IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.

ASTRID CAROLINA BELLO MEDINA JESSICA FERNANDA SERRANO PEREZ

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA 2017

IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.

ASTRID CAROLINA BELLO MEDINA JESSICA FERNANDA SERRANO PEREZ

Trabajo de grado para optar al titulo de: Bacteriólogo y Laboratorista Clínico

Director de Tesis NÉSTOR FABIÁN GALVIS SERRANO

Asesor Científico DRA. NANCY GARCÍA Asesor Metodológico

M.Sc. JAEL CONTRERAS RANGEL

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA

22017

ADVERTENCIA

Los autores, Astrid Carolina Bello Medina y Jessica Fernanda Serrano Pérez autorizamos a la UNIVERSIDAD DE SANTANDER (UDES) la reproducción total o parcial de este documento, con la debida cita de reconocimiento de la autoría y cedemos a la misma Universidad los derechos patrimoniales con fines de investigación, docencia e institucionales, consagrado en el artículo 72 de la Ley 23 de 1982 y las normas que lo instituyan o modifiquen.

(Artículo 4°, Acuerdo 0066 de 2003)

DEDICATORIA

En primer lugar por darme la vida y tanta bendiciones recibidas como la de regalarme personas maravillosas como lo son mi Familia y Amigos.

A mis padres Miguel Eduardo Bello Duran y Nancy Medina Ibarra quienes me han dado amor, apoyo pero sobre todo han creído en mí.

A mi hermano Fabián Sneider Collantes Medina por todo su apoyo.

A nuestro director Fabián Galvis por su colaboración y por todo su conocimiento.

Astrid Carolina Bello Medina

DEDICATORIA

A Dios, por darme la oportunidad de vivir y por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.

Mis padres Emiro Antonio Serrano Angarita y Mirian Pérez Pineda por darme la vida, por quererme mucho, por creer en mí y porque siempre me apoyaron desde la distancia. Mil gracias por darme una carrera para mi futuro, todo esto se los debo a ustedes.

Mi hermana Nasly Susana Serrano Pérez, por estar conmigo y apoyarme siempre, te quiero mucho Susan.

A nuestro director Fabián Galvis por su colaboración y apoyo en el transcurso de la realización de nuestro proyecto de grado.

Jessica Fernanda Serrano Pérez

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a:

A la Universidad de Santander UDES por prestarnos sus instalaciones donde se logró desarrollar pasó a paso nuestro proyecto de grado.

A la Dra. Claudia Sofía Montejo, Coordinadora del programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, por estar siempre pendiente de nuestros avances académicos.

Al docente Jael Contreras por apoyarnos y guiarnos en la formación académica a lo largo de cada una de sus áreas.

A todas las personas que nos colaboraron en la toma de muestra para poder empezar con nuestro proyecto.

A las auxiliares del Laboratorio que siempre nos brindaron su colaboración.

GLOSARIO

Aedes aegypti: “es el principal vector de los virus que causan el dengue. Los seres humanos se infectan por picaduras de hembras infectadas, que a su vez se infectan principalmente al succionar la sangre de personas infectadas1”.

Arn: “ácido ribonucleico; es un componente químico que ayuda a transmitir la información genética contenida en el adn a las fábricas de proteínas localizadas en el citoplasma de las células2”.

Artralgias: “engloba todo tipo de dolores a nivel de las articulaciones. El dolor puede ser de origen mecánico, después de repetidos esfuerzos o inflamatorio3”.

Agente etiológico: “entidad biológica, física o química capaz de causar enfermedad4”.

Dengue: “es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos que se ha propagad o rápidamente en todas las regiones. Se conocen cuatro serotipos distintos, pero estrechamente emparentados, del virus: den-1, den-2, den-3 y den-45”.

Enfermedad reemergente: “son aquellas conocidas que aumentan después de una disminución significativa de la incidencia6”.

Epidemia: “manifestaciones de un número de casos de alguna enfermedad que excede claramente a la incidencia prevista en un periodo de tiempo determinado, en una colectividad o región7”.

Inmunidad: “estado de resistencia general asociado con la presencia de anticuerpos o células que poseen acción específica contra el organismo causante

                                                            1 MERCOSUR/GMC/RES. Nº 53/99. Glosario de terminología de vigilancia epidemiológica– Mercosur [Consulta: 29/08/2017] Disponible: http://www.bvs.org.ar/pdf/vigilancia.pdf 2 Ibid., p. 12 3 Ibid., p. 13 4 Ibid., p. 14 5 Ibid., p. 15 6 Ibid., p. 16 7 Ibid., p. 17

de una enfermedad infecciosa o contra su toxina8”.

Período de incubación: “es el intervalo de tiempo entre la exposición efectiva del huésped susceptible a un agente biológico o sus productos tóxicos y el inicio de los signos y síntomas clínicos de la enfermedad en ese huésped9”.

Portador: “persona o animal infectado que alberga un agente infeccioso especifico de una enfermedad, sin presenta síntomas clínicos de esta y constituye fuente potencial de infección”10.

Síndrome del guillain-barré: “en el síndrome de guillain-barré, el sistema inmunitario del organismo ataca parte del sistema nervioso periférico. El síndrome puede afectar a los nervios que controlan los movimientos musculares así como a los que transmiten sensaciones dolorosas, térmicas y táctiles. Esto puede producir debilidad muscular y pérdida de sensibilidad en las piernas o brazos”.

Transmisión autóctona: “significa que las poblaciones de mosquitos que residen en un área determinada están infectadas con el virus y comienzan a transmitirlo a las personas que estén en esa misma área”.

Vector: “ser viviente (insecto, roedor, etc.) Que asegura la transmisión de un agente infeccioso”.

Virus: “son pequeños pedazos de arn o adn, muchos están encapsulados en una envoltura echa a base de proteínas conocida como cápside, otros protegen su material genético con una membrana o envoltura derivada de la célula a la que infectan y algunos otro, además rodean su cápside con una membrana celular”.

                                                            8 Ibid., p. 19 9 MERCOSUR/GMC/RES. Nº 53/99. Glosario de terminología de vigilancia epidemiológica– Mercosur [Consulta: 29/08/2017] Disponible: http://www.bvs.org.ar/pdf/vigilancia.pdf

IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.

Autores

Astrid Carolina Bello Medina, Jessica Fernanda Serrano Pérez

RESUMEN

Los virus Dengue y Zika (flavivirus) son virus trasmitidos por artrópodos, arbovirus. Su importancia aumentó en las Américas en los últimos 20 años. Los vectores principales son Aedes aegypti y A. albopictus. El dengue es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos que se han propagado rápidamente en los últimos años. El virus del dengue se transmite por mosquitos hembra principalmente de la especie Aedes aegypti y, en menor grado, de Aedes albopictus. Estos mosquitos también transmiten la fiebre chikungunya, la fiebre amarilla y la infección por el virus de Zika. La fiebre por virus Zika (ZIKV) es una enfermedad febril, zoonótica, emergente de curso agudo, benigno y autolimitado; de origen selvático la cual es causada por el virus Zika. El virus de Zika es un flavivirus transmitido por mosquitos de la especie Aedes aegypti. Su sintomatología es inespecífica por lo cual puede confundirse con otros síndromes febriles y en varias ocasiones puede cursar de forma asintomática, o presentarse con un cuadro clínico moderado. Fue detectada en primates no humanos y en Aedes africanus en el año de 1947 en el bosque Zika en Uganda y por primera vez en humanos en Nigeria en 1954. El objetivo de este estudio es Determinar la presencia o ausencia de los virus Dengue y Zika en ARN aislado de muestras de suero mediante la amplificación por RT-PCR. La metodología utilizada fue el Aislamiento de ARN de las 93 muestras, utilizando el método de Trisure siguiendo el protocolo propuesto por la casa comercial Bioline, PCR por duplicado y finalmente la electroforesis en gel de Agarosa. Según los resultados obtenidos del estudio de 93 muestras analizadas de personas asintomáticas para el virus Dengue y Zika solo 1 muestra se logró determinar la presencia del virus Zika, lo cual no se considera un resultado significativo para ser un foco de transmisión. Con este estudio aportamos a la investigación la presencia del Virus Zika en personas asintomáticas de San José de Cúcuta, puesto que esta ciudad es considerada una zona endémica donde prolifera el zancudo del genero Aedes aegypti que transmite no solo este virus sino también el Dengue, la Fiebre Amarilla y el Chikungunya. Palabras Claves: Arbovirus; Zika; Dengue; Artrópodos; Exantema; Microcefalia; Aedes aegypti; RT-PCR.

TITLE: IDENTIFICATION OF DENGUE AND ZIKA VIRUS THROUGH RT-PCR IN ASYMPTOMATIC PEOPLE OF SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.

Authors

Astrid Carolina Bello Medina, Jessica Fernanda Serrano Pérez

SUMMARY Dengue and Zika viruses (flavivirus) are viruses transmitted by arthropods, arboviruses. Its importance has increased in the Americas in the last 20 years. The main vectors are Aedes aegypti and A. albopictus. Dengue fever is a viral disease transmitted by mosquitoes that has spread rapidly in recent years. Dengue virus is transmitted by female mosquitoes mainly of the species Aedes aegypti and, to a lesser extent, Aedes albopictus. These mosquitoes also transmit chikungunya fever, yellow fever and Zika virus infection. Zika virus fever (ZIKV) is a febrile, zoonotic, emerging, acute, benign and self-limiting disease; of jungle origin which is caused by the Zika virus. Zika virus is a flavivirus transmitted by mosquitoes of the species Aedes aegypti. Its symptomatology is nonspecific and can be confused with other febrile syndromes and can occur on several occasions asymptomatically or present with a moderate clinical picture. It was detected in non-human primates and Aedes africanus in the year 1947 in the Zika forest in Uganda and for the first time in humans in Nigeria in 1954. The objective of this study is to determine the presence or absence of Dengue and Zika viruses in RNA isolated from serum samples by amplification by RT-PCR. The methodology used was the Isolation of RNA of the 93 samples, using the Trisure method following the protocol proposed by the commercial house Bioline, duplicate PCR and finally the agar gel electrophoresis. According to the results obtained from the study of 93 samples analyzed from asymptomatic persons for the virus Dengue and Zika only 1 sample, it was possible to determine the presence of Zika virus, which is not considered a significant result to be a focus of transmission. With this study, the presence of the Zika Virus in asymptomatic people of San José de Cúcuta is investigated, since this city is considered an endemic zone where the mosquito of the genus Aedes aegypti proliferates, which transmits not only this virus but also Dengue, Yellow Fever and Chikungunya. Keywords: Arbovirus; Zika; Dengue; Arthropods; Exanthema; Microcephaly; Aedes aegypti; PCR.

CONTENIDO

pág.

INTRODUCCIÓN 19

1. PROBLEMA 21

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 21

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 32

1.3 OBJETIVOS 32

1.3.1 Objetivo general 32

1.3.2 Objetivo específico 32

1.4 JUSTIFICACIÓN 32

2. MARCO REFERENCIAL 34

2.1 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN 34

2.2 MARCO TEÓRICO 43

2.2.1 Taxonomía del virus dengue 43

2.2.2 Estructura del virus 43

2.2.3 Genoma del virus 43

2.2.4 Serotipos del virus 44

2.2.5 En el ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti ocurren tres etapas a saber huevos, larvas y adultos 44

2.2.5 Células 46

2.2.6 Etapas clínicas de la enfermedad 46

2.2.7 Clasificación del dengue 50

2.2.7 Taxonomía del virus Zika 51

2.2.8 Genoma del virus 52

2.2.9 Linajes del virus 52

2.2.10 Células Diana en la infección 52

2.2.11 Manifestaciones clínicas de la enfermedad 52

2.2.12 Diagnóstico diferencial 53

2.2.13 Prevención del dengue y Zika 54

2.3 MARCO CONCEPTUAL 54

2.4 MARCO LEGAL 56

2.5 MARCO CONTEXTUAL 56

2.6 SISTEMA DE HIPOTESIS 57

2.7 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES 58

3. MARCO METODOLÓGICO 59

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 59

3.1.1 Nivel de Investigación 59

3.1.2 Diseño de Investigación 59

3.2 MÉTODOS O PROCEDIMIENTOS 59

3.2.1 Materiales y equipos 59

3.2.2 Métodos 60

3.2.2.1 Diligenciamiento del consentimiento informado y la encuesta para la participación en el estudio. 61

3.2.2.2 Toma, transporte, adecuación y almacenamiento de muestras sanguíneas. 61

3.2.2.3 Comprobación especifica de cebadores empleando herramientas de bioinformática como el software en línea BLAST 61

3.2.2.4 Aislamiento de ARN utilizando el método de Trisure siguiendo el

protocolo propuesto por la casa comercial Bioline 61

3.2.2.5 RT-PC Múltiple para la identificación de Dengue y Zika 61

3.2.2.6 Electroforesis 65

3.2.2.7 Tabulación de las encuestas y análisis de los resultados moleculares. 66

3.3 POBLACIÓN Y MUESTRA 66

3.3.1 Población 66

3.3.2 Muestra 67

3.3.3 Definición de sujetos de estudio 67

3.3.4 Criterios de inclusión 67

3.3.5 Criterios de exclusión 67

3.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS 67

3.5 TECNICAS DE PROCEDIMIENTOS Y ANALISIS DE DATOS 68

4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 69

4.1 RESULTADOS 69

4.1.1 Presencia o ausencia de los virus dengue y Zika 69

4.2 DISCUSIÓN 72

5. CONCLUSIONES 75

6. RECOMENDACIONES 76

BIBLIOGRAFIA 77

ANEXOS 80

LISTA DE FIGURAS

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Figura 1. Ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti 46

Figura 2. Evolución de la enfermedad de dengue 50

Figura 3. Clasificación del dengue 51

Figura 4. Signos y síntomas asociados con dengue, Chikungunya y Sarampión 53

Figura 5. Universidad de Santander UDES Campus Cúcuta, a la derecha vemos su ubicación y a la izquierda una imagen de la Universidad 57

Figura 6. Amplificación por RT-PCR del virus Zika 72

LISTA DE CUADROS

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Cuadro 1. Operacionalización de las variables 58

Cuadro 2. Retrotranscripció 62

Cuadro 3. Cebadores específicos utilizados en la RT-PCR Múltiple para la identificación de Dengue 63

Cuadro 4. Mezcla de la PCR Múltiple 63

Cuadro 5. Programa de amplificación para el diagnóstico del virus Dengue PCR Múltiple 64

Cuadro 6. Cebadores específicos utilizados en la PCR para la identificación de ZIKA 64

Cuadro 7. Mezcla de PCR 65

Cuadro 8. Programa de amplificación para el diagnóstico de Zika por PCR Múltiple 65

Cuadro 8. Determinación de Dengue 69

Cuadro 9. Determinación de Zika 71

LISTA DE GRÁFICAS

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Gráfica 1. Determinación de Dengue 69

Gráfica 2. Determinación de Zika 71

LISTA DE ANEXOS

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Anexo 1. Encuesta 81

Anexo 2. Tabulación de la encuesta 83

Anexo 3. Aislamiento de RNA 95

Anexo 4. Electroforesis 98

Anexo 5. RT-PCR 101

Anexo 6. Toma de muestra sanguinea 107

Anexo 7. Actas 111

INTRODUCCIÓN

El dengue es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos que se han propagado rápidamente en los últimos años. El virus del dengue se transmite por mosquitos hembra principalmente de la especie Aedes aegypti y, en menor grado, de Aedes albopictus. Estos mosquitos también transmiten la fiebre chikungunya, la fiebre amarilla y la infección por el virus de Zika.

Se conocen cuatro serotipos distintos, pero estrechamente emparentados, del virus: DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4. Cuando una persona se recupera de la infección adquiere inmunidad de por vida contra el serotipo en particular. Sin embargo, la inmunidad cruzada a los otros serotipos es parcial y temporal. Las infecciones posteriores causadas por otros serotipos aumentan el riesgo de padecer el dengue grave.

Se conoce un gran número de manifestaciones de la enfermedad que van desde procesos asintomáticos hasta cuadros severos; es así como se definen diversas formas clínicas: dengue sin signos de alarma, dengue con signos de alarma, y el dengue grave donde se encuentran incluidos el síndrome de choque por dengue (SCD) y otras complicaciones del dengue como miocarditis, encefalitis, hepatitis las cuales se asocian con mayor mortalidad.

