indicadores biologicos y esterilización

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Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización Tecnología Farmacéutica II 1701 – Equipo 8 Bernal Albarrán Luis Daniel Pérez Pérez José Manuel Sánchez Flores Rosa María

Indicadores Físicos, Químicos y biológicos para la Esterilización

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Esterilización

La acción conseguida con la esterilización es la asepsia. Por tanto, un material aséptico es

un material estéril. Lo contrario es séptico que significa que está contaminado por virus,

bacterias y hongos. Con la esterilización se destruye toda forma de vida microbiana ya sea

vegetativa o de resistencia, por lo que no se puede utilizar sobre personas. Los objetos

que se someten a la esterilización son los utensilios críticos (instrumental quirúrgico,

sondas urinarias, implantes)

Esterilización Concepto estadístico

Cuando una población bacteriana es sometida a un proceso de esterilización que le

provoca la pérdida de la viabilidad, se observa una disminución progresiva en el número

de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición al agente

esterilizante. La muerte microbiana sigue un comportamiento de tipo exponencial, por lo

que se hace asintótico y nunca se llega a un número de microorganismos igual a cero.

N = N0. e - Kt

Donde N es el número de microorganismos viables, N0 es el número de microorganismos

viables iniciales, k es la tasa de muerte (min-1) y t es el tiempo de exposición al agente. El

coeficiente k es función de las condiciones de esterilización (temperatura, tenor de

humedad, concentración del agente químico) y de la resistencia del microorganismo al

proceso de esterilización. Si esta ecuación se transforma a base 10 resulta:

N = N0. 10 - t / D

En donde D (min) se denomina Tiempo de reducción decimal, esto es el tiempo requerido

para reducir la población microbiana un 90% o un orden de magnitud. El valor de D se

deduce cuando t=D y por lo tanto N=0.1 N0. Comparando las ecuaciones anteriores se

llega a que:

D = ln 10 / K = 2.303 / K

Esto significa que D está inversamente relacionado con k. Entonces, menores valores de D

significan una mayor tasa de muerte o una muerte más rápida.

Graficando el logarítmo del número de microorganismos sobrevivientes en función del

tiempo de exposición a un determinado agente esterilizante se obtiene una recta. La

pendiente está dada por -1/D y la ordenada al origen es log N0. Por lo explicado

anteriormente, la pendiente de la recta está determinada por las condiciones de

esterilización y de la resistencia del microorganismo.


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Cuando el log del número de

sobrevivientes es menor a cero se

habla de probabilidad de

sobrevivencia. Por lo tanto cuando el

valor de la probabilidad sea -1

significa que hay 0.1

microorganismos viables por unidad,

o correctamente expresado una

unidad contaminada por cada 10

unidades idénticas procesadas.

Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades

contaminadas es menor o igual a 10-6, esto es una unidad contaminada cada millón de

unidades idénticas procesadas.

A mayor número de microorganismos y/o resistencia de la población se necesitará mayor

tiempo de esterilización, o lo que es lo mismo mayor tiempo para alcanzar la probabilidad

de sobrevivencia.

Durante el proceso de esterilización por calor debe tenerse en cuenta que el tiempo de

esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima en el interior del

aparato (autoclave o estufa) y que generalmente el contenido de un autoclave puede

requerir tiempos más largos para alcanzar la temperatura de esterilización.

Hay diferentes métodos de

esterilización: físicos (por

medio de calor seco o

húmedo) y químicos

(utilizando óxido de etileno,

glutaraldehído). Para

controlar la esterilización

existen indicadores físicos,

químicos y biológicos. De

todo ellos, es conocido el uso

de Bacillus

Estearothermophilus como

indicadores biológicos para comprobar el grado de esterilización en autoclave.

Controles de Esterilización


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Son controles que se realizan sobre el método de esterilización. Monitorean o controlan si

el proceso de esterilización funciona correctamente. En la actualidad no es suficiente

someter los materiales al proceso de esterilización, sino que además se requiere cierto

grado de seguridad en la eficiencia del procedimiento. Los controles de esterilización se

pueden clasificar en tres grupos:

Controles de

Esterilización

Controles físico-químicos Monitorean el proceso de

esterilización Controles biológicos

Controles de

Esterilidad

Transferencia a medios de cultivo

Monitorean el material

esterilizado

Test de promoción del

crecimiento

Test de bacteriostásis

Filtración por membranas

1. Monitores físicos:

Son elementos incorporados al esterilizador como termómetros, manómetros de presión,

sensores de carga, válvulas y sistemas de registro. Estos monitores físicos son de gran

utilidad, pero no son suficientes como indicadores de esterilización. Deben ser calibrados

periódicamente.

