Nicolás Cataldo – Pablo Fagúndez – Verónica López – Natalia Bobba - Lourdes Lebrato

Práctico 6: Inhibición por sustrato, sistema xantina oxidasa/xantina

Objetivo:

Estudiar la velocidad de reacción de un sistema enzimático con inhibición por sustrato y calcular los parámetros cinéticos.

Resultados:

En este práctico se midió la velocidad de reacción de la enzima xantina oxidasa (EC 1.2.3.2). Esta enzima participa en las fases finales del catabolismo de las purinas en mamíferos, catalizando la oxidación de la xantina a ácido úrico a expensas de la reducción de oxígeno, y presenta un fenómeno de inhibición por sustrato cuando las concentraciones de xantina son elevadas. Dicha inhibición provoca que la enzima presente una cinética que viene definida según la siguiente ecuación:

v=Vmax [S ]

Km+ [S ]+ [S ]2

Ki

Este fenómeno puede ser verificado de varias formas. Una de ellas es evaluar la velocidad de aparición de ácido úrico a concentraciones crecientes de xantina; sin embargo, este absorbe en la región ultravioleta del espectro y por tanto requiere de un espectrofotómetro capaz de medir en dicha región. Un modo alternativo es llevar a cabo la reacción en presencia de diclorofenolindofenol (DCFIF), quien podrá reemplazar al oxígeno al actuar como agente oxidante. El DCFIF es de color azul y absorbe en el espectro visible con un máximo a 600 nm, pero al reducirse pasa a una forma incolora; de este modo, la actividad enzimática de la xantina oxidasa puede ser evaluada al estudiar la desaparición del agente oxidante, observada cómo un descenso en la absorbancia a 600 nm. El siguiente esquema resume lo anterior:

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En el práctico se utilizaron concentraciones fijas de xantina oxidasa (1.5 µM) y DCFIF (0,04 mM), y concentraciones crecientes de xantina (5 µM, 7.5 µM, 10 µM, 50 µM, 100 µM, 500 µM, 1 mM, 2 mM, 3 mM y 4 mM). Para cada condición se midieron los valores de absorbancia a 600 nm cada 10-20 segundos, durante 2-3 minutos, por duplicado, de modo de estudiar la disminución de la concentración de DCFIF oxidado a lo largo del tiempo (vía relación de Lambert-Beer). Luego, a partir de los gráficos de concentración de DCFIF oxidado en función del tiempo se obtuvieron los valores de velocidad inicial catalizada por la enzima (representada por la pendiente del ajuste lineal de los datos). En la Figura 1 se detallan los valores de velocidad inicial obtenidos en presencia de concentraciones crecientes de xantina y el gráfico correspondiente.

Xantina (M) V (M.min)

0.000 0.002 0.004

0.0000000

0.0000007

0.0000014

v (M

.min

-1)

Xantina (M)

5.00 x 10-6 6.3395 x 10-8

5.00 x 10-6 6.5854 x 10-8

7.50 x 10-6 1.0244 x 10-7

7.50 x 10-6 1.2439 x 10-7

1.00 x 10-5 1.2196 x 10-7

1.00 x 10-5 1.1941 x 10-7

5.00 x 10-5 4.5746 x 10-7

5.00 x 10-5 5.479 x 10-7

1.00 x 10-4 8.6195 x 10-7

1.00 x 10-4 8.9122 x 10-7

5.00 x 10-4 1.4819 x 10-6

5.00 x 10-4 1.3967 x 10-6

1.00 x 10-3 1.442 x 10-6

1.00 x 10-3 1.4605 x 10-6

2.00 x 10-3 1.1786 x 10-6

2.00 x 10-3 1.2451 x 10-6

3.00 x 10-3 1.1546 x 10-6

3.00 x 10-3 1.1016 x 10-6

4.00 x 10-3 1.1395 x 10-6

4.00 x 10-3 1.0136 x 10-6

Figura 1. Tabla de valores de Velocidad inicial de reacción (M.min -1) en función de la concentración de xantina (M) y gráfico correspondiente

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El gráfico de la Figura 1 muestra un comportamiento típico de un sistema enzimático con inhibición por sustrato, acorde a lo esperado. La línea en el gráfico representa el ajuste a la ecuación definida anteriormente, y a partir de este fue entonces posible obtener los parámetros cinéticos Vmax = (2.07 ± 0.09) x 10-6 M.min-1, KM = (1 ± 0.1) x 10-4 M y Ki = (34 ± 4) x 10-4 M.

En caso de no contar con un programa capaz de realizar el ajuste no lineal del gráfico presentado en la Figura 1, los parámetros aún pueden determinarse mediante los métodos de ajuste lineal. Entre ellos se destacan los gráficos de Lineweaver-Burk, de Dixon y de Hill.

Gráfico de Lineweaver-Burk: 1/v vs. 1/[xantina]

Se desprecian los valores obtenidos a altas concentraciones de sustrato y se obtiene una recta cuya intersección con el eje y representa el valor 1/Vmax y cuya intersección con el eje x representa el valor -1/KM. La recta obtenida fue: y = (72 ± 2)*x + (5 ± 2) x 105, de la cual se obtuvieron los valores Vmax = (2.0 ± 0.8) x 10-6 M. min-1 y KM = (1.4 ± 0.6) x 10-4 M.

