a la que se alcanza Valor mximo = temperatura ptima (Valor superior o similar al interior de clula). La temperatura ptima de enzima en animales son por debajo de 40oC, las de origen vegetal est por encima de los 40oC. Enzimas de ciertos microorganismos poseen temperatura ptima con valores cercanos a 100oC. La temperatura ptima depende del tiempo de exposicin de la enzima a dicha temperatura. Cuanto ms corto sea el tiempo de exposicin ms alta ser la temperatura ptima alcanzada. La aceleracin de la reaccin producida por el aumento de temperatura que no superen a la ptima resulta del aumento de la energa cintica de las molculas reaccionantes. A temperaturas ms altas la enzima cintica aumenta tanto que excede barrera energtica que mantiene la estructura cataltica activa, perdiendo la enzima la estructura (desnaturalizacin) y su actividad cataltica desaparece irreversiblemente. In vivo las enzimas son estables moderadamente a temperaturas habituales de los organismos. El proceso de extraccin de la enzimas de su ambiente in vivo, sin embargo puede aumentar su susceptibilidad a la desnaturalizacin por efecto de la temperatura. La mayor cantidad de enzimas se desnaturalizan a 100oC, pierden a 60oC actividad. Peor enzimas como ribonucleasas y Adenilato quinasa pueden resistir temperaturas de ebullicin = facilita purificacin. Las enzimas de microorganismos que viven en aguas termales (60-80oC) presentan una resistencia excepcional al calor. Valor de Q10 para reacciones catalizadas por encima est entre 1.5 y 2.5. En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. En el efecto de la temperatura hay dos componentes:

1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin de Arrhenius k = A exp (-Ea/RT) 2. Desnaturalizacin trmica de la protena EFECTO DEL pHLos enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra.6

Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Sus pH ptimos son entre 4-8, el pH ptimo refleja el pH del entorno en el que ejercen su actividad cataltica. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. Ejemplo: la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos. La actividad enzimtica debe medirse a pH ptimo por 2 razones: 1. Porque la sensibilidad de la reaccin es mxima a ese valor de pH 2. Porque la curva de efectividad Vs pH tiene de ordinario mnima pendiente cerca de ese pH, por lo que una variacin de pH causar un cambio mnimo en la actividad enzimtica

En el efecto del pH hay tres componentes: a) Sobre la fijacin del substrato al centro activo: o Grupos disociables de la enzima o Grupos disociables del substrato b) Sobre la transformacin cataltica del substrato c) Sobre la estructura de la protena enzimtica

EFECTO DE LA FUERZA INICAA veces, un enzima requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catlisis: los cofactores.

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Los cofactores pueden ser iones inorgnicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molcula orgnica se llama coenzima. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostticos. La forma catalticamente activa del enzima, es decir, la enzima unida a su grupo prosttico, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima.

EFECTO DE LOS ACTIVADORES E INHIBIDORESLos inhibidores enzimticos son molculas que reducen o anulan la actividad enzimtica. Estos inhibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible (la desaparicin del inhibidor restaura la actividad enzimtica) o irreversible (el inhibidor inactiva permanentemente a la enzima).

Los activadores se unen al centro regulador, cambian la configuracin del centro activo, que hasta ese momento estaba inactivo y desencadenan la catlisis enzimtica.

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO

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Mantiene constante: concentracin de enzima, pH y temperatura ptima de la E, en ausencia de inhibidores enzimticos es posible medir la velocidad de reaccin en funcin de concentraciones variables de sustrato. La disminucin de concentracin de sustrato ->Velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de sustrato= es decir que la cintica de reaccin es de primer orden con respecto al sustrato. Al aumentar la concentracin de sustrato y alcanzar concentraciones intermedias de sustratos -> Velocidad de reaccin se va tornando independiente de la [S] y la cintica de la reaccin es de orden mixto o pseudoprimer orden. El aumento de la concentracin de sustrato > la enzima est saturada por sustrato-> Velocidad de reaccin se hace completamente independiente de la concentracin de sustrato y la cintica es de orden 0. La concentracin de sustratos saturantes -> Factor limitante de la reaccin de concentracin de enzima. Todas las enzimas muestran este efecto de saturacin, peor varan ampliamente con respecto a la concentracin de sustrato para alcanzar dicha saturacin.

