identificacion de microorganismos agua.pdf

M I C R O B I O L O G Í A A M B I E N T A L U T LA S E S O R A :

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ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLOPROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

GRUPO

QU- 304

MATERIA

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

TÍTULO

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA

ASESORA

Dra. ROSA RICO MATA

DATOS DE IDENTIFICACIÓN DE LOS ANALISTASFecha de inicio del análisis: 1 de Julio del 2015Fecha de termino: 9 de Julio de 2015

Nombre CargoMaría Guadalupe Regina Salas Padilla Responsable

Víctor Manuel Guadalupe Piña Cardona Administrador

Andrés Ramírez Sánchez Laboratorista 1

Noé Miguel Ángel Pedroza Díaz Laboratorista 2

Jorge Rentería Aldana Laboratorista 3

GENERACIÓN: 2014-2016


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DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO1.- Breve descripción del estatus ambiental del sitio de estudio: La muestra para el análisis microbiológico setomó de la planta tratadora de aguas residuales de la Universidad Tecnológica de León, en la cual llegandescargas de aguas a diario, las mismas que después del proceso en el que se someten son utilizadas para lasáreas verdes y para el drenaje de la misma universidad, de esta manera haciendo de esta una simbiosisambiental.

SITIO DEMUESTREO

Nombre Ubicación/coordenadas GPS

Imagen de mapa satelital

Planta Tratadora deagua residual de la

UTL

21.062997,-101.582700.

2. Evidencia fotográfica del sitioFecha:30 de Junio del 2015Hora:10:40 a.m.

Fecha:30 de Junio del 2015Hora:10:45 a.m.

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR1. Identificación

Matriz ambiental:Agua Hora de toma de muestra:10:40a.m. Hora de siembra:11:00 a.m.

Punto de Muestreo (ubicación /coordenadas GPS): Tiempo de exposición (aplica solo para muestra deaire)

Nombre del/ los analistas que tomaron la muestra:NoéMiguel Ángel Pedroza Díaz

Nombre del/ los analistas que sembró lamuestra:Andrés Ramírez Sánchez

2.Parámetros FisicoquímicosColor:Café Temperatura (oC) ambiental: 20 º CpH:5

Olor: Materia orgánica en descomposición y hecesfecales.

Describir condiciones climatológicas:Soleado

3. Evidencia fotográfica del sitio de toma de muestra


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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

1. Justificación del proceso para la identificación bacterianaLa identificación de una bacteria que interviene en un ciclo biogeoquímico es de suma importancia ya que seestudia su proceso metabólico, que nos permite conocer la manera en la que asimila los nutrientesproporcionados por el micromedió ambiente en donde se encuentre, sobre todo a conocer que mecanismosmetabólicos utiliza para degradar o transformar sustancias orgánicas o inorgánicas que se encuentran disueltasen el agua y cuya función del microorganismo es retirarlas de dicha matriz como un proceso de depuración deagua, y por lo tanto se debe de aislar en un medio selectivo para poder hacer las pruebas correspondientespara su identificación, para después poder implementar el microorganismo en un proceso de Biorremediaciónsi es que sus propiedades metabólicas pudiesen favorecer al mismo.

2. Dos medios de siembra (Nombre y Composición)Agar Triple Azúcar de Hierro Agar Kliger de Hierro

gr/lt gr/lt

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)Descripción

Imagen Imagen

1.- Peptona de Carne ……………. 13 g

2.- Cloruro de Sodio ………………. 5 g

3.-Lactosa ……………………………….10 g

4.-Tripteina …………………………… 10 g

5.-Glucosa ………………………..……. 1 g

6.-Citrato de Hierro y Amonio…… 0.5 g

7.-Tiosulfato de Sodio ……………… 0.3 g

8.-Rojo de Fenol …………………… 0.025 g

9.-Agar …………………………………… 15 g

1.- Extracto de Carne……………………. 30 g2.- Pluripeptona ………………………….. 20 g3.- Cloruro de Sodio ……………………… 5 g4.- Lactosa …………………………………… 10 g5.- Sacarosa……………………………………. 10 g6.- Glucosa ……………………………………....1 g7.- Sulfato de Hierro y amonio ……….0.2 g8.- Tiosulfato de Sodio …………….…..0.2 g9.- Rojo de Fenol ………………………….. 0.025 g10.-Agar

Crecimiento de colonias de una formapuntiforme, con bordes ondulados, yuna superficie convexa lisa y cremosa.

