I . . Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA I P

I/ ' /DNlSiON DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

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SERVICIO SOCIAL

1n.oie.w

26 de Octubre de 1995.

CC.CBS. 0610.95

Por medio de la presente se hace constar que el (la):

A S E ~ O Q - : ENOL. ALBERTO REYES DORANTES

del Departamento de: BIOTECNOLOG~A de la Divisi6n de Ciencias Biol6gicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:

TITULO:

MICROBIOL6GICA DE LA BACIRIA Leuconostoc Oenos 'DESACiDIFICAC16N DE VINO TINTO RUBY CABERNET, DEBIDO A LA ACCIÓN

/ALUMNO: PLACER MEDRANO GUSTAVO

__ JLICENCIATURA: INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS

JPERIODO: MAYO 19 1994-SEPTIEMBRE 7 1995/

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a los veintisiete días del mes de Octubre de mil novecientos noventa y cinco.

Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo"

M. EN C. ERNEST fl/ RODRIGUEZ A. DIV. CBS

'LPO

UNiDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán Y La Purísima Iztapalapa 09340 México, D.F. A.P. 55-535 Fax: (5) 612-80-83 Tels. 724-46-81 y 85

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Casa ab!& al iiamoo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA MYISION DE CIENCIAS BlOLOGlcAS Y DE LA SALUD SEmcio S i J W l L

ss.ws Mi0 Y5 ilA016 9á

26 de Ouubre de 1m

Por medio de la presente se nace wnslar que el (la):

ENOL. ALBERTO REYES WRANTES

del üepartarnento de: BIOTECNOLOGiA de la División de Cincias EIiológicas y de la Salud, aesrsor6 el siguiente Servicio Social:

TITULO: DESACIDIFICACION DE VINO TINTO RUB" CABERNET. DEBIDO A LA ACCICN MICROBIOLÓGICA DE L4 BACTERIA Lexonosbz Oenos

ALUMNO: PLACER MEDRANO GUSTAVO

UCENCIATUM: INGENlERiA DE LOS ALIMENTOS

PERIODO: MAYO 19 1994-SEPI'IEMBRE 7 1995

Se extiende la presente para 10s fines que al interesada convengan, en ia Ciudad de ~exico, D.F. a los üeintlslete dla6 del ma6 de Ociubre de mii novecientos novenla y cinco.

Aientamente, "Casa AblWa al Tiempo"

Desacidificación de vino tinto Ruby Cabernet debido a la acción microbiologica de la bacteria Leuconostoc oenos

Servicio Social del aiumno: Gustavo Piacer Medrano

de la Lic. ing. de ¡os Alimentos

Asesor: Enoi. Alberto Reyes Dorantes Laboratorio de Enoiogia s-i 52.

Depto de Biotecnoiogia Üivisión de C.B.S.

ÜAM-iztapalapa Septiembre de I Y95

1. INTRODUCCION

* En zonas v&Úcolas frias es frecuente encontrar kinos embotellados que sufren enturbiamientos espontáneos, que, observados al microscopio de manera directa, se puede apreciar una abundante poblacion microbiana, se percibe un ligero desprendimiento de COZ, e indaga analíticamente la presencia de ácido láctico. La aparente alteración no es sino un desarrollo natural de este proceso microbiano, proceso que tiene lugar en sustratos líquidos que se deriban de zumos de frutas ricos en ácido máiico (Suares Lepe, 1990).

L a disminución de la acidez total en vinos ricos en este ácido ha constituido uno de los procesos tecnicos más estudiados en Enologia, considerándose la retrogradación malica de la acidez como una condición indispensable para e1 afmamiento de los \inos. Esta transformacion málico-láctico, desarrollada por bacterias, autenticas protagonistas de la misma, es conocida con el nombre de fermentación malolactica (Suares Lepe, i99ij).

Las primeras observaciones sobre la disminución fuerte de la acidez total de un @o, en comparación al mosto de procedencia, se deben a Berthelot y De Fleurieu (1884). 0rdonnt.a (1891) .observa la desaparición casi total del ácido malico durante el envejecimiento de Los vinos. Sin embargo, fue Kunz (1901) quien pone en ekidencia que la disminución del ácido m h c o se acompana de un incremento simultáneo de ácido láctico. La comprobación en la misma época de que dicho fenómeno era de origen biologico se debe a Seiferi (1901), quien aisló bacterias capaces de descomponer el ácido máiico.

En Francia. la transformación maloiictica h e oi senada por biestrezat (1907), que atribuía el protaganismo de la feirnentación a las levaduras, y Moreau (1913). que comprueba como la acidez total inicial de los vinos blancos de h j o u puede reducirse casi a la mitad entre el primer trasiego y el verano (Peynaud. 1989).

También a comienzos del siglo, hlüüer-lhurgau y Ostenvalder (1913), en ,Qeinania. estudian detenidamente el proceso en \,Uios publicando trabajos todabla hoy funtíaincntales en ese campo. De iguai manera. h'iensio y Garino-canina (1914). en Itaiia. abordan los primeros criterios de clasificación de bacterias iicticas del linot y obser\-an que la fermentación inaiokctica es un fenómeno coiiiente en ia \iniiicación piamontesca (Suares Lepe, i990).

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Bélgica; Fornachon (1957) sigue la evolución de la fermentación maioíiciic:i en vinos de Australia. Marques (liómez y ~a Siiva (i965), en bines verdes tie ~ o r t u g i ~ , en in fermentación del mosto y Feii (1961) utiliza pies de cuba conjuntos de ievaduras y bacterias, al igual que Iiiigo et al. (1969) en %uios de Navai~a (Suares Lepe, 1990).

Más recientemente, Schopfer (1971), &din (1972), Sozzi et al. (1976) y Kossi y Clementi ( 1984) ensayan nuevas tecnicas para favorecer y provocar esta transformación bacteriana y conducirla de manera controlada.(Suares Lepe. 1990).

Según Buchanan y Gibbons (1974) las bacterias lácticas están agrupadas en el orden Eubacteriales, familia Lactobacillaceae, con dos tiibus importantes: Stmploc zcmeoe y Lactobacillaceae. A la primera de ellas pertenecen los géneros Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus, y a La segunda el género Lactobuciillrs. (Swres Lepe, 1990).

En estudios realizados por Kibereau-Ciayon et al. (1975) sobre 670 cepas de bacterias aisladas de uvas y vinos de diferentes paises mediterráneos, se determinan como especies más frecuentes en uvas y mostos, las de Leztc. gracile, Leirc. oenos y L. hilgardii.

En Italia, según estudios realizados por Kossi (¡984), la especie Leric. oenos es la que aparece con mayor porcentaje de frecuencia en los aislamientos realizados, y sus caractensticas bioquimicaf son las que inducen mis rápidamente .la transformación maioíactica.

De acuerdo al Berge-s Manual, las células de Leuconostoc oenos, son esféricas o lenticulares de 0.5-1.0 por 0.7-1.0 um. Su crecimiento es lento (5 a 4 dias a 22°C) y pobre. Se desarrollan en pares o formando cadenas. La temperatura óptima para su desarrollo esta entre ¿ U T y 30%'. Eí pH óptimo para su crecimiento esta entre 4.2-1.8. Es anaerobio facultativo.

