informe nº 9 bioquímica

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE CARBOHIDRATOS

Facultad de Farmacia y Bioquímica Página 0

LABORATORIO DE BIOQUÍMICAFacultad de Farmacia y Bioquímica

03/07/20132013

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE CARBOHIDRATOSBioquímica I -Práctica N 9


INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos que se ingieren en la dieta son mayoritariamente polisacáridos; y en

menor proporción monosacáridos o disacáridos. Los polímeros se encuentran presentes en

diferentes alimentos como en cereales, las legumbres y los tubérculos; mientras que los

segundos se encuentran en la leche, las frutas y el azúcar.

Las primeras enzimas que participan en la degradación de los polisacáridos son las ptialinas

o -amilasas salivales y las -amilasas pancreáticas1.

Si bien la secreción de cada glándula salival tiene características diferentes, en la cavidad

bucal, las secreciones se mezclan y constituyen lo que se denomina saliva mixta o total.

Esta saliva bucal es viscosa, contiene, prácticamente, un 99% de agua y su pH se encuentra

entre 6,8 y 7,2, que es el pH óptimo para que pueda actuar la amilasa salival o ptialina2.

Recientemente, se ha detectado en la saliva humana un analgésico natural que es varias

veces más potente que la morfina. Esta sustancia inhibidora del dolor ha recibido la

deformación de opiomorfina, ya que actúa como sobre las mismas vías que la morfina y

otros analgésicos opiáceos2.

Se estima que el volumen de saliva que producen las glándulas salivales humanas puede

llegar a 1,5 litros por día, pero se calcula que solo se llega a 600-800 mL diarios. La

cantidad de saliva secretada nuestra un ritmo circadiano, ya que varía en los diferentes

momentos del día, disminuyendo considerablemente durante las horas de sueño2.

En esta práctica los objetivos son:

- Demostrar la actividad de hidrólisis enzimática de la amilasa salival

- Ver cómo influyen los cambios de pH a la actividad de amilasa.

MARCO TEÓRICO



La digestión de los carbohidratos se inicia en la boca con la acción de la enzima -amilasa, que se secreta en la saliva. Esta enzima es capaz de actuar sobre los enlaces 14 de los polímeros de glucógeno y almidón. Debido a que el alimento no permanece por mucho tiempo en la boca, la proporción de enlaces que logra romper no es muy alta. La enzima salival, junto al bolo alimenticio, llega al estomago, donde es rápidamente desnaturalizada por el pH tan acido (alrededor de 2) que se mantienen en ese órgano3.

Los carbohidratos continúan el tránsito hacia el intestino delgado sin sufrir mayores modificaciones. Al salir el alimento del estomago, se detiene en la pared duodenal y esto estimula la secreción de dos hormonas a la sangre: la colecistoquinina y la secretina. La colecistiquinina llega hasta el páncreas exocrino y provoca la liberación de un líquido rico en enzimas. Dentro de estas enzimas se encuentran la -amilasa pancreática, el cual, al igual que su isoforma salival, actúa sobre los enlaces 14 de los polisacáridos2.

La secretina, por su parte, trabaja también en el páncreas donde estimula la liberación de un líquido rico en bicarbonato. Este bicarbonato es el responsable de la alcalinización del medio intestinal, que permite la acción de las enzimas a valores de pH cercanos a su pH óptimo3, 4.

Amilasa salival

Las glándulas salivales liberan una secreción ligeramente alcalina que además de agua y sales inorgánicas contiene glucoproteinas (mucina) como material lubricante, anticuerpos y enzimas. La -amilasa actúa sobre los polisacáridos y una lipasa que hidroliza una pequeña parte de las grasas neutras.



Es probable que la -amilasa y la lisozima, una enzima que degrada la mureina, tengan la función de controlar la flora bacteriana de la boca más que la de contribuir a la digestión4.

Como se mencionó, la amilasa salival, también llamada ptialina, actúa hidrolizando los enlaces glucosa-14-glucosa y por lo tanto, degrada almidón y el glucógeno. La ptialina requiere cloruro como cofactor inorgánico para la catálisis ocurra de manera óptima5.