La fiebre por virus Zika (ZIKV) es una enfermedad febril, zoonótica, emergente de curso agudo, benigno y autolimitado; de origen selvático la cual es causada por el virus Zika. El virus de Zika es un flavivirus transmitido por mosquitos de la especie Aedes aegypti. Su sintomatología es inespecífica por lo cual puede confundirse con otros síndromes febriles y en varias ocasiones puede cursar de forma asintomática, o presentarse con un cuadro clínico moderado. Fue detectada en primates no humanos y en Aedes africanus en el año de 1947 en el bosque Zika en Uganda y por primera vez en humanos en Nigeria en 1954.

El virus Zika es transmitido por la picadura de los mismos vectores del dengue y el Chikungunya, por lo que la región se constituye en una población de riesgo de contagio. En Colombia, el Instituto Nacional de Salud confirmó los primeros cuatro casos autóctonos del virus Zika en la semana epidemiológica número 40 de 2015 y dado que varias regiones presentan infestación de Aedes aegypti y/o Aedes albopictus, estas son condiciones que facilitan la transmisión de estas enfermedades. Solo 1 de cada 4 personas presenta sintomatología, usualmente leve. Sin embargo, desde finales del 2015 en Latinoamérica se empezó a sospechar la posible asociación de este virus con microcefalia en fetos de mujeres gestantes infectadas por el virus y en algunas pacientes

 

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manifestaciones de síndromes neurológicos10" La OMS/OPS recomienden a los países que establezcan y mantengan la capacidad para detectar y confirmar casos de infección por el virus Zika, fue el incremento de anomalías congénitas, síndrome de Guillain Barre y otras manifestaciones autoinmunes en zonas donde circula el virus Zika, y su posible relación con este virus, fuertemente sospechosa pero que no ha sido probada científicamente. Pero los casos de microcefalia y otros desórdenes neurológicos por sí mismos, por su gravedad y por la carga socio-económica que conllevan para las familias constituyen una amenaza".

Los virus Dengue y Zika son un problema creciente para la Salud Pública mundial, debido a varios factores: el cambio climático, el aumento de la población mundial en áreas urbanas de ocurrencia rápida y desorganizada, la insuficiente provisión de agua potable que obliga a su almacenamiento en recipientes caseros habitualmente descubiertos, la inadecuada recolección de residuos y la gran producción de recipientes descartables que sirven como criaderos de mosquitos al igual que los neumáticos desechados. A esto se suman el aumento de viajes y migraciones, fallas en el control de los vectores y la falta de una vacuna eficaz para prevenir la enfermedad.

                                                            10 MINISTERIO DE SALUD. Lineamientos para la atención clínica integral de pacientes con Zika en Colombia. [Documento en línea]. 2016, pp. 9-10 [Consulta: 15/11/2017]. Disponible: https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/Lists/BibliotecaDigital/RIDE/VS/PP/ET/lineamientos-atencion- clinica-integral-paciente-zika-colombia.pdf

 

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1. PROBLEMA

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El Dengue es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico, transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti, que constituye hoy la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y afectación económica que tiene diversas formas de expresión clínica: desde fiebre indiferenciada (frecuente en niños) y fiebre con cefalea, gran malestar general, dolores osteomioarticulares, con o sin exantema, leucopenia y algún tipo de sangrado hasta formas graves que, habiendo comenzado con lo anterior presenta choque hipovolémico por extravasación de plasma, con trombocitopenia moderada o intensa y con grandes hemorragias en aparato digestivo y otras localizaciones. También el dengue es capaz de expresarse mediante las llamadas formas "atípicas" que son relativamente infrecuentes y resultan de la afectación particularmente intensa de un órgano o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, entre otras.

El complejo Dengue lo constituyen cuatro serotipos virales serológicamente diferenciables (DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4) que comparten analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquiera puede producir las formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos 2 y 3 han estado asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos. Son virus constituidos por partículas esféricas de 40 a 50 nm de diámetro que constan de las proteínas estructurales de la envoltura (E), membrana (M) y cápside (C), así como un genoma de ácido ribonucleico (ARN), También tienen otras proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5-3. Los virus del dengue pertenecen al género Flavivirus de la familia Flaviviridae.

La inmunidad que deja la infección por cada serotipo viral es duradera, probablemente de por vida y se expresa por la presencia de anticuerpos (Ac) neutralizantes hemotípicos. No existe inmunidad cruzada de serotipos, excepto durante las primeras semanas o meses después de la infección. Sin embargo, cuando una persona tiene Ac subneutralizantes contra uno de los virus del dengue y es infectado por otro serotipo viral se produce una respuesta infrecuente, casi exclusiva de la infección por dengue: una amplificación dependiente de anticuerpos (ADA) que se traduce en una elevada replicación viral y aumento de la viremia, lo cual condiciona y favorece el desarrollo la forma grave de la enfermedad.

Carga mundial de Dengue: En las últimas décadas ha aumentado enormemente la incidencia de Dengue en el mundo. El número real de casos de Dengue está insuficientemente notificado y muchos casos están mal clasificados. Según una estimación reciente, se producen 390 millones de infecciones por dengue cada año (intervalo creíble del 95%), de los cuales 96 millones se manifiestan clínicamente (cualquiera que sea la gravedad de la enfermedad). En otro estudio sobre la prevalencia del Dengue se estima que 3.900 millones de personas, de 128 países, están en riesgo de infección por los virus del Dengue.

Los Estados Miembros de tres regiones de la OMS notifican sistemáticamente el número anual de casos. El número de casos notificados pasó de 2,2 millones en 2010 a 3,2 millones en 2015. Aunque la carga total de la enfermedad a nivel mundial es incierta, el comienzo de las actividades para registrar todos los casos de dengue explica en parte el pronunciado aumento del número de casos notificados en los últimos años. Otra característica de la enfermedad son sus modalidades epidemiológicas, en particular la hiperendemicidad de los múltiples serotipos del virus del dengue en muchos países y la alarmante repercusión en la salud humana y en las economías nacionales y mundiales.

Antes de 1970, solo nueve países habían sufrido epidemias de Dengue grave. Ahora, la enfermedad es endémica en más de 100 países de las regiones de África, las Américas, el Mediterráneo Oriental, Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental. Las regiones más gravemente afectadas son las Américas, Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental.

En 2008, en las regiones de las Américas, Asia Sudoriental y Pacífico Occidental se registraron en conjunto más de 1,2 millones de casos, y en 2015, más de 3,2 millones (según datos oficiales presentados por los Estados Miembros a la OMS). En fecha reciente el número de casos notificados ha seguido aumentando. En 2015, se notificaron 2,35 millones de casos tan solo en la Región de las Américas, de los cuales más de 10.200 casos fueron diagnosticados como Dengue grave y provocaron 1.181 defunciones.

Además de que el número de casos aumenta a medida que la enfermedad se propaga a nuevas zonas, se están produciendo brotes epidémicos de carácter explosivo. Europa ya se enfrenta con la posibilidad de brotes de Dengue ya que la transmisión local se notificó por vez primera en Francia y Croacia en 2010, y se detectaron casos importados en otros tres países europeos. En 2012, un brote de dengue en el archipiélago de Madeira (Portugal) ocasionó más 2000 casos, y se registraron casos importados en otros 10 países europeos, además de Portugal continental. Entre los viajeros que regresan de países de ingresos bajos y medianos, el Dengue constituye la segunda causa de fiebre diagnosticada tras el

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paludismo.

En 2013 ha habido casos en Florida (Estados Unidos de América) y la provincia de Yunnan (China). Además, el Dengue sigue afectando a varios países de América Latina, especialmente Costa Rica, Honduras y México. En Asia se ha notificado un aumento del número de casos al cabo de varios años en Singapur, y también se han notificado casos en Laos. Las tendencias observadas en 2014 indican un aumento del número de casos en China, Fiji, las Islas Cook, Malasia y Vanuatu, y que el virus del Dengue de tipo 3 (DEN 3) está afectando a los países insulares del Pacífico tras un periodo de 10 años. El dengue se ha notificado también en el Japón tras un lapso de más de 70 años.

En 2015, en Delhi (India) se registró el peor brote desde 2006, con más de 15.000 casos. La isla de Hawai, en el estado homónimo de los Estados Unidos de América, se vio afectada en 2015 por un brote con 181 casos, y la transmisión continúa en 2016. Se han seguido registrando casos en estados insulares del Pacífico: Fiji, Tonga y Polinesia francesa.

El año 2016 se caracterizó por grandes brotes de Dengue en todo el mundo. La Región de las Américas notificó más de 2.380.000 casos ese año, y solo en Brasil hubo poco menos de 1.500.000 casos, es decir, cerca de tres veces más que en 2014. En la región se notificaron asimismo 1.032 muertes por Dengue. En la Región del Pacífico Occidental, en 2016 se notificaron más de 375.000 casos, 176.411 de ellos en Filipinas y 100.028 en Malasia, cifras que representan una carga similar a la de años anteriores en ambos países. Las Islas Salomón declararon un brote con más de 7.000 casos sospechosos. En la Región de África, Burkina Faso notificó un brote localizado con 1.061 casos probables.

Hasta la semana epidemiológica 11 del 2017, la Región de las Américas había notificado 50.172 casos, cifra inferior a la registrada en el mismo periodo en años anteriores. En la Región del Pacífico Occidental se han notificado brotes de Dengue en varios Estados Miembros, y la circulación de los serotipos DENV-1 y DENV-2. Cada año, unas 500.000 personas que padecen Dengue grave necesitan hospitalización, y aproximadamente un 2,5% fallecen.

Hasta la semana epidemiológica 01 del 2017, en Colombia se ha notificado en el Sivigila 1.044 casos de Dengue, 1.024 casos (98,1 %) corresponde a Dengue y 20 casos (1,9 %) corresponde a Dengue Grave. En relación con la misma semana del año 2016 se registró 1.336 casos, disminuyo en un 21,9% la notificación.

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En el 2017 en la ciudad de Villavicencio se ha visto reducido el número de personas infectadas por Dengue, Chicunguña y Zika en un 60%, gracias a que las personas han empezado a tomar conciencia de que se deben evitar los criaderos de zancudos, gracias a las campañas que adelantan las autoridades. La secretaria de salud de la ciudad reporto que mientras el año pasado, hasta la semana epidemiológica 42, se habían registrado 1.174 casos, este año se han presentado 454. De Dengue grave en el 2016 se presentaron 15 casos y este año van 6, y el año pasado murieron 2 personas, mientras que en este año no se ha presentado ningún fallecimiento.

Pero para las autoridades aún falta mucho por hacer, especialmente ante la proximidad de la temporada vacacional y el paso de la época de lluvias. Por lo que la Secretaria de Salud intensifica las acciones preventivas y pedagógicas para la eliminación de pozos de agua que sirvan de criadero a estos vectores, se espera culminar el año con 10.000 visitas a locales comerciales, viviendas, lotes y demás.

Para lograr esto las autoridades están repartiendo afiches, folletos, volantes, material didáctico y demás elementos que brinden información necesaria para saber cómo disminuir la población de los zancudos. Al mismo tiempo se realizan brigadas de inspección de las zonas que puedan acumular agua y verificar si hay presencia de larvas del zancudo en la zona.

En la semana epidemiológica 22 del 2017, en Colombia se notificaron al Sivigila 583 casos probables de Dengue; en la misma semana epidemiológica 22 del 2016 se notificaron 2.684 casos.

Se reportaron casos procedentes de 36 entidades territoriales, cuatro distritos y 675 municipios; Cali con el 17,0 %, Medellín con el 9,3 %, Neiva con el 2,2 %, Cúcuta con el 2,1 %, Ibagué con el 2,0 %, Villavicencio con el 1,9 %, Bucaramanga con el 1,6 %, Floridablanca con el 1,4 %, Armenia con el 1,3 %, Espinal con el 1,2 %, Palmira y Sincelejo con el 1,1 % cada uno, Girardot y Tuluá con el 1,0 % cada uno, registran el 44,1 % de los casos notificados como dengue; Neiva con el 10,6 %, Ibagué y Cali con el 4,9 %, Villavicencio y Buenaventura con el 2,8 % cada uno, Purificación, Galapa, Cartagena, Espinal y Medellín con el 2,1 % cada uno, registran el 36,6 % de los casos notificados como dengue grave.

La secretaría de Salud de la ciudad de Cúcuta anunció que durante el año 2017 continuará el programa educativo que busca la erradicación de criaderos de mosquitos y también seguirá la fumigación. El trabajo que se hizo durante todo

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el 2016 ha dado frutos, los reportes han bajado, sostuvo Judith Ortega, secretaría de Salud. Este año, el programa continuará la meta es no volver a tener que pasar por situaciones como las que vivió la ciudad con el Dengue, Chikungunya y Zika.

Por su parte, la empresa Aguas Kpital inició una campaña para que todos sus usuarios mantengan en buen estado los tanques de almacenamiento de agua potable, siguiendo la regulación vigente del gobierno, para contribuir con la erradicación de criaderos de mosquitos.

La infección por Dengue puede ser clínicamente inaparente o puede causar una enfermedad de variada intensidad. Luego de un período de incubación que puede ser de 5 a 7 días, (se han observado casos con un período de incubación de 3 hasta 14 días), podrán aparecer las manifestaciones clínicas, aunque una alta proporción de las personas infectadas cursarán de manera asintomática. Las infecciones sintomáticas pueden variar desde formas leves de la enfermedad, que solo se manifiestan con un cuadro febril agudo, de duración limitada (2 a 7 días) a otros cuya fiebre se asocia a intenso malestar general, cefalea, dolor retroocular, dolor muscular y dolores articulares. En no más del 50% de los casos estos síntomas pueden acompañarse de un exantema en la mayoría de los casos pruriginoso, no patognomónico.

Algunos casos de Dengue pueden evolucionar a formas graves (Dengue grave) en las que hay manifestaciones hemorrágicas, pérdida de plasma debida al aumento de la permeabilidad vascular, (lo que ocasiona un incremento del hematocrito) y presencia de colecciones líquidas en cavidades serosas (derrame pleural, ascitis y derrame pericárdico), lo que puede llevar a un cuadro de shock. Los casos de dengue grave son más frecuentes en personas que ya padecieron dengue por un serotipo (infección primaria) y se infectan nuevamente (infección secundaria) con un serotipo diferente al que le ocasionó el primer cuadro. Este fenómeno puede ocurrir hasta muchos años después de ocurrida la infección primaria, pero no implica necesariamente que toda infección secundaria conduzca a dengue grave. No obstante, también la infección primaria puede asociarse a dengue grave, en relación a virulencia de la cepa o a otros factores del hospedero.

Finalmente, existen otras formas clínicas de Dengue menos frecuentes, que se caracterizan por la afectación especialmente intensa de un órgano o sistema: Encefalitis, Miocarditis, Hepatopatía, y afectación renal con Insuficiencia Renal Aguda. El Dengue es una enfermedad sistémica y muy dinámica, en la que en pocas horas un paciente puede pasar de un cuadro leve a un cuadro grave. Al inicio de la fiebre, no es posible predecir si el paciente tendrá síntomas y signos leves todo el tiempo, o si evolucionará a una forma grave de la enfermedad. Por lo tanto, el equipo de salud debe realizar un seguimiento estricto del paciente, y éste

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junto a su grupo familiar deben estar atentos a los signos de alarma, controlando a todo paciente con dengue hasta al menos 48 horas de finalizada la etapa febril.

El virus Zika es un arbovirus (virus transmitidos por artrópodos) de la familia Flaviviridae. Es un virus ARN monocatenario, muy relacionado genéticamente con los virus Dengue dentro de la familia viral. Las comparaciones genómicas han revelado varios genotipos que componen tres linajes, dos africanos y uno asiático. La estructura de este virus es similar a la de otros flavivirus, los cuales presentan una estructura icosaé- drica, de alrededor de 50 nm de diámetro, y contienen una envoltura lipídica cubierta con proyecciones de superficie que incluyen: una proteína M (membrana), una proteína E (“envoltura”). El virus Zika es muy cercano filogenéticamente a virus como el dengue, fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, o el virus del Nilo Occidental. El virus fue identificado por primera vez el 18 de abril de 1947, en un Macaco Rhesus (primate no humano) en cautiverio, que desarrolló fiebre durante una investigación sobre la fiebre amarilla selvática y al cual se le realizaron pruebas de laboratorio que permitieron identificar este virus. Se ha detectado en mosquitos, primates no humanos y humanos en 19 países a lo largo de África, Asia, Oceanía y recientemente en América del Sur.