Leuconostoc oeiios como otras bacterias lacticas, tiene complejos requerunientos nutricionales. L a mayoria de las cepas de L. oei7o.s requieren 4'0-( b-gíucopiranosií) icido U-pantotenico como factor de crecimiento ( \-an k~uuren 1993).

El icido málito presente en las uvas, pertenece ai isóinrro L y es un intermediario en el ciclo de los ácidos tiicarboúlicos. Su acumulación en ri fiuto se ticbe a ia interaccion con otros procesos metabólicos. Representa hasta ei 6ü"o tie la acidez total tiel mosto cuando el fmto esta "verde" : según el fiuto \:a madurnndo. esta proporcion tíisininuye y cu:indo ri fmto esta maduro su contenido u i í a entre un 10 y #I"O <id i, ;icitiez total (Reyes ijornnies. iyy?).

. ... . En ¡os \inos el icido in&o consttiuy un fxtou de inrsinbitic~id en cistn que la\-oi-ccrii cl desairoilo de ivcteiias iiciiciis que io nidaiwiixm ~>rodiicicntio iidi) i ; i i . t i i o .

Sens«iiaimente product un siihoi. ii_«eiiiincnic ~ I I I I : I I ~ ( J . pim> 40 piieiicti itirniiiic;irw en ¡os

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.wios blancos muy jóvenes y cuyas uvas no maduraron completamente. (Reyes Dorantes, 1992).

2. FERMENTACION MALOLACTICA

La fermentación maloláctica, es la degradación del icido L- máiico, a ácido L-láctico y dióxido de carbono por la acción enzúnática de algunas bacterias Iácticas. El resultado directo de esta fermentación es la reducción de la acidez del tino(5);

La reacción global de esta desacidificación, originada en el vino esta descrita por la siguiente ecuación:

en la que cualitativamente , la fermentación de 1 g de ácido malic0 forma U.67 g de acido láctico y alrededor de 167 cm de CO2 (Peynaud, 1989). 3

La reacción anteriormente descrita, es una simple descarboxiiación del ácido máiico. Sin embargo, el mecanismo de transiormación de dicha molécula no es tan sitr-le. Existen tres posibles caminos paraésto, según se admita el paso por el estadio ácido osalacético, o de una manera mas directa por el estadio ácido pinhico.

Para Charpentie (1954), el esquema mas probable consiste en piimer lugar en una deshidrogenación que conduce al acid0 osalacetico. Este icido es a continuación descarboxilado, y el pirüvico foimado, reducido a láctico por el hidrógeno liberado en la primera reacción:

. .. . ,

CH3 -CHOH - CVOH U(-) ó L(+)

~

Dicha reaccion no consistiria en una simple desc

siguientes ecuciones:

J redox. io a 13s pasando por una etapa intermedia con formacit

ENZIhfA hi. h l n h

C<J(>H - cH7 - CH(3H - CÜÜH 1L

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DESHDROGENASA

Esta enzjma esta muy extendido en la naturaleza; ha sido encontrado en vísceras animales, tejidos de plantas superiores, o bien funcionando en sentido inverso juega un papel esencial en la fijación de CO2 y síntesis de acido malic0 (Kibereau-Gayon y Peynaud, 1966).

En bacterias su presencia también ha sido senaiada en Esclwrichiu coli. El de L. arabiizoszis es adapiativo y sólo aparece en células cultivadas en presencia de ácido mako. Según ensayos de Kadker (1957), se demostró que agregando a un mosto de uva de 1 a 3 g de peso seco de L. arabiizoszrs, se obtiene en 2 a 3 horas la desaparición del ácido milico.

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Jerchei et ai. (195'-), afirman que los dos mecanismos son vilidos, puesto que las bacterias maioiácticas dei vino poseen ia deshidrogenasa indica, la p-descarbodasa. la deshidrogenasa iáctica, asi como el enzima milico de Ochoa, io que también h e confirmado por Peynaud (1968).

L'na tercera tia de degratiacion es posible gracias a un envlnn maiolictico que transfoima directamente ei icido iniiico en L(-) Lactic0 . sin conocer actuaiinente ins reacciones o pasos inteimedios de dicha dsgadación:

Dicha enzima con un peso inoiecuiar de C ~ ~ . C I I I I I aproximadamente >- piinto iwcic<itico 4.35. es constitutivo en el 6Ouo de ins bacteiias liciicas heteroterrnentaii\.as e iniiiiiii~le en o t~ i s . 1.0s icidos tniiiiico. succinico !. liciico pueden actuw comc nii i i !~ id~wx

coinpetiti\.os ( SLIXKS 1 ~qx. 1Wii).

;\hora se sabe que la mayoria de las bacterias maiolácticas, inciuyentio ;I Lct<comrtoc 0~170s contienen ia enzima maloláctica y descarboxiian el L-malato n i~(-)-iachto en la presencia de N A D y manganeso, como se observa a continuación:

L

NAD+

Mn++ L-malato 4 L(+)-Lactato + C02

enzima maioláctica

E¡ crecimiento de L. oenos aumenta cuando las células se desarrollan en la presencia de L- malato. EI aumento de la biomasa esta acompanado por el incremento en los niveles de D(-)-acid0 iactico y la achidad de U(-)-LDH (Van Vuuren, 1993)

2.1. BENEFICIOS DE LA FERMEN'TACION MALOLACTICA

La fermentación malolactica constituye una verdadera desacidificación biol6gica del vino. Cuanto más rico es u1 vino en ácido matico mayor es su acidez natural, mas fuerte In desacidificación y más desficada la suavidad del vino.

Desde el punto de vista gustative representa una mejora considerable. El aumento tie calidad se debe a dos causas. La primera es la disminución de los indices de 10s ácidos y in segunda, la sustitución de un ácido de sabor muy pronunciado, el ácido inático, por otro menos agresivo a las papilas de La lengua, el ácido láctico (Peynaud, 1989).

2.2. CONDICIONES DE LA FERMENT.i¿'iON MALOLACTICIL4

2.2. i. INFLt~ENCI.4 DEL pH.

LTn factor primordial en ei l ino es ei pH. La acidez reai tiene un eiecto seiectivo y reniiza un dobie apartado: especies de bacterias y componentes susceptibies cit. ser descompuestds. Ei pH-umbrai es ei pH en ei cual ei desarrollo tie ias bacterias y e¡ :itntlue de un componente determinado pueden Uevarse a cabo .

Existe un pH-umbral tis ntnque a i icitio miiico y un pti-iimhrni de ataque :I íos ;izíkai-es. Cuanto mayor sea la diierencin entre ainhos. menor debe ser el riesgo de que se produzi:i un picado iictico. alterxion tiel \in0 cit. oiigen microhian» consistente en ti n t i i q i ~ ;i ios anicares con ioiinacion de iictico. acetico. CO?. elc.