Descripción

Crecimiento de colonias de una formapuntiforme, con bordes ondulados, y unasuperficie convexa lisa y cremosa.


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3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y composición)Agar Triple Azúcar de Hierro (medio 1) Agar Mac Conkey (medio 2)

gr/ litro gr/ litro

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)Descripción

Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mmaproximadamente de Shigella Flexneri

Descripción

Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mmaproximadamente, regreso en Shigella flexneri

Imagen Imagen

1.- Peptona ……………………….. 1.5 g

2.- peptona de gelatina.……….17.0 g

3.-Lactosa ………………………….. 10 g

4.- Mezcla de sales biliares ….1.5 g

5.- Cloruro de Sodio ……………. 5 g

6.-Agar ………………………………… 13.5 g

7.-Rojo Neutro …………………….. 0.3 g

8.-Cristal Violeta ………………….. 0.001 g

1.- Extracto de Carne……………………. 30 g

2.- Pluripeptona ………………………….. 20 g

3.- Cloruro de Sodio ……………………… 5 g

4.- Lactosa …………………………………… 10 g

5.- Sacarosa……………………………………. 10 g

6.- Glucosa ……………………………………....1 g

7.- Sulfato de Hierro y amonio………..0.2 g

8.- Tiosulfato de Sodio …………….…..0.2 g

9.- Rojo de Fenol ………………………….. 0.025 g

10.-Agar


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4. Procedimiento de Aislamiento(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)

Materiales y equipo 1 parrilla de calentamiento 1 agitador de vidrio 2 matraces Erlenmeyer 250 mL 2 vasos de precipitado 250 mL 3 cajas Petri

Reactivos y medios de cultivo Agar triple azúcar de hierro

Preparación de medios de cultivo:

Pesar 6.25 g de Agar Triple Azúcar de Hierro y disolverlo en 100 mL de agua destilada y calentarlodurante 1 minuto o hasta que el medio se disuelva completamente en el agua, después llevar aesterilizar durante 15 minutos a 120 º C, en condiciones estériles distribuir el medio en las placas Petri(Aproximadamente 33. 33 mL en cada caja), se necesitan 3 cajas; una para la siembra, otra para laresiembra y una tercera de control. Una vez que se repartió el medio se dejan solidificar.

Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, selección de la colonia y resiembra):

Siembra: Una vez que se distribuyó el medio en las placas, se toma la muestra de agua de la planta detratamiento de aguas residuales de la UTL ya previamente recolectada, con ayuda del mechero seesteriliza el asa metálica de nicromo y se toma un poco de la muestra, después esta se distribuye en elmedio por el método de estriado, como se muestra en las siguientes imágenes y se pone a incubar a 37° C de 18 a 24 horas.

Selección de la colonia: Después del periodo de incubación se observa el crecimiento que hubo en elmismo y verificar que la morfología de las colonias sean las que se pretenden identificar puesto que enun medio de cultivo pueden crecer diferentes tipos de bacterias, ya que se verificó que la colonia quese busca identificar se elige la que haya quedado aislada de las demás, de esta manera lograr uncultivo selectivo para su resiembra.

Resiembra: Se hace una división en la placa seleccionada para la resiembra, esta se marca por debajode la misma con ayuda de un marcador, para poder hacer dos estriados y aislar dos coloniaspreviamente seleccionadas, cada una en su respectiva zona de la caja Petri con su crecimiento, conayuda del mechero se esteriliza el asa y se toman dos colonias y se siembran mediante el método yamencionado, se incuban a 37 ° de 18 a 24 horas.

2 charolas de pesado

1 espátula

Agua destilada

Mecheros Bunsen

Asas metálicas

Equipo para esterilización


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5. Esquema del Perfil bioquímico (metabólico )para la identificación del microorganismo seleccionado

Tinción de Gram

(-)

Prueba de Motilidad

Cápsula

Catalasa

Degradación de la Caseína (-)

Producción de Indol (-)

Prueba Rojo de Metilo (-)

Vogues Proskauer (-)

Producción de Gas (-)

Producción de ácido Sulfhídrico (-)

Degradación de Citratos (-)

(+))


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RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)Agar triple azúcar de hierro Agar triple azúcar de hierro

2. MORFOLOGÍA COLONIAL OBSERVADATipo de colonia 1: Descripción FOTO 1

Tipo de colonia 2: Descripción FOTO 2

Tipo de colonia 3: Descripción FOTO 3

Crecimiento abundante en el medio de cultivo,las colonias son incoloras y con una morfología debordes regulares y con una elevación convexa.