La transmisión es principalmente vectorial, a partir de mosquitos infectados, principalmente del género Aedes. El virus se transmite generalmente a los artrópodos hematófagos durante su ingesta de sangre y se reproduce en ellos sin afectarlos, manteniéndose en el insecto toda la vida y transmitiéndose en la próxima picadura. Para la mayoría de los países de del mundo, las especies Aedes aegypti y Aedes albopictus pueden plantear las mayores amenazas, dada su casi omnipresencia en muchos países tropicales y subtropicales, su adaptación a los entornos urbanos y peri-domésticos, sus comportamientos altamente antropófilos, y su competencia para actuar como vectores para muchas otras arbovirosis. En particular, se considera que A. aegypti, es el vector principal para la transmisión de virus Zika entre los humanos.

Además existen otras vías de transmisión de virus Zika. Se ha documentado la transmisión sexual; asimismo, pueden producirse infecciones perinatales y congénitas por transmisión vertical, lo cual da lugar a un grave problema de salud pública. Otro importante problema clínico y de salud pública es la posibilidad de transmisión a través de transfusiones y trasplantes. Esto ha sido bien documentado para arbovirus como el Dengue, Nilo Occidental, y virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Durante el brote de Zika en la Polinesia Francesa en 2013-2014, se detectó mediante RT-PCR que el 3% de los donantes de sangre asintomáticos cursaban con viremia, lo que destaca el potencial para la

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transmisión transfusional del virus Zika11".

Entre las enfermedades emergentes del Siglo XXI, la enfermedad por virus Zika se encuentra entre las mayores preocupaciones para la salud pública a nivel mundial. Comparte el mismo mosquito vector con otros arbovirus de particular importancia para Salud Pública en las Américas, tales como Dengue y Chikungunya, además de la Fiebre Amarilla Urbana.

El virus se aisló por primera vez en 1947 en los bosques de Zika (Uganda), en un mono Rhesus durante un estudio sobre la transmisión de la fiebre amarilla selvática. En 1952 mediante estudios serológicos se demostró la infección en seres humanos (Uganda y Tanzania). En 1968 se logró aislar el virus a partir de muestras humanas en Nigeria. Finalmente, en 2007 ocurrió el primer brote importante de infección por virus Zika en la Isla de Yap (Micronesia), con 185 casos.

En 2013 se registró un brote en las islas del Pacífico Sur, en la Polinesia Francesa, con 8510 casos sospechosos notificados en diversas islas (Bora-Bora, Moorea, Raitea, Tahaa, Tahiti, Nuku-Hiva y Arutua) y en Nueva Caledonia (perteneciente a Nueva Zelanda), afectando el 10% de la población. Durante este brote 74 pacientes registraron síndromes neurológicos o síndrome autoinmune luego de que se manifestaran síntomas compatibles con infección por virus Zika. De éstos, 42 fueron confirmados como SGB, de los cuales 37 presentaron un síndrome viral previo.

En 2014 se registraron también casos de enfermedad por virus Zika en Nueva Caledonia y en Islas Cook, y en los últimos siete años se han notificado casos en viajeros de forma esporádica (Tailandia, Camboya, Indonesia y Nueva Caledonia). Entre octubre y diciembre de 2015 se registró un brote en Cabo Verde, con 4744 casos notificados.

Desde el año 2014 se ha detectado la circulación autóctona de virus Zika en las Américas. En febrero del 2014 las autoridades de salud pública de Chile confirmaron el primer caso de transmisión autóctona de infección por virus Zika en la isla de Pascua (Chile).

                                                            11 MINISTERIO DE SALUD PRESIDENCIA DE LA NACIÓN. Guía para la vigilancia integrada de la infeccione por Virus Zika y recomendaciones para el equipo de salud [Documento en línea]. 2016, pp. 50-51 [Consulta: 15/11/2017]. Disponible: http://www.msal.gob.ar/images/stories/bes/graficos/0000000933cnt-2017-01-25-zika-guia-para-equipos-de-salud.pdf

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En mayo de 2015, las autoridades de salud pública de Brasil confirmaron la transmisión autóctona de virus Zika en el nordeste del país. En julio de 2015 Brasil informó a la OMS sobre la detección de 76 pacientes con síndromes neurológicos que tenían historia reciente de infección por virus Zika, especialmente en el estado de Bahía.

En octubre de 2015 se confirmó la transmisión autóctona del virus en Colombia. Adicionalmente, en noviembre de 2015, El Salvador, Guatemala, México, Paraguay, Suriname y Venezuela confirmaron casos de transmisión autóctona.

La vinculación epidemiológica entre Zika y microcefalia se observó por primera vez en Brasil en 2015. También se habían reportado casos de microcefalia durante la epidemia de zika registrada en la Polinesia Francesa en 2013. Durante este brote se estimó que la incidencia de microcefalia asociada a virus Zika fue del 1%.

En Brasil (Bahía) estiman tasas de microcefalia entre 0.88% y 13%, y en un estudio de Rio de Janeiro, de 42 mujeres con infección confirmada por Zika a las cuales se les realizó estudios ecográficos, 12 presentaban anomalías fetales (29%) de los cuales 5 presentaban retraso de crecimiento intrauterino con o sin microcefalia. Debido a la asociación epidemiológica detectada en los últimos años entre brotes de zika y conglomerados de otras enfermedades autoinmunes o neurológicas, principalmente Guillain- Barré (SGB) y microcefalia, el 1 de febrero de 2016, la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró que el virus Zika representaba una emergencia de salud pública de importancia internacional (ESPII).

Desde 2015 y hasta el 17 de noviembre de 2016, 48 países/territorios de las Américas confirmaron casos autóctonos por transmisión vectorial del virus Zika y cinco países notificaron casos de Zika transmitido sexualmente. Además, 20 países han confirmado casos de síndrome congénito asociado a virus Zika.

América del Norte: En los Estados Unidos de América, el Departamento de Salud de Florida informó que el estado no tiene actualmente áreas identificadas con transmisión activa de Zika y no se notificaron casos de transmisión vectorial local en 2017. En la SE 30 de 2017, el Departamento Estatal de Salud de Texas y el Condado de Hidalgo notificaron un caso probable de transmisión vectorial local durante 2017.

En México se observó un aumento de casos confirmados desde la SE 16 a la SE

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27 de 2017 comportamiento similar a lo observado con dengue en el mismo periodo en el país. El 51% de los casos confirmados de Zika en las primeras 32 semanas de 2017 correspondieron a los estados de Nayarit (171 casos), Tamaulipas (146 casos) y San Luis Potosí (123 casos) y en estos estados el número de casos confirmados fue superior a lo notificado en 2015-201612".

América Central: “Desde la SE 20 y hasta la SE 30 de 2017 se observó un pequeño aumento de casos sospechosos y confirmados en la subregión a expensas de un ligero aumento registrado en Belice y Costa Rica, con un promedio semanal de 117 casos sospechosos y confirmados entre las SE 21 y SE 30 de 2017 en esta sub región13".

Caribe:

“En los países/territorios de esta subregión continúan notificándose casos esporádicos con un promedio semanal de 252 casos sospechosos y confirmados entre las SE 21 y SE 30 de 2017. En Puerto Rico la tendencia de casos observada en las últimas 10 semanas es decreciente14”.

América del Sur: Desde la semana epidemiológica (SE) 44 de 2016 ningún nuevo país o territorio de las Américas confirmó transmisión autóctona vectorial de Zika; por lo que se mantiene en 48 el número de países y territorios de las Américas que confirmaron casos autóctonos por transmisión vectorial de Zika y en cinco el número de países que notificaron casos de Zika transmitidos sexualmente. Desde la SE 14 de 2017 se observa una tendencia decreciente de casos sospechosos y confirmados notificados en esta subregión, con excepción de Ecuador donde se observó un aumento en el número de casos sospechosos y confirmados entre las SE 4 y 20 de 2017. Entre las SE 21 y 30 de 2017, en promedio se registraron 293 casos sospechosos y confirmados semanales en la subregión15".

En total, Colombia reporta 61.393 casos de Zika desde el inicio de la circulación del virus, de los cuales 2.603 fueron confirmados por laboratorio y 58.790 sospechosos por clínica, se han confirmado 1.186 mujeres embarazadas

                                                            12 ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD Y ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Zika - Actualización Epidemiológica Regional de la OPS (Américas) 25 de agosto de 2017 [Documento en línea]. 2017, pp.3 [Consulta: 15/11/2017]. Disponible: http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=11599%3Aregional-zika- epidemiological-update-americas&catid=8424%3Acontents&Itemid=41691&lang=es 13 Ibid., p. 4 14 Ibid., p. 5 15 Ibib., p. 3

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infectadas con Zika, a las que se suman 10.053 casos sospechosos. Desde el inicio de la epidemia hasta el 26 de marzo del 2016, se han presentado 34 casos de microcefalia por diferentes causas y ocho están en estudios por posible relación con el Zika. Además, en el país se han notificado 401 casos de síndromes neurológicos con antecedentes compatibles con infección por Zika. De estos, 270 están relacionadas con el Síndrome Guillain-Barré.

En el 2016 más del 80% de los casos registrados en Norte de Santander se han reportado en Cúcuta. Las autoridades de salud hacen especial seguimiento a las mujeres embarazadas y continúan en alerta ante el alto número de casos de personas contagiadas con el virus del Zika. El departamento es el que más se ha visto afectado por la epidemia. En un día, tan solo el número de casos de mujeres embarazadas con el virus aumentó a 30 casos. En los centros médicos se mantiene la atención especializada a embarazadas, adultos mayores y niños.

Según Daniel Gutiérrez, auditor del Instituto departamental de Salud de Norte de Santander, desde octubre se registran 3.274 casos de Zika en el departamento, siendo Cúcuta la zona más afectada con cerca del 84% de los registros, seguido por Los Patios con el 10%. Las autoridades continúan además haciendo seguimiento médico especial a los bebés recién nacidos cuyas madres presentaron el virus en la última etapa del embarazo.

En la semana epidemiológica 20 de 2017 se notificaron 48 casos de Zika, 29 casos correspondientes a la semana epidemiológica 20 de 2017 y 19 casos ingresaron como notificación tardía de las semanas epidemiológicas anteriores; en la misma semana del año 2016 se notificaron 2.646 casos. En total se han notificado 1.211 casos de Zika, tres casos confirmados procedentes de tres municipios, 1.113 casos proceden de 162 municipios donde se han confirmado casos por laboratorio, 95 casos proceden de 25 municipios donde no se han confirmado casos por laboratorio. Se notificaron 12 casos procedentes del exterior, ocho por el distrito de Bogotá, dos por el departamento de Amazonas y dos por el departamento de Nariño.

Durante los años 2015 a 2017, se confirmó la circulación de virus Zika en 552 municipios y cuatro distritos del territorio nacional; Antioquia es la entidad territorial con el mayor número de municipios con casos confirmados por laboratorio (55 municipios). Se han notificado casos sospechosos de enfermedad por virus Zika en 247 municipios, sumando un total de 803 municipios con casos reportados entre confirmados y sospechosos.

La infección se presenta inicialmente con dolor de cabeza, un exantema

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maculopapular descendente que involucra palmas y plantas, fiebre, malestar general, mialgias, anorexia, conjuntivitis no purulenta, artralgia, edema de extremidades y algunas veces síntomas abdominales (Dolor abdominal, diarrea). El rash puede ser pruriginoso e interferir en las actividades diarias del paciente, incluso dificultar el sueño. En su fase de convalecencia puede producir descamación laminar. El compromiso articular habitualmente se presenta en forma de poliartralgia con edema periarticular, bilateral y simétrico. A diferencia de los casos de infección por virus del Chikungunya, el dolor en los casos de enfermedad por el virus Zika tiende a ser menor y no es incapacitante: al examen físico puede observarse la presencia de un leve edema articular, aunque sin hiperemia ni calor local. Las articulaciones de las manos y las muñecas son las afectadas con mayor frecuencia, seguidas de las rodillas y los tobillos.

El edema de miembros y la conjuntivitis parecerían ser más comunes en las infecciones por virus Zika que en el dengue o el chikungunya, mientras que la hepatomegalia, leucopenia y trombocitopenia fueron menos comunes en infecciones por Zika. La evidencia disponible en cuanto al espectro de la enfermedad por virus Zika en bebés y niños infectados a través de picaduras de mosquitos indica que la mayoría de los niños no presentan síntomas o tienen una enfermedad leve, similar a los resultados en adultos infectados con la enfermedad por virus Zika.

La infección intrauterina por virus Zika ha sido asociada con la aparición de diversas anomalías congénitas. El síndrome actualmente descrito incluye la presencia de microcefalia, y otros signos tales como desproporción cráneo-facial, cuero cabelludo redundante con rugosidades, hipertonía o espasticidad, irritabilidad, secuelas cognitivas y crisis epilépticas. Se presenta un amplio espectro de alteraciones del sistema nervioso central: se observó hipoplasia cerebral, así como hipoplasia o agenesia del cuerpo calloso. Es característica la presencia de calcificaciones cerebrales (principalmente corticales y subcorticales), alteraciones de los ventrículos cerebrales, anomalías de la fosa posterior y lisencefalia, así como anormalidades auditivas y visuales, tales como hipoacusia central, alteraciones pigmentarias focales de la retina y atrofia coriorretiniana, predominantemente en el polo posterior, especialmente en la mácula e hipoplasia del nervio óptico.

Las manifestaciones neurológicas pueden aparecer durante la fase aguda de la infección o después de ella. El síndrome de Guillain-Barré (SGB) es la complicación neurológica más frecuente, bien en su forma clásica o en algunas de sus variantes (como por ejemplo, el síndrome de Miller-Fisher). Aunque menos frecuentes, otras manifestaciones de infección por Zika son encefalitis, meningoencefalitis, cerebelitis, encefalomielitis aguda diseminada, mielopatía

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inflamatoria y alteraciones de nervios craneales.

El síndrome de Guillain-Barré es un trastorno en el que el sistema inmunitario del organismo ataca el sistema nervioso periférico, afectando tanto las fibras motoras como sensitivas, produciendo así debilidad muscular y alteración de sensibilidad en los miembros superiores o inferiores. Puede ser desencadenado por diversas infecciones, entre ellas las producidas por arbovirus. Un estudio realizado a partir del brote en la Polinesia Francesa obtuvo información sobre las características clínicas y neurofisiológicas de los casos, estimando que el riesgo de SGB fue 0,24 por 1 000 infecciones por virus Zika, partiendo de una tasa de ataque de 66% en la población general.

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Se pueden identificar los virus del Dengue y Zika mediante RT-PCR en personas asintomáticas?

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo general. Identificar los virus de Dengue y Zika mediante RT-PCR en personas asintomáticas de San José de Cúcuta.

1.3.2 Objetivo específico. Se plantea el siguiente:

Determinar la presencia o ausencia de los virus Dengue y Zika en ARN aislado de muestras de suero mediante la amplificación por RT-PCR.

1.4 JUSTIFICACIÓN

El dengue es una enfermedad viral febril aguda. Se reconoce un espectro de manifestaciones de la enfermedad que va desde procesos asintomáticos hasta cuadros severos; es así como se definen diversas formas clínicas: dengue sin signos de alarma, dengue con signos de alarma, y el dengue grave donde se encuentran incluidos el síndrome de choque dengue (SCD) y otras complicaciones del dengue como miocarditis, encefalitis, hepatitis las cuales se asocian con mayor mortalidad.

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El virus Zika es un arbovirus de la familia Flaviviridae género (Flavivirus) transmitido por mosquitos causante de la fiebre Zika un síndrome febril exantemático autolimitado similar al dengue los signos y síntomas más frecuentes son: fiebre moderaba, exantema maculopapular, artralgias, mialgias, cefalea y conjuntivitis. Con menor frecuencia pueden manifestarse edemas, faringitis, tos y vomito. Existen casos que se han acompañado de sindroma de Guillain-Barré y de Hipoacusia. Actualmente existen evidencias que se continúan investigando, que relacionan a este virus con el incremento de las tasas de incidencia de microcefalia en las regiones afectadas.