Amilasa pancreática

La acción de la -amilasa pancreática es casi idéntica a la de la -amilasa salival: sin embargo, en el organismo, la acción de la amilasa pancreática es más importante, dado que el almidón y el glucógeno permanecen por más tiempo en el duodeno (para su digestión) que en la boca5, 6.

La amilasa pancreática puede degradar completamente la amilosa del almidón hasta maltosa, pero solamente de manera parcial el glucógeno y la amilopectina. El producto de esta digestión parcial de la amilopectina y el glucógeno da origen a maltosas, malotriosas, isomaltosas y lo que se conoce como dextrina limite, que es el producto del ataque máximo que pueden realizar las amilasas sobre el glucógeno. El resultado es un múleo muy ramificado de glucosas, debido a la presencia de numerosos enlaces 16-glucosidasa7.

La degradación posterior de la dextrina limite y la isomaltasa requiere otra enzima, sintetizada por las glándulas del duodeno, que se llama isomaltasa o 16-glucosidasa, que quita la glucosa en posición 16 y, al hacerlo, deja expuesta la siguiente glucosa, que se encuentra en posición 14, sobre la cual puede actuar la amilasa pancreática sin ninguna restricción7, 8.



E la dieta, es normal encontrar disacáridos; estos compuestos deben ser digeridos con el fin de absorber los monosacáridos que los componen. Existen, para tal efecto, algunas disacaridasas que se encuentran en las células epiteliales del intestino delgado6.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


La amilasa salival fue obtenida a partir de 4 ml de saliva, que se diluyo 1 en 50, la cual fue la solución de enzima.


ENSAYO 1: Actividad de la hidrolisis de almidón

Componente 1(ml) 2(ml) 3(ml) 4(ml) 5(ml) 6(ml)Sol. Almidón 1%

1 1 1 1 1 1

Buffer fosfato pH 6.65 5 5 5 5 5

Sol. Salina (NaCl 1%)2.2 2.2 2.2 2.2 - 2.0

Agua Destilada0.8 0.6 0.4 0.2 2.4 0.4

Los tubos del 1 al 5 fueron colocados en un baño de agua a 37ºC durante 5 min y el tubo 6 fue mantenido como control a temperatura ambiente. Luego a cada uno de los tubos se agrego la solución de enzima:

Enzima(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 0.8 0.8

Los tubos del 1 al 5 fueron colocados en baño maría de agua a 37ºC por 30 min y el tubo 6 fue mantenida temperatura ambiente.

ENSAYO 2: Efecto de la concentración de sustrato y del tiempo de incubación sobre la actividad de la amilasa salival

Componente 1 (ml) 2 (ml) 3 (ml) 4 (ml) 5 (ml)Sol. Salina (NaCl 1%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5Buffer fosfato pH 6.6

5 5 5 5 5

Sol. Almidón 1%3.2 2.8 2.2 1.8 1.3

Sol. Enzima0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Agua destilada0.1 0.5 1.1 1.5 2

Cada uno de los tubos fue llevado a baño a maría 37º C por 15 min.

ENSAYO 3: Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival


Componentes 1 (ml) 2 (ml) 3(ml)Sol. Almidón 1% 5 5Sol. Salina 2.0Buffer pH 6 2Buffer Ph 4 2Buffer pH 10 2


Cada uno de los tubos fue llevado a baño maría 37ºC por 5 minutos y se agrego 1 ml de la solución de enzima a cada uno de los tubos. Luego fueron llevados a baño maría 37ºC durante 20 minutos.

Control por la reacción de lugol

De cada uno de los tubos fueron tomados 0.5 ml de muestra y se agrego 0.5 ml de lugol. Se mezclo bien y fueron dejados en reposo durante 5 minutos. Se observo los resultados.

Control por la reacción de Benedict

De cada uno de los tubos se tomo 0.5 ml y se agrego 2.5 ml del reactivo de Benedict, se mezclo bien y fueron sometidos a la acción del calor en baño de agua hirviendo durante 3 minutos, luego fueron enfriados a Tº ambiente y se observo los resultados.

