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Reuniones Técnicas de FontagroReuniones Técnicas de FontagroBogotá, 26 - 27 julio de 2006

Identificación de marcadores molecularesasociados con la resistencia a la pudrición de

cogollo en palma de aceiteFTG-58/99

Pedro León Gómez Cuervo, Ph.D.Pedro J. Rocha S., Ph.D.

• Fecha de aprobación: junio de 1999• Fecha de inicio: 1 julio de 2002• Fecha de terminación: 30 junio 2004

– Prórroga 1 hasta el 30 de diciembre de 2004– Prórroga 2 hasta el 5 de junio de 2005

• Coordinador General: Pedro L. Gómez C.• Ejecutor responsable: Pedro J. Rocha S.• Ejecutores asociados:

– CIAT (Colombia), Embrapa (Brasil), ASD y Coopeagropal(Costa Rica), INIAP y Palmeras del Ecuador (Ecuador)

Pudrición de Cogollo (PC)Pudrición de Cogollo (PC)

Sana PC Avanzado

PC: PC: GeneralidadesGeneralidades

• Clorosis y necrosis en las flechas.• Agente causal: Thielaviopsis paradoxa

(Nieto, 1996).• Factores abióticos predisponentes

– Climáticos (Acosta et al., 1996).– Edáficos.

Físicos (Burgos y Perdomo, 1997).Nutrición (Munévar y Acosta, 2002).

• Estrategias de control fallidas– Uso de fungicidas, cirugías, organismos

antagónicos, etc.

ComplejoComplejo de de pudriciónpudrición del del cogollocogollo

Distribución geográfica (según Fanqueville, 2001)

ObjetivoObjetivo

• Lograr que el proceso de mejoramientogenético de la palma de aceite porresistencia a la PC sea más rápido y efectivo.

Objetivos específicosObjetivos específicos

• Implementar y desarrollar el laboratorio de marcadores moleculares.

• Desarrollar experimentos de caracterización molecular de materialescon tolerancia o resistencia a la PC.

• Establecer alianzas con institucionesnacionales e internacionales.

ActividadesActividades

• Desarrollo de un taller con expertos en el tema– Instituciones participantes: CIAT, Iniap, Embrapa,

Cirad, Nifor, U. Cambridge– No participaron: Costa Rica, plantación de Ecuador

• Generación de recomendaciones para el desarrollo del proyecto

– Reorientación de objetivos y actividades.– Sugerencias y hechos:

• No se encontrará un marcador molecular asociado a la resistencia (al menos en los siguientes 10 años).

• Continuar con el proyecto y explorar nuevas posibilidades de investigación.


• Fortalecer la logística del Laboratorio – Compra de equipos– Solicitud de acceso a materiales biológicos– Gestión de convenios

• Desarrollar e implementar metodologías de marcadores moleculares

– Estandarizar metodología de extracción de ADN– Estandarizar metodologías RAPD, AFLP y SSR.


• Generación de nuevas estrategias experimentales

– Anáslisis de diversidad de materiales susceptibles y tolerantes a PC mediante herramientas moleculares

• E. guineensis de origen Africano (Angola)• E. oleifera de Amazonía Colombiana y Magdalena Medio• Híbridos interespecíficos OxG

– Evaluación de poliaminas como estrategia de control de la PC

– Participación en la discusión sobre la marchitez letal y surelación con la PC

ResultadosResultados

• Metodologías de marcadores molecularesimplementadas y utilizadas de manera rutinaria.

• Análisis de diversidad.– Materiales comerciales– E. guineensis proveniente de Angola– E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena

Medio• Generación de una práctica de manejo de la

enfermedad con poliaminas• Generación de convenios (Ecuador, Malasia).



• Análisis de diversidad.– Materiales comerciales – E. guineensis proveniente de Angola– E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena



Metodologías Implementadas

• Folíolos de hojas jóvenes• E. guineensis provenientes de los cruces (Palmar del

Oriente):– Ekona/ Deli x Ekona (20 muestras)– Ekona/ Deli x La Mé (20 muestras)– Tanzania x Avros (13 muestras) – Deli x Avros (14 muestras)

• E. guineensis IRHO (29 muestras), La Cabaña • E. oleifera (41 muestras) del banco de germoplasma• Total 137 muestras.