La infección por este virus suele cursar con sintomatología leve o incluso con infección asintomática en el 75% de los casos. Su sintomatología puede confundirse con la causada por la infección con Virus Dengue o Virus Chinkungunya.

Existe dificultad para su diagnóstico porque en la mayoría de los casos (75%) la infección es asintomática. Además, la sintomatología es similar a la desencadenada por otras infecciones por otros arbovirus que cambien cursan con fiebre de mayor o menor intensidad y exantema. Por ellos existe el riesgo por los viajeros procedentes de áreas donde actualmente existe incidencia de casos (Países de América latina como Brasil y del Sudeste Asiático como Tailandia y Polinesia) y que en nuestro país pueden desplazarse a regiones donde está presente la especie de mosquito Aedes albopictus constituyen un riesgo para establecer un foco.

El diagnóstico de la infección por virus Zika y Dengue puede realizarse por:

Aislamiento del virus en cultivo celular

Detección molecular por RT-PCR o por PCR en tiempo real

Detección de anticuerpos a partir del 3° o 5° día de la aparición de los síntomas

Se han utilizado varios métodos como ELISA o Inmunofluoresencia indirecta. Estos métodos tienen el problema de las reacciones cruzadas existentes de los anticuerpos generados por otros virus causantes de sintomatologías similares como ocurre con otros flavivirus Dengue y Chinkungunya.

Por este motivo la prueba más confiable hasta el momento es la RT-PCR.

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2. MARCO REFERENCIAL

2.1 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN

En el año 2007 LANCIOTTI y colaboradores realizaron un estudio sobre las propiedades genéticas y serológicas del virus zika asociados con una epidemia, estado de Yap, Micronesia, 2007

El Virus Zika (ZIKV) es un virus transmitido por mosquitos en la familia Flaviviridae y del género Flavivirus .Inicialmente se aisló en 1947 a partir de sangre de un mono rhesus centinela febril durante un estudio de la fiebre amarilla en el bosque Zika de Uganda El virus fue aislado posteriormente de un grupo de Aedes africanus mosquitos recogidos en 1948 de la misma región de la selva Zika; una encuesta serológica realizada en ese momento mostró que 6,1% de los residentes en regiones cercanas de Uganda tenía anticuerpos específicos para ZIKV.

Durante los próximos 20 años, varios aislados ZIKV se obtuvieron de Aedes spp. en África ( Ae . africanus ) y Malasia ( Ae . aegypti ), que implican estas especies de probabilidades epidémicas. Varias cepas humanas ZIKV También se obtuvieron en los años 1960 y 1970 de África oriental y occidental durante los estudios de vigilancia de arbovirus de rutina en la ausencia de epidemias. Estudios serológicos adicionales en los años 1950 y 1960 detectaron ZIKV infecciones entre los seres humanos en Egipto, Nigeria, Uganda, India, Malasia, Indonesia, Pakistán, Tailandia, Vietnam del Norte, y Filipinas. Estos datos sugieren fuertemente práctica generalizada de la ZIKV desde África hasta el sudeste de Asia oeste y norte de la línea de Wallace.

En 1977, la infección se confirmó ZIKV entre los 7 pacientes en el centro de Java, Indonesia, durante un estudio de fiebre aguda. Los datos sobre estos casos y 7

ZIKV varios ya se ha informado infecciones en humanos indicaron que las características clínicas de la infección con ZIKV incluyen fiebre, dolor de cabeza, malestar general, dolor de estómago, mareos, anorexia y erupción maculopapular; en todos los casos la infección apareció relativamente leve, autolimitada y no letal.

En abril de 2007, una epidemia de erupción, conjuntivitis y artralgia fue observado

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por los médicos en el estado de Yap, Estados Federados de Micronesia .Las pruebas de laboratorio con un ensayo rápido sugiere que un virus del dengue (DENV) era el agente causal. En junio de 2007, se enviaron muestras para pruebas de confirmación al Laboratorio de Diagnóstico de Arbovirus en los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, Fort Collins, CO, EE.UU.). Las pruebas serológicas por inmunoglobulina IgM ELISA de captura de antígeno con DENV confirmó infección reciente flavivirus en varios pacientes. Realizar el ensayo por PCR con transcripción inversa (RT-PCR) con cebadores de consenso flavivirus generados fragmentos de ADN, que cuando se somete a secuenciación de ácidos nucleicos, demostraron identidad de nucleótidos ≈90% con ZIKV. Estos hallazgos indicaron que ZIKV era el agente causante de la epidemia Yap. Presentamos parámetros serológicos de la respuesta inmune entre los humanos ZIKV infectados, los datos sobre los niveles estimados de viremia, y la secuencia completa región de codificación de ácido nucleico de ZIKV asociado con esta epidemia.

Análisis de muestras de pacientes: Detalles de la epidemia, incluyendo los hallazgos clínicos y de laboratorio para todos los pacientes, serán reportados en otra parte (MR Duffy et al., Sin publicar. Datos). Un subconjunto de pacientes infectados por el ZIKV para quienes aguda y de las muestras de suero se combina la fase de convalecencia se había recogido se analizó mediante el uso de varios ensayos serológicos para evaluar el grado de reactividad cruzada con varios flavivirus relacionados. Los pacientes fueron clasificados como primarios flavivirus

/ ZIKV infectado o secundaria flavivirus / ZIKV infectados probable. Flavivirus primaria / pacientes infectados por ZIKV eran aquellos en los que las muestras de suero de fase aguda (<10 días) no tenían anticuerpos detectables (por IgG ELISA y ensayo de neutralización de reducción de placa [PRNT]) para cualquiera de los flavivirus heterólogos ensayados y fueron ya sea IgM-positivo en sus espécimen de fase aguda o IgM y IgG positivo para ZIKV en una muestra de la fase de convalecencia (seroconversión). Flavivirus secundario / ZIKV pacientes probable infectados eran los que tenían anticuerpos detectables a > 1 flavivirus heterólogos en sus espécimen de fase aguda y también eran IgM positivo para ZIKV en sus espécimen de fase aguda, o IgM e IgG positivo para ZIKV en su convalescent- espécimen de fase. Se utilizó la designación “ZIKV probable” porque las infecciones por flavivirus secundarias demuestran extensa reactividad cruzada con otros flavivirus, y en algunos casos, superior serológica reactividad a los flavivirus que infectan originales (fenómeno de “pecado antigénico original”). Datos serológicos por sí sola es insuficiente para confirmar ZIKV como los flavivirus recientemente que infectan. Sin embargo, estas infecciones probables secundaria flavivirus / ZIKV fueron las infecciones ZIKV recientes probablemente debido ZIKV fue el único virus detectado durante la

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epidemia en Yap, una relativamente pequeña y aislada isla.

Metodología utilizada: Las pruebas serológicas: Muestras de suero aguda y de la fase de convalecencia fueron probadas por IgG ELISA con antígeno ZIKV como se describe para la detección de IgG a los arbovirus. Las muestras también se ensayaron mediante IgM ELISA como se describe con los siguientes antígenos virales: ZIKV, DENV 1-4 mezcla, el virus de la fiebre amarilla (VFA), virus de la encefalitis japonesa, y Murray Valley virus de la encefalitis. Las pruebas para detectar IgM contra el virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus de la encefalitis de San Luis se llevó a cabo mediante el uso de un inmunoensayo de microesferas. Las relaciones de los valores de densidad óptica de pacientes a los valores de control negativo (P / Ns) se calcularon para IgG e IgM ELISA. Valores> 3 se consideraron positivos y valores 2-3 se consideraron ambiguos. Títulos de anticuerpos neutralizantes se determinaron mediante el uso de un PRNT con un valor de corte del 90%.

En tiempo real RT-PCR: Dos en tiempo real de cebadores / sondas fija específica para la cepa ZIKV 2007 fueron diseñados utilizando ZIKV 2007 de datos de secuencias de nucleótidos en el paquete de software PrimerExpress (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los cebadores fueron sintetizados por Operon Biotecnologías (Huntsville, AL, EE.UU.) con 5-FAM como el colorante indicador para la sonda.Todos los ensayos en tiempo real se llevaron a cabo utilizando el Kit de QuantiTect sonda RT-PCR (QIAGEN, Valencia, CA, EE.UU.) con la amplificación en el instrumento iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. La especificidad de los cebadores ZIKV se evaluó ensayando los siguientes ARN virales, todos los cuales dieron resultados negativos: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DENV-4, el WNV, encefalitis de San Luis virus, VFA, virus Powassan, Semliki virus del Bosque, O'nyon-Nyong, virus chikungunya, y el virus Spondweni (SPOV).

Nucleic Acid Secuenciación y análisis filogenético: Se extrajo ARN de muestras de pacientes que demostraron la mayor concentración de RNA ZIKV determinado por el ensayo en tiempo real, y para los que estaba disponible suficiente volumen de muestra (pacientes 824, 037, 830a, y 958). Brevemente, el ARN fue extraído de 150 l de suero utilizando el Kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN), y el ARN se eluyó con 75 l de agua libre de RNasa. Una serie de RT-PCR se realizó con cada preparación de ARN mediante el uso de pares de cebadores diseñados para generar fragmentos de ADN que se solapan que abarcaban toda la poliproteína región del virus de la codificación. Los cebadores se diseñaron utilizando el virus prototipo 766 ZIKV secuencia de codificación MR región (GenBank adhesión no. AY632535 ) y el módulo de software PrimerSelect del paquete LaserGene (DNASTAR Inc., Madison, WI, EE.UU.). Varios cebadores

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fracasaron inicialmente para amplificar por lo tanto, los cebadores se rediseñaron mediante el uso de datos de secuencias de ADN recién generados desajustes de secuencia entre ZIKV MR 766 y ZIKV Yap 2007., y un enfoque de “paseo genómico” se utilizó para derivar completas de codificación de sequence data de la región. La lista completa de cebadores de amplificación y secuenciación está disponible bajo petición.

Todos RT-PCR se realizaron con 10 ul de ARN utilizando el Kit de OneStep RT- PCR (QIAGEN) siguiendo el protocolo del fabricante. Los ADN se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, y las bandas del tamaño predicho se escindieron del gel y se purificó usando el Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN). Los ADN purificados se sometieron a análisis de secuencia de ácido nucleico con cebadores de secuenciación espaciados ≈500 bases aparte en ambas cadenas de los fragmentos de ADN mediante el uso de la mezcla de reacción de secuenciación de ciclo ABI BigDye Terminator V3.1 Ready (Applied Biosystems). Secuencia de nucleótidos se determinó por electroforesis capilar usando el analizador genético ABI 3130 (Applied Biosystems) siguiendo Protcol del fabricante. Datos de la secuencia primas fueron alineados y editarse utilizando el módulo de SeqMan de LaserGene (DNASTAR Inc.). Debido a volumen de muestra insuficiente, no RNA paciente fue suficiente para generar ADN que incluía la región codificante entera. Por lo tanto, los datos de ADN obtenidos a partir de 4 pacientes se combinaron para generar una secuencia de consenso designado hasta ahora la ZIKV 2007 epidemia de consenso (CE) secuencia (GenBank adhesión no. EU545988 ).

La región de codificación completa de ZIKV 2007 CE o la proteína no estructural subregión gen 5 (NS5) se alineó con todas las secuencias de flavivirus disponibles en GenBank utilizando el algoritmo Clustal W dentro del paquete de software de la versión 4 MEGA. Se construyeron árboles filogenéticos utilizando ya sea la región de codificación completa o la región NS5 porque un gran número de secuencias de NS5 estaban disponibles en GenBank y los árboles para la región NS5 se han construido. Cepas ZIKV adicionales de la colección de referencia Organización CDC / Mundial de la Salud (cepas 41662, 41524, y 41525) aislado de Aedes spp. Mosquitos recogidos en Senegal en 1984 también se amplificaron por RT-PCR en la región NS5 y se sometieron a secuenciación de ácidos nucleicos como se describe anteriormente y se incluye en el análisis región NS5. Los árboles se construyeron a partir de codificación de datos de región o de datos NS5 por MEGA 4 a partir de secuencias de nucleótidos alineadas. Utilizamos algoritmos de máxima parsimonia, vecino a participar, o evolución mínima con 2.000 réplicas para el apoyo de arranque de las agrupaciones de árboles. Todos los árboles generan topología casi idénticos; sólo

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el árbol NS5 vecino a participar se muestra"16.

En el año 2011 PAUDEL y colaboradores realizaron un estudio sobre la Comparación del ensayo de dengue SYBR Green en tiempo real con el ensayo de dengue en tiempo real taqman RT-PCR y la PCR anidada convencional para el diagnóstico de infección primaria y secundaria de dengue, el objetivo fue: Desarrollar un ensayo de dengue de diagnóstico SYBR Green de bajo costo, rápido y confiable en tiempo real y compararlo con el ensayo en tiempo real Taqman y la PCR anidada convencional (Lanciotti modificado).

El dengue es una enfermedad humana causada por un virus transmitido por el Aedes spp. Los mosquitos con cuatro serotipos distintos, pero estrechamente relacionados de virus, que se refiere como el dengue "serotipos" DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4. Anualmente entre 50 y 100 millones de personas están afectadas por el dengue, y 500.000 de ellos progresan a la fiebre del dengue hemorrágico (DH) con 25.000 muertes. Zona de riesgo de infección por dengue está aumentando año tras año. Alrededor de 2,5 mil millones de personas están en riesgo de dengue y otros 120 millones de personas visitan el dengue área endémica cada año. La vida ajustada por discapacidad por año para el dengue es de 520 a 580 por millón de población.

La fiebre del dengue (FD) y la fiebre hemorrágica del dengue (FHD) son la principal manifestación clínica de la enfermedad. DH con choque (síndrome de choque del dengue o DSS) es la etapa más grave de la enfermedad. La presentación clínica de los pacientes con dengue y dengue hemorrágico en 3-5 días después de la aparición de la enfermedad son de alguna manera similar con la presencia de desaparición de la fiebre en el mismo tiempo , de modo que Fiebre del Dengue son difíciles de diagnosticar en este período crítico. Fiebre del Dengue se clasifican de acuerdo a la directriz de la OMS de 1998, la sensibilidad y la especificidad de esta clasificación clínica todavía siguen siendo bastante bajos. Inmunidad de por vida del virus del dengue para el serotipo homólogo es posible, sin embargo parcial o falta de inmunidad después de la infección con el serotipo heterólogo exacerbar la replicación del virus en la infección secundaria. Inmunidad mejora dependiente de anticuerpos basado (ADE) es uno de los procesos patogénesis declare, por la causa grave de la enfermedad. A medida que la infección progresa secundaria con la manifestación clínica más grave, que puede correlacionarse con una mayor viremia y DH / SCD.

                                                            16 LANCIOTTI RS, KOSOY OL, LAVEN JJ, VÉLEZ JO, LAMBERT AJ, AJ JOHNSON, et al. Propiedades genéticas y serológicos del virus Zika asociados con una epidemia, Estado de Yap, Micronesia, 2007. [Artículo en Línea]. En: Emerg Infect Dis. 2008 Aug., vol. 14, n°8, pp.1232-1239. [28/2/2017]. Disponible: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2600394/ DOI: 10.3201/eid1408.080287

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La detección de anticuerpos mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es útil y herramienta más popular para el diagnóstico, después de 1 semana de la fiebre, pero no se puede utilizar antes de 3-5 días después de la fiebre ni se puede utilizar para discriminar los serotipos. Método molecular de diagnóstico de dengue va a reemplazar el método tradicional de cultivo de células como la prueba estándar de oro para la detección viral. SYBR reacción verde cadena de transcripción inversa de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) tiene más ventaja en encuesta epidemiológica, ya que es rápido, simple y sensible que los métodos de RT-PCR tradicionales. Debido a la detección del producto amplificado y la sonda en el mismo recipiente cerrado, la contaminación se reduce considerablemente en comparación con otra reacción PCR. RT-PCR es una herramienta útil para la detección y la cuantificación de dengue.