1.0s ensayos de C'haiyeniic ( 1954). tiemuesirnri qtic ¡:is iiiicieiins :iihi;is tic \ .n ios ti< 1111 i i i i o no termentiin ei i i L i c i o indico o io h x r n mu\ &iiiiniciiie en i n c h s (IC 111 I i+. ~ ' ~ ~ i i ~ r i i t i ~ i r n e n ~ ~ . cuantic) ci p i i oii$n:ii dci \,¡no cc iyjo. in.: íiacicrias iicticiw s(m L:~p:~ccs

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de actuar en condiciones súrulares. Cuanto mis bajo es el pH, la degradación es mis pura, en tinninos generales, y su inicio mis diíicii. En tanto que a píi relativamente eie\.ndo. la fermentación comienza antes, es mas ripida. El pH óptimo para la proiiieracion de las bacterias se sihia entre 4.2 y 4.5, muy por encima del pH de los linos. Entre 3.0 y 4.u. la fermentación maloláctica se inicia más ripidamente se,& el pH sea mas elevado. E1 p1-I limite absoluto se encuentra, de modo aproximado, en 2.9, valor por debajo del cual la fermentación maloláctica no es, generalmente, posible.

Se observó que la viabilidad y crecimiento de Leiicoimstoc mnos esta ligado al pH del lino. El pH óptimo de crecimiento estuvo entre 4.5 y 5.5. A pH menores de 4.U la degradación de glucosa fue fuertemente inhibida, pero la degradación de malato fue fue más rápida. Esta es mas alta a pH de 3.5 que a pH de 5.5 (Bntz-Tracey, 1990).

2.2.2. LVFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

La fermentación del ácido matico es lenta por debajo de los 15" C, mientras que a 16-25 "C se efectúa solo en unos dias. A 12 o 13°C. necesitana aiguna, semanas e incluso meses a temperaturas inferiores. Sin embargo, una vez iniciada la fermentación, esta puede continuar por debajo de los 10" C. (3). .. La temperatura optima para el desarrollo de Lettconostoc oenos. esta comprentiida entre 20-25'C.

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2.2.3. ISFLUENCIA rlE LA AIREACION

Las bacterias Iácticas estin consideradas como microaerófiías ( K d e e 1967: Condon 1483). Kibereau-Gayon et al. (1976), señalan que en crecimiento de las bacteiias licticas en vino es favorecido tanto por una pequeña iniluencia de dióxido de carbono como por un poco de aire disuelto. Una completa anaerobiosis como una intensa aerobiosis, inhiben ei crecimiento de estas.

Kelly et ai. (1989) demostró que Leuconostoc oenos, crece mas ripitininente en condiciones estrictas de anaerobiosis. En suma. in influencia del aire depende cit. in especir bacteriana. Ciertas bacteiias se desarrolla mejor si estin protegdas del aire. (anaerohios facultativos)!, por el contrario aigunas están favorecidas con in presencia tie ujn poco tic aire (microoerófias).

:.-, I -7 j . INPLCciEI-íC.I.A DEL GKZJiU ;\LC~i i t iOí , i< 'O

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hnitante del crecimiento bacteriano y el piincipai obstiicuio para el éxito de Las sicinbras con cuitivos bacterianos.

L a mayoria de ins bacterias iicticas ( principalmente Leircoimtoc oenos) son tolerantes a concentraciones de 15% voi;vol de alcohol (Siero 1990). Se ha Msto que ei.etanol puede inhibir su crecimiento pero no matarlos cuando la concentración es de 1 lq>O voi'vol y que solo pocos pueden sobrmivir a esta concentración (Riberenu-Ciayon 1975).

2.2.5. INFLUENCIA DEL STYLFITADO

Este es otro factor detetminante de la fermentación malolactica. El anhidrido suUÜroso ataca considerablemente a las bacterias lacticas, mucho mas que a las levaduras.

El SO2, según la dosis empleada, actúa simplemente como desiniectante, antiséptico o microbicida. Su acción destructiva de proteinas enlimaticas bacterianas ai bloquear funciones tioles se ve potenciada por el alcohol. También el pH actua en sinergismo con grado aicohólico y SO2, molécula que puede encontrarse en estado libre o combinado; y aunque no exista SO2, libre, el SU2 combinado con el acetaldehido o con el ácido pirúvico (aunque cinco a duez veces menos activo) es también Tucho mas abundante, por io que puede uihibir completamente la fermentación maioiictica .

Para que las condiciones de la fermentación maioiactica sean óptimas, se recomienda que la Concentración de SO2, sea no mayor a 40-50 mgA.

Por encima de 50 -70 mpi. ia actividad de Leuconostoc oenos, se ve fuertemente disminuida(lim-\;\'en K. James F. Gaíiender 1983).

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2.2.6. KEQUERIhlIENiC~S NXTRITIVOS

Para un elevado porcentaje de cocos y bacilos, las bases púricas y pirimidinicas no parecen ser indispensables, pero el ácido pantoténico y ei nicotinic0 son práctic;iinente indispensables para ei desaiToilo bacteiiano (Peymuti et ai.. 1965).

Las bactenaslmaloiácticas tienen exigencias nutiitiws: mucho mayores que ins isdtir;ls. principalrnente de aminoiicitios. En generai, se encuentran en ei vino cantidades suiicienles de diversas vitaininas dei grupo B que actúan como factores tie Crecimiento. ¡.a pi)siidi(i;iti de sintetizar el factor tie crecimiento o taita de aininoiicitio iaiixoautrofia). no exi<tc i'ii ¡:is bacterias iacticas cid lino. C na base nitrogenada. cuatro \itaminas. dieciocho ntnliii):i&los ¡es son absoiutainente intiispr.nsabies. Sus necesidaties zn tnniciins ininernies sc!n g:iiidci. especiaimente en manganeso. inagnesio y pottisio.

E¡ \ i no no siempre s;iti\ixc totias esas nectsiii;idr..: dc t i t i iiiotio pe i . i zc i~ constiiuyc tiit metilo p ( v ~ ~ i:i\.oi-;hIe. iiinitantio a ~ i ciio ¡;I \.iLi:i di' ¡;IS h i ~ i i ; t i .

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3. OBJETIVO GENERAL

Observar la desacidificación del Mno tinto Ruby Cabernet, debido a la acción microbiologica la bacteria Leuconostoc 0efzo.s.

3.1. OBJETIVOS ESPECIFICOS

-

3.1.1 Preparación de los medios de cultivo 3.1.2. Selección e identificación de colonias 3.1.3. Inducción del crecimiento 3.1.4. Preparacion del inóculo 3.1.5. Determinación del numero de bacterias viables en una muestra (UFC) 3.1.6. Análisis inicial de¡ vino 3.1.7. Inoculación de la cepa (fermentación) 3.1.8. Cuantificación y análisis de la desacidificación del vino

J. MXTODOLOGIA

La metodologia comprende ocho etapas que a continuación se describen:

4.1. Preparación de los medios de cultivo.

Se prepararon dos medios de cultivo para Iactobacilos: hMS agar y MRS caldo. La composición química de íos medios se describe en la tabla 1. Se disoheron los ingredientes en el jugo de tomate (o agua destilada), en bano de agua hirviente. Se estenlizo a 121°C por 15 minutos.