Métodos físicos se dividen en:

- Calor seco: flameado, incinerado y horno Pasteur.

- Calor húmedo: Tindalización (calentamiento tres veces), uperización (hasta 150º C

durante 1 a 20 segundos. Tratamiento de productos lácteos) y autoclave (vapor saturado a

presión).

- Radiaciones ionizantes: rayos X, rayos gamma y rayos ultravioleta (UV tiene una baja


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capacidad de penetración. Destruye bacterias y esporas).

- Filtración: Los filtros no destruyen las formas vitales, sino que las separan del resto.

Ejemplos: filtros de Berkelfeld, de vidrio poroso, de membrana.

Filtración por Membranas

Se utiliza para determinar la esterilidad de medios de cultivo, soluciones de antibióticos,

etc. Se filtran los medios y se procesa el filtro como en un control de esterilidad para

determinar si hay microorganismos presentes.

2. Indicadores químicos:

Los indicadores químicos son productos comerciales consistentes en sustancias químicas

que cambian de color si se cumple un elemento clave del proceso de esterilización como

por ejemplo la temperatura necesaria; un indicador es una sustancia natural o sintética

que añadida a la muestra sobre la que se desea realizar el análisis produce un cambio

físico que es apreciable por los sentidos (generalmente, un viraje de color). Este cambio en

el indicador se produce debido a que durante el análisis se lleva a cabo un cambio en las

condiciones de la muestra e indica el punto final de la valoración. Algunos indicadores

requieren más de un parámetro como cierto tiempo de exposición y humedad para

cambiar de color. Pueden ser fabricados de papel especial, cintas autoadhesivas o

consistir en tubos de vidrio con líquidos especiales. Todos estos indicadores tienen la

desventaja que pueden reaccionar cambiando de color aún cuando no se han dado los

parámetros necesarios para obtener la esterilización. Los indicadores químicos son

diferentes de acuerdo al proceso utilizado (calor seco, húmedo o gas).

3. Indicadores biológicos:

Un indicador biológico es una preparación caracterizada de un microorganismo específico

resistente a un proceso de esterilización en particular. Los indicadores biológicos se

utilizan como auxiliares en la operación de la calificación física de aparatos de

esterilización, en el desarrollo y establecimiento de un proceso de esterilización validado

para un producto, en la verificación periódica de esterilización validada de un equipo,

materiales y componentes de empaque que se empleen en procedimientos asépticos y en

programas de verificación periódica de ciclos de esterilización previamente establecidos y

documentados.

Los indicadores biológicos pueden presentarse principalmente en dos formas en las cuales

se utiliza un cultivo de un microorganismo de una especie conocida. En una de las

presentaciones, las esporas de adicionan a un soporte (disco o tira de papel filtro, vidrio o


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plástico) y se empaca tanto para mantener la integridad del soporte inoculado, como para

permitir que el agente esterilizante ejerza su efecto sobre el empaque individual. Otra

presentación es cuando las esporas se adicionan a unidades de lote por esterilizar

(producto sin inocular) o a unidades similares; el producto inoculado no afecta

negativamente las características de germinación de las esporas viables. Cuando el

producto por esterilizar es un líquido, en el cual no es práctico adicionar el indicador

biológico a las unidades seleccionadas, las esporas viables pueden agregarse a un

producto simulado cuya resistencia al proceso de esterilización no difiere a la presentada

por el producto por esterilizar.

Para utilizar efectivamente un indicador biológico, se precisa tener un conocimiento

completo del producto por esterilizar y de sus componentes (materiales y empaque) y

tener una idea general del número y tipos de microorganismos que constituyen la carga

microbiana presente en el inoculó inmediatamente antes de la esterilización. Cuando un

producto es más sensible a la esterilización se realiza una evaluación más extensa de la

carga microbiana. La selección del indicador biológico es crítica y requiere del

conocimiento de su resistencia al proceso específico de esterilización de tal manera que

cuando es utilizado bajo características de operación representa un desafío al proceso de

esterilización que excede al reto de la carga microbiana natural presente en el producto.