Sonda Taqman RT-PCR que contiene el par de cebadores específicos para cada serotipo y las sondas es más específico. Este es el método de diagnóstico rápido, específico y costoso que SYBR verde RT-PCR. El desarrollo de los cebadores específicos para la detección y tipificación del virus del dengue mediante el ensayo de verde SYBR RT-PCR podría ser más exacto. El par de cebadores desarrollado en los estudios anteriores no puede amplificar la muestra respectiva debido a que estos cebadores no pudieron alinearse con la mayor parte de la cepa asiática debido a la variación de los genotipos en diferentes países. Los cebadores de PCR deben variar para lograr una mayor sensibilidad. Objetivo de nuestro estudio fue desarrollar el cebador específico de la región de la cápside más conservada del virus y optimizar la condición de este manual, para desarrollar una rápida menor costo, ensayo SYBR dengue verde en tiempo real y comparar la sensibilidad a la más lenta convencional anidada PCR y ensayo de PCR más caro sonda TaqMan en tiempo real.

Metodología realizada: El estudio se realizó en la colaboración de la Facultad de Medicina Tropical de la Universidad de Mahidol y las fuerzas armadas Instituto de Investigación de Ciencias Médicas (AFRIMS) Bangkok, Tailandia. La investigación se llevó a cabo después de la aprobación por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Tropical de la Universidad de Mahidol y el permiso otorgado por el Walter Reed Nacional Centro Médico Militar, EE.UU.

Cuatro cepas de laboratorio y ocho cepas estándar de virus del dengue se utilizaron para detectar el límite de detección (LOD) en la PCR anidada convencional. Ocho cepas estándar se utilizaron para la optimización del nuevo cebador para el ensayo en tiempo real verde SYBR. Para calcular la sensibilidad y especificidad del intervalo de confianza, se utilizó la calculadora estadística de la página web KT Centro de Información en:

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Las muestras de suero. Doscientos veintitrés muestras clínicas de suero fueron utilizados en el estudio fueron recogidos desde 2006 para 2008, de pacientes febriles. La confirmación del diagnóstico de dengue hecho por tanto ELISA y PCR anidada convencional. Las muestras se mantuvieron en -700C en AFRIMS. Fuera de 223 muestras se utilizaron 30 muestras ciegas para la validación inicial del ensayo en tiempo real verde SYBR. Fuera de 193 muestras de 43 fueron primario, 130 eran secundaria y 20 fueron negativos por ELISA.

Dilución y extracción de RNA de Wild y cepa estándar. Cuatro de laboratorio cepas virulentas: DENV-1 cepa Hawaii, DENV-2 cepa NGC, DENV-3 H87 Filipinas tensión, y DENV-4 814 669 de deformación Dominica y ocho cepas estándar de C6 / 36 dengue aislado virus se utilizaron para determinar el límite de detección. Cepas de virus estándar se propagaron en células C6 / 36; Los títulos de UFP se determinaron por ensayo de placas y se almacenaron a -70 ° C. Cepa de virus salvaje se diluyó en solución RPMI, mientras que la cepa estándar fue diluido en suero humano normal. Diez veces diluciones en serie se realizaron para hacer que la concentración más baja de 0,0001 pfu / ml en ambos grupos de cepas. La solución diluida de cada concentración de 140 l se tomó como muestra de interés y el ARN total se extrajo por QIAGEN kit comercial (EE.UU.) de acuerdo con la recomendación del fabricante. 50! L de tampón AVE se aplicó para la elución. RT-PCR: protocolo Lanciotti Modificado se aplicó por una etapa de RT-PCR y PCR anidada

Un escalón RT-PCR de un solo paso 1 st ronda de RT-PCR se estableció en 50 l de volumen final que contiene 5 l de suspensión de ARN, 5 l de 10 x tampón de PCR II, 1! L de dNTPs 10 mM, 3 l de 25 mM MgCl 2 , 1,25 l de 10 pmoL/μl de cebador directo D1, 1,25 l de 10 pmoL/μL de cebador inverso D2, 0,25 l de DTT 1 M, 0,10 l de transcriptasa inversa de virus de la mieloblastosis aviar (AMV RT, 10 U / l, Promega, Madison, WI, 0,25 l de AmpliTaq DNA polimerasa (5 U /! l, Applied Biosystems), y 32,9 l de RNasa libre de agua se aplicó en termociclador. se realizó la etapa de RT a 42 ° C durante 60 min fue seguido por 35 ciclos de ciclismo termo ; 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 2 min, usando el sistema gene Amp PCR 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EE.UU.).

Nested PCR: 5 l de tampón 10 x PCR II , 4 l de dNTPs 10 mM, 5 l de 25 mM MgCl 2 , 1,25 l de 10 pmoL/μL de cebador directo D1, 1,25 l de 10 pmoL/μL de cada cebador inverso, ADN polimerasa (5 U /! l, Applied Biosystems), y 24.50 l de RNasa libre de . luego agua El producto de RT-PCR (2 l) se diluyó a 1: 100 diluciones en agua libre de RNasa. Cinco camada micro de esta dilución se añadió en 45! L de mezcla de PCR anidada.

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La etapa de la PCR anidada se realizó durante 25 ciclos de ciclismo termo; 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 2 min, usando el sistema Gene Amp PCR 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EE.UU.).

Electroforesis en gel de: los productos de PCR tanto de RT-PCR y los pasos Nested PCR (9 l de producto de PCR con 1 l de tampón de carga de gel) eran electroforesis en gel de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio. Se observó la banda común de 511 pares de bases (pb.) De tamaño en la etapa de RT-PCR, mientras que en la muestra de paso de PCR anidados que contienen 3 o 4 fue identificado como la banda de ADN de 482, 119 DENV-1, 2. 290, o 392 pb.

Diseño de cebadores oligonucleotídicos para la base-SYBR Green RT-PCR: Los cebadores descritos por Shu et al. Fueron considerados y re-diseñada por alineación de secuencias para dar la máxima homología de secuencia entre las cepas de DENV Thai y otras cepas de Asia y el Pacífico la cepa Dominicana. The Thai DENV cepas de secuencias se obtuvieron de GenBank (números de acceso entre paréntesis) incluyen 10 DENV-1 (AY732474-AY732483), 10 DENV-2 (DQ181797-DQ181806), 6 DENV-3 (AY676348-AY676353), 6 DENV- 4 (AY618988-AY618993) fueron alineados utilizando software Clustal X.

Las secuencias de algunos cebadores fueron modificados para degenerar para que coincida con las secuencias de las cepas de DENV Thai y otras cepas. Los cebadores se diseñaron para evitar el dímero cebador y la estructura secundaria Cebador diseñado a partir de la región de la cápside más conservada del virus se ha optimizado en hibridación a 540C durante 30 segundos y extensión a 600C durante 30 segundos. Para un paso RT-PCR, RT mezcla maestra se preparó de acuerdo con el protocolo de la energía SYBR Green RNA-a-C T 1-Step Kit (Applied Biosystems, Foster, CA, EE.UU.). 20! L de mezcla de PCR fue preparado con RNasa libre de agua a 4,24 l, 10 volumen mol, Potencia SYBR® Green Mix RT- PCR (2 x) 0,3! L, cebador directo (10? Mol) de 0,3 l de cebador inverso (10! Mol), RT Enzyme Mix (125 x), 0,16 l. Los tubos con la mezcla Se tomaron alícuotas en el tubo de micro y se añaden 5 l de molde de ARN. Los tubos ópticos de reacción se sellaron con tapas ópticas y se sometieron en 7300 Applied Bio Sistemas de PCR en tiempo real con transcripción inversa (480C, 30 min), la activación de ADN Gold® polimerasa ampliTaq, UP (Ultra Pure) (950C, 10 min), la desnaturalización (950C, 15 sec) de recocido 540C 30 seg y la sEC y disociación etapa de extensión 600C 30 con 950C 15 seg, 600C 1 min, 950C 15 seg, y 600C 15 seg.

TaqMan en tiempo real RT-PCR: El TaqMan en tiempo real RT-PCR se realizó de acuerdo a las Fuerzas Armadas Instituto de Investigación de Ciencias Médicas de

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protocolo AFRIMS usando AgPath Id de TM . One-Step RT-PCR kit (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). Dos reacciones separadas dúplex se llevaron a cabo para cada muestra de ARN, una para la detección simultánea de DENV-1 y DENV-3 y uno para DENV-2 y DENV-4. Mezcla de reacción DENV-1 / DENV-3 contenía 2,5 l de suspensión de ARN, 10 pmol (1 mu l) de cada DENV-1 y DENV-3 cebadores, 5 pmol (0,5 mu l) de cada sondas DENV-1 y DENV-3, 1,83 l de RNasa libre de DNasa agua, 1,67 l de detección Enhancer, 20 U de RNasa, 12,5 l de 2 x tampón de RT-PCR, y 1 l de 25 x mezcla de enzimas RT-PCR, en volumen total de 25! l. Mezcla de reacción DENV-2 / DENV-4 tenía se utilizó la misma composición de cebadores y sondas. El único paso RT-PCR que consiste en una RT paso 10 min a 45°C, 15 min de activación de la polimerasa Taq a 95°C, seguido de 40 ciclos de PCR a 95°C durante 15 seg y 60°C durante 1 min se llevó a cabo en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7300. La acumulación de productos de la PCR se detectó mediante el control de la fluorescencia emitida por la hidrólisis de la sonda usando el software SDS. Se determinó el ciclo de amplificación (valor Ct) en el que se detectó la fluorescencia por encima del umbral. Una muestra se define como positivo si el valor de Ct era <40, basado en el fondo de reactividad cruzada de los cebadores y sondas en reacciones de control no plantilla.

Y para concluir El límite de detección del virus del dengue en tiempo real verde SYBR era casi igual que la PCR anidada convencional. Sensibilidad y especificidad de ensayo con verde SYBR fue del 84% y 81%. Era mejor que el ensayo Taqman en tiempo real. SYBR verde se acordó moderadamente en la sensibilidad con la PCR anidada convencional. En tanto la infección primaria y secundaria, excepto DENV-3, todo serotipo fueron más sensibles en el ensayo de PCR en tiempo real verde SYBR de ensayo de Taqman en tiempo real. Taqman ensayo del dengue en tiempo real es menos sensible que en tiempo real SYBR verde. Tiempo para realizar el ensayo verde SYBR fue menor en comparación con el ensayo de PCR anidada convencional. El costo de reacción del ensayo de verde SYBR era también más barato entre tres ensayo dengue PCR. En el futuro necesitamos más más estudios para encontrar el ensayo de imprimación dúplex para diagnosticar la infección dual en zonas endémicas de dengue.

Alto sensible, específico y de bajo consumo de tiempo y ensayo con verde SYBR bajo precio se puede concluir que el ensayo adecuado y recomendado como una herramienta útil para la encuesta epidemiológica del virus del dengue en las zonas endémicas"17.

                                                            17 PAUDEL D, JARMAN R, LIMKITTIKUL K, KLUNGTHONG C, CHAMNANCHANUNT S, NISALAK A,

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2.2 MARCO TEÓRICO

2.2.1 Taxonomía del virus dengue. Familia: Flaviviridae Género: Flavivirus Especie: Dengue

2.2.2 Estructura del virus. “La partícula viral del DENV tiene un diámetro de 40-

60 nanómetros (nm). La parte externa del DENV está formada por una nucleocápside esférica de 30 nm, la cual deriva de la bicapa lipídica de la célula hospedera. La nucleocápside recubre a la membrana lipídica y esta a su vez rodea a la cápside viral, que protege al material genético del virus (ARN)”18.

2.2.3 Genoma del virus. Es el siguiente:

El virión maduro tiene tres proteínas estructurales: la proteína C de la nucleocápside, la proteína M asociada a la membrana y la proteína E de la envoltura y otras proteínas no estructurales: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5. Todas estas proteínas se forman a partir de una gran poliproteína (5´ C-prM-E-NS1- NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 3´), para la cual codifica el genoma del virus. El genoma del virus está constituido por una molécula de ácido ribonucleico (ARN) de cadena única y aproximadamente 11 kilobases (kb) y de relativamente alta variabilidad genómica. Tiene un coeficiente de sedimentación de 42S y un peso molecular de 4,2 kD. El ARN genómico es de polaridad positiva y funciona como ARN mensajero al traducirse directamente en los ribosomas durante el proceso de replicación. Presenta una caperuza tipo I, con una estructura Gppp Amp cubriendo el extremo 5´ terminal, seguido por una secuencia dinucleotídica conservada AG. El extremo 3´ terminal carece de cola poliadenilada y termina con una secuencia dinucleotídica conservada CU. Los ácidos nucleicos genómicos, por sí mismos, son infecciosos, por lo que las autoridades de salud recomiendan manejar este virus en el nivel de bioseguridad 2 (BLS-2, por sus siglas en inglés)"19.

                                                                                                                                                                                     GIBBONS R, CHOKEJINDACHAI W. Comparación de ensayo dengue verde SYBR en tiempo real con tiempo real TaqMan ensayo dengue RT-PCR y la PCR anidada convencional para el diagnóstico de la infección primaria y secundaria dengue. [Artículo en Línea]. En: North Am J Med Sci. 2011, vol. 3, n°10, pp. 478-485. [Consultado: 9/5/2017]. Disponible: http://www.najms.org/text.asp?2011/3/10/478/86113 PMID: 22363089 18 VELANDIA y Col. Virus del dengue: estructura y ciclo viral. [Articulo en línea] En: Infectio. 2011, Vol. 15, n°1, pp. 33-43. [Consulta: 11/09/2017]. Disponible: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-93922011000100006#figura1 19 TISCAREÑO Y COL. Virus del dengue: estructura de serotipos y epidemiología molecular. [Artículo en línea] En: CienciaUAT. 2012. Vol. 6 n°3., pp. 27-33. [Consulta: 11/09/2017]. Disponible: http://www.redalyc.org/pdf/4419/441942927002.pdf ISSN 2007-7521

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2.2.4 Serotipos del virus. Son:

Existen cuatro variantes los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4. La inmunidad es serotipo-específica por lo que la infección con un serotipo determinado confiere inmunidad permanente contra el mismo (inmunidad homóloga) y sólo por unos meses contra el resto de los serotipos (inmunidad heteróloga). Aunque en teoría una persona podría padecer dengue hasta cuatro veces a lo largo de su vida (una por cada serotipo) hasta el momento solo se han comprobado hasta tres infecciones en un mismo individuo. Cualquier serotipo puede producir formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos DENV-2 y DENV-3 han sido asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos. En Argentina los 25.000 casos confirmados de dengue ocurridos durante el 2009, se registraron casos de dengue grave por el serotipo DENV-1"20.

2.2.5 En el ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti ocurren tres etapas a saber huevos, larvas y adultos. En la etapa de los huevos es principalmente vespertina y son puestos uno a uno, quedan adheridos en las paredes del receptáculo al ras del agua. Los huevos miden menos de 1 mm de largo, inicialmente son blancos, cambian a oscuros en unas dos horas; en el momento de la postura, el embrión inicia su formación, para lograr su desarrollo necesita de dos a tres días con mucha humedad. Las primeras 48 horas de esta etapa es un período crítico donde la temperatura y la humedad son cruciales para su supervivencia; desarrollada completamente la larva dentro del huevo es capaz de resistir sequía y bajas temperaturas, sobrevive por períodos de varios meses hasta poco más de un año. Bajo estas condiciones la larva permanece en estado de diapausa hasta tener contacto con el agua de nuevo al disminuir el suministro de oxígeno atmosférico, se activa y emerge del cascarón. Su vida acuática se inicia con el primero de cuatro estadios larvales, cada uno es de mayor talla que el anterior. El paso de un estadio larval a otro se lleva a cabo por muda en la que abandona su exoesqueleto, manteniéndose protegida por una nueva cubierta del cuerpo que se formó previamente, esto permite el aumento de su talla. Las larvas pasan la mayor parte del tiempo alimentándose, tienen sedas bucales en forma de abanico que emplean para atrapar las partículas y microorganismos que encuentran en el agua, por lo que se les considera omnívoras"21.

