Identificación, evaluación y reconocimiento de microorganismos a partir de una muestra de aire determinando las implicaciones patogénicas y

ambientales del grupo B. anthracis

Jesica Palacios, David Lozada, Sebastián Ruiz, Fabián Becerra1

Fecha: 13 de marzo del 2012

RESUMEN

Las  bacterias  es el más simple y abundante de los organismos, estas están presentes  en  tierra, agua, aire, materia orgánica o en plantas y animales. En este caso  se estudiaron las bacterias presentes en un cuerpo de aire para lograr la identificación del grupo bacteriano, así como para identificar patógenos bacterianos que afecten de una manera directa   la salud pública,  estas se encuentran presentes en el aire pero indirectamente también se encuentran en productos crudos de aves de corral, en desechos humanos y animales, son propagados a través de los alimentos y agua por efectos totalmente gravitacionales. También es importante reconocer las complicaciones respiratorias que estos microorganismos pueden causar al ser humano ya que debido a el tamaño de las partículas en el aire estas son de fácil absorción por el sistema respiratorio humano

En la práctica se utilizo el agar Mc Conkey, agar sangre. El agar Mc Conkey se expuso al aire libre sin tapa para que se incorporaran microorganismos presentes en el aire; el agar sangre lo colocamos en el equipo MAS por un tiempo de 5 minutos, luego ambos agares se introdujeron en la incubadora por 8 días para poder ver el crecimiento de microorganismos en cada uno, pasado el tiempo de incubación, se realizo el conteo de colonias a el agar sangre, observamos específicamente tres de ellas y describimos sus características, por tinción de Gram observando su fisiología y morfología, por otro lado a el agar Mc Conkey para poder observar los microorganismos presentes en el aire le realizamos preparación en fresco con azul de lacto fenol.

Palabras claves: Muestreo de Aire, siembra, crecimiento, Tinción de Gram, identificación de microorganismo.

Objetivos generales

Conocer los diferentes tipos de cultivo, su calcificación y su importancia.

Aprender a preparar medios de cultivo utilizados para el muestreo ambiental. Conocer y diferenciar las características del crecimiento bacteriano in vitro.

Objetivos específicos

Identificar un grupo bacteriano a partir de una muestra de aire, usando técnicas de laboratorio como tinción de Gram y microscopia óptica directa.

Evaluar y analizar las posibles afectaciones patogénicas del microorganismo para el humano y para el contexto ambiental en el que se encuentra ubicado.

1 Universidad de la Sallé. Ingeniería Ambiental. Microbiología grupo 7

INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos.Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras. El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C.

De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.

Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación. Se utilizan para estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo).

Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación. Estos medios inmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al microbiólogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar también se utilizan para la determinación de células viables (recuento en placas).

De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente.

Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos.

De acuerdo a su función, los medios de cultivo se clasifican como:

Medios selectivos: Son aquéllos que poseen uno o más componentes añadidos, los cuales inhibirán o prevendrán el crecimiento de ciertos tipos de especies de bacterias y/o promoverán el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede ajustarlas condiciones físicas de un medio de cultivo tales como el pH, la temperatura, para hacerlo selectivo para los organismos de interés.

Medios diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias con base en alguna característica observable en su patrón de crecimiento en el medio, ya sea por producción de algún pigmento o por cambios de color en el medio debido a indicadores de pH, o por halos de degradación de algún componente en el medio de cultivo.

Medios de enriquecimiento: Contienen algún componente que permite el crecimiento de cierto tipo específico de bacteria, pero no contienen sustancias inhibidoras.

Medios enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que requieren un gran número de factores de crecimiento. Generalmente contienen extractos biológicos poco usuales como sangre, suero en polvo, extracto de cerebro de res, yema de huevo, etc.

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN LA PRÁCTICA

AGAR SANGRE

Sangre Agar Base

Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos.Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis.También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

FundamentoLa infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis.

Mac Conkey Agar.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteria se desarrollan en el mismo.

Fundamento En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.

Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares.Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Morfología Colonial de Bacterias

El crecimiento bacteriano en una superficie sólida presenta características de cultivo llamadas: morfología colonial.

Una colonia se define como una masa visible de microorganismos, todos originados de una sólo célula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias, todas genéticamente similares.