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Se ajustó el pH a 6.2-6.6 (con HzSOd 1 3 ) .

Para el medio solido, se adicionó 25 gramos de agar i litro. y se procedió de igual foima que en la preparación tiel caído b R S .

4.2. .aslamiento, seieccion e identificacion de la bacteria ;\Ku o ~ u 7 ~ ~ partir de un cultivo madre (L. oenu.s, Gibson c j tomate. ‘ ~ j ) , se sembro por

estna cruzada, una cepa de L. oems y se encubo por Xi dias a .U’ C.

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Una vez desarrollada la cepa, se procedió a identificar a la bacteria. L a identifcacion se llevó a cabo por medio de una técnica diferencial: la tincion de Gram.

En este método las bacterias se tinen en primer iugar con cristal violeta, tratándolas posterio.inente con solución de yodo. A continuación se tratan las extensiones bacterianas con etanol o acetona, con in cuai se elunúia por completo el tinte violeta de las bacterias gramnegativas, pero no dé ias bacterias grampositivas. Como colorante de contraste se empiea safranina o hicsina fenicada diluida, con el propósito de tenú las bacterias gamnegativas.

La técnica se llevó a cabo de la siguiente manera:

- Se preparo una extension fijada ai calor, a partir de un cuitivo de L. oeizos. - Se hizo una tincion con solución ciistal violeta durante 1-2 minutos. Inmediatamente. se enjuago con agua destilada. - Se anadió unas gotas tie soiución de iugoi. dejando reposar durante un minuto. - Luego de decantar el iugoi, se iavó el portaoabjetos en etanoi a i 95uo por aprosimadainknte i 5 segundos. - Finalmente, se enjuago con agua destilada para tenir con safranina durante 20 segundos. - Se iavó bien el portaobjetos y se seco con papei secante.

4.3. Induccih de¡ crecimiento

4.4. i'ieparacion del iiii)culo

La preparación del inoculo, comprende cuatro etapas de acondicionamiento. Estas eiapas consisten en la disminución del pH, desde 6.5 hasta un pH de 3.4, asi como el cambio de jugo de tomate (disoivente) por vino tinto.

A continuación, en La tabla 2 se describen las caractensticas de cada etapa.

Tabla 2 ETAPAS DE ACONDIC'IONAiCIIENTO

NOTA. Para las cuatro etapas, el ajuste del pH se realizó con H2S04 13.

como control. Cada etapa contiege 25 mi de inoculo (por duplicado) y con un medio sin inóculo

En cada etapa, se hizo tinción de gram, para observar una posible contaminación.

4.5. Ueterminacion del níimero de bacterias viables en una muestra

4.5.1. Metodo de recuento de colonias.

Este método pemite el recuento del numero de bacterias +as o de los grupos de bacterias (es decir, uiudades formadoras de colonias) que se encuentran presentes en una muestra,

En un matraz erlenmeyer, se preparó 100 iní de inedio agar MRS y se esteriíizó a i¿l"C durante 15 minutos. El pH del medio fue de 6.5.

Se prepararon 5 tubos de ensayo para realizar diluciones. Para cada uno se preparó Y t n i

de solución salina risioiógica a l 0 . 8 5 9 ~ . disohiendo el cloruro sónico y esteidizando en el autoclave a 121°C durante 15 minutos.

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Del inoculo de la cuarta etapa (tabla 2). se toin6 1 in¡ (son pipeta esteid) y se deposito en un tubo de ensayo que contiene solución salina. obtrniindose ia ciiiuci¿m i ' i o . ik inanera sunilar. de in diiución 1 10. se tomó 1 in1 y se transfino a otro tubo para iener i:i tiiiucion 1/iüci. i k i tnistno inodo se preparwon tliliici«nes tiastii k ~ a r :I iina diiiicitin tic 1,100 000 (es decir 5 ddiiciones).

En una placa o caja de petri, se depositó 15 ml del medio fundido a 4 5 T e inmediatamente se mezclo el medi0.y 1 ml de la dilución 1 : l U mediante una combinación de movimientos giratorios . de vaivén durante 5-10 segundos.

Para las demás diluciones se procedió de la misma manera.

Una vez concluido el vaciado. se dejaron sotiditcar las placas, se inWtieron y encubaron a 5Ü'C durante 4 dias.

1.6. Análisis inicial del tino

Para el desarrollo de la fermentación se utilizó vino tinto (Los Pioneros) de la variedad Ruby Cabemet, del estado de Zacatecas.

L a desaciditlcación se Nevó a cabo en dos frascos fermentadores, cada uno con lüüü mí de vino. Al primer fermentador se le designo como F-1 y al segundo como F-2, esto para poder diferenciarlos.

Para el control o testigo de la fermentación se contó con otro frasco que contenia 5ÜÜ mí de wio. . Antes de iniciar la fermentación, al vino se le hicieron los siguientes análisis:

- PH

- i\lcohol - Anicares reductores

- Acido matico - .&do láctico - h i d e 2 volatii - so2

La metodologia y ei material para cada una de estas pruebas se describen en el h e s o 1.

4.7. Inoculación de la cepa

X cada feiinentador, es decir al F-1 y a l F-2. se ic adicionó I 2 id tie inóculo preparado anteriormente (esto es el i.?ó "'v).

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La fermentación se desaii.olió durante '1 dias a temperatura ambiente ( ¿ < I c ' ) . Diariamente. se tomaron 3 muestras de catin fcnnent:iclor ( 1 - 1 y 17-2) para ¡os nn:iiisis rúiaies de1 xino (en cada iniiestra se tomó 10 mi).

Para el control o testigo, se tomaron muestras de kino. solo al inicio y a l tina¡ de la fermentacion.

Todas las muestras se congelaron a -20°C.

1.8. Análisis y cuantificación de la desacidificación del vino

Los analisis se realizaron en tres etapas: Antes de la fermentacion (mencionado anteriormente), durante la misma ( A. láctico y A. máiico) y después de la fermentacion (se anaiizaron los mismos parametros que en la primera etapa).

El ácido malic0 y láctico, se realizaron a traves de métodos enzitnáticos. El pH, alcohol, acidez volitd, anhídrido sulfuroso y azUcares reductores totales (i\ltT) se hicieron por métodos químicos.

5. ACTIVIDADES REALIZADAS

Las actividades realizadas, pueden dividirse en tres etapas: la primera comprende al desarrollo microbiologico del experimento, la segunda a la fermentación y la ultima al analisis de los resultados obtenidos.

El desgloce de estas actividades se describen en las tablas 3, 4 y 5.

6. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

L a fermentación maioiactica, se dio tanto para el fermentador F-1 como para el fermentador F-2.