Respecto a la etapa de larvas, se reconocen con riesgo de equivocarse, por los movimientos sinuosos que hacen al nadar, por evitar la luz y por tener redondeada la punta del sifón. Normalmente el desarrollo larval dura de cinco

                                                            20 Ibíd., p. 4. 21 CENTRO NACIONAL PARA ENFERMEDADES INFECCIOSAS EMERGENTES Y ZOONÓTICAS. Ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti. [Documento en Línea]. (s.f.), pp.2. [Consulta: 11/09/2017] Disponible:https://www.colorado.gov/pacific/sites/default/files/OEPR4_ZTK_MosquitoLifeCycle_Spa nish_1.pdf

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a siete días, termina cuando la larva en el cuarto estadio se desarrolla y alcanza la forma de pupa, la cual es móvil y sólo respira, no se alimenta, por lo general este estadio dura 48 horas o un poco más. Bajo condiciones desfavorables, el tiempo del cuarto estadio larval puede prolongarse dando lugar a pupas y adultos de tamaño más pequeño.

El adulto, al emerger de la pupa es un mosquito oscuro, con un diseño característico de color blanco plateado en forma de lira sobre el mesonoto y con bandas blancas en las patas. Los machos se diferencian de las hembras por ser más pequeños y por tener antenas más plumosas. Hembra y macho liban néctar u otros carbohidratos de cualquier fuente accesible, sólo la hembra se alimenta de sangre, que le es necesaria para la maduración de los ovocitos, y aumentar la viabilidad de los huevos"22.

En cuento a la etapa de adultos no se alejan grandes distancias, rara vez se separan del lugar donde nacieron, salvo si algún requerimiento vital no lo encuentra a su alrededor o algún otro factor los está perturbando, su presencia es prácticamente un indicio certero de la proximidad de los criaderos. El apareamiento ocurre a pocas horas de haber emergido y de haber levantado el vuelo, una vez inseminada la hembra no necesita volver a copular y podrá producir varias veces huevos fértiles si se alimenta con sangre antes de cada ovipostura.

Las hembras son atraídas por los humanos aunque se alimentan de otros animales vertebrados; pican mayormente durante el día, su conducta es sutil y astuta: se acercan al huésped desde la sombra cuando el viento sopla a su favor y pican generalmente alrededor de los tobillos, los machos llegan a presentar comportamiento similar sin tener la capacidad de picar ni de alimentarse de sangre. La cantidad de huevos que producen las hembras por cada ovipostura está directamente en relación con el volumen de sangre que ingirieron, regularmente 72 horas o menos son necesarias para que los ovocitos estén listos para fecundarse, la hembra grávida busca un sitio con agua en donde poner los huevos, y así se cierra el ciclo de vida23"

                                                            22 Ibid., p. 15 23 Ibíd., p.2

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Figura 1. Ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti

Fuente: Centro Nacional para Enfermedades Infecciosas Emergentes y Zoonóticas. (s.f.) }

2.2.5 Células Diana en la infección. Las principales células diana de la infección por DENV son los monocitos, los macrófagos, las células dendríticas, los linfocitos CD4+ y CD8+.

2.2.6 Etapas clínicas de la enfermedad. El dengue es una enfermedad muy dinámica, a pesar de ser de corta duración (no más de una semana en casi el 90% de los casos). Su expresión puede modificarse con el paso de los días y puede también agravarse de manera súbita; por lo cual el enfermo necesita que el médico realice seguimiento, preferentemente en forma diaria.

El curso de la enfermedad del dengue tiene tres etapas clínicas:

Etapa febril

Etapa crítica

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Etapa de recuperación

La etapa febril. “Es de duración variable (entre 3 a 6 días en niños y 4 a 7 días en adultos), se asocia a la viremia, durante la cual existe una alta posibilidad de transmisión de la enfermedad si la persona es picada por un mosquito vector. En esta etapa el paciente puede tener además de la fiebre, dolor muscular y articular, cefalea, astenia, exantema, prurito, y síntomas digestivos tales como: discreto dolor abdominal y, a veces, diarrea. Es frecuente la presencia de leucopenia con linfocitosis relativa, trombocitopenia e incremento de las transaminasas”24.

Algunos pacientes pueden desarrollar manifestaciones hemorrágicas leves tales como epistaxis, gingivorragias, petequias, púrpuras o equimosis, sin que correspondan a un cuadro de dengue grave. También en algunos pacientes puede detectase extravasación plasmática, pero sin que la misma tenga significado hemodinámico. Estos casos no deben ser considerados como dengue grave. Los sangrados ginecológicos, tanto la menorragia como la metrorragia, pueden ser de intensidad variable. Las pacientes pueden requerir internación para una mejor observación o para un tratamiento de reposición de líquidos o de sangre. Estas pacientes NO serán consideradas como casos de dengue grave. Para esta clasificación se requieren otros parámetros.

El período durante el cual se produce la caída de la fiebre y hasta 48 horas después, es el momento en el que, con mayor frecuencia, los enfermos pueden presentar complicaciones; ya que la extravasación de plasma se hace más intensa y es capaz de conducir al shock por dengue. Durante o después del shock es el momento cuando se producen con mayor frecuencia las grandes hemorragias (hematemesis, melena y otras). Prevenir el shock es prevenir las grandes hemorragias.

A la caída de la fiebre, el enfermo puede mejorar o empeorar. El empeoramiento es precedido por uno o más signos clínicos conocidos como signos de alarma, ya que anuncian la inminencia del shock.

Los signos de alarma son:

Dolor abdominal intenso y sostenido

                                                            24 ARGENTINA. MINISTERIO DE SALUD. Enfermedades Infeccionas: Dengue. [Guía para el Equipo de Salud]. 2013, pp. 56. [Consulta: 12/09/2017]. Disponible: http://www.msal.gob.ar/images/stories/epidemiologia/pdf/guia-dengue.pdf

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Vómitos persistentes

Derrame seroso (en peritoneo, pleura o pericardio) detectado por clínica, laboratorio (hipoalbuminemia) o imágenes (ecografía de abdomen o Rx de tórax)

Sangrado de mucosas

Cambio en el estado mental del paciente: somnolencia o irritabilidad

Hepatomegalia (> 2 cm). (la hepatomegalia brusca se observa sobre todo en niños)

Incremento brusco del hematocrito concomitante con rápida disminución del recuento de plaquetas.

La etapa crítica. Se caracteriza por la extravasación de plasma (escape de líquidos desde el espacio intravascular hacia el extravascular), que puede llevar al shock hipovolémico (piel fría, pulso débil, taquicardia, hipotensión). Debido a la extravasación de plasma, el hematocrito sube lo que constituye un método confiable para el monitoreo de la fuga de plasma.

“Generalmente el shock solo dura algunas horas. Sin embargo, también puede ser prolongado o recurrente (más de 12 ó 24 horas y, excepcionalmente, más de 48 horas). En estos casos los pacientes pueden evolucionar a un cuadro de distrés respiratorio, así como presentar complicaciones tales como hemorragias masivas, falla multiorgánica y coagulación intravascular diseminada (CID)”25.

No es necesario esperar hasta que se produzca la hipotensión para diagnosticar el shock. Se debe vigilar la presión arterial diferencial de 20 mm Hg o menos, ya que constituye un indicador inicial de la evolución a shock junto con los signos de inestabilidad hemodinámica tales como taquicardia, frialdad y enlentecimiento del llenado capilar.

Los pacientes que llegan a la etapa crítica de la enfermedad sin un diagnóstico y tratamiento adecuado, pueden tener una mortalidad de entre el 30 al 50%.

                                                            25 Ibíd., p. 7

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Las plaquetas pueden descender progresivamente desde la etapa febril, pero este descenso se hace más intenso en la etapa crítica.

No se ha demostrado que, en el dengue, exista una estricta correlación entre la trombocitopenia y el sangrado. No obstante, esta disminución progresiva de las plaquetas constituye una indicación para un control repetido y estricto del paciente, porque puede ser un marcador de progresión de enfermedad.

La trombocitopenia en esta enfermedad no es debida a un déficit de producción sino a la destrucción masiva periférica, por un mecanismo inmunomediado (anticuerpos antivirales con reacción cruzada contra las plaquetas), de carácter transitorio, por lo cual van a iniciar su recuperación de manera espontánea, después de un breve período. Cuando las plaquetas comienzan a elevarse, indican que el paciente ha iniciado su mejoría.

El paciente con dengue, puede presentar en cualquier momento de su enfermedad signos y síntomas de afectación particular de algún órgano o sistema: encefalitis, miocarditis o hepatitis por dengue, así como insuficiencia renal. Estas se consideran formas clínicas graves de dengue.

La etapa de recuperación. Se observa lo siguiente:

Generalmente se hace evidente la mejoría del paciente pero, en ocasiones, existe un estado de sobrecarga de volumen, así como alguna infección bacteriana agregada.

En esta etapa es importante vigilar sobre todo a aquellos pacientes que tengan dificultades en el manejo de los líquidos (insuficiencia renal crónica, insuficiencia cardíaca, pacientes ancianos).

También puede aparecer en esta etapa un exantema tardío entre el 6 y 9 hasta incluso el 15 día que, con frecuencia, afecta las palmas de las manos y las plantas de los pies, asociado a un intenso prurito.

  49

Figura 2. Evolución de la enfermedad de dengue

Fuente: Argentina. Ministerio de Salud. 2013.

2.2.7 Clasificación del dengue. Se realizó una clasificación binaria de la enfermedad: dengue y dengue grave.

Los criterios de dengue grave obtenidos fueron los siguientes:

Extravasación grave de plasma, expresada por la presencia de shock hipovolémico, y/o por dificultad respiratoria debida al exceso de líquidos acumulados en el pulmón.

Hemorragias graves

La afectación de órganos: hepatitis grave por dengue (transaminasas superiores a

1000 unidades), encefalitis o afectación grave de otros órganos, como la miocarditis. Con estos criterios de gravedad se obtuvo una sensibilidad del 95% y una especificidad del 97%33.

50

Figura 3. Clasificación del dengue

Fuente: Argentina. Ministerio de Salud. 2013

2.2.8 Taxonomía del virus Zika. Familia Flaviviridae Género Flavivirus Especie: Zika

Grupo IV del orden sin clasificar

Estructura del virus. Es la siguiente:

La estructura del virus Zika es similar a la de otras estructuras de flavivirus conocidos. Son virus con envoltura que contienen un genoma de ARN de aproximadamente 11.000 pares de bases con múltiples copias de la proteína de la cápside, rodeado de una cápside icosaédrica que consta de 180 copias tanto de la envoltura glucoproteína (E) (~ 500 aminoácidos), la membrana proteica (M) (~ 75 aminoácidos), o el precursor de la misma (prM) (~ 165 aminoácidos) ancladas en una membrana lipídica. El genoma también codifica siete proteínas no estructurales que están implicados en la replicación, ensamblaje y antagonismo con la respuesta innata a la infección. En su ciclo de vida, existen viriones en tres estados principales: inmaduros, maduros y de fusión, que son no-infecciosos, infecciosos y unión a la membrana, respectivamente.

Las desigualdades de aminoácidos podría significar diferencias en los tipos de moléculas a la que el virus puede conectar y las distintas células humanos que pueden infectar. Los científicos tienen ahora un mapa del virus que muestra las regiones potenciales que podrían ser vulnerables al tratamiento terapéutico y a las vacunas, o ser utilizados para mejorar la capacidad de diagnosticar y distinguir la

51

infección Zika de la de otros virus relacionados"26.

2.2.9 Genoma del virus. “El genoma del virus Zika consta de unas proteínas estructurales como son la capside (105aa), la membrana (187aa), la envoltura (505aa) y unas proteínas no estructurales como NS1 (352aa), NS2A (217aa), NS2B (139aa), NS3 (619aa), NS4A (127aa), NS4B (255aa) y NS5 (904)”35.

2.2.10 Linajes del virus. “Existen dos tipos de linajes uno Africano y el otro Asiático, este último es el que parece haber emergido en la región del Pacífico y las Américas, provocando la epidemia”27.

2.2.11 Células Diana en la infección. Se cree que la patogénesis viral comienza con la infección de las células dendríticas cercanas al sitio de la inoculación con la saliva del mosquito, seguido por la diseminación a los nódulos linfáticos y el torrente sanguíneo. Aunque frecuentemente los Flavivirus se replican en el citoplasma de las células, también se han encontrado elementos del ZIKV en el interior del núcleo celular.

2.2.12 Manifestaciones clínicas de la enfermedad. Los síntomas aparecen después de un corto período de incubación de 3 a 12 días después de la picadura de un mosquito infectado. Su presentación abarca un espectro clínico variable que va desde formas asintomáticas, cuadros febriles leves (similares a la influenza) o moderados-graves (similares al dengue). A diferencia de otras infecciones producidas por Flavivirus, la viremia es breve y se presenta del tercer al quinto día después del inicio de los síntomas.

Las formas sintomáticas son cuadros autolimitados que tienen una duración promedio de 4 a 7 días y se caracterizan por presentar síntomas como fiebre, conjuntivitis no purulenta, cefalea, mialgia, artralgia, astenia, exantema maculopapular que inicia en la región cefálica y se extiende en sentido cefalocaudal, edema en miembros inferiores y, con menor frecuencia, dolor retroocular, anorexia, vómitos, diarrea o dolor abdominal.

Se ha reportado, además, el aumento de anomalías congénitas en recién nacidos

26 SIROHI, D., CHEN, Z., SUN, L., KLOSE, T., PIERSON, ROSSMANN, M., KUHN, R. Estructura de alta resolución del virus Zika. [Documento en Línea]. 2016. En: Sirohi et al., Science., pp. 1-3. [Consulta: 11/09/2017]. Disponible: http://www.microbiologiaysalud.org/noticias/estructura-de-alta- resolucion-del-virus-zika/ 27 ESPAÑA. CONSEJO GENERAL DE COLEGIOS OFICIALES DE FARMACÉUTICOS. Enfermedad por virus Zika. [Documento en Línea]. 2016, pp.1-6. [Consulta: 12/09/2017]. Disponible: http://static.correofarmaceutico.com/docs/2016/02/04/informe-virus-de-zika.pdf

52

cuyas madres estuvieron en contacto con el virus del Zika durante la gestación, principalmente durante el primer o segundo trimestre de gestación. Estas malformaciones incluyen microcefalia, anomalías cerebrales, síndromes polimalformativos que incluyen lesiones cerebrales, disfunción del tronco cerebral y ausencia del reflejo de deglución. Sus potenciales complicaciones de tipo autoinmune a nivel neurológico y hematológico han incrementado en frecuencia. En Brasil, se reportó un 62% de casos de síndrome de Guillain-Barré (SGB) asociados con infección por ZIKAV; en la epidemia del 2013 en la Polinesia Francesa, de los 8262 casos sospechosos de infección por ZIKAV, 70 presentaron complicaciones, de los cuales se describieron 38 casos de SGB y 25 casos de encefalitis, meningoencefalitis, parestesia, parálisis facial y mielitis, 4 casos de púrpura trombocitopénica inmune (PTI), 2 casos de complicaciones oftalmológicas y 1 caso de complicación a nivel cardíaco"28.

2.2.13 Diagnóstico diferencial. “Basados en las características clínicas típicas, el diagnóstico diferencial de esta enfermedad es amplio, siendo las infecciones por los virus del dengue y chikungunya las primeras a considerar. Otras entidades, como fiebre amarilla, malaria (o paludismo), leptospirosis, sepsis bacteriana, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), sarampión, rubéola, mononucleosis infecciosa y enfermedades reumatológicas, también deben ser tenidas en cuenta”.

Figura 4. Signos y síntomas asociados con dengue, Chikungunya y Sarampión

28 RAMÍREZ, R. & MENDOZA, L. Infección por virus del Zika. [Artículo en línea] En: CCAP. 2015, vol. 15, n°1, pp. 61-69. [Consulta: 11/09/2017]. Disponible: https://scp.com.co/wp- content/uploads/2016/04/6.-Infecci%C3%B3n-Zika.pdf

53

2.2.14 Prevención del dengue y Zika. El control del mosquito es la única medida que puede interrumpir la cadena de transmisión, no solo del ZIKAV, sino también del DENV y del CHIKV.

Para la reducción y eliminación de los criaderos dentro de las viviendas y alrededor de ellas, así como en escuelas, hospitales, clínicas, cárceles, iglesias, etc, se deben realizar las siguientes actividades:

Cepille y lave las paredes de los tanques de almacenamiento de agua para consumo humano con cloro, con el fin de eliminar los huevos del mosquito.

Limpie los patios mediante la recolección de basuras o residuos sólidos que puedan acumular agua lluvia.

Tape de manera adecuada los tanques de almacenamiento de agua para consumo humano.