Las esporas seleccionadas para utilizarse como indicadores biológicos de un proceso en

particular, no necesariamente son adecuadas para emplearse en diferentes condiciones

del mismo o en otros procesos de esterilización.

Las características de un indicador biológico se definen utilizando aparatos especiales y

perfectamente calibrados, bajo condiciones estrictamente establecidas. Es importante

que todos los laboratorios usuarios de un indicador biológico dado tengan acceso a tales

aparatos. Las características de resistencia en condiciones de uso de un indicador

biológico pueden no ser idénticas a las mencionadas en la etiqueta, si se emplean

condiciones y aparatos de esterilización diferentes, el usuario averigua el efecto de tales

variaciones y utiliza apropiadamente el indicador biológico para el propósito requerido

como en la verificación periódica de ciclos de esterilización o en la validación de un

proceso de esterilización, esto es, certificar que la esterilización se llevo a cabo y con una

letalidad adecuada. No obstante en la mayoría de los casos, los ciclos de esterilización

pueden diseñarse usando como guía lo que indica la etiqueta y evaluando las

modificaciones necesarias debidas a las diferencias ya mencionadas en las condiciones de

esterilización del fabricante y del usuario. Mantener los aparatos y condiciones de

esterilización con especificaciones constantes de un ciclo de esterilización a otro para un

uso válido del indicador biológico.


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En los procesos de esterilización por vapor a ciertas temperaturas, se emplean

comúnmente esporas de cepas apropiadas de Bacillus stearothermophilus (ATCC 7953),

debido a la resistencia que presentan a esta forma de esterilización. En los procesos de

esterilización por calor seco u óxido de etileno, se emplean comúnmente esporas de una

subespecie de Bacillus subtillis (ATCC 9372). Las esporas de cepas de Bacillus pumilus

(ATCC 27142), han sido utilizadas como indicadores biológicos para verificación periódica

de procesos de esterilización por radiaciones ionizantes.

La preparación de la suspensión concentrada de esporas de los microorganismos

seleccionados, requiere del desarrollo de procedimientos apropiados que incluyan cultivos

masivos, cosechas y mantenimiento de la suspensión de esporas. La suspensión

concentrada contiene predominantemente formas inactivas (no germinativas) que se han

mantenido en medios líquidos no nutritivos. Es necesario tomar precauciones para

asegurar que la preparación de! indicador biológico no altera sustancialmente la

resistencia al proceso de esterilización de los microorganismos indicadores. El

funcionamiento del indicador biológico depende tanto de la cuenta inicial de esporas

viables, como de su resistencia al proceso de esterilización. Es importante, por tanto, que

el indicador biológico mantenga su interdependencia entre el número de esporas viables y

las características de resistencia a través de su período de vigencia. Un indicador biológico

preparado a partir de esporas de una cepa microbiana en particular y que se pretende;

utilizar en una variedad de ciclos empleando el mismo método de esterilización, puede

tener diferentes presentaciones: una clase que contenga un número relativamente grande

de esporas por inoculo o acarreador, digamos 106 o 107, requiere que el grado de

exposición a la esterilización, esto es, el número de valores D aplicados se determinen por

la cuantía de la reducción de esporas viables a través de una cuenta real. Otros

indicadores biológicos contienen solamente el número de esporas requerido para indicar

que e! ciclo validado ha sido aplicado. El resultado final necesario sería presencia o

ausencia de crecimiento microbiano cuando se cultiva la preparación del indicador

biológico. No se realiza una cuenta de esporas particularmente. Otros indicadores

biológicos pueden tener cantidades altas o bajas para aplicaciones especiales particulares

para verificar periódicamente la esterilización por vapor de instrumental quirúrgico

esterilizado en emergencias en el quirófano, cada forma de indicador biológico ha sido

validado para cada aplicación.

INDICADORES BIOLÓGICOS EN TIRAS DE PAPEL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO.