Las metas propuestas para el desairollo del esperimento(descritas en ei punto 1) se cuumplieron de manera satisfactoria en kista tie que si se presento la desacidificación del \in0 tinto. '

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Tabla 4. SEGUNDA ETAPA

T t- F-N I

Tabla 5. - TERCERA ETAPA

7. RESULTADOS

7.1. Riot.fologia de LelLcorlostoc ot?rzos

C'on ia ticnica tie tincion de tiram en totias ins tinciones reaiizatías tiurante el cqxiitnenio se obser-o: flora abundante de cocos p a i n p < i u i i i \ . o ~ forinando pares o c;itien:ts. I ;iinnno entre 0.5- i .O pin.

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En agar se observo: colonias esféricas. Tainano entre 2-3 nun. Células opacas. Elevación convexa. Consistencia mantecosa. Superiicie iisa.

L.- . 7.2 Determinación de unidades forniadoras de colonias. I- ¡ L. De las 5 cajas que se prepararon para la cuenta, las cuatro piimeras estaban por encima del

rango de 30-300 colonias. Unicamente la dilución presentó crecimiento dentro de dicho rango. y

L.

r L

i

c

L.

F

Se contaron 74 colonias, por lo que la concentracion microbiana es:

7-1/(11100 000) = 7 400 Q00 cei!ml

7.3. Análisis inicial del vino

Los resultados del analisis inicial del vino están en la tabla 6.

7.4. Resultados de Ia fermentación maioláctica.

7.4.1. FERMENíADOR P-1

Los resultados obtenidos por ei método quimico ai inicio de la fermentación son los de la tabla 7.

~ . .~

Como se obseiva en la tabla anterior, se realizaron analisis por tiipliciido. se saco un promedio para obtener el resultado f-mal. Un ejemplo de la forma tie obtener e¡ resulfado para cada parametro se explica en el h e s o 1.

Los resultados obtenidos por el metodo enzimatico durante la fermentación se Yen en las tabla 8 y 9, tanto para el ácido hfilico como para el ácido láctico.

Tabla 8 RESVLT.4DOS DEL ANALISIS ENZIhIATIC0 PARA E L ACID0

MALIC0 EN EL F-1

Durante la fermentación se realizaron 11 pruebas. La pninera corresponde al tiempo cero (primer &a). A partir de la segunda corresponde un incremento de 18 horas (o dos dias), hasta liegar a 21 dias de fermentación.

En la uitima columna, de izquierda a derecha. se expresa la cantidad tie ácido indico en gramos por litro.

En la gráfica 1, se puede apreciar el cambio tie la concentracion (g'i) del icido máiico con respecto ai tiempo.

i'oda la secuencia tie cilculo tiel método enzimitico x-iene tizsciito en el hino no i ~

La expiicación es anilogn para todas las tahins que correspontien al inéiodo enzimitico.

RESLíLTA4UOS DEL ANALISIS ENZIMATICO P4R4 E L ACID0 LACTIC0 EN E L I;-1

En ia gráfica 2, se puede observar el cambio de la concentración (gil) de acido lactic0 con respecto a i tiempo. Los resultados obtenidos por el método químico al h a 1 de la fermentación están en la tabla 10.

Tabla í ú RESULTADOS DE XI\íI\¿ISIS QtiIR.IICOS PARA EL F-í

En la tabla 11 se inuesírn una síntesis de íos resuitncios obtenidos para el F-1

Tabla 11

RESULTADOS COMPARATIVOS DEL INICIO Y FINAL DE LA FERMENTACION PARA F-1

INICIO DE LA~FINAL

7.42. FERiIENTADOR F-2

P-

*-

P-

.. c

L

r-

L

P

L.

c

L

P

L

c

L

c

L

P

4..

I"

En la tabla 13 y 14 se muestran los resultados obtenidos por el inetodo enzunatico tanto málico como para el láctico.

Tabla 13 RESULTADOS DEL ANALISIS ENZIMATICO PARA h L ACID0

MALIC0 EN E L F-2

En la gráfica 3 se muestra el cambio de in concentración (g'l) con respecto al tiempo (dias).

En la gráfica 4, se observa el cambio de la concentración &"l) con respecto al hempo.

En la tabla 15 se tienen los resultados obtenidos por el método químico al final de la fermentación.

Tabla 15 RESULTADOS DEL ANALISIS QLXVIIC'O PAR4 EL F-2

En la tabla 1 6 se muestra una sintesis de los resultados obtenidos en el F-2.

Tabla 16 RESULTADOS C,'OMPxiUTIVOS DEL, INií:io i7 FINAL DE LA

FER'LíENi.~C:IOI\í

r-

L

r-

-_ c

7.4.3. TESTIGO

INICIO DE LA FERMEiWACION

En la tabla 17 se pueden ver los resultados iniciales de la fermentacion

Tabla 17 RESULTADOS QUIMICOS Y ENZIMATICOS DEL TESTIGO

FINAL DE LA FERI\IENTACION

En la tabla 18 se pueden ver los resultados finales tie la femetiración para el testigo.

r. .. 1 I-

La bacteria metabolizo de la manera esperada el icido málico. El peiiodo de adaptación o acondicionamiento que tuvo favoreció mucho a la fermentación ya que a pH 3.88-3.87 (condición externa) la cepa se desarrolló satisfactoriamente.

. Sin embargo, la cantidad de ácido. matico consumida y ácido Iáctico producido fue evaluado enzimáticamente con un "Kit" boehringer mannheim. Los resultados que se pueden obtener por este metodo son de alta confiabilidad siempre y cuando las muestras a dete&, sean sometidas a las mismas condiciones de análisis.

Lo antes mencionado, significa que los Kits (reactivos para el método enzimático), tienen un tiempo determinado de estabilidad. La "potenciatidad de la enzima se va mermando se& pase el tiempo y como las reacciones de este tipo están en función del tiempo, lógicamente se producen algunos errores en la cuantiñcación de una muestra.

Un reflejo de lo dicho en el párrafo anterior, puede apreciarse en el comportamiento de las gráficas del F-1 y el F-2 para ambos ácidos ( d c o y láctico). Siendo que el F-1 y el F-2 son "iguales" su comportamiento durante la fermentación es distinto.

Sin embargo, se puede pensar también que durante la toma de muestras para los análisis, la homogenización no fue la misma o a veces no se realizó la misma. Esto uuede tener un - poco de repercusión en el resultado porque siendo Leuconostoc microaerofiio (Kunkee y Condon, lr83) la Concentración de ácido es mayor en el fondo del fermentador.

Finalmente, si se puede asegurar que hubo actividad metabólica en ambos fermentadores, porque el control o testigo no presento prácticamente ningun cambio en las cantidades de ácido m&co y láctico.

8. CONCLUSIONES

La fermentación maioláctica se desarrollo, en ambos fermentadores (F-1 y F-2) bajo condiciones óptimas de desarrollo. Esto es pH entre 3.88-3.87, temperatura de 20 grados centigrados y concentración de Stjz inferior a 50 mgi.

Leitcotlostoc oems temperatura. (3.88 y LO grados centigrados)

es capaz de desarrollarse bajo condiciones extremas de pH >.