Los siguientes adjetivos pueden usarse para describir la morfología colonial o características de cultivo:

1) Tamaño: medido en milímetros; menos de 1mm = puntiforme

2) Forma: Circula, Irregular, Filamentosa, Rhizoide y Ondulada

3) Margen: (la forma del contorno de la colonia): Entero, Ondulada, Lobada, Irregular, Concéntrica, Arrugado, Circular irradiado, Filamentoso (filiforme), Ciliado.

4) Propiedades ópticas: Opaca, Translúcida y Transparente y Brillante (mucoide).

5) Elevación: Elevada, Convexa, Plana, Gotiforme (forma de gota), Umbonada, Crateriforme.

Colonias de bajo crecimiento*

6) Textura: Suave, Granular, Tenaz, Mucoide.

7) Pigmento: Hialino a colores blanquesinos, y de amarillos a rojos.

Problemas respiratorios causados por B. anthracis

En los humanos es una enfermedad actualmente poco frecuente. Dependiendo de la vía de transmisión, produce dos clases de infecciones principales: una cutánea relativamente benigna y una respiratoria que compromete la vida del paciente. La infección cutánea se produce por contacto directo con animales infectados. La infección respiratoria requiere la vía inhalatoria, la cual, para ser efectiva, requiere que los esporas bacterianos sean aerosolizados. Por este motivo, esta vía raramente ocurre de manera natural y despierta la sospecha de intencionalidad (bioterrorismo), aunque se han asociado casos de ántrax inhalatorio con el procesamiento a gran escala de pelos y lana de animales contaminados realizado en espacios pequeños y cerrados. Excepcionalmente se produce una forma gastrointestinal por la ingesta de esporas bacterianas, a partir de carne contaminada. No es transmitida de persona a persona.

El carbunco cutáneo se produce por contacto de la piel con material infectado. Los ésporos ingresan a través de una lesión de la piel. Al ser ingeridos por los macrófagos en el sitio de entrada, los ésporos germinan y las células se multiplican produciendo cápsula y toxinas. El carbunco pulmonar ocurre cuando las esporas ingresan a la vía aérea y se depositan en los espacios alveolares, donde son fagocitadas por los macrófagos alveolares. En el interior de los mismos germinan y producen las toxinas, para ser luego transportadas por la circulación linfática a los ganglios mediastinales. Alcanzan el torrente sanguíneo pudiendo causar shock séptico. La germinación puede ocurrir hasta 60 días después del ingreso de las esporas a la vía respiratoria; de ahí la importancia de que la profilaxis antibiótica en casos de exposición se prolongue por 60 días. Se estima que la dosis inhalatoria letal para los seres humanos es de 2500 a 55000 esporas.

La infección cutánea, que comprende el 95% de los casos humanos, se manifiesta por una pápula indolora de centro color negro-azulado con un gran borde edematoso. Sin

tratamiento tiene un 20% de mortalidad. La infección pulmonar es una severa infección respiratoria que evoluciona a la insuficiencia respiratoria aguda y tiene una muy alta tasa de mortalidad (100% sin tratamiento). Es sensible a penicilina (aunque existen informes de unos pocos casos resistentes), eritromicina, tetraciclina, gentamicina, cloranfenicol y quinolonas.

Metodología

Realización de un muestreo de aire para microrganismos con el equipo MAS 100, MAS ECO y muestreo ambiental al aire libre.

1. Se tiene dos cajas Petri, una con Agar sangre y otra con Agar Mac Conkey. Para la caja de Petri con Agar Mac Conkey se hizo un muestreo al aire libre para cultivar microrganismos presentes en el medio ambiente y con la caja de Agar sangre se hizo muestreo con ayuda del equipo MAS 100 o MAS ECO que nos recolecta una cantidad de aire a un flujo constante con el fin de inocular microorganismos presentes en el aire, este muestreo se realizo dentro del laboratorio de microbiología.

Después de realizar estos dos muestreos introducimos las cajas en la incubadora con el fin de darles a los microorganismos la temperatura óptima para su crecimiento, estas cajas se dejaron por un periodo de 8 días para después observar el crecimiento en cada medio.

Resultados

Muestreo de aire

Colonias analizadas (3 extraídas de la muestra de aire tomada )

Imagen 1.Bacilos Gram positivos

Forma Tinción de Gram Textura Elevación Morfología colonial

Bacilos Gram positivos Suave Convexa FusiformeBacilos encapsulados

Suave Plana Puntiforme

Cocos Gram positivos Rugosa Plana convexa Racimos

DISCUSION DE ERESULTADOS

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/