La colonia seleccionada tiene un bordeondulante, es incolora y tiene una superficieopaca.

.

Su transmisión de luz es opaca y tieneuna consistencia cremosa.


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3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO ( RESIEMBRA)FOTO 1

Agar Mac ConkeyFOTO2

Agar Mac Conkey

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

Descripción

La resiembra resultó muy favorable, estoquiere decir que el medio de cultivoseleccionado para la resiembra si fue elcorrecto para la bacteria que se deseabaaislar.En la foto 1 se puede observar las coloniasaisladas en las dos partes del medio, sepuede identificar claramente el estriadoque se realizó de una manera correcta, lascolonias están un poco pequeñas porqueaún les falta crecimiento, esta foto se tomódespués de 12 horas de incubación.

En la foto 2 se puede observar que lascolonias que ya crecieron un poco más,pues el estriado se alcanza a distinguirclaramente.

La foto 3 se tomó después de 24 horas deincubación que necesitan este tipo debacterias para su crecimiento por lo tantolas bacterias aisladas se alcanzan a verperfectamente.

FOTO 1

FOTO 2

FOTO 3


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5. EVIDENCIA FOTOGRÁFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUÍMICO

Nombre de laprueba

Medio de cultivoutilizado

Resultado obtenido(positivo/negativo) Evidencia fotográfica

1. Tinción deGram Negativo

Fundamento de la prueba

Es un tipo de tinción diferencial empleada en la microbiología para la visualización de bacterias.Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufredaño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para laretención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol ola acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados conmordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de lapared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite elescape del complejo de cristal violeta con yodo.

2. Prueba deMotilidad

1.- Agar SIM Positivo en el áreaanaerobia


La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la líneade inoculación. Esto se debe a la presencia de flagelos que le permiten desplazarse por el medio en busca dealimento. Puede ser en medio aeróbico o anaeróbico.


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3.- Prueba de Cápsula Negativo

La cápsula es una cubierta de grosor variable formada habitualmente por unidades de polisacáridos, proteínas oambos. Si está bien estructurada y se encuentra bien adherida a la célula, se le denomina cápsula; si por elcontrario, tiene estructura mal definida y su adhesión es débil, se le conoce como glicocálix. De acuerdo a suestructura química, puede ser flexible o rígida. La rigidez le confiere la característica de una matriz impermeable.Determina la adhesión a superficies (biopelículas), constituye una barrera de protección contra la fagocitosis y losanticuerpos e impide la desecación y la acción de otros agentes.

4.- Prueba de Catalasa1.- Aguaoxigenada Positivo


La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido dehidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que elmicroorganismo posee dicha enzima.

H2O2 + catalasa -------------------H2O + O2


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5.- Degradación de lacaseína

1.- Agar lechedescremada Negativo


Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche quele da el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada por las proteasas o enzimas que degradan esta proteína,desaparecerá el color blanco alrededor del crecimiento bacteriano.

6.- Producción de Indol 1.- Agua de Peptona Negativo


El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva del triptófano y esta reacción esllevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Paradetectar la producción de indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la prueba se realiza con elreactivo de Kovac’s, con el que el indol producido reacciona generando una coloración rosa intensa.

C11H12N2O2+ triptofanasa ---------- C8H7N + NH3 + C3H4O3 + energía


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7.-Prueba RM-VP 1.-Caldo RN-VPNegativo


La prueba de rojo de metilo detecta la fermentación acido-mixta, donde se acumulan acido relativamentefuertes (acético, fórmico, láctico, etc.) bajando así el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detectaañadiendo un indicador (rojo de metilo) al medio de cultivo

C6H12O6 + fermentación + rojo de metilo ------ ácidos + cambio de color

8.- VoguesProskauer

1.- Caldo RM-VP

Negativo


Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en lafermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo (alfa-naftol y KOH) sedetecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoÍna). La acetoÍna en presenciade oxigeno se oxida a diacetilo. El diacetilo origina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidÍnicosde algunos aminoácidos de la peptona del medio

C6H12O6 ---->C4H10O2 + C10H8O + KOH ----> C3H6O + O2 -- C4H6O2 + aminoácidos -- coloración roja


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9.- Producción degas CO2 y H2

1.- CaldoLactosado

Negativo


El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno mientras que la lactosa es el hidrato decarbono a fermentable. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas (CO2 y H2), el cual se evidenciaal utilizar campanas Durham).