9. RECOMENDACIONES

.ates de tomar muestras de bina. es conveniente hornog,eniznr ei \,in0 agtnndo ei trasco iermentador. Se recomienda hacer los anaiisis con lotes tie 5 inuestras ai mismo tiempo. prexi~mente congeiridas.

Se rcc«mienda estrriiicar in muestra tie vino p r ; i poder tirterininar ei contenitlo ioini iici icitio (ia sima dei libre ri estenticado). para así ci.ii:ir xxinziones o picos rn ¡as gtiiiius.

r-

L.

F

c.

c

L

c

c.

?-

L._

c

%-

r ! L

r I L

c

L..

r'

L

i

A N - E X 0 1

ANALISIS POR METODOS QUIMICOS

AZUCARES REDUCTORES

METODO DEL DNS

Material y equipo

Tubos de ensaye con tapón Pipetas volumetricas de 2 ml Pipetas de 1 ml Pipetas de 5 mi Pipetas de 10 mi . Matraz aforado de 10 mi Balanza anaiitica Agitador .le tubos (vortex) ñano maria Baio de hielo Espectrofotometro Genesis 5 (Milton Roy) Piseta Papel fítro Espituia

Reactivos

Sub aqetato de plomo ai 10% Acido 3 ,5 dinitrosaiicilico (DNS) Carbon activado Glucosa nnhidra

Eiaboracion de is curva estindar

1. Se preparo una solución estintiar <iisoi\ientio 0.050 g tie giucosa anhidra en 5 0 mi tie agua destilada.

2. Con la solucion estindar. sr &b«t.ó i;i siguiente CUIT:I tie coiicentriiciones conocidw tie giucosa. \'er tabia LO.

Lir

c

I

Tabla 2ü

I ~

I n o 1 n I

n 1 0 3 I n x (L2

? I n d o 6 as 3 1 O 6 l as 0.6 1 1 n x I n ? I 5 1

n x 1 .n nn i n

,

Por ejemplo para el tubo 1 , si tenemos 0.05 g de giucosa en 50 mi, en 0.2 mi de solucion se tiene 0.2 mi de giucosa.

3. Para cada tubo de la curva estándar, se anadio 1 mi del reactivo del I"

4. Los tubos bien tapados se calentaron a baño en ebullición durante 5 minutos.

5. Se enfno rápidamente-en bano de hiel y se adiciono 8 mi de agua destilada a cada tubo.

6. Se apito en vortex y se leyó a 575 nm.

En la gráfica A, se puede apreciar la curva estándar para los azúcares reductores

Para l a muestra se tomo 2 mi de %ino, se agrego 1 mi de sub acetato de plomo al l ü l ó y una pizca de carbon activado. Se aforo a 10 mi con agua destilada y se filtro con papel wbatman No. 1.

Del filtrado se tomo 1 ml de muestra y se procedio como en la curva estándar desde el punto 3 a l 5.

Finalmente se volvió a tomar 1 mi de la muestra y se adiciono Y mi de agua destilada. Se agito en vóries y se leyó a 575 nm.

(.Inn \ t z ieida la absorbancia de cada una tie las muestras, no fue necesario hacer una reps ion h e a l ya <pie ei espectrofotometro Genesis 5 cuenta con un "menu" (programa) que proporcion;i la concentración tomando en cuenta los parámetros de la cuna patron.

Por etjempio. para caicuinr in Concentración de anicnrei en el %-I al inicio se procedi0 tic in siguiente in;inera:

~~

v

I_

r

.. P"

L

P.

L

?-

hi

P

L_

f-

L

P

L.

c

c..

P

L

r- L

P

i-

r i

r-

L

De las muestras por triplicado se obtuvo:

0.787 mg O. 777 mg 0.797 mg

El promedio de las tres corresponde a 0.787 mg. Entonces, 0.787 mg estan en 2 ml de Wio. Pero, se hicieron 2 diluciones: X 0 y 1/10, por io que el factor de dilución es 50. h i 0.787 mg s 50 = 39.35 ma2 mi de %bo. De esta manera en 1 litro de vino tenemos 19675 mg de Wio Ó 19.6 g de Vino por litro.

De manera analog se procedió con los demás caícuíos de azticares reductores.

DETERMINALION DE ETANOL POR OSIDACION CROM IC-4 'b (H.W.. ZIMMERMANN 1963)

Material y equipo

Matraz er1enmeyer.de 50 mi Pipetas de 10 mi Pipeta volumetrica de 25 mi Frascos Gerber Baño maría Lquipo de mi -0ctestilación Bureta de 25 iní b asos precipitado Piseta

~~

Reactivos

Solución de dicromato Sultnto ferroso amonico i. iü-0-ienantroiina

1. Se reaiizó una midrotiestilación usando como colector un irasco Gerber con 25 in¡ tie dicroinato. Se tlestiló 15 mi de agua (blanco).

2. El frasco Cierber bien cenado. se coioc0 en biiño inaiiii n eiwiíición por 5 iiiiniitoi pii-:t

que se lieve a cabo ia oxidación.

3. El contcniti<i tici tiasco. se transhrin 2u~inlit;ili\;iiineriie n un niair;iy. erienmc!.;; y \c \-doro con ia tiisolucinn tie sdiato ten-oso mionico hiist;i una ioioracioii \.erdc ;I 1.1 iw dcI di 3.

0.".

L

F

L

c

L.

P

L..

F

u..

F

L-.

r-

I..

p'

b..

c-

4. Se anadio unas gotas del indicador (l.lU-C)-fenantroha) y se prosiguio la valoración. El punto fmal de la titulacion se vio con un cambio d e f i d o del color verde azulado a púrpura pardusco.

5. Para la muestra, se tomo 1 mi de wio y se trato de iguai manera.

La concentración de etanol se calculó por la siguiente relación:

ETANOL gil00 ml = (25-(25 s z+B))xü.7933

donde:

A = volumen en mi de la solución de sulfato ferroso amonico consumidos en la valoración del exceso de dicromato. B = volumen en ml de la solución de sulíato ferroso amónico consumido en l a valoración del blanco.

Por ejemplo para el análisis de etanol del F-1, al inicio, se tiene:

26.2 mi de sulfato ferroso amónico 26.5 mi 1'

26.2 ml

El promedio es de 26.3 ml, entonces:

I* . ,I

etanol = ( p ( 2 5 x 26.3;51)) x U.7933 = Y.60 gfl0ü mi = 9.6' G.L.

Nota. El valor de B, h e de 51 mi para todas las muestras.

De esta manera se realizaron los cálculos para todos los análisis.

DETERMINACION DEL pH

1. Se tomo el potenciometro y se calibro con una solución buffer de pH 4 (a temperatura ambiente).

t. Luego de enjuagar con agua destiiatla el eiectrotio y srcario con papei nbsoiwnte. se midió el pfi de ia muestra a temperatura ambiente.

