infeccion por hhv6 en transplantados renales: una controversia en el diagnostico julieta giménez...

INFECCION POR HHV6 EN INFECCION POR HHV6 EN

TRANSPLANTADOS TRANSPLANTADOS

RENALES:RENALES:

UNA CONTROVERSIA EN UNA CONTROVERSIA EN

EL DIAGNOSTICOEL DIAGNOSTICO

Julieta GiménezJulieta GiménezCarolina CarrizoCarolina Carrizo

Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199

Hombre, 29 añosHombre, 29 años Enfermedad renal terminal por complicación de DBT tipo IEnfermedad renal terminal por complicación de DBT tipo I

SerologíaSerología pre-Tx

PositivoPositivo NegativoNegativo

CMVCMV

HSVHSV

VZVVZV

EBVEBV

HHV-6HHV-6

Treponema palidumTreponema palidum

Toxoplasma gondiiToxoplasma gondii

HCVHCV

HBVHBV

HIVHIV

Infection with Herpesvirus 6 after Kidney-Pancreas TransplantInfection with Herpesvirus 6 after Kidney-Pancreas Transplant Benito N. et al, American Journal of transplantation 2004; 4:1197-1199Benito N. et al, American Journal of transplantation 2004; 4:1197-1199

IntroducciónIntroducción

El procedimiento El procedimiento quirúrgico se realizó sin inconvenientesquirúrgico se realizó sin inconvenientes

Profilaxis:Profilaxis:

Trimetoprima – sulfametoxasolTrimetoprima – sulfametoxasol

GanciclovirGanciclovir

Alta 13 días post-trasplanteAlta 13 días post-trasplante

Crea 1.3 mg/dl y Glu: 73 mg/dlCrea 1.3 mg/dl y Glu: 73 mg/dl


Caso ClínicoCaso Clínico

Caso ClínicoCaso Clínico

Días post-TxDías post-Tx

GBGB (cel/mm(cel/mm33))

HbHb (mg/dl) (mg/dl)

PlqPlq (/mm(/mm33))

1717 2222 3434 6161

91009100

10.5 10.5

145000145000

31003100

--

--

100100

77

-- MM

UU

EE

RR

TT

EE

ASTAST (UI/ml)(UI/ml)

ALTALT (UI/ml)(UI/ml)

FALFAL (UI/ml)(UI/ml)

GGTGGT (UI/ml)(UI/ml)

122122

222222

317317

9292

864864

11531153

11861186

416416

Progresión Progresión a a

normalizar normalizar las Ezlas Ez

CultivosCultivos sangre y sangre y orinaorina

LCRLCR SangreSangre

OtrosOtrospp65 (-) pp65 (-)

Biopsia HpBiopsia HpHHV-6 HHV-6

por PCRpor PCRSerologíasSerologías


HHV-6 HHV-6 GeneralidadesGeneralidades

FamiliaFamilia HerpesviridaeHerpesviridae, , subgruposubgrupo Betaherpesvirinae Betaherpesvirinae

DNA lineal doble cadenaDNA lineal doble cadena (160-162 Kb)(160-162 Kb)

NucleocápsideNucleocápside icosahédrica icosahédrica

(90-100 nm)(90-100 nm)

EnvolturaEnvoltura glicoproteglicoproteicaica

Variantes A y B (90% de Variantes A y B (90% de

homología)homología)

De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245


LATENCIALATENCIA


MonocitosMonocitos

Células progenitoras Células progenitoras de MOde MO

Tropismo celular:Tropismo celular:

• CerebroCerebro• Glándulas salivalesGlándulas salivales• HígadoHígado• EndotelioEndotelio

CD46CD46: : en todas las en todas las células nucleadascélulas nucleadas

Infección primariaInfección primaria

Niñez (6 meses – 1 año) 20% Sexta enfermedadNiñez (6 meses – 1 año) 20% Sexta enfermedad

Reinfección o reactivación en huesped inmunocomprometidoReinfección o reactivación en huesped inmunocomprometido

Trasplantados Organo Sólidos (TOS) – Incidencia 32 %Trasplantados Organo Sólidos (TOS) – Incidencia 32 %

Trasplantados de Médula Osea (TMO) – Incidencia 48 %Trasplantados de Médula Osea (TMO) – Incidencia 48 %

Reinfección o reactivación en huesped inmunocompetenteReinfección o reactivación en huesped inmunocompetente



Pruebas DiagnósticasPruebas Diagnósticas

SerologíaSerología IFIIFI

ELISAELISA

AislamientoAislamiento Cultivo convencionalCultivo convencional

Shell vial (cultivo rápido)Shell vial (cultivo rápido)

PCRPCR Cualitativa (linfocitos o plasma)Cualitativa (linfocitos o plasma)