Gráfico de Dixon: 1/v vs. [xantina]

Se desprecian los valores obtenidos a bajas concentraciones de sustrato y la intersección del ajuste lineal con el eje x representa el valor -Ki. La recta obtenida fue: y = (8.7 ± 0.8) x 107*x + (6.3 ± 0.2) x 105, de la cual se obtuvo Ki = (72 ± 0.7) x 10-4 M

Figura 2. Determinación de parámetros cinéticos mediante gráfico de Lineweaver-Burk: 1/v vs. 1/[xantina]

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Figura 3. Determinación de parámetros cinéticos mediante gráfico de Dixon: 1/v vs. [xantina]Gráfico de Hill: Ln (Vmax – v) vs. Ln [xantina]

Se observan dos tendencias lineales, una de pendiente positiva a valores bajos de concentración de sustrato, cuya intersección con el eje x representa el valor Ln KM; y otra de pendiente negativa a valores altos de concentración de sustrato, cuya intersección con el eje x representa el valor Ln Ki. Las rectas obtenidas fueron y = (0.94 ± 0.03)*x + (8.1 ± 0.3), de pendiente positiva, de la cual se obtuvo KM = (1.84 ± 0.09) x 10-4 M, y por otro lado y = -(0.7 ± 0.1)*x + -(4.4 ± 0.8), de pendiente negativa, de la cual se obtuvo Ki = (25 ± 0.6) x 10-4 M

Figura 4. Determinación de parámetros cinéticos mediante gráfico de Hill: Ln (Vmax – v) vs. Ln [xantina]

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La Tabla 1 resume los valores de los parámetros cinéticos obtenidos mediante el ajuste no lineal y los ajustes lineales recién descritos:

Ajuste no lineal Lineweaver-Burk Dixon HillVmax (M.min-1) (2.07 ± 0.09) x 10-6 (2.0 ± 0.8) x 10-6 - -KM (M) (1 ± 0.1) x 10-4 (1.4 ± 0.6) x 10-4 - (1.84 ± 0.09) x 10-4

Ki (M) (34 ± 4) x 10-4 - (72 ± 0.7) x 10-4 (25 ± 0.6) x 10-4

Como se puede apreciar en la Tabla 1, los valores de Vmax y K M obtenidos a partir del ajuste no lineal y de los ajustes resultan muy similares. No es el caso de los valores de K i de los que podría decirse presentan una diferencia significativa, siendo el valor obtenido a partir del gráfico de Dixon el más alejado al obtenido mediante el ajuste lineal. La mejor aproximación del gráfico de Hill puede deberse a que este último utiliza la escala logarítmica, lo que conduce a un error experimental menor en la determinación de K i en base a la intersección de la recta con el eje x.

Posteriormente se analizó la variación de la velocidad de reacción en función de de concentraciones variables de enzima, a dos concentraciones fijas de sustrato (xantina). Los resultados se muestran en el gráfico de la Figura 4.

Figura 4. Velocidad de reacción en función de concentración de xantina oxidasa a dos concentraciones fijas de xantina (10 µM y 100 µM)

En este gráfico se puede observar que a medida que aumentamos la cantidad de enzima, la velocidad aumenta de forma lineal, como era de esperarse.

El ensayo realizado a [xantina] = 100µM ocurre en condiciones de Vmax (ver Figura 1), y dado que Vmax=kcat .[E], la pendiente del gráfico representará el valor de Kcat de la enzima, a saber (1.77 ± 0.09) x 10-5 min-1

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A una [xantina] = 10µM, estamos por debajo de la Km de la enzima. Dado que v = kcat[E]T[xantina]/(Km + [xantina]), el grafico de v vs [E] representa una recta, cuya pendiente corresponde a kcat[xantina]/(Km + [xantina]), si [xantina] es muy baja, se puede simplificar la pendiente a kcat[xantina]/Km.

Conociendo Vmax es posible calcular la actividad por mL de enzima, según lo siguiente:

Vmax = 2.07x10-6 M.min-1 = 2.07 µM.min-1, dado que el volumen total de la reacción fue de 3 ml podemos determinar que se convierten 6.21µmol.min-1, y dado que se emplearon en el ensayo 100µl de enzima, dividiendo por esta cantidad obtenemos una actividad de 62.1 U.ml-1

En cuanto a posibles mecanismos capaces de explicar el tipo de inhibición observado, se pueden establecer diversas hipótesis. La xantina oxidasa cataliza la oxidación de xantina o hipoxantina a ácido úrico mediante un mecanismo de ping-pong, en donde el factor clave es el transporte electrónico: primero del sustrato a la enzima, y luego de la enzima reducida al O 2. Por lo tanto, si dicha cadena de transporte electrónico ve disminuido su flujo en alguno de estos dos pasos, la velocidad de catálisis se verá claramente afectada. Podría ocurrir que el exceso de sustrato diera lugar a la unión de más de una molécula al sitio activo al mismo tiempo, y que la formación de dicho complejo influyera negativamente en el transporte electrónico, por algún impedimento de tipo estérico u otro. Asimismo, el exceso de sustrato podría resultar en una “sobrerreducción” a nivel de alguno de los 3 centros redox presentes en el sitio activo, lo cual podría enlentecer la cadena de transporte electrónico llevando a una disminución o pérdida total de la actividad catalítica. Teniendo en cuenta lo anterior, y sabiendo que los centros redox del sitio activo (Fe-S, FAD y Mo) poseen metales de transición, podrían realizarse experimentos de resonancia paramagnética electrónica (EPR), en donde son activas las especies que poseen electrones desapareados, para estudiar como se ve afectado su estado de oxidación por el exceso de sustrato.