RESULTADOS

Ensayo 1: Demostración de la actividad de la hidrólisis del almidón

Tubos 1 2 3 4 5 6Intensidad de reacción

+ ++ ++ ++ + +++ Benedict

0 0 0 0 0 0 Lugol


Control por la reacccion de lugol y Benedict

Ensayo 1

Ensayo 2

Ensayo 3


a) Con reactivo de BENEDIC

b) Con reactivo de LUGOL

Ensayo 2: Efecto de la concentración de sustrato y del tiempo de incubación sobre la actividad de la amilasa salival.

a)

Con reactivo de BENEDIC


1 2 3 4 5 6

1 2 4 5 6

Precipitado rojo ladrillo en todo los tubos

No hay reacción, solo variación de la intensidad del color

3

Tubos 1 2 3 4 5Intensidad de Reacción

+++ ++ ++ + + Benedict++ ++ + + 0 Lugol



Ensayo 3: Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival

Tubos 1 2 3Intensidad de reacción

+++ 0 0 Benedict0 +++ +++ Lugol

a) Con reactivo de BENEDIC


5 4 3 2 1

1 2 3 4 5

Ligera coloración anaranjada

Se observa disminución de la tonalidad azul

Intensidad de coloración azul de mayor a menor

Reacción negativa



DISCUSIONES

La alimentación humana normal solo contiene tres fuentes importantes de hidratos de

carbono: la sacarosa, que es el disacárido conocido popularmente como azúcar de caña; la

lactosa, el disacárido de la leche, y los almidones, grandes polisacáridos presentes en casi

todos los alimentos de origen no animal, especialmente en las patatas y en los distintos

tipos de cereales.9 Donde la amilasa salival, secretada por la glándula parótida cataliza la

hidrólisis los enlaces α-1,4 glucosidicos de la región central de la cadena de amilosa y

amilopectina del almidón, exceptuando las moléculas cercanas a la ramificación,


1 2 3

1 2 3

Reacción positiva (color ligeramente anaranjado)

No hay reacción

Reacción positiva (azul intenso)No hay

reacción


obteniendo como resultado maltosa, glucosa y dextrinas que poseen enlaces α-1,6 de la

amilopectina.10

Durante la práctica realizamos un análisis cualitativo de la actividad enzimática de la α-

amilasa salival en relación con algunos factores que van a modificar el curso normal de la

reacción en condiciones normales del organismo.

En una reacción normal, la [E] puede estar presente en concentraciones de orden

nanomolar, mientras que la [S] puede ser 5 o 6 órdenes de magnitud mayor. Por lo tanto,

en el primer ensayo a medida que aumentemos la [E], habrá una mayor cantidad de enzima

que catalice la reacción del sustrato, aumentando así la velocidad de reacción y por ende el

producto obtenido será mayor.11 En la reacción con lugol, varia en intensidad de colores

donde el tubo 1 con menor concentración de enzima presento menos hidrólisis que en el

tubo 4, con mayor concentración de enzima.12 También se pudo observar que en el tubo 5

no presento reacción debido a q no estaba su activador ion Cl- en la solución salina.14 Y en

la reacción de Benedict para azucares(glucosa) con grupos de reductores libres existe una

correlación consecutiva de formación de producto en forma de precipitado de Cu2O3 (rojo

ladrillo) en función de la concentración de enzima.13

En el segundo ensayo la [E] estuvo presente en concentraciones constantes, mientras que la

[S] presento una mayor magnitud. Por lo tanto, a medida que aumentemos la [S], habrá una

mayor cantidad de producto que se catalice en la reacción. Hasta que la enzima llegue a

saturarse, llegando a una velocidad máxima que ya no genere mayor formación de

producto.11 Así en la reacción con lugol está en función de la concentración de sustrato

donde en el tubo 5 hay una mayor hidrólisis del almidón en unidades de glucosa que en el

tubo 1, cuya escala va de rojo(amilopectinas) a azul intenso(amilosas).12 Y en la reacción de

Benedict para azucares(glucosa) con grupos de reductores libres existe una correlación

consecutiva, donde el tubo 1 empieza a decolorarse hasta el tubo 5 donde se aprecia el

precipitado de Cu2O3 (rojo ladrillo), lo que indica que en los primeros tubos estaban

saturados de exceso de sustrato.13

En el tercer ensayo se evaluó el efecto del pH optimo en el que su actividad es máxima,

pero a valores superiores o inferiores disminuye la actividad de la enzima.11 Por lo tanto se

trabajo con pH diferentes (4,6.6 y 10) teniendo como rango de pH teórico estable entre 5.5-