Método de extracción de ADN empleando fenol

• Emplea 3 g de tejido foliar• Se obtienen 3µg de ADN / g

de tejido• Utiliza fenol, cloroformo• Estable durante ocho días• Rocha (2001)


RAPD

• 137 muestras• 7 cebadores• 26 bandas por muestra• > 3500 bandas• Ausencia total de

polimorfismo• No se comprobaron

resultados de Ochoa (2000)

MP

DA1 DA2

DA3

DA4

DA5

DA6

DA7 DA8

DA9

DA1

0D

A11

DA1

2D

A13

DA1

4D

A15

DA1

6D

A17

DA1

8D

A19

1,000

1,650

300


Microsatélites

• 137 muestras• Veinte combinaciones de cebadores (Billotte et al., 2001)• 7124 bandas• Siete cebadores polimórficos


AFLP• 12 materiales• Siete combinaciones de

cebadores• 5748 bandas• 258 bandas polimórficos

EACT-MCAA

Conclusiones

• Dentro de E. oleifera se encuentra alta variabilidad genéticay es mayor que la que presenta E. guineensis.

• Los materiales de Angola poseen mayor variabilidad que la reportada para otros materiales E. guineensis

• No existe un marcador molecular de amplio espectro queagrupe a los individuos tolerantes a la PC.

• Las técnicas de AFLP y SSR son reproducibles y generanresultados complementarios . En ningún momento se presentan discrepancias.

• La relación beneficio costo define a la técnica de SSR como la más adecuada para el LCM.



• Análisis de diversidad.– Materiales comerciales – E. guinenesis proveniente de Angola– E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena



Poliaminas en PCPoliaminas en PC

1. Estudiar la relación entre el contenido de poliaminas y la pudrición de cogollo en palma de aceite.

2. Evaluar el efecto de la aplicación exógena de poliaminas en palmas afectadas por pudrición de cogollo.

Contenido endógeno de PAContenido endógeno de PA

cogollo

meristemo

Muestreo destructivo en palmas adultas

Detalle de los tejidos analizados

Resultados: Análisis CualitativoResultados: Análisis CualitativoParámetro TR (min) K Asym α N R

B u t A 9,1 ± 0,98 10,12 1,02 - 4935 -

P u t 9,7 ± 1,4 11,15 1,20 1,10 5425 1,80

S p d 12,8 ± 2,7 15,08 1,16 1,35 8254 9,21

S pm 20,3 ± 2,5 24,45 1,15 1,62 9246 10,37

Resultados: Contenido endógeno de PAResultados: Contenido endógeno de PA

Perfil cromatográfico de las PA presentes en una palma adulta sana. Meristemo

Perfil cromatográfico de las PA presentes en una palma adulta con PCA. Meristemo

Resultados: Contenido endógeno de PA en Resultados: Contenido endógeno de PA en COGOLLO (nmol/gpf)COGOLLO (nmol/gpf)

Edad Vivero (10 meses) Adultas (15 años) Estado Sana PCI Sana PCI PCA REC Put 45,2 67,2 95,6 71,0 43,6 108,1 Spd 24,8 26,1 35,8 20,6 14,9 34,8 Spm 4 6,8 12,2 7,2 5,3 9,3 PA total 74,1 100,2 143,6 98,9 63,8 152,3

La PC altera el contenido total de PA en el cogollo y el meristemo

Contenido endógeno de PAContenido endógeno de PA

Conclusiones

- Se detectó la presencia de Put, Spd y Spm libres en palma de aceite.- Las concentraciones de PA varían según el tejido, la edad y el grado de desarrollo de la PC.- La PC en la palma de aceite altera el contenido endógeno de PA.

- Aumenta en palmas de vivero- Disminuye en palmas adultas

AplicaciAplicacióón exn exóógena de PAgena de PA

Estrategia

• Determinar el efecto de la aplicación exógena de poliaminas sobre la prevención y/o recuperación de las palmas afectadas por la pudrición del cogollo.