3. Todas lac mediciones se hicieron por triplicado

i>ETER%iI\.-\<~iOY ÜE íd.\ t\C'IiJE% \-Oi,.\'¡lL

.\laterial y eq1iipo

c J

F

L

F

L

c

L

I

F-

L

c

in

F

híicrodestilador Piseta

. Reactivos

NaOH 0.00548 N Fen o fi a I e Íiin a

1. Se colocó 1 mi de muestra eri el microdestilador y se destiló 10 mi de muestra.

2, El destilado se recibió en un matraz con 5 ml de agua destilada hervida.

3. Se anadio unas gotas del indicador y se valoro con NaOH 0.00548 N hasta una coloración rosa.

La concentración de acido se obtuvo por:

Acides vohtil (gi) = N x V x 0.06 x 1000 iVM

donde:

N- = 0.00548 N de NaOH V- = mi gastados de sosa VM = volumen de la muestra

I

Para el F-1, la acidez volátil se calculo de la siguiente manera:

De las muestras, por ttipiicado se obtuvo:

1.6 mi de NaOH gastados 1.3 mi 1.5 mi En promedio se tiene 1.63 id. as]:

, , . .

Biireta de 25 id Piseta

Reactivos .

KOH 0.00245 N H2S04 1:3 Amidon 1%

1. En un matraz de yodo se colocó 5 mi de muestra y 12.5 mi de KOH.

2. Se tapó el matraz y agitó suavemente para dejar actuar la solución sobre el wio durante 1 o milutos.

3. Se agego aproximadamente 2.5 ml de la solución de almidón y 5 mi de HIS04 1 3 , para titular con ia solución de yodo hasta coloración a d permanente.

La cantidad de SO2 se calculó por:

SO2 total (mg'l) = N xV x 32 x1üÜÜ / v

donde: *

N = normalidad de la solución de KOH V = ml de KOH gastados v = volumen de la muestra

Entonces para F-1 al inicio de la fennentacion tenemos:

De los analhiis se obtuvo:

2.5 mi de la solución de yodo 2.4 mi 2.5 mi, en promedio 2.46. Entonces

svr = ü.üO215 x 2.46 x 32 lüüü 5 = 38.57 mgl

De ia misma iootma se hicieron los demis cilcuios para ei SO?.

, I

c

METODOS ENZIMATICOS

DETERR/IINACION DEL ACID0 híALIC.'O

PRINCIPIO

El ácido L - málico (NAD) en la presencia de L - malato deshidrogenasa (L - bDH) a oxalacetato.

(L-dato) es oxidado por la nicotinamida-adenina-dinucieotico

L - h D H L - malato + NAD+ t+ oxaiacetato + NADH + H*

El equilibrio de esta reacción se dirige casi en su totalidad hacia el lado del L - malato. Sin embargo, en una subsecuente reacción catatizada por la enzima glutamato oxalacetato iransaminasa (GOT) en la presencia de L - glutamato, el equilibrio de la reacción se puede desplazar en favor del oxalacetato y el NADH.

GOT Uxalacetato + L - glutamato

La cantidad de NlUjH formada en la reacción precedente es estequiométrica con la cantidad de acido málico. El incremento del NADH es determinado a una absorbancti de 340 nm.

MATERIAL Y METODO

t+ aspartato + 2 - osogiutarato

Material

Espectrofotómetro digital Cienesis 5 (hlilton Roy). Micropipetas de 10. 100, 1000 pi

Reactivos

Soiucion 1: fiascon con 3ü ml de solución de buffer de ghcilglicina, pH 10: icitio giutimico 11ü ing; y estabilizadores.

Solución 2: frasco con L iü mg K.Ul iiofilizatio.

Solución 3: frasco con ü.4 ini de (.31¡ en solución tie s i i h t o de ainonio. I O U L.

Solución 4: frasco con CJ.4 ini tit: I- -.\iF>I~i en soiucitin tie giiceroi. ?IUO 1.

Preparación tie i;ls soiucioiics

¡.as soiucioncs 1.J y 4 se uson sin tiiiuir.

F

-

L a solución 2, se diluye con 6 mi de agua biciestilada.

'Todos los reactivos que se uthzaron en las deieiininaciones se obtuvieron comercialmente de la f m a "Boehnnger Mannheim

PREPARACION DE LA CURVA ESTAiiAR DE ACID0 MALIC0

Procedimiento

Longitud de onda: 340 nm Celdas de vidrio: 1 cm de longitud interna Temperatura: 20-25T Volumen fmai: 2.22 mi Solución estandar: 0.147 gil

..\ partir de la concentración de ¡a solución están .... r, se determinaron 10 concentraciones entre 1.47-14.7 pg. Ver tabla 21.

Tabla 21

i preparación de las muestras se realizaron directamente en las celdas de vitirío de la siguiente manera: \'er tabla 22. ~~

Se mezclo y se leyó las absorbancias de las soluciones, tanto del blanco como de la muestra, (Ai) después de aproximadamente 3 minutos. Para iniciar la reacción se anadio: .

Se mezclo y se esperó a que la reacción se complete (aproximadamente 10 a 15 minutos). Se 1 yó las absorbancias del blanco y de la muestra (A?) inmediatamente UM despues de la otra.

Calculo

Se determinó las diferencias de las absorbancias (A2-Ai), tanto para el blanco como para la muestra.

Por Último, se redizó la diferencia entre la absorbancia de la muestra y la absorbancia del blanco.

*

AA AA.% - A h

Lo anterior se realizo para cada una de las pruebas, para cada concentración. Xsi, se tiene: Ver tabla 23.

EII la grafica E%, se puede apreciar la relación concentración (pg).

Para la determinacion de las muestras de vino, el procedimiento es el mismo, con la única diferencia de que en lugar de colocar la muestra de la solución estandar, se colocó 1 mi de \in0 diluido en una relación 1 100.

de la absorbancia (AA) contra la

De esta manda para conocer la concentración tie la muestra problema, se tiene la siguiente relación:

donde:

\ ' = volumen final de in pruebn (iiii)

p;, I ~=~ peso moiecuiar del icido indico (g inoi) o -: cocficiente de absorciti\.idad del N;U)ii. &3(1 s mino1 ' I cin ' ) d = longitud interna de la celda (an)

I I

I ! ....... . / ,

v = volumen de la muestra (mi) F = factor de dilución

entonces:

2.22 x 134.09 C = x AA x 100

6.3 x 1 x 0.1 x 1000

C = 47.3 x AA

De esta manera, se conoce la concentración de una muestra de ácido málico.

Tabla 23

..

DETERMINACION DEL ALIDO LACTIC0 (R)

PRINCIPIO

~. kl acido I. - lactic0 (;“.i,iT)) en ia presencia de L - inctnto deshidrogenasa (L - LDH) a piruvato.

(L-Iactato) es oxidado por i a nicotinamida-adenina-dinucieotico

~~. k.1 equilibrio de esta reacción se dirige casi en su totaiidxi hacia e¡ iaJ0 del I . - iaci:iio. Sin einiuigo, en una suhseciientc reacciOn cnt;iiiznti;i por l a eniiina g,iut:iinnto pimi-ato

!

transatninasa (GF'T) en la presencia de L - glutamato, el equilibrio de la reacción se puede desplazar en favor del piruvato y el NADH.