SemicuantitativaSemicuantitativa

Cuantitativa Cuantitativa

Cuantitativa en tiempo realCuantitativa en tiempo real

Antigenemia Antigenemia Detección de Ag específicos en células Detección de Ag específicos en células mononucleares de sangre periféricamononucleares de sangre periférica

InmunohistoquímicaInmunohistoquímica

(IHC)(IHC)

p101 (HHV-6B)p101 (HHV-6B)

gp82 (HHV-6A)gp82 (HHV-6A)

Benito N. et al; Enferm Infecc Microbiol Clin 2003;21(8):424-32Benito N. et al; Enferm Infecc Microbiol Clin 2003;21(8):424-32

SerologíaSerología

Permite la detección de infección latente o seroprevalenciaPermite la detección de infección latente o seroprevalenciaPoblación adulta > 90% seropositivosPoblación adulta > 90% seropositivos

Infección primaria:Infección primaria: 4 veces IgG IFI ó 4 veces IgG IFI ó 1.6 veces IgG EIA 1.6 veces IgG EIA

Dockrell Dockrell et alet al, Transplantation 1999, Transplantation 1999 Lautenschlager Lautenschlager et alet al, Clin Infect Dis 1998, Clin Infect Dis 1998

Saxinger Saxinger et alet al, J Virol Methods 1988, J Virol Methods 1988

La detección de IgM es más controversial ya que puede La detección de IgM es más controversial ya que puede producirse tanto en infecciones primarias como en reactivacionesproducirse tanto en infecciones primarias como en reactivaciones

Dockrell Dockrell et alet al, Transplantation 1999, Transplantation 1999

DesventajasDesventajas: : NO DISTINGUE ENTRE VARIANTES NO DISTINGUE ENTRE VARIANTES NO ES DE UTILIDAD EN PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOSNO ES DE UTILIDAD EN PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOS

Aislamiento viralAislamiento viral

• Cultivo convencional:Cultivo convencional: Cocultivo de linfocitos del paciente con linfocitos de sangre de Cocultivo de linfocitos del paciente con linfocitos de sangre de

cordón umbilical activados y tratados con IL-2cordón umbilical activados y tratados con IL-2

Técnica laboriosa Técnica laboriosa (5 – 21 días)(5 – 21 días)Singh Singh et alet al, Ann Inter Med 1996, Ann Inter Med 1996

• Shell Vial:Shell Vial: Cultivo primario en fibroblastos humanos que permite la Cultivo primario en fibroblastos humanos que permite la detección de antígeno viral a las 24 - 72 hs.detección de antígeno viral a las 24 - 72 hs.

Singh Singh et alet al, Ann Inter Med 1996, Ann Inter Med 1996Singh Singh et alet al, Transplantation 1997, Transplantation 1997

PCRPCR

Técnica rápidaTécnica rápida

Elevada SensibilidadElevada Sensibilidad

PCR cualitativaPCR cualitativa Valor limitado en la correlación clínica y la infección activa Valor limitado en la correlación clínica y la infección activa

Secchiero Secchiero et alet al, J Infect Dis 1995, J Infect Dis 1995Singh Singh et alet al, Ann Inter Med 1996, Ann Inter Med 1996

Dockrell Dockrell et alet al, Rev Med Virol 2001, Rev Med Virol 2001

PCR cuantitativa, en tiempo real y multiplex PCRPCR cuantitativa, en tiempo real y multiplex PCR Permite detectar infección activa y distinguir entre variantesPermite detectar infección activa y distinguir entre variantes

Secchiero Secchiero et alet al, J Clin Microbiol 1995, J Clin Microbiol 1995Kidd Kidd et alet al, J Virol Methods 1998, J Virol Methods 1998

Emery Emery et alet al, Clin Infect Dis 2001 , Clin Infect Dis 2001 Gautheret –Dejean Gautheret –Dejean et alet al, J Virol Methods 2002, J Virol Methods 2002

ResumenResumenLatenciaLatencia

Célula no infectadaCélula no infectada Célula infectada productivaCélula infectada productiva

ReactivaciónReactivación ExpansiónExpansiónRespuestaRespuesta a la terapiaa la terapia

LatenciaLatencia Infección ActivaInfección Activa LatenciaLatenciaAislamiento Aislamiento viralviral -- ++ ++ --