C6H12O6C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

10.- Producciónde ÁcidoSulfhídrico

1.- Agar Kligerde Hierro Negativa

Fundamento de la pruebaEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan nutrientes adecuados para el desarrollobacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El rojo de fenol es elindicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance asmótico. Por fermentación de azucares, seproducen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medioacido. El Tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona luego con una sal de hierroproporcionado el típico sulfuro de hierro de color negro.

Na2S2O3 + Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa H2S + FeSO4 (sal de hierro) Fe2S3Azucares + rojo de fenol Ácidos + color amarillo


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11.- Pruebadedegradaciónde Citrato.

1.- Agar Citratode Simmons Negativo


En esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de Carbonopara su metabolismo y crecimiento. El medio de cultivo Citrato de Simmons incluye; citrato de Sodio, un anióncomo única fuente de Carbono y Fosfato de Amonio como fuente de Nitrógeno.La citrato permeasa permiten el transporte de citrato al interior de las células y la enzima citrasa convierte elcitrato en ácido pirúvico y CO2. El CO2 liberado se combina con el sodio y agua y forman carbonato de sodio quees alcalino cambiando el bromotimol de verde a azul intenso.

Citrato ---------------- Oxalacetato + Acetato

Piruvato + Acetato Reacción en pH ácido

2 Piruvato ----------------- Acetato + CO2 + Lactacto

2 Piruvato -- ---------------- Acetoína + 2 CO2

Reacción en pH básico

Citrato ------------------- CO2 + Ácido Fórmico + 2 Ácido Acético


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IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: AGUA

1.- Nombre científico del microorganismo identificado de acuerdo a los resultadosdel perfil bioquímico planteado ( genero y especie)

Shigella flexneri

2. Taxonomía del o los microorganismo identificadosSon Bacterias Anaerobias y Anaerobias facultativas.

Dominio: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Grammproteobacteria Orden: Enterobacteriales

3. Características generales

Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias deforma bacilar, no esporulados, inmóviles, pero animados de movimiento pendular (oscilación) in situ.

Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sinproducción de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. Nodescarboxilan la lisina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como única fuente de carbono. No crecenen el medio cianuro potásico. Su actividad bioquímica es muy reducida.

4. Conclusión parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz estudiada y la importancia de lamicrobiología en el área ambiental

El perfil bioquímico de la bacteria que fue aislada de la muestra de la planta tratadora de aguas residuales dela Universidad Tecnológica de León UTL, corresponde a una bacteria patógena (Shigella Flexneri), esta es unaentero bacteria Gram negativa, no esporulada, sin cápsula en su estructura celular, tiene una baja actividadbioquímica,. Sus enzimas son muy específicas, pues bajo esta serie de pruebas sólo fue identificada la catalasapues pudo descomponer el peróxido en agua más oxígeno, no hacen fermentaciones, algunas de ellas como loes la fermentación de lactosa, y la fermentación ácido-mixta, motivo por el cual las pruebas de RM-VPresultaron negativas, por otro lado tampoco asimila el citrato como única fuente de carbono lo cual indica queno posee la enzima que degrada el citrato en su batería metabólica.

La identificación de bacterias nos ayuda a entender cómo se lleva a cabo la purificación de un efluentecontaminado al entender el metabolismo catabólico de dichos microorganismos identificados y que seencuentran en un efluente contaminado es muy importante ya que ellos son los que se encargan de degradarla materia orgánica disuelta en el agua, como sabemos cuando hablamos de materia orgánica nos referimos alas biomoléculas como son proteínas, carbohidratos y lípidos que serian la fuente de energía y los nutrientesque necesita la bacteria para mantenerse viva y multiplicarse, al degradar esta biomoléculas e incorporarlas asu estructura celular, hace una limpieza al efluente convirtiéndose la materia orgánica disuelta en biomasa

Familia: Enterobacteriaceae Género: Shigella Especie: S.flexneri


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bacteriana que así ves puede ser el alimento de protozoarios que se encuentran en los lodos activados y queentran en contacto con el efluente contaminado, realizando una interacción microbiana benéfica para eltratamiento de aguas contaminadas.

Al identificar a un microorganismo nativo de una matriz ambiental ( suelo, el agua y el aire ) y entender sumetabolismo catabólico estamos generando conocimientos que nos pueden ayudar posteriormente a unaaplicación biotecnológica en el área ambiental y así poder proponer nuevos tratamientos innovadores debiorremediación.

identificacion de microorganismos agua.pdf

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