Área total: 12 haEscala: 1:125

Aplicaciones exAplicaciones exóógenas de PAgenas de PA

Detalle de la inyección de soluciones de PAPerforación de la base peciolar

Resultados: Prevención de la PCResultados: Prevención de la PC

4060100Testigo104080100Spm 100960100100Spm 7584080100Spm 5076060100Spd 20064080100Spd 100580100100Spd 5044080100Put 20003

100100100Put 100028080100Put 50011261MesTRAT

% de palmas sin síntomas de PC

Aplicación de Put 1000 µM evitó la aparición de PC en palmas sanas

Resultados: Recuperación en PCAResultados: Recuperación en PCA

4000Testigo1080800Spm 1009

100800Spm 758401000Spm 507601000Spd 200640400Spd 1005

1001000Spd 504801000Put 2000360600Put 10002201000Put 50011261MesTRAT

% de palmas con PCA recuperadas

Aplicación de Spd 50 µM y Spm 75 µM indujeron la recuperación total en las palmas con PCA

Aplicaciones de PAAplicaciones de PA

Conclusiones

• Las palmas respondieron a la aplicación de PA con el sistema de perforación de la base peciolar

• La aplicación exógena de PA en palmas sanas previno el desarrollo de PC

– Put 1000 µM previno la aparición de PC en palmas sanas

• La aplicación exógena de PA en palmas con PC favoreció la recuperación

– Spd 100 µM indujo mayor recuperación en las palmas con PCI– Spd 50 µM y Spm 75 µM indujeron la recuperación total en las palmas con PCA

•Después de 24 meses de evaluación, las PA aplicadas no mostraron efectos sobre los componentes de productividad



• Análisis de diversidad.– Materiales comerciales – E. guinenesis proveniente de Angola– E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena



Visitas Técnicas

• A Ecuador– Iniap, Ancupa, Palmar del Río, Palmeras del Ecuador

• A Malasia– SDTC, MPOB, AAR, GH, UP, UKM,

• A Reino Unido– University of Cambridge, University of Nottingham– John Innes Centre, Sainsbury Laboratory

Fontagro: Fontagro: Indicadores Indicadores de de EjecuciónEjecución

Nombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidosExtracciones de ADN ejecutadas

Número - Aislamiento de ADN de mínimo 30 materiales susceptibles y 30 materiales resistentes a PC. Cada muestra con tres réplicas- Se emplearon 137 materiales.

Prueba molecular tipo RAPD

Número - Validación de tres de los cebadores reportados como polimórficos para PC. - Prueba de 20 cebadores - Cebadores A8, B12 y G10 fueron probados pero no fueron reproducibles.

Prueba molecular tipo AFLP (microsatélites)

Número - Mínimo cinco combinaciones de cebadores evaluadas en los 40 individuos contrastantes. - Introducción de SSR al laboratorio (20 micros).

Taller de trabajo Número - Definición de estrategias de trabajo con base en un taller internacional con expertos en el área de marcadores moleculares - Taller de MM y Visita Dra Airede llevados a cabo en Diciembre 2002.

Proyectos nuevos Número - Presentación de al menos un proyecto para financiación externa - Proyecto presentado a Colciencias (aprobado Cód. 7262-12-13788). - Proyecto Bioinformática presentado a Colciencias.

Tesis de Pregrado Número - Una tesis de pregrado aprobada. - Tesis meritoria para Diana Arias (UPTC, Febrero 2003). - Tesis MSc. Cristina Mendoza (Unal, 2003).

Continuación ...

Fontagro: Fontagro: Indicadores Indicadores de de EjecuciónEjecución

Nombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidos Seminario Número - Al menos un seminario en Universidad o Instituto acerca de la

investigación de Cenipalma en el área molecular. - Seminario Universidad Nacional (2) - Seminario Universidad de Cundinamarca - Seminario Semilleros de Investigación - Seminarios Malasia, Ecuador - Participación RedBio 2004 (Rep. Dominicana) - Seminario Reunión Anual Cenipalma (2)

Convenios Número - Ser miembro de una sociedad científica colombiana especializada en el área de ingeniería genética y/o biología molecular. (Si no existe tal sociedadparticipar en su creación). - Ser miembro de la iniciativa CENIS liderada por CIAT. - Creación de la Red Nacional de Ingeniería Genética. - Mayor participación en la Red Cenis (Página Web, propuestas de trabajo).

- Creación de un consorcio de bioinformática (Cenis, CIAT, IBUN, Von Humboldt, Sinchi).