8 14; evaluándose con el reactivo de lugol, se tiene que a pH 6.6 presenta una coloración

rojiza, evidencia de que se hidrolizo la amilosa (azul), quedando las amilopectinas(rojo).12



Y en la reacción de Benedict para azucares(glucosa) con grupos de reductores libres se

evidencio precipitación rojo ladrillo abundante confirmando el pH 6.6 adecuado para la

actividad de la enzima.13

Además la reacción con el lugol, el almidón tomo una coloración azul intenso, debido a que

el yodo es capaza de formar complejos tanto con amilosa como con amilopectina. En el

caso de la amilosa, los largos segmentos helicoidales permiten la formación de largas

cadenas de poli (I3-) que dan lugar al color azul intenso característico. La amilopectina se

colorea de color rojo purpurea con el yodo debido a que sus ramas son demasiado cortas

para la formación de largas cadenas de poli (I3-).12

Finalmente se tiene la reacción de Benedict, la cual es específica para azucares con grupos

reductores libres(C=O), tomando en cuenta que todos los monosacáridos (glucosa) poseen

un grupo reductor libre, este reduce al Cu+2 en medio alcalino a Cu+1 para luego oxidar y

precipitar en forma de Cu2O3, lo que proporciona la coloración positiva (rojo ladrillo) de la

reacción.13

CONCUSIONES

En el primer ensayo se demostró de la actividad de la amilasa salival se tuvo como

controles al reactivo de lugol, donde se aprecia variaciones en intensidad de colores

donde el tubo 1 con menor concentración de enzima presento menos hidrólisis que

en el tubo 4, con mayor concentración de enzima. También se puso observar que en

el tubo 5 no presento reacción ya que no tenía solución salina y el control por la

reacción de Benedict donde la precipitación de Cu2O3 (rojo ladrillo) va en forma

creciente con excepción del tubo 5 debido a que no presenta solución salina.

En el segundo ensayo se demostró el efecto de la concentración de sustrato y tiempo

de la enzima amilasa salival presenta el control por la reacción de lugol, donde el

tubo 5 con menor concentración de sustrato dio una coloración rojiza y el de mayor

concentración de sustrato dio un color azul oscuro, además para el control por la

reacción de Benedict la precipitación que al inicio es inapreciable va en forma

creciente hasta que llega al tubo 5 con mayor precipitado rojo ladrillo de Cu2O3.

En el tercer ensayo se demostró el efecto del pH sobre la actividad de la enzima

amilasa salival mediante sus controles con lugol, dio color rojizo para el tubo con

pH 6.6 y los demás de color azul intenso; además mediante el control por la



reacción de Benedict se confirmo el valor de pH optimo de 6.6 mediante su

formación de precipitado de Cu2O3 (rojo ladrillo).

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de lugol?

Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de

Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta

característico.

Fundamento: Esta característica es específica del almidón, debido a su estructura, y se

debe a la adsorción del Iodo por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa.

Por tanto no es una reacción química, sino una interacción física reversible por métodos

físicos que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración

azul violeta.

Esto se puede comprobar fácilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece, y

al enfriarla vuelve a aparecer.

2. Como influye el pH en la actividad de la amilasa salival

Con frecuencia la boca está expuesta a alimentos que tienen un pH mucho más bajo que el

de la saliva y que son capaces de provocar una disolución química del esmalte (erosión),

bajo estas condiciones, los mecanismos tampón también se ponen en marcha para

normalizar el pH lo antes posible.

Los alimentos se clasifican como ácidos o alcalinos de acuerdo al efecto que tienen en el

organismo humano después de la digestión y no de acuerdo al pH que tienen en sí mismos.

Es por esta razón que el sabor que tienen no es un indicador del pH, si no lo que generaran

en nuestro organismo una vez consumidos.

De acuerdo a estudios se ha demostrado que algunos alimentos producen efecto alcalino o

ácido dentro del organismo lo que provoca un aumento o descenso del pH.