CONDICIONES DE ENSAYO PARA LA MEDICIN DE LA VELOCIDAD DE REACCIN EN FUNCIN DE SUSTRATO

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La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de sustrato. La Figura 1 muestra la velocidad de una reaccin enzimtica a 6 concentraciones distintas de sustrato. Adems, la presencia de los productos finales puede hacer que la reaccin sea ms lenta, o incluso invertir su sentido (Figura 2).

Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica. Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido en producto. Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando una nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de enzima.

PARMETROS CINTICOS

Km

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Km-> ndice muy aproximado de la afinidad de la Enzima por el Sustrato. Definicin: concentracin de sustrato necesario para alcanzar la mitad de la velocidad mxima (Vmax) La KM es inversamente proporcional con la actividad de la enzima (inversamente proporcional la afinidad de la Enzima por el Sustrato). Valor de KM grande, baja actividad-> menor afinidad y viceversa. Valor de KM pequeo, alta actividad-> [S] se alcanzar Vmax. Valor de km se expresa en moles/l de solucin. Es constante en cada enzima y depende del sustrato en particular y condiciones del ensayo. El conocimiento del valor de Km de una enzima puede ser de considerable valor en investigaciones de control metablico. Las alteraciones en la concentracin celular de un sustrato o un cofactor no influyen forzosamente en la velocidad de una reaccin enzimtica. Influirn solo si las concentraciones son menores o sobrepasan en mucho el valor del Km del cofactor o del sustrato de la E. Ejemplo : [glucosa en sangre en 5mM] 2 enzimas hepticas que fosforolizan la glucosa: Hexoquinasa Km 0.01M para la glucosa Glucosquinasa Km 20 mM para la glucosa

Kcat (constante para cada enzima)Nmero de recambio = Nmero de molculas de sustrato convertidas en producto por molcula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturacin de sustrato. Su inversa define el tiempo requerido por el enzima para transformar una sustrato molcula de

Unidad de enzimaCantidad de enzima que transforma 1mol de sustrato por miunto= una forma comn de expresar la velocidad.

Constante especficaSirve para comparar la eficiencia de una enzima dada para distintos sustratos Kcat/Km

Actividad especficaUnidades por mg de protena total de la preparacin enzimtica. En el caso de enzimas en suero: unidades/L (U/L), unidad ms moderna kat= nmero de moles de producto/segundo.

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Vmax (Velocidad mxima terica)La velocidad cuando todos los centros activos estn ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad). Llamada tambin EFICACIA CATALITICA Mxima velocidad a la cual la enzima es capaz de transformar el sustrato en producto Revela el nmero de recambio de la enzima. La Vmax se alcanza siempre que se trabaja a concentraciones saturantes de sustrato El valor de Vmax depende de la concentracin de enzima. Al duplicarse la concentracin de enzima se duplica el valor de Vmax, pero no vara el Km. Vmax es una expresin de EFICENCIA DE OPERACIN, en el lmite superior de cierta enzima. Para comparar Enzimas diferentes es necesario expresar la Vmax en trminos de la mxima cantidad molar de cada enzima. Cuando se trata de E purificadas los valores de Vmax se suelen referir los miligramos de protena. Experimentalmente se puede determinar el valor de la velocidad mxima de una reaccin enzimtica Vmax = K3 [Et]

Constante de Michaelis - MentenLa constante de Michaelis Km se define como la concentracin a la que la velocidad de la reaccin enzimtica es la mitad de la Vmax. Esto puede verificarse sustituyendo la concentracin de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la etapa limitante de la velocidad de la reaccin es lenta comparada con la disociacin de sustrato (k2