GPT e--+ L - alanina + 2 - oxogiutarato Phvato + L - glutamato

L a cantidad de NADH formada en la reacción precedente es estequiométnca con la cantidad de ácido láctico. El incremento del NADH es determinado a una absorbancia de 340 nm. MATERIAL Y METODO

Material

Espectrofotometro digital " Genesis 5 " (Milton Roy). Micropipetas de 10, 100, 1000 pi

Reactivos

Solución 1: frascon con 30 mi de solución de buffer de glicilglicina, pH 10; ácido glutamic0 440 mg; y estabilizadores.

Solución 2: frasco- con 210 mg NAD liohlizado.

Solucjón 3: frasco con 0.7 mi suspensión de CiPT 1100 U.

Solución 4: frasco con 0.7 ini de solución L -LDH 3800 U

k.

Preparación de las soluciones

Las soluciones 1,3 y 4 se usan sin diluir.

La solución 2, se diluye con 6 mi de agua bidestilada

Todos los reactivos que se utilizaron en Ins determinaciones se obtulieron comercialmente de la t ima "Boehringer Mannheim

PREP.ARICI0N DE L-4 CIiRVA ESTAND.4R DE A C I D 0 LACTIC0

Procedimiento

Longitud de onda: 340 nm .Celdas de vidilo: 1 einperatura: Lll-L3"c' \ oiiiinen final: 2.24. in1 SoiuciOn estindni: o.2oi g l

i cin de iongiíutl interna - . - - .. ... - ~~

r,.. . ... . . -,

P

partir de la concentracion de In solución estandar, se deternunaron 10 concentraciones entre 2.02-20.1 pg. Ver tabla 24.

Tabla 24

La preparación de las muestras se realizaron directamente en las celdas de kidrio de la siguiente manera: ver tabla 25.

Se mezcló y se ieyo las ahsorbancias de las soluciones, tanto tiel bianco como de is muestra, (AI) despues de aprodmadainente 3 minutos. Para iniciar la reacción se nnadio:

Se inezcio y se espero ;I que In reascih se coinpicic (Iipi.oiiin;iti;tmente 15 a Lii ininiiios). Sc icy0 ias nbsoriiancias tiei hianco y de in iniiesira (:\?) inineciiainincnie una despues tic: in oirn.

i. ..

F"

,

P

b

Cálculo

Se determino las diferencias de las absorbancias (A2-Al), tanto para el blanco como para la muestra.

Por ultimo, se realizó la diferencia entre la absorbancia de la muestra y la absorbancia del blanco.

.

AA= & - A h

Lo anterior se realizó para cada una de las pruebas, para cada Concentración. Asi, se tiene: Ver tabla 26.

En la gráfica C, se puede apreciar la relación concentracion (pg).

Para la determinación de las muestras de vino, el procedimiento es el mismo, con la Única diferencia de que en lugar de colocar la muestra de la solución estándar, se colocó 1 ml de Mno diiuído en una relación 11100.

De esta manera para conocer la concentración de la muestra problema, se tiene la siguiente relación:

de la absorbancia (AA) contra la

. V X P M

c. x U x F E x d x v x l ü ü 0

donde:

V = volumen final de la prueba (mi) PM = peso molecular del ácido d c o (gimol) E = coeficiente de absorvitividad del NADY 6.3(1 x mmol-' x cm-') d = longitud interna de la ce1&3 (cm) v = volumen de La muestra (mi) F = factor de dilución

entonces:

2.24 s 90.1

6.3 x 1 s 0.1 x 1000 c = S AA X lÜÜ

De esta manera se caicuiaron todas las concentraciones de ácido láctico para cada una de las muestras.

i..

Tabla 26

11. BIBLIOGRAFIA

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, , ..... ~ >,

Curva Estándar Azúcares Reductores

0.25

I II 1 1

I

0.05 I 1 , 1

3.:5

0.1

I

D O 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

*WM

I Pendiente : 0.380 LoefLorr. : 0.996 575 nm Y-int : -0.045 D.S. : 0.0129

Gráfica A

r" i L,.

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Curva Estándar Acido Máiicu

O 5 10 15 20

Conc (ugiL) - Pendiente : 0.023 Y-int : -0.005 c

Loef.Lorr. : ü.998 D.S. : 0.0046

340 nm t = 20Q

Gráfica B

1

Curva Estandar Acido Láctico

O 10 20 30

Conc (uglL)

Pendiente : 0.035 Y-int : -0.000 - U.?;. : 0.0241 c

Loe£Corr. : 0.994 340 nm t = 20G

Gráfica C

CAMBIO DE LA C!ONCEN'iKACION DEL ACID0 MALIC'O EX E L FEKMENTADOK 1 DEBIDO A LA ACCION DE L OEROS EN VINO

TINTO RLBY CABEFt.NET. .

Y . I

o i

1 3 5 7 9 1 1 13 15 17 19 21 "iwrpo (das)

340 nm t = 20°c

Gráfica .1

CAMBIO DE LA CONCENTRACION DEL ACID0 MALIC0 EN EL FERMENTADOR 2 DEBIDO A LA ACCION DE L OEROS EN VINO

TINTO RUBY CABERh-ET.

~ ~ ~ ~~~~~~ ~~~~~~ ~ ~. ~ ~~ . ~ ~~

IÍ

1 3 5 7 9 !I 13 15 I? I9 Te- (dar)

Gráfica 3

21

* CAMBIO DE LA CONCENTRACION DEL ACID0 LACTIC0 EN EL FERMENTADOR 1 DEBIDO A LA AC'CION DE L OEROS EN VINO

TINTO RUBY CABERNET.

1

D

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 Tiwrpc (días)

340 nni t=¿Ú"C ~

Gráfica 2

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CAMBIO DE LA CONCENTRACION DEL ACID0 LACTIC0 EN EL FERMENTADOR 2 DEBIDO A LA ACCION DE L OEROS EN VINO

TINTO RUBY CABERNET.

3 T

. 0.5 i n i

9 11 43 45 17 19 21 1 3 5 7

(das)

34ü nm t = 2u0c pH 3.X8

Gráfica 4

CONCENTRACION DEL ACID0 RLALICO EN EL TESTIGO DURANTE LA FERMENTACION DEL VINO TINTO RUBY

CABERNET DEBIDO A LA ACCION DEL OEKOS.

0.8 i I

0.7 t - 0.6 i

D I

0.4

t

340 nm t = 20OC pH 3.88

Gráfica 5

CONCENTRACION DEL ACID0 LAC TIC0 EN EL TESTIGO DURANTE LA FERhlEIVTACION DEL VINO TINTO RUBY

CABERNET DEBIDO A LA ACCION DEL L OEROS.

I

o.4 t 0.2 + .

Gráfica 6

13 15 17 19 21 1 3 5 7 9 11

Tionpo (dar)

Gráfica 2