Para evitar el contacto con los mosquitos, siga estas recomendaciones:

Use ropa que cubra la máxima superficie posible de piel.

Aplique repelentes de mosquitos en la piel expuesta y en la ropa, siguiendo sus instrucciones de uso.

Utilice mosquiteros o toldillos para proteger a los niños, ancianos y enfermos, o cualquier otra persona que repose durante el día.

2.3 MARCO CONCEPTUAL

Coagulación intravascular diseminada (cid): “consiste en la generación excesiva y anormal de trombina y fibrina en la sangre circulante. Durante el proceso, hay aumento de la agregación plaquetaria y del consumo de factores de coagulación”29.

29 FONDEVILA. C. Coagulación Intravascular Diseminada. [Artículo en línea]. En: SUPLEMENTO. 2012, vol. 16, pp 36-40. [Consulta: 29/08/17] Disponible: http://www.sah.org.ar/revista/numeros/vol16_supl2012_36_40.pdf

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Conjuntivitis: “es una afectación rara en la que el sistema inmunitario del organismo ataca parte del sistema nervioso periférico. El síndrome puede afectar a los nervios que controlan los movimientos musculares así como a los que transmiten las sensaciones de dolor, temperatura o tacto. Esto puede producir debilidad muscular y pérdida de sensibilidad en las piernas o brazos”30.

Dolor retroorbital: “se puede describir como una sensación urente, pulsátil, dolorosa o lacerante alrededor del ojo. También se puede sentir como si tuviera algo alojado en el ojo”31.

Edema: “significa hinchazón causada por la acumulación de líquido en los tejidos del cuerpo. Suele ocurrir en los pies, los tobillos y las piernas, pero puede afectar todo el cuerpo”32.

Hepatopatia: “se aplica a muchas enfermedades que impiden que el hígado funcione o evitan que trabaje bien. El dolor abdominal, el color amarillo de la piel o los ojos (ictericia) o los resultados anormales de las pruebas de la función hepática pueden sugerir que usted padece una hepatopatía”33.

Microcefalia: “es una malformación neonatal caracterizada por una cabeza de tamaño muy inferior a la de otros niños de la misma edad y sexo. Cuando se acompaña de un escaso crecimiento del cerebro, puede ser leve o grave”.

Miocardiopatía: “es una enfermedad en la cual el miocardio resulta debilitado, dilatado o tiene otro problema estructural. Con frecuencia ocurre cuando el corazón no puede bombear o funcionar bien. La mayoría de los pacientes con miocardiopatía tienen insuficiencia cardíaca”34.

Rt-pcr: “permite una cuantificación absoluta o relativa de los niveles de rna mensajero (mrna) de una determinada muestra de rna. El material de partida puede ser tanto rna total, como de mensajero. En ambos casos, el rna se

                                                            30 Ibíd., p.10 31 Ibid., p. 11 32 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Temas de Salud. (s.f.), (s/n°). [Consulta: 29/08/2017] Disponible: http://www.who.int/topics/es/ 33 CUENCA y COL. Ecografía en escala de grises en el diagnóstico de la hepatopatía difusa e hipertensión portal. 2 ed. Madrid. Díaz de Santos. 2014, pp 45. 34 GÁLVEZ, E & COL. Guías de práctica clínica de la Sociedad Española de Cardiología en miocardiopatías y miocarditis. [Artículo en línea]. En: Rev Esp Cardiol. 2000, vol. 53, n°.3, pp.360-393. [Consulta: 29/08/2017] Disponible en: http://www.revespcardiol.org/es/guias-practica-clinica- sociedad-espanola/articulo/9344/

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retrotranscribe a dna”35.

Shock: "es una afección potencialmente mortal que se presenta cuando el cuerpo no está recibiendo un flujo de sangre suficiente. La falta de flujo de sangre significa que las células y órganos no reciben suficiente oxígeno y nutrientes para funcionar apropiadamente, muchos órganos pueden dañarse”36.

Trastornos neurológicos: “son enfermedades del sistema nervioso central y periférico, es decir, del cerebro, la médula espinal, los nervios craneales y periféricos, las raíces nerviosas, el sistema nervioso autónomo, la placa neuromuscular, y los músculos”37.

2.4 MARCO LEGAL

Resolución número (1288 de 2016)

Protocolo de vigilancia en salud pública dengue: Instituto Nacional de Salud

Protocolo de vigilancia en salud pública zika: Instituto Nacional de Salud

Circular conjunta externa 043 de 2015

Guía nacional para el manejo de la infección por el virus zika

2.5 MARCO CONTEXTUAL

El estudio sobre IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016 se llevó a cabo en tres laboratorios diferentes de la Universidad de Santander ubicados en el bloque A, contamos con el Intramural que se encuentra ubicado al frente de crédito y cartera, el de Biología se encuentra ubicado al lado del laboratorio de Microbiología donde se logró realizar la                                                             35 VILCHES A y col. Expresión Genética por RT-PCR en Guía práctica de estudio. [Artículo en línea]. En: Universidad Nacional Autónoma de México. 2013. Primera edición: 7 de junio de 2013, Pp:8 [Consulta:29/08/2017] Disponibleen: http://antares.iztacala.unam.mx/papime/wp-content/uploads/2014/10/RT_PCR_GUIA1.pdf ISBN: 978-607-02-4635-7 36 Op. Cit. Organización Mundial de la Salud, p. 11 37 Ibid., p. 25

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respectiva toma de muestra.

En el laboratorio de Biología Molecular que se encuentra ubicado al lado derecho el Anfiteatro y al lado izquierdo el laboratorio de Química se realizó todo el proceso de aislamiento del ARN, PCR y electroforesis. La Universidad de Santander se encuentra ubicada en la urbanización el Bosque Avenida 4 10N-61 Cúcuta, Norte de Santander.

Figura 5. Universidad de Santander UDES Campus Cúcuta, a la derecha vemos su ubicación y a la izquierda una imagen de la Universidad

Fuente: Google. Mapas. UDES. 2017.

2.6 SISTEMA DE HIPOTESIS

H.T: A mayor personas asintomáticas portadoras de los virus Dengue y Zika existen mayor probabilidad de transmitir estos virus a nuevas personas.

H.O: A mayor personas asintomáticas portadoras de los virus Dengue y Zika NO existe mayor probabilidad de transmitir estos virus a nuevas personas.

  57

2.7 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES

Cuadro 1. Operacionalización de las variables

Pregunta de Investigación

Objetivo Específico

Variables Naturaleza Escala Medición Relación entre las variables

¿Se pueden identificar los virus del Dengue y Zika mediante RT-PCR en personas asintomáticas?

Determinar la presencia o ausencia de los virus Dengue y Zika en ARN aislado de muestras de suero mediante la amplificación por RT-PCR.

Virus Dengue Virus Zika

Cualitativa Nominal Dicotómica --------

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3. MARCO METODOLÓGICO

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN

Esta investigación tiene un diseño de estudio descriptivo y de campo porque se busca determinar la presencia o ausencia de los virus Dengue y Zika en personas asintomáticas, siendo este un evento de importancia epidemiológica en la ciudad de Cúcuta, Norte de Santander, Colombia, en un periodo específico de tiempo delimitado del año 2016.

3.1.1 Nivel de Investigación. Según Sampieri (1998, Pág. 60) los estudios descriptivos permiten detallar situaciones y eventos, es decir como es y cómo se manifiesta determinado fenómeno y busca especificar propiedades importantes de personas, grupos, comunidades o cualquier otro fenómeno que sea sometido análisis. Este proyecto de investigación se considera que es de carácter descriptivo porque se determinara la presencia o ausencia de los virus Dengue y Zika en personas asintomáticas.

3.1.2 Diseño de Investigación. De campo porque permite tener un contacto directo con la población para así recolectar tanto la información como las muestras.

3.2 MÉTODOS O PROCEDIMIENTOS

3.2.1 Materiales y equipos

Tubos tapa roja

Agujas vacutainer

Algodón

Alcohol

Torniquete

RNA Trisure

Enzima Reverse

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DNTPS

Marcador de peso molecular

Tubos PCR

Gel Red

Primer

Tris

Taq polimerasa

Cava transportadora

Pilas de hielo

Vórtex

Centrífuga

Balanza analítica

Micropipetas de 100 a 1000µL

Micropipetas de 50 a 200µL

Puntas amarillas

Puntas azules

Tubos de PCR

Termociclador

Buffer

Cámaras de electroforesis

Fuente de poder

Sistema de captura de imágenes

3.2.2 Métodos. De acuerdo al objetivo planteado en este estudio, la recolección y procesamiento de muestras se ejecutó en tres fases de trabajo que se describen a continuación.

  60

Fase I descriptiva

3.2.2.1 Diligenciamiento del consentimiento informado y la encuesta para la participación en el estudio. A las personas seleccionadas mediante los criterios de inclusión se les aplico la encuesta (Ver Anexo 1) y el consentimiento informado (ver anexo 2), se les explico el objetivo del estudio y el respectivo procedimiento para la toma de muestra, siendo la participación de manera voluntaria.

3.2.2.2 Toma, transporte, adecuación y almacenamiento de muestras sanguíneas. Una vez que la persona aceptaba participar y diligenciaba el consentimiento informado y la encuesta, las estudiantes encargadas del proyecto realizaban el proceso de Venopunción en los laboratorios Intramural y Biología de la Universidad de Santander, la toma de la muestra sanguínea se realizó de acuerdo al procedimiento estandarizado para recolectar suero, una vez se extrajo la muestra se removió el coagulo y se llevó a centrifugar a 3.000 rpm por 15 min para separar el suero de la sangre total, el cual fue transferido a viales estériles de 1.5 y se preservaron a -20°C.

3.2.2.3 Comprobación especifica de cebadores empleando herramientas de bioinformática como el software en línea BLAST. Por medio del programa software en línea BLAST el cual encuentra las regiones de similitud entre las secuencias locales. El programa compara secuencias de nucleótidos o de proteína a bases de datos de secuencia y calcula la significación estadística de los partidos. BLAST se puede utilizar para inferir las relaciones funcionales y evolutivas entre las secuencias, así como ayudar a identificar miembros de familias de genes.

Fase II analitica

3.2.2.4 Aislamiento de ARN utilizando el método de Trisure siguiendo el protocolo propuesto por la casa comercial Bioline. Se agregó 900 ul de Trisure a 300 ul del suero de cada muestra, se le dio Vórtex durante 30 seg y se incubo a temperatura ambiente durante 5 min, luego se le adiciono 200 ul de Cloroformo y se centrifugo a 12.000 rpm por 15 min. La fase superior fue trasferida a un tubo limpio y se le agrego 500 ul de Isopropanol, se centrifugo a 12.000 rpm por 15 min y se eliminó el Isopropanol por inversión. Se agregó 1 ml de Etanol al 75% se le dio Vórtex durante 10 seg y se centrifugo a 12.000 rpm por 5 min. Se descartó el Etanol por inversión y por último se agregó 100 ul de Agua DPC.

3.2.2.5 RT-PC Múltiple para la identificación de Dengue y Zika

  61

Retrotranscripción: Para la identificación de los virus Dengue y Zika, inicialmente se realizó la retrotranscripción del ARN para producir ADNc.

Cuadro 2. Retrotranscripción

Total RNA 4 μl

Primer: Oligo (dT) (10 μm) or Randon Hexamer (40 μm) or GSP (8 μm)

1 μl

10 Mm dNTP mix 1 μl

5 X RT Buffer 4 μl

RiboSafe RNase inhibitor 1 μl

Tetro Reverse Transcriptase (200 u/μl) 1 μl

DEPC-treated water 20 μl

Fuente: Bioline. (s.f.)

Mezcle suavemente pipeteando.

Incubar las muestras a los 10 min a 25 ° C seguido de 45 ° C durante 30 min.

Terminar la reacción incubando a 85 ° C durante 5 min, enfriar en hielo.

Almacenar la reacción a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, o proceder a la PCR de inmediato.

Dengue

Cebadores: Para la identificación de cualquiera de los cuatro serotipos del virus Dengue por RT- PCR Múltiple se utilizaron los cebadores propuestos por Dayakar et al (2015).

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Cuadro 3. Cebadores específicos utilizados en la RT-PCR Múltiple para la identificación de Dengue

NOMBRE SECUENCIA

D1 5’ TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G 3’

TS1 5’ CGT CTC AGT GAT CCG GGG G 3’

TS2 5’ CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG 3’

TS3 5’ TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C 3’

D4 5’ CTC TGT TGT CTT AAA CAA GAG A 3’

Fuente: Dayakar et al (2015)

Los cebadores se restituyeron de la siguiente manera: Cantidad de Restituyente = (Densidad Óptica x mg)

Mezcla de la PCR Múltiple: Para la realización de la PCR Múltiple se utilizaron las concentraciones de la mezcla establecidos en este trabajo, las temperaturas y ciclos propuestos por Dayakar et al (2015).

Cuadro 4. Mezcla de la PCR Múltiple

REACTIVO STOCK VOLUMEN 1X CONCENTRACIÓN FINAL

Buffer 5 x 10 1 x

Primer D1 1μM /μl 1 μl 1μM

Primer TS1 1μM /μl 0.5 μl 1Μm

Primer TS2 1 μM /μl 0.5 μl 0.5 μM

Primer TS3 1 μM /μl 0.5 μl 0.5 μM

Primer D4 1 μM /μl 0.5 μl 0.5 μM

MyTaq 5 U/μl 0.2 μl 1 U

ADNc - 2 μl -

Agua destilada - 35.8 μl -

Volumen Total - 50 μl -

Fuente: Bello A, Serrano J, Laboratorio de Biología Molecular UDES, Colombia 2016.

  63

Cuadro 5. Programa de amplificación para el diagnóstico del virus Dengue PCR Múltiple

TEMPERATURA # DE CICLOS TIEMPO PROCESO

95°C 5 min. Desnaturalización Inicial

94°C 30 seg. Desnaturalización

55°C 1 min. Hibridación

72°C

40

2 min. Extensión

72°C - 5 min. Extensión final

0°C - 18 h Preservación del producto

Fuente: Dayakar et al (2015).

ZIKA: Cebadores: Para la identificación del virus ZIKA por PCR se diseñaron cebadores empleando diversas herramientas de bioinformática.

Cuadro 6. Cebadores específicos utilizados en la PCR para la identificación de ZIKA

NOMBRE SECUENCIA

ZIKA 1F 5’-CCATACGGCCAACAAAGAG-3’

ZIKA2F 5’-AAGTGCAGGAGGTGAGAGGA-3’

ZIKA 1R 5’-TCATTCACAGCTTCCACAGC-3’

ZIKA 2R 5’-CTCTTTGTTGGCCGTATGGT-3’

Fuente: Bello A, Serrano J, Laboratorio de Biología Molecular UDES, Colombia 2016.

Mezcla de PCR: Para la realización de la PCR se utilizaron las concentraciones de la mezcla de RT-PCR, temperaturas y ciclos establecidos en este trabajo.

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Cuadro 7. Mezcla de PCR

REACTIVO

STOCK

VOLUMEN 1X CONCENTRACIÓN

FINAL

Buffer 5 x 10μl 1 x

Primer Zika F 1μM /μl 1 μl 1Μm

Primer Zika R 1μM /μl 1 μl 1μM

MyTaq 5 U/μl 0.2 μl 1 U

ADNc - 2 μl -

Agua destilada - 35.8 μl -

Volumen Total - 50 μl -

Fuente: Bello A, Serrano J, Laboratorio de Biología Molecular UDES, Colombia 2016.

Cuadro 8. Programa de amplificación para el diagnóstico de Zika por PCR Múltiple

TEMPERATURA # DE CICLOS TIEMPO PROCESO

95°C 5 min. Desnaturalización Inicial

94°C 30 seg. Desnaturalización

60°C 1 min. Hibridación

72°C

30

1 min. Extensión

72°C - 5 min. Extensión final

0°C - 18 h Preservación del producto

Fuente: Bello A, Serrano J, Laboratorio de Biología Molecular UDES, Colombia 2016.

3.2.2.6 Electroforesis. La visualización de los productos de amplificación de las muestras se realizó en una migración electroforética (140V) en gel de agarosa preparado 1.8 %, en cada electroforesis se utilizó un marcador de peso molecular GeneRuler 100 bp Plus con el fin de determinar el tamaño de los fragmentos amplificados, según las condiciones de corrida descritas.

