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Bacterias lácticas no fermento y Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Jornadas
5 y 6 de junio de 2014
Dra. Erica Hynes
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Las bacterias lácticas no fermento se desarrollan en todos
los quesos madurados
Predominan en los productos de maduración media y
prolongada
Pueden crecer en las condiciones ambientales del queso:
20015010050010
1
102
103
104
105
106
107
108
109
1010
Días de maduración
UFC g-1
no fermento
fermento
• Humedad 30 - 60 %
• pH 5,0-5,4
• % de NaCl en la humedad entre 2-6
• Bajo potencial redox (Eh –150 mV)
• Ausencia o cantidades muy bajas de azúcares fermentables
• Bajas temperaturas de maduración (7- 12 ºC)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Lactobacilos heterofermentativos facultativos del grupo II
Lactobacillus casei /paracasei – Lactobacillus plantarum -Lactobacillus pentosus - Lactobacillus rahmnosus, etc.
También se pueden considerar NSLAB:
• Lactobacilos heterofermentativos del grupo III Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis
• Bacterias lácticas termófilas no agregadas con el fermento (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus)
• Leuconostoc spp., pediococos y enterococos
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso
Leche cruda
Fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
La elaboración de queso en condiciones asépticas o extra higiénicas
reduce sólo levemente la contaminación con NSLAB (McSweeney, 1994)
Se han encontrado cepas NSLAB que se recuperan luego de 72°C -
90 seg al ser incubadas en leche estéril (De Angelis et al., 2004)90 seg al ser incubadas en leche estéril (De Angelis et al., 2004)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 5 10 15 20 25
Tiempo (días)
Lo
g U
FC
/ m
l
Recuperación de células de L. plantarum DPC2739 (ca. 7,0 log UFC/ml) calentadas 72 °C 90 seg, en leche estéril a 7 °C por 20 días
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso
La leche cruda
Es la fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
Varias cepas de NSLAB sobreviven a tratamientos de pasteurización
– 73°C 15 seg - y termización – 60 °C 5 min) (Christiansen et al., 2006)
La flora NSLAB de quesos elaborados con la misma leche en dos
plantas distintas comparte gran parte de las cepas (Poznanski et al., 2004)
Las leches con muy baja contaminación inicial desarrollan NSLAB
mucho más lentamente o alcanzan menores números, al igual que
leche de quesería microfiltrada (Crow et al., 2001)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso
La contaminación post pasteurización
También contribuye al desarrollo de las NSLAB en el queso
A partir de bioflims que se hallan en plantas sanitizadas, en el silo de
leche cruda, en la unidad de ultrafiltración, el fondo de la tina, la cinta leche cruda, en la unidad de ultrafiltración, el fondo de la tina, la cinta
de cheddaring y la torre formadora de bloques (2-4 log UFC/ml)(Sommers et al., 2001; Agarwarl et al., 2006)
La tecnologíay el medioambiente que ésta define
Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo
�Tratamiento térmico
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnologíay el medioambiente que ésta define
Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo
�Tratamiento térmico de la leche
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
�Fermento primario
�Temperatura de maduración
�Proteólisis primaria por coagulante y plasmina
�Fermento primario
�Temperatura de maduración
�Proteólisis primaria por coagulante y plasmina
� tratamiento térmicotermización, pasteurización y cocción
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnologíaBacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La pasteurización introduce una acción de selección sobre la
biota inicial de la leche de quesería.
9
10
11
CF
U g
-1
Fermento y NSLAB para quesos Pategrás
(♦) y semiduro de leche cruda (■)
quesería.
En los quesos de leche cruda el
número inicial de NSLAB es más alto (Bude Ugarte et al., 2006)
6
7
8
7 22 37 52 67
Ripening time (days)lo
g 1
0CF
U g
� tratamiento térmicotermización, pasteurización y cocción
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnologíaBacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Tanto los quesos de leche cruda como los de leche pasteurizada se han encontrado comunidades bacterianas diversas (Babini et al., 2010).
En los quesos duros donde existe cocción, esta etapa también puede tener un impacto en la composición de la flora no fermento, aunque la
temperatura no influye en el recuento promedio (Sheehan et al., 2007)
� fermento primario
La tecnología
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Si existe galactosa disponible, el crecimiento de las NSLAB correlaciona
con la disminución de galactosa en el queso
7
8
9
recu
ento
de
lact
ob
acil
os
(Lo
g
25
30
Gal
acto
sa (
mm
ole
s/K
g)
Lactobacillus
rahmnosus Exp
NSLAB control
Galactosa E
Galactosa C
Crecimiento de NSLAB adventicias en quesos Cheddar elaborados con S. thermophilus
además de L. lactis
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4 5 6
tiempo de maduración (meses)
recu
ento
de
lact
ob
acil
os
(Lo
g
cfu
/g)
0
5
10
15
20
Gal
acto
sa (
mm
ole
s/K
g)
Galactosa C
Tiene un fuerte impacto en la velocidad de crecimiento
9 Leche cruda
1 ºC 8 ºC 12 ºC
8 * 104 UFC g-1 1 * 107 UFC g-1 1 * 108 UFC g-1
Cheddar
6 meses
� temperatura de maduración
La tecnología
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 30 60 90 120 150 180
Tiempo (días)
log
UF
C g
-1
Leche cruda1ºC
Lechepasteurizada1ºC
Leche cruda8ºC
Lechepasteurizada8ºC
Shakeel-Ur-Rehman et al., 2000
La distribución temporal y espacial
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Fitzimons, 2001
El impacto de las NSLAB en la calidad de quesos
En quesería industrial generalmente se las asocia a los defectos
� Formación de gas
� Cristales de de lactato de calcio
� Off flavours
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
� Off flavours
� Inconstancia de la calidad
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Quiberoni et al., 2004
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Causas
• Contaminación elevada en la leche cruda
Leuconostoc sp
Lactobacilos heterofermentantes obligatorios
Lb. brevis y Lb. fermentum
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Lb. brevis y Lb. fermentum
• Problemas asociados al funcionamiento del pasteurizador –
períodos de trabajo muy largos, contaminación del equipo con S.