PCR PCR cualitativa cualitativa plasmaplasma

-- ++ ++ --

PCR PCR cualitativa cualitativa leucocitosleucocitos

+/-+/- ++ ++ +/-+/-

PCR PCR cuantitativa cuantitativa leucocitosleucocitos

+/-+/- ++++ ++++++++ +/-+/-

Frecuencia de HHV-6 postFrecuencia de HHV-6 postTx de MOTx de MO

Método Muestra nInf. activa

(%)Estudio

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR

PCR,IHC

qPCR

qPCR

Cultivo

Cultivo

Cultivo

Cultivo

GB y BAL

GB y plasma

GB

GB y plasma

GB

GB, orina y saliva

GB y piel

GB y LCR

GB

GB

GB

GB

GB

41

92

22

61

37

57

57

74

20

82

22

26

25

46

42.5

60

28

ND

60

ND

78

ND

38

ND

46

48

Takatsuka et al (2003)

Imbert-Marcille et al (2000)

Maeda et al (1999)

Chan et al (1997)

Wang et al (1996)

Wilborn et al (1994)

Appleton et al (1995)

Ljungman et al (2000)

Cone et al (1999)

Yoshikawa et al (2002)


Kadakia et al (1996)


De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245ND: no determinadoND: no determinado


Frecuencia de HHV-6 postFrecuencia de HHV-6 postTx renales y renopancreáticosTx renales y renopancreáticos

Método Muestra n Inf. activa (%)

Estudio

PCR

qPCR

PCR, Serología

Cultivo, Serología

Cultivo, Serología

GB

GB

Orina y suero

GB

GB

107

52

30

32

65

ND

23

50

31

55

Pacsa et al (2003)

Kidd et al (2000)

Ratnamohan et al (1998)

Herbein et al (1996)


ND: no determinadoND: no determinado

TEST DIAGNÓSTICO DE TEST DIAGNÓSTICO DE REFERENCIA REFERENCIA

para detectar infección por para detectar infección por HHV-6HHV-6

Volin et al, British Journal of Hematology, 2004Volin et al, British Journal of Hematology, 2004

??

UN MÉTODO DE CULTIVO PARA UN MÉTODO DE CULTIVO PARA DIAGNÓSTICO DE HHV-6DIAGNÓSTICO DE HHV-6

ObjetivosObjetivos

Procesar las muestras de plasma y leucocitos de los Procesar las muestras de plasma y leucocitos de los mismos pacientes mediante Nested PCRmismos pacientes mediante Nested PCR

Realizar Shell vial para detectar HHV-6 en pacientes Realizar Shell vial para detectar HHV-6 en pacientes trasplantados trasplantados

Materiales y MétodosMateriales y Métodos

Total de muestrasTotal de muestras: : 3131 LLeucocitos (obtenidos por dextran) eucocitos (obtenidos por dextran) 31 P31 Plasmalasma

SerologSerologíía IgG HHVa IgG HHV--6 :6 : 1144 (+) (+), 1 (-), 1 (-)

PPacientes trasplantadosacientes trasplantados (15)(15)

RRenales enales ((1313))

RRenopancreenopancreááticos ticos ((22))

AntAntiigenemia pp65 genemia pp65 : : 15(-)15(-)

Diagrama de trabajoDiagrama de trabajo

Muestras de Muestras de Pacientes trasplantadosPacientes trasplantados

LLeucocitoseucocitos

Shell vialShell vial Nested PCRNested PCRNested PCRNested PCR

PlasmaPlasma

Materiales y MétodosMateriales y MétodosShell VialShell Vial

200 ul de 200 ul de leucocitosleucocitos

previamente previamente acondicionadosacondicionados

CentrifugaciónCentrifugación1 h – 2200 rpm1 h – 2200 rpm

37º C37º C

48 hs48 hs

1)1) Células de fibroblastos humanos crecidas en forma de monocapa Células de fibroblastos humanos crecidas en forma de monocapa

Presencia Presencia de Antígenode Antígeno

AcMo AcMo ARGENEARGENE

2)2) IFIIFI

Ac Antiratón marcadoAc Antiratón marcado

Secchiero et al. J Infect Dis.Secchiero et al. J Infect Dis.1995;171:273-801995;171:273-80

Materiales y MétodosMateriales y MétodosNested PCRNested PCR

1)1) ExtracciExtracción de ADNón de ADN Columnas comerciales (Qiagen)Columnas comerciales (Qiagen)

1er producto de amplificación 520 pb1er producto de amplificación 520 pb2do producto de amplificación 258 pb2do producto de amplificación 258 pb

Termociclador: Abbot LCXTermociclador: Abbot LCX

2)2) AmplificaciónAmplificación

3)3) ElectroforésisElectroforésis258 pb258 pb

Nested- PCRNested- PCR

1º Producto de 1º Producto de amplificaciónamplificación

(520 pb) (520 pb)

2º Producto de 2º Producto de amplificaciónamplificación (258 pb) (258 pb)

Primer Ext.Primer Ext.Primer ExtPrimer Ext.