  65

Fase III conclusiva

3.2.2.7 Tabulación de las encuestas y análisis de los resultados moleculares. Los resultados obtenidos del estudio, fueron almacenados sistemáticamente con códigos internos de identificación en una base de datos creada en Excel.

Según el análisis de la encuesta de las 93 personas asintomáticas que participaron en el estudio, se trabajaron las siguientes variables en cuanto a la edad participaron desde 17 años hasta los 53 años de edad encontrándose mayor porcentaje en personas entre las edades de 19 años a 23 años de edad con un porcentaje de 64,6%; En cuanto al sexo el 72% corresponde al sexo femenino y el

28% al sexo masculino; En los estratos socioeconómicos participaron desde el estrato 1 hasta el estrato 5, el mayor número de personas correspondía al estrato

3 con un porcentaje de 40,9%. Debido a que eran personas asintomáticas ninguna presento complicaciones neurológicas y por ende no se realizaron la unidad de análisis del síndrome neurológico y el 88,2% refirieron que ningún familiar presento sintomatología de ninguno de los virus en los últimos 15 días; otra variable analizada fue el desplazamiento en los últimos 15 o 30 días aunque el mayor porcentaje fue el 82,8% de personas que no se desplazaron y un 17,2% si se desplazaron a lugares como Chinacota, Bucaramanga, pamplona, Ocaña, Salazar, Sardinata, Tibu, Ureña, San Antonio, Rubio, Bogotá , Medellín y Villavicencio. En cuanto a Dengue ninguna persona presento la enfermedad.

Según los resultados obtenidos la gráfica 1. Determinación de Dengue, De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas de San José de Cúcuta en el

100% se determinó la ausencia del virus Dengue. Según la gráfica 2. Determinación de Zika, el hallazgo determina que de 93 personas asintomáticas que participaron en el estudio el 99% no presento el virus de Zika y el 1% de las muestras presento el virus Zika, en consecuencia tal resultado no es significativo como foco de transmisión para la población de San José de Cúcuta.

3.3 POBLACIÓN Y MUESTRA

3.3.1 Población. La población de interés para este estudio correspondió a Personas Asintomáticas de San José de Cúcuta, que firmaron el consentimiento

  66

informado de participación voluntaria y llenaron la respectiva encuesta para participar en el microproyecto de investigación: “IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, AÑO 2016”.

3.3.2 Muestra. La muestra es no probabilística conformada por un grupo de 93 personas asintomáticas.

3.3.3 Definición de sujetos de estudio. Los sujetos participantes del estudio correspondieron a estudiantes, docentes, administrativos y demás población de San José de Cúcuta, quienes recibieron la información donde los invitábamos a participar en nuestro estudio durante un periodo determinado del año 2016, los cuales cumplieron con los criterios de inclusión y participaron voluntariamente en el estudio.

3.3.4 Criterios de inclusión. Para la realización del estudio, los sujetos fueron incluidos de acuerdo al cumplimiento de los siguientes criterios:

No haber presentado ningún signo y síntoma de los virus Dengue y Zika

3.3.5 Criterios de exclusión. No se tomaron en cuenta las muestras para el análisis de este estudio de las personas que hayan presentado la enfermedad o alguno de sus síntomas.

Personas que hayan sido diagnosticadas mediante un examen de laboratorio.

Personas que hayan presentado los síntomas sin ser diagnosticados por pruebas de laboratorio.

3.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS

TÉCNICAS INSTRUMENTOS

Observación Cuaderno de Campo Cuestionario Encuesta (Se aplica ALPHA DE

CRONBACH)

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Fuente primaria: Datos obtenidos de la encuesta aplicada a las personas asintomáticas en el estudio, así como la obtención de suero a partir de sangre total para el aislamiento del ARN por métodos moleculares como la RT-PCR determinando la presencia o ausencia de los virus.

Según los resultados del Alpha de Cronbach se considera viable la encuesta para aplicarla en el estudio, debido al puntaje obtenido.

3.5 TECNICAS DE PROCEDIMIENTOS Y ANALISIS DE DATOS

Para el análisis de los resultados se empleó la herramienta SPSS, a partir de ella obtuvimos gráficas y tablas de frecuencia como resultados a las diversas preguntas de la encuesta, la cual fue aplicada a las personas asintomáticas.

  68

4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

4.1 RESULTADOS

4.1.1 Presencia o Ausencia de los virus Dengue y Zika

Cuadro 8. Determinación de Dengue

CATEGORIAS CODIGOS FRECUENCIA ABSOLUTA

FRECUENCIA RELATIVA (%)

Presencia 1 0 0 %Ausencia 2 93 100 % Totales 93 93 100 %

Gráfica 1. Determinación de Dengue

Determinación de Dengue

0%

ausencia

0%

Bello A, Serrano J, Laboratorio de Biología Molecular UDES, Colombia

2016.

de San José de Cúcuta

presencia

10

Fuente:

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas

  69

  70

del virus Dengue. en el 100% se determinó la ausencia

Cuadro 9. Determinación de Zika

CATEGORIAS CODIGOS FRECUENCIA ABSOLUTA

FRECUENCIA RELATIVA (%)

Presencia 1 1 1.075 %Ausencia 2 92 98.9 % Totales 93 93 100 %

Gráfica 2. Determinación de Zika

Determinacion de Zika

1

9%

El hallazgo determina que de 93 personas asintomáticas que participaron en el

%

presencia ausencia

9

Fuente: Bello A, Serrano J, Laboratorio de Biología Molecular UDES, Colombia 2016.

estudio el 99% no presento el virus de Zika y el 1% de las muestras presento el virus Zika, en consecuencia tal resultado no es significativo como foco de transmisión para la población de San José de Cúcuta.

  71

Figura 6. Amplificación por RT-PCR del virus Zika

spués de un período de incubación de aproximadamente 7 días. La hembra del mosquito A. aegypti es transmisora después de un período de 7 a 14

El dengue en Colombia representa un problema prioritario en salud pública debido

el

Descripción de la figura: Líneas 1 y 9: Marcador de pesos molecular (Promega™ 1kb DNA Ladder Molecular Weight Marker). Línea 2: Control Negativo. Líneas 3 a 7: Muestras de personas asintomáticas. Línea 8: Control Positivo. Se observa la amplificación de un fragmento 242 pb, que corresponde a lo esperado en la identificación por RT-PCR de Zika.

4.2 DISCUSIÓN

El Dengue es una enfermedad viral febril aguda. Se reconoce un espectro de manifestaciones de la enfermedad que va desde procesos asintomáticos hasta cuadros severos. Las personas infectadas sintomáticas y asintomáticas son los portadores y multiplicadores principales del virus, y los mosquitos se infectan al picarlas. Para transmitir la enfermedad es necesario que el mosquito haya picado a una persona infectada con el virus del Dengue durante el período de viremia, que ocurre de

días de incubación y puede trasmitir la enfermedad por el resto de su vida.

a la reemergencia e intensa transmisión. La tasa de incidencia de Dengue ha sido fluctuante desde 1978 con tendencia al incremento a través del tiempo. En nuestro estudio evaluamos la presencia o ausencia del virus Dengue en personas asintomáticas, es decir personas que durante el brote no tuvieron contacto conmosquito y por lo tanto no presentaron los síntomas.

  72

Al comparar nuestro estudio donde se analizaron 93 muestras de personas asintomáticas utilizando 5 cebadores específicos (D1, TS1, TS2, TS3, D4) en donde el 100% corresponde a la ausencia del virus Dengue, por el contrario el estudio que realizo Paudel et al. (2011) se analizaron 223 muestras utilizando un cebador universal (DNF + R) de las cuales el 10.7% que corresponde a 24

fueron positivas para Dengue mediante la PCR en tiempo real utilizando

diferencias icativas en ibilidad de aron muestras de pe omátic

nto al número de la muestra. Todos los ensayos de PCR para Dengue son menos sensibles después de los 7

comparables a los del ensayo Taqman RT-PCR (81% y 74%). la PCR en tiempo real utilizando SYBR Green fue

por v ril, z a, emergente;

o Aedes albobictus a un huésped susceptible. La transmisión también puede ocurrir por transfusiones sanguíneas o us derivados, madre a hijo particularmente durante la última semana de estación"39.

n el estudio realizado por Lanciotti et al. (2007) se realizó una RT-PCR en tiempo al, se diseñaron dos cebadores específicos para la cepa ZIKV 2007 utilizando

                                                           

muestras SYBR Green.

Por otra parte se encontraron signif la sens la técnica, teniendo en cuenta que se utiliz rsonas asint as frente a personas que presentaban síntomas y en cua

días de presentar fiebre. Sólo el 50% son detectables por RT-PCR Taqman en tiempo real a los 5 días después de la fiebre.

La sensibilidad y la especificidad de la PCR en tiempo real utilizando SYBR Green fue del (84% y 66%, respectivamente) fueron casi

igualmente sensible en infecciones primarias y secundarias, mientras que Taqman en tiempo real fue menos sensible en la infección secundaria"38.

La fiebre irus Zika (ZIKV) es una enfermedad feb oonótic de curso agudo, benigno y autolimitado; lo cual es causado por el virus del Zika. Su sintomatología es inespecífica por lo cual puede confundirse con otros síndromes febriles y en varias ocasiones puede cursar de forma asintomática, o presentarse con una clínica moderada. La enfermedad se transmite por la picadura de la hembra infectada del mosquito Aedes aegypti

sg

Ere

 38 PAUDEL D, JARMAN R, LIMKITTIKUL K, KLUNGTHONG C, CHAMNANCHANUNT S, NISALAK A,

PMID: 22363089 SALUD. Zika

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  73

datos de secuencia de nucle en el paquete de Software PrimerExpress (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) Los cebadores

f

C 5-CCGCTGCCCAACACAAG-3’, ZIKV 1162c 5’-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3’, ZIKV 1107-FAM 5-

n negativas. Utilizando la RT-PCR en tiempo real" .

aron cuatro cebadores empleando diversas herramientas de bioinformática ZIKA 1F 5’-CCATACGGCCAACAAAGAG-3’, ZIKA2F 5’-AAGTGCAGGAGGTGAGAGGA-3’, ZIKA 1R 5’- TCATTCACAGCTTCCACAGC-3’ y ZIKA 2R 5’ CTCTTTGTTGGCCGTATGGT-3’. La población estudiada correspondió a 93 muestras de personas asintomáticas de San José de Cúcuta, 2016; en donde 1 muestra se determinó la presencia del virus Zika y en las 92 muestras no se determinó la presencia del virus, y como método se empleó la RT-PCR"41.

                                                           

ótidos del ZIKV 2007

diseñados ueron ZIKV 835 5’-TTGGTCATGATACTGCTGATTGC-3’, ZIKV 911c 5’-

CCTTCCACAAAGTCCCTATTGC-3’, ZIKV 860-FAM 5’-GGCATACAGCATCAGGTGCATAGGAG-3’ y ZIKV ’1086

’AGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAA-3’.

La población estudiada correspondió a 157 pacientes en fase aguda obtenidas durante la epidemia de Yap, en donde 17 muestras positivas, 10 fueron equivocas esto indica que una muestra particular fue positiva solo con 1 de los 2 conjuntos de cebadores lo que sugiere un resultado falso positivo y 130 fuero

40

Estos resultados difieren de los nuestros en cuanto a los métodos y la población, en nuestro estudio se diseñ

 40 LANCIOTTI RS, KOSOY OL, LAVEN JJ, VÉLEZ JO, LAMBERT AJ, AJ JOHNSON, et al. Propiedades genéticas y serológicos del virus Zika asociados con una epidemia, Estado de Yap, Micronesia, 2007. [Artículo en Línea]. En: Emerg Infect Dis. 2008 Aug., vol. 14, n°8, pp.1232-1239. [28/2/2017]. Disponible: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2600394/ DOI: 10.3201/eid1408.080287 41 RODRIGUEZ A, ACEVEDO W, VILLAMIL W, ESCALERA J. Aspectos Clínicos y Epidemiológicos de la Infección por Virus Zika: Implicaciones de la Actual Epidemia en Colombia y América Latina. [Artículo en Línea]. En: Hechos Microbiol 2014, vol. 2, n°5, pp. 92-105 [Consultado:11/5/2017].Disponible:http://aprendeenlinea.udea.edu.co/revistas/index.php/hm/article/ view/323271/20780486

  74

5. CONCLUSIONES

Con este estudio estandarizamos en el laboratorio una técnica para la determinación de los virus Dengue y Zika en personas asintomáticas, puesto que San José de Cúcuta es una ciudad considerada zona endémica en donde prolifera el zancudo del género Aedes aegypti que transmite no solo este virus sino también la Fiebre Amarilla y el Chikungunya. En el departamento no se han realizado estudios moleculares en esta población.

daria) los datos indican que el grado de reactividad cruzada en el ensayo es mayor, por lo que son poco recomendados para la confirmación del virus Zika en la fase convaleciente.

La prueba de laboratorio más confiable hasta el momento es RTPCR, a partir de suero proveniente del paciente en fase aguda (primeros cinco días luego de la aparición de signos y síntomas).

En el análisis serológico sobre la base de los resultados de las pruebas de anticuerpos de muestras en fase aguda. La respuesta de anticuerpos IgM en pacientes con ZIKV (infección primaria) es específica para ZIKV no presenta reacción cruzada, por el contrario cuando se produce la infección por ZIKV después de una infección por otro flavivirus (infección secun

  75

  76

6. RECOMENDACIONES

implemeontra insectos, prendas con manga larga, pantalones largos, toldillos y

mallas mosquiteras en ventanas y puertas.

n como la e él e. o d y

mbién se debe garantizar la preservación del RNA a través de métodos como la realización de gel de RNA y medir las

La principal medida es cortar la cadena epidemiológica mediante el control de la infestación del vector al eliminar sus criaderos y evitar el contacto con el mismo, mediante la ntación de medidas de protección personal como el uso de repelentes c

El ARN es menos estable que el ADN, pues sus moléculas no alcanzan grados de organización ta compactos d doble h ic P r lo cual se ebe trabajar bajo las condiciones necesarias de transporte, almacenamiento (-20°C) procesamiento del mismo; ta

concentraciones, para tener certeza de los resultados obtenidos.

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emia ,

st

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ANEXOS

  81

Anexo 1. Encuesta

  82

  83

Anexo 2. Tabulación de la encuesta

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 21,5 % corresponde a 20 años de edad, seguido del 11,8% que corresponde a 22 años de edad y en menor porcentaje se encuentran las siguientes edades 29,31,32,45,53 años que corresponde al 1,1%.

Grafica 2.

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 72% corresponde al sexo

femenino y el 28% al sexo masculino.

  84

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 40,9% corresponde al estrato socioeconómico 3 y el 1,1% corresponde al estrato socioeconómico 5.

  85

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 100% corresponde a que ningunas de estas personas presentaron complicaciones neurológicas.

  86

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 100% corresponde a que ninguna de estas personas se realizó la unidad de análisis del síndrome Neurológico para el virus Zika.

  87

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 100% corresponde a que los resultados de la unidad de análisis fueron descartados.

  88

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 82,8% corresponde a que las personas no se desplazaron en los últimos 15 o 30 días y el 17,2% corresponde a las personas que si se desplazaron a diferentes lugares.

  89

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 82,8% corresponde a ningún lugar visitado y el 2,2% corresponde al municipio de Chinacota.

  90

icas el 88,2% corresponde a que ningún familiar presento sintomatología de ninguno de los virus en los últimos 15 días, mientras que el 10,8% si presentaron sintomatología asociada a cualquiera de los virus y el 1,1% informo desconocer si algún familiar presento o no los síntomas.

De las 93 muestras analizadas de personas asintomát

  91

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 100% corresponde a que ninguna persona presento Dengue sin signos de alarma.

  92

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 100% corresponde a que ninguna persona presento Dengue con signos de alarma.

  93

De las 93 muestras analizadas de personas asintomáticas el 100% corresponde a que ninguna persona presento síntomas de Dengue grave.

  94

  95

Anexo 3. Aislamiento de RNA

  96

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  98

Anexo 4. Electroforesis

  99

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  101

Anexo 5. RT-PCR

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  105

  106

  107

Anexo 6. Toma de muestra sanguinea

  108

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  111

Anexo 7. Actas

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