thermophilus
• Fermento poco activo, consumo lento de la lactosa
No se han informado fallos asociados a lactobacilos heterofermentantes facultativos, como Lb. paracasei y Lb.
plantarum.
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Este defecto es diferente del causado por bacterias coliformeso levaduras – que se produce muy tempranamente en la
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
o levaduras – que se produce muy tempranamente en la maduración – y del defecto de hinchazón tardía en quesos duros.
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
• No afecta negativamente el aroma o sabor de los productos – nota sabor de los productos – nota intensa a manteca
• No trae problemas de inocuidad• Deprecia el producto por su aspecto
y características físicas: aceptación por parte del consumidor y operaciones como corte y empacado.
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Los sustratos para la producción de gas por NSLAB
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
• Lactosa residual• Galactosa residual• Citrato• Aminoácidos• Lactato (?)
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
la fermentación proceso biológico
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
puede ser afectado de distinta forma por la actividad de los microorganismos presentes y la tecnología de elaboración,
distintas velocidades de desaparición de lactosa y sus componentes, glucosa y galactosa
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Sample descriptions Lactose determination by
enzyme kit
(mg 100 g-1)
D-galactose
determination by
enzyme kit
Jarlsberg (Norwegian) <10 <10
Tesco Continental Gouda 140 <10
Sainsbury’s Dutch Gouda 30 <10
Asda Edam Wedge 20 <10
Sainsbury’s Mature West Country 30 <10Sainsbury’s Mature West Country
Farmhouse Cheddar
30 <10
Tesco Continental Jarlsberg <10 <10
Asda West Country Farmhouse Cheddar 30 <10
Asda Gouda Wedge 100 20
Sainsbury’s Extra Mature West Country
Farmhouse Cheddar
60 <10
Tesco Fresh Italian Parmesan 30 <10
Sainsbury‘s Mature Gouda 40 <10
Portnoi & McDonald, 2009
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Cheddar
Portnoi & McDonald, 2009
La calidad
� Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o
aberturas
capacidad de las NSLAB para degradar el citrato y formar CO2
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
especie y cepa dependiente
vinculada a la presencia de azúcares en el medio y al estado fisiológico de las células
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La producción no deseada de CO2 debería controlarse a través de:
la microbiota
la composición
la temperatura de enfriado del queso y de maduración
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Metabolismo del lactato
La calidad
� Cristales de lactato de calcio
• Pequeños cristales visibles en superficies de corte• son inocuos pero pueden ser confundidos con hongos por el
consumidor lo que provoca rechazo• en general se consideran un defecto, aparecen en quesos
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
• en general se consideran un defecto, aparecen en quesos duros
• las bacterias lácticas del fermento producen L-lactato pero muchas NSLAB producen directamente D-lactato, menos soluble, o lo forman a partir del L- lactato
• este defecto se ve favorecido por enfriado lento de bloques grandes de queso, bajo pH y alta temperatura de maduración, así como el ahumado natural.
La calidad
�Cristales de lactato de calcio
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
H
C
COOHH3C
HO
H
C
HOOCCH3
OH
Pyruvate
Oxidation of L-lactateto pyruvate by L-lactate dehydrogenase
Reduction to D-lactate byD-LDH (NSLAB)
L(+)-Lactic acid D(-)-Lactic acid
McSweeney, 2003
En quesería artesanal o productos de alto valor agregado (con denominación de origen o productos probióticos, por ejemplo) el rol de las NSLAB se revaloriza
� Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
� Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour
� Aceleración de la maduración
� Degradación de péptidos amargos
� Diversificación de notas de aroma
� Potencial probiótico
AROMA Y SABOR DEL QUESO
McSweeney & Sousa, 2000
AROMA Y SABOR DEL QUESO
Sólo starterStarter + NSLAB1
Starter + NSLAB2
Starter + NSLAB3
James Steele, 2012
Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos
principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por
aminotransferasas
desarrollo de flavour durante la maduración de quesos
Amino acids
α-keto acid
Glutamateα-ketoglutarate
Glutamate
(Glutamate deshidrogenase)
(Aminotransferase)
GDH
AT
α-keto acid
Hydroxyacid
Carboxylic
Acid
P-Cresol (Tyr)
Skatole (Trp)
Acyl-CoA Aldehyde
Alcohol
Benzaldehyde (Phe)
Methylthioacetaldehyde (Met)
Dimethyldisulphide
Dimethyltrisulphide
α -keto acid
dehydrogenase α -ketoacid
decarboxylase
Tanous et al. (2002)Antonie van Leeuwenhoek
82: 271–278, 2002.