Son Preparaciones de esporas viables obtenidas a partir de un cultivo derivado de una

cepa específica de Bacillus subtillis subespecie niger (ATCC 9372), impregnadas en una tira

de papel de calidad satisfactoria, (un papel de calidad adecuada puede ser un papel filtro

de velocidad de filtración media puro y derivado del algodón; cualquier grado de oscurecí-


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miento sin desmenuzamiento no interfiere en su uso) empacadas

individualmente en un recipiente adecuado permeable al aire caliente, caracterizado

en su resistencia a la esterilización por calor seco y son empleados en programas para

calificar, validar y verificar periódicamente les ciclos de esterilización por calor seco

INDICADORES BIOLÓGICOS EN TIRAS DE PAPEL PARA ESTERILIZACIÓN POR VAPOR

Son preparaciones de esporas viables obtenidas a partir de un cultivo derivado de una

cepa especifica de Bacillus stearothermophilus impregnadas en una tira de papel de

calidad satisfactoria (un papel de calidad apropiada puede ser un papel filtro de

velocidad de filtración media, puro y derivado del algodón) empacadas

individualmente en un recipiente adecuado fácilmente permeable por el vapor, la

cepa se caracteriza por su resistencia a la esterilización por vapor. Estos indicadores son

empleados para calificar, validar y verificar periódicamente ciclos de esterilización por

vapor. Si el indicador biológico tiene una concentración de esporas declarada de 5 xlO-3

esporas a menos de 5 xlO6 esporas por tira y se sujeta a condiciones de esterilización por

vapor a I21°C ± 0,5°C tiene un valor D entre 1,3 y 1,9 min, un tiempo de sobrevivencia no

menor 3.9 min y un tiempo de muerte no mayor a 19 min. Si se tiene ora concentración

de esporas declarada y se sujeta el indicador a esterilización por vapor de 121°C ±

0,5°C tiene un valor D entre 1.3 min y 1,9 min y los tiempos de muerte y de sobrevivencia

que corresponden a los especificados en la Tabla 31 para varias concentraciones de

esporas. Si los indicadores son recomendados para temperaturas de esterilización

diferentes cumplen con las especificaciones anteriores cuando se sujetan a condiciones de

esterilización de 121 ± 0.5°C. Evaluar al indicador biológico en una cámara provista de

dispositivos que permitan verificar y controles que permitan regular la temperatura, el

tiempo y la presión de vapor. Evaluar al indicador biológico en una cámara provista de

dispositivos que permitan verificar y controles que permitan regular la temperatura, el

tiempo y la presión de vapor. El contenido de aire dentro de la cámara es

reemplazado completamente por vapor en un máximo de 10 s. hasta alcanzar una

temperatura de 121,5°C ± 0,5"C con la correspondiente presión de vapor saturado,

cuando la cámara se vacía se alcanza la presión atmosférica en no menos de 5 s

Determinación de los tiempos de sobrevivencia y de muerte: tomar 200 muestras del

indicador biológico cuatro recipientes adecuados, distribuirlos en la cámara de empaque

individual repartidas en números iguales en dos o cuatro recipientes adecuados de

esterilización, se calibra previamente a su uso con cámara expuestos a las condiciones de

esterilización establecidas. La esterilización en una posición específica para que estén los

recipientes pero sin muestras, durante por lo menos 60 min. Para realizar la prueba,

precalentar la cámara a la temperatura especificada, mantenerse así durante 5 min


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Debe enfriarse la cámara y abrirse la puerta lo más pronto posible, una vez abierta la

puerta, introducir inmediatamente él o los recipientes con las muestras, esta operación no

dura mucho establecer la temperatura deseada y mantener ésta durante el tiempo

seleccionado por más de 5 s. Aumentar la presión hasta obtener la temperatura por un

período de exposición para la determinación de los tiempos de sobrevivencia y de muerte,

se selecciona dependiendo de la concentración de esporas para un indicador , una

temperatura de esterilización de 121°C± 0,5°C y un biológico con una concentración de

esporas de 1 x 106 por tira valor D de 1,6 mm, el tiempo de exposición es de 5 min,

transcurriendo éste, la cámara es enfriada lo más pronto posible, y el o

los recipientes con las 100 muestras se extraen. Para determinar el tiempo de

muerte, repetir el procedimiento inmediatamente con las 100 muestras

restantes, en caso de ser necesario precalentar la cámara. Para el ejemplo dado exponer

durante 16 min a la temperatura especificada. Terminado e! ciclo de prueba y de

transcurrir 1 h, sembrar las ultras en tubos que contengan 10 mL de caldo de soya-

tripticaseína . Incubar los tubos entre 55°C y 60°C y observarlos diariamente, hasta

completar siete días de incubación. La prueba es satisfactoria si todos los tubos

sembrados con las muestras expuestas para determinar el sembrados con las muestras

expuestas para determinar el tiempo de sobrevivencia muestran crecimiento específico de