Primer Int.Primer Int.Primer Int.Primer Int.

Secuencia TargetSecuencia Target

Sensibilidad : 0.012 DICT Sensibilidad : 0.012 DICT 50 50 / ml/ ml

Nested- PCRNested- PCR

Muestra:Muestra: PlasmaPlasma

Gel de agarosa 2%Gel de agarosa 2%

258 pb258 pb

Detección de HHV-6 en TxDetección de HHV-6 en Tx

PCR Leucocitos SHELL VIAL PCR Plasma

1 4 / 4 1 / 4 0 / 42 3 / 3 0 / 3 0 / 33 2 / 2 0 / 2 0 / 24 1 / 1 0 / 1 0 / 15 1 / 1 0 / 1 0 / 1

6 0 / 2 0 / 2 0 / 27 0 / 2 0 / 2 0 / 28 0 / 2 0 / 2 0 / 29 0 / 2 0 / 2 0 / 210 0 / 2 0 / 2 0 / 211 0 / 2 0 / 2 0 / 212 0 / 2 0 / 2 0 / 213 0 / 2 0 / 2 0 / 214 0 / 2 0 / 2 0 / 215 0 / 2 0 / 2 0 / 2

POSITIVOS / Total de muestrasPACIENTES

31 31 31Total

NEGATIVONEGATIVO

POSITIVOPOSITIVO

Serología pre-Tx

NDNDCMV, HSV I y II, EBVCMV, HSV I y II, EBV

CMVCMVHCV, HBV, HIV , HHV-6HCV, HBV, HIV , HHV-6

DonanteReceptor

ND: no disponibleND: no disponible

Paciente 1Paciente 1

Sexo masculino, 54 añSexo masculino, 54 añosos

Causa de Tx: Causa de Tx: Insuficiencia Renal CrInsuficiencia Renal Crónica secundaria a poliquistosis ónica secundaria a poliquistosis (desde 35 años) (desde 35 años)

Transplante renal con donante vivo relacionadoTransplante renal con donante vivo relacionado

Paciente 1Paciente 1

El paciente evoluciona favorablementeEl paciente evoluciona favorablemente

Se lo controla por consultorio externo a partir de la 2da Se lo controla por consultorio externo a partir de la 2da semana pos-Trasplantesemana pos-Trasplante

Sin datos clínicos relevantesSin datos clínicos relevantes

Semanas 2 4 8 24

PCR Leucocitos Positivo Positivo Positivo Positivo

SHELL VIAL Negativo Negativo Positivo Negativo

PCR Plasma Negativo Negativo Negativo Negativo

Pos-Trasplante

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

1-1- La frecuencia de La frecuencia de detección de HHV-6 en leucocitos por PCR detección de HHV-6 en leucocitos por PCR fue de 11/25 (44%), esto sugeriría infección fue de 11/25 (44%), esto sugeriría infección activa activa en 5 de en 5 de los pacientes estudiadoslos pacientes estudiados

22-- La PCR en plasma fue negativa en todos los pacientes y no La PCR en plasma fue negativa en todos los pacientes y no se encontraron se encontraron ssííntomas clntomas clíínicos asociados a nicos asociados a eenfermedad nfermedad porpor HHVHHV--66

33-- En 1/En 1/25 (4%)25 (4%) el Shell vial fue positivo con PCR positiv el Shell vial fue positivo con PCR positiva en la a en la misma muestra. Correspondería a un paciente que adquirió misma muestra. Correspondería a un paciente que adquirió infección primaria pos-trasplante. infección primaria pos-trasplante.

Esto no se correlacionó con enfermedadEsto no se correlacionó con enfermedad

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

44-- EEl Shell Shelll vial es una alternativa complementar vial es una alternativa complementariia a las a a las ttéécncniicas moleculares paracas moleculares para detectar la infeccidetectar la infeccióón activa por n activa por HHVHHV--66

5-5- Son necesarios Son necesarios estudios en forma longitudinal y prospectiva estudios en forma longitudinal y prospectiva con mayor ncon mayor núúmero de pacientesmero de pacientes evaluandolos a diferentes evaluandolos a diferentes tiempos Postiempos Pos--Trasplante con el finTrasplante con el fin de definir unde definir un algoritmo algoritmo diagndiagnóóstico para la infeccistico para la infeccióón activa por HHV6.n activa por HHV6.

AgradecimientosAgradecimientos

Bioq. Alfredo MartínezBioq. Alfredo Martínez

Dra en Biología Cristina VidelaDra en Biología Cristina Videla

Servicio de Virología (CEMIC)Servicio de Virología (CEMIC)

infeccion por hhv6 en transplantados renales: una controversia en el diagnostico julieta giménez...

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