Reportes Número

y fecha Informes técnicos 2 Informes financieros 5

Fontagro: Fontagro: Indicadores Indicadores de de ResultadosResultados

Nombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidos

Metodología para aislamiento de ADN

Número - Mínimo una metodología optimizada y reproducible. - Dos métodos para extracción con diferentes cantidadesde tejido.

Marcadores RAPD & AFLP y microsatélites

Número - Mínimo dos marcadores moleculares ligados a la resistencia a PC. - Se optimizaron metodologías pero no se encontró marcador alguno

Base de datos Número - Una base de datos relacional que integre información agronómica y de marcadores moleculares que sirva de apoyo a la selección de materiales. - Archivos creados - Dendrogramas

Fontagro: Fontagro: Indicadores Indicadores de de ImpactoImpactoNombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidos

Práctica de selección exitosa

Número - Aplicar la información obtenida con los MM para seleccionar poblaciones de material susceptible y resistente a PC en etapas de previvero. - No se desarrolló ninguna práctica para selección de material resistente a PC. - Se desarrolló metodología para incorporación de datos moleculares en el proceso de selección del programa de mejoramiento de Cenipalma.

Convenios Número - Convenio con INIAP y ANCUPA (?) - Convenio con NIFOR

Publicaciones Número - Journal of Oil Palm Research 17:167-174 (2005) –

Poliaminas. - Fitotecnia Colombiana 5(2)1-10 (2005) - Angola - Palmas 25(3): 11-27 (2004) – Resultados RAPD, AFLP y SSR. - Palmas 25 (especial): 39-48. - Palmas 25 (especial) 11-17 - Palmas 24(4): 9-20 (2003) - Fusarium - Palmas 24(3): 11-25 (2003) – Marcadores moleculares. - Palmas 23 (4): 39-46 (2002) – Revisión poliaminas. - Palmas 23(3):9-17 (2002) – Extracción de ADN. - Ceniavances 121:1-4 (2005) – Evaluación Angola. - Ceniavances 105:1-4 (2003) – Poliaminas. - Ceniavances 101:1-4 (2003) – Colecta Amazonas. - Ceniavances 100:1-3 (2002) – Marchitez letal. - Protocolos del LCM. (ISO-Colciencias)

EjecuciónEjecución PresupuestalPresupuestal

Presupuesto USD Total Gastos Cenipalma USD

0 Personal0,1 Salarios 0 113.939

Subtotal: 0 113.939

1 Equipamento1,1 Insumos 18.500 11.8221,2 Instrumentos y maquinaria 20.500 3.2661,3 Equipo de Computo 0 01,4 Contratos por "Obra especializada " 0 0

Subtotal: 39.000 15.088

2 Consultores o especialistas2,2 Honorarios 50.000 02,3 Viáticos 02,4 Seguros 0

Subtotal: 50.000 0

3 Viajes y viáticos (Personal Nacional)3,1 Viáticos 03,2 Pasajes 30.000 03,3 Arriendo de Vehículos 0

3.3.1 Combustible 03.3.2 Kilometraje 03.3.3 Desplazamiento a Aeropuertos 0

Subtotal: 30.000 0

4 Divulgación4,1 Publicaciones 6.000 04,2 Eventos 0 0

Subtotal: 6.000 0TOTAL GASTOS 125.000 129.027TOTAL INGRESOS 106.250DISPONIBLE 18.750

CATEGORIA

Agradecimientos

• Catherine Airede (Nifor)• Norbert Billotte (Cirad)• Edson Barcelós (Embrapa)• M.C. Duque, M. Fregene, J.

Tohmé (Ciat)• Rommel Vargas (Ancupa)• Digner Ortega (Iniap)

• Diana Arias• Carmenza Montoya• Cristina Mendoza• Fanny Fuentes• Jacqueline Sánchez• Marcelo Torres

Agradecimientos

• Plantaciones– La Cabaña, Palmar del Oriente

• Iniap, Ancupa, Ciat, Embrapa• Cirad, Nifor, Sdtc, Mpob• Colciencias• Fondo de Fomento Palmero• Fontagro

identificación de marcadores moleculares asociados con la ... · nombre del indicador unidad...

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