La función amortiguadora de la saliva se debe principalmente a la presencia del bicarbonato

ya que la influencia del fosfato es menos extensa. La capacidad amortiguadora es la

habilidad de la saliva para contrarrestar los cambios de pH.



Esta propiedad ayuda a proteger a los tejidos bucales contra la acción de los ácidos

provenientes de la comida o de la placa dental, por lo tanto, puede reducir el potencial

cariogénico del ambiente.

El buffer ácido carbónico/bicarbonato ejerce su acción sobre todo cuando aumenta el flujo

salival estimulado. El buffer fosfato, juega un papel fundamental en situaciones de flujo

salival bajo, por encima de un pH de 6 la saliva está sobresaturada de fosfato con respecto a

la hidroxiapatita (HA), cuando el pH se ve disminuido por debajo del pH crítico (5,5), la

HA comienza a disolverse, y los fosfatos liberados tratan de restablecer el equilibrio

perdido, lo que dependerá en último término del contenido de iones de fosfato y calcio del

medio circundante. Algunas proteínas como las histatinas o la sialina, así como algunos

productos alcalinos generados por la actividad metabólica de las bacterias sobre los

aminoácidos, péptidos, proteínas y urea también son importantes en el control del pH

salival.

Los amortiguadores funcionan convirtiendo una solución ácida o alcalina altamente

ionizada, la cual tiende a alterar el pH, en una solución más débilmente ionizada libreando

(H+) u (OH-).

3. ¿Cual es la función de la solución salina y de la solución de almidón utilizados en el

ensayo 1?

La función de la solución salina en el ensayo 1 es que otorga iones Cl-, los cuales se

utilizan como activadores de la enzima amilasa salivan. Y la función de la solución de

almidón es actuar como sustrato de la reacción con la amilasa salivan y se compruebe como

disminuye el sustrato en función de la concentración de enzima.2

4. ¿Cuál es la clasificación y la nomenclatura de las amilasas empleadas en la

práctica?



En la práctica empleó la amilasa salival mas no la pancreática sin embargo se mencionará

tanto la clasificación y nomenclatura de ambas:

La amilasa salival o α amilasa es una enzima clasificada dentro de las hidrolasas y la

nomenclatura que posee es EC 3.2.1.1. 1

La amilasa pancreática es también del mismo grupo de hidrolasas, en el mencionado órgano

se encuentra con pesos moleculares de 52000 (Ec 3.2.1.1) y 53000 (EC 3.2.1.1). Esta

nomenclatura esta normada por la comisión IUPAC-IUB para nombrar múltiples formas de

enzimas.2

Referencias:

1. IUBMB Enzyme Nomenclature [en línea]. Disponible en:

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/1.html

2. Stiefel DJ, Keller PJ. Preparation and some properties of human pancreatic amylase

including a comparison with human parotid amylase.Biochim Biophys Acta 1973;

302: 345-361

3. Hand A, Oliver C. Methods in cell biology. Editorial Academis Press. 1° edición.

New York, 1985. Pág. 348.

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4. Quesada S. Manual de experimentos de laboratorio de Bioquímica. Editorial Universidad Estatal. Primera Edición. San José, 2007. Pág. 103-109.

5. Koolman J y Röhm K. Bioquímica: texto y Atlas. Editorial Panamericana. Tercera Edición. Madrid, 2004. Pág. 266-270.


http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/1.html


6. Gennaro A. Remington: Farmacia. Editorial Médica Panamericana. 20a Edición. Buenos Aires, 2003. Pág 602.

7. Voet D, Voet J y Pratt Ch. Fundamentos de Bioquímica. Editorial Medica Panamericana S.A. 2a Edición. Madrid, 2006.

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Decimoprimera edicion.E.E.U.U.2006 Pag: 809-81010. Plummer, D. Bioquimica Práctica. Editorial Mc-Graw Hill Latinoamreicana S.A.

Bogota.1981. Pag: 256-26111. Lenhinger.Principios de Bioquimica. David L. Nelson Michael M.Cox, cuarta

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14. Stiefel DJ, Keller PJ. Preparation and some properties of human pancreatic amylase including a comparison with human parotid amylase.Biochim Biophys Acta 1973; 302: 345-361.


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informe nº 9 bioquímica

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