Bacillus stearothermophilus y si en ninguno de los tubos inoculados con las tiras

empleadas para determinar tiempo de muerte presentan crecimiento.

Selección de indicadores para procesos de esterilización específicos.

La selección de un indicador biológico requiere el conocimiento de la resistencia del sistema indicador biológico con respecto al proceso de esterilización específico. Se debe establecer que el sistema indicador biológico ofrece mayor resistencia al proceso de esterilización que la correspondiente a la carga microbiana natural presente en el producto. El uso eficaz de indicadores biológicos en el ciclo de desarrollo, proceso y validación del producto y en el control de la producción de rutina de un proceso de esterilización requiere un profundo conocimiento del producto que se va a esterilizar y de sus componentes. En el desarrollo o la validación de un proceso de esterilización solo se deben usar los indicadores biológicos ampliamente reconocidos en la monografía del indicador biología específico.

Calor húmedo: con frecuencia se utilizan esporas de cepas adecuadas de Bacillus stearothermophilus, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis y Bacillus coagulans.

Calor seco: Algunas veces se emplean esporas de Bacillus subtillis.

Radiación ionizante: las esporas de Bacillus pumilus se han usado para controlar los procesos de esterilización que emplean radiación ionizante; sin embargo, esta practica se esta abandonando.


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Óxido de etileno: habitualmente se emplean esporas de una subespecie de Bacillus subtilis.

Peroxido de hidrógeno en fase de vapor: Bacillus sterothermophilus es el indicador biológico mas utilizado para validar el proceso.

Transferencia Directa a Medios de Cultivo

Se transfiere una parte de la muestra a medios de cultivos apropiados que permitan el

crecimiento de cualquier contaminante.

Tioglicolato para anaerobios y aerobios (37°C).

Soya-Tripticaseína para aerobios (25°C).

Las muestras representativas se incuban en estos medios durante un período de 14 días,

al cabo del cual no se debe observar ningún tipo de crecimiento.

Puede ocurrir que la muestra no se encuentre estéril pero que no se produzca crecimiento

durante la incubación por algún motivo inherente al medio o a la muestra, por ejemplo

presencia de algún inhibidor, etc.

Promoción del Crecimiento

Es un testigo del control de esterilidad. Son testigos que se utilizan para los medios de

crecimiento del control ya que estos medios tienen capacidad de promover el

crecimiento. Para estos testigos se utilizan microorganismos con exigencias nutricionales.

Los medios deben ser inoculados con un bajo número de microorganismos, se incuban

durante 7 días, al cabo de los que se debe observar un abundante crecimiento.

Observación e interpretación de resultados.

A intervalos durante el periodo de incubación, y al momento de su finalización, examinar los medios en busca de evidencias macroscópicas de crecimiento microbiano. Si no se hallan evidencias de crecimiento bacteriano, el producto examinado cumple con la prueba d esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba d esterilidad, a menos de que pueda demostrarse claramente que la prueba resulto invalida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba puede considerarse inválida solo si se cumplen una o más de las siguientes condiciones:

Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla.

Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela una falla.


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Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.

Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o especies) puede atribuirse de manera equivoca a fallas con respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedimiento de la prueba de esterilidad.

Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo numero de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba d esterilidad.

Bacteriostásis

Es un control que se realiza para determinar si la muestra supuestamente estéril no posee

propiedades bacteriostáticas. De esta forma se previenen falsos negativos pues no se

produce crecimiento habiendo en la muestra microorganismos viables. Para este test se

toman los medios de cultivo con microorganismos de ensayo y se siembran en las

muestras a testear. Se incuban durante 7 días. Si se produce crecimiento esto indica que el

material no contenía inhibidores.

BIBLIOGRAFÍA

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