alcohol
dehydrogenase
Methanethiol (Met)
Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos
principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por
aminotransferasas
desarrollo de flavour durante la maduración de quesos
Aspartate
Oxaloacetate
Glutamateα-ketoglutarate
Glutamate
Oxaloacetate
GDH
Asp-AT
Piruvate
2-acetolactate
Oxaloacetate
descarboxilase
CO2
Acetoin
Diacetyl
Butanediol
NADH
NADO2
CO2
Diacetyl reductase
NADNADH
CO2
Acetaldehyde TPP
CO2
Le Bars and Yvon (2008)J Appl Microbiol 104 ,171–177
Acetolactate
synthase
Acetolactate
descarboxylase
Alcoholes isohexanal Ésteres metileno bis(metilsulfuro)
1,2-butanodiol 2-metilbutanal acetato de etilo Compuestos nitrogenados 2-butanol 3-metilbutanal benzoato de etilo 2-acetil-1-pirrolina
etanol 2-metilpropanal butirato de etilo Pirazinas 2-etilbutanol Nonanal hexanoato de etilo 2,3-dietil-5-metilpirazina
2-etilhexanol (E,E)-2,4 nonadienal isobutanoato de etilo 2-etil,3-5-dimetil-pirazina
2-heptanol (Z)-2-nonenal octanoato de etilo 2-metoxi-3-
isopropilpirazina
hexanol (E)-2-nonenal 2-metilbutanoato de etilo Furanos isobutanol octanal butanoato de isobutilo 2-etil-4-hidroxi-5-metil-
3(2H)furanona
3-hidroxi-4,5-dimetil-
2(5H)furanona
4-hidroxi-2,5-dimetil-3-
(2H)furanona
2-metilbutanol pentanal acetato de 3-metilbutilo Compuestos fenólicos 3-metilbutanol propanal metil-2-metilbutanoato p-cresol
2-metilpropanol propenal 3-octil acetato Ácidos grasos 2-nonanol thripfen-2-aldehído acetato de pentilo acetato
(Z)-1,5- Cetonas acetato de fenetilo butirato
Compuestos aislados como componentes de “flavour” en varios tipos de quesos
AROMA Y SABOR DE QUESOS
(Z)-1,5-
octadien-3-ol Cetonas acetato de fenetilo butirato
2-octanol Acetoína butirato de propilo caproato
1-octen-3-ol Acetona Lactonas decanoato
2-pentanol 2,3- butanodiona
(diacetilo) δ-lactona isobutirato
feniletanol 2-butanona γ-lactona metilacetato
2- feniletanol h-damaescenona δ-dodecalanctona ác. 2-metilbutírico
1-prropanol 2-heptanona δ-octalactona ác. 3-metilbutírico
2-propanol 2-hexanona (Z)-6-dodecen-γ-lactona octanoato
Aldehídos 3-metil-2-butanona Compuestos azufrados fenilacetato
acetaldehído 2-nonanona dimetil disulfuro propionato
decanal 3-octanona dimetil sulfuro valerato
heptanal 1-octen-3-ona trimetil disulfuro
(Z)-4-heptenal 2-pentanona metanotiol
hexanal 2-tridecanona metional
2-hexenal 2-undecanona hexanotiol
tipos de quesos
(Marilley & Casey, 2003)
Se conocen los compuestos que se necesitan para formar el flavour del queso, pero no cómo combinarlos de manera adecuada para conseguir la percepción global deseada en una determinada matriz
La sinfonía del flavour:
“…… stimuli such as flavour compounds, notes of music, or
colours in a picture do not generate the same response whenthey act singly, as when they act together in a rapid sequencethey act singly, as when they act together in a rapid sequence(e.g., an arpeggio) or even simultaneously (e.g., in a chord,
which can be harmonious or not).” “In each case, the whole ‘matrix’ or
environment must be considered”
Bosset, J. O. & Gauch, R. (1993) International Dairy Journal, 3, 359 –
377
“ We have our flavour orchestra:• Chamber – cheese structure• Flavour instruments – processes tocreate flavour notes• Flavour notes – cheese flavour compounds
The challenge is to conduct the orchestra todeliver the symphony of cheese flavour”deliver the symphony of cheese flavour”
Holland & Coolbear, 2012
• Si se agrega αααα-cetoglutarato al queso, el aroma general aumenta significativamente.
• Si se utilizan cepas de lactococos donde se inhibió la síntesis de aminotransferasas, el aroma y sabor del queso disminuye. Si la síntesis de aminotranferasas, por el contrario, se
� Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesosLa calidad
Controlar el catabolismo de los aminoácidos por los microorganismos del queso promete ser una manera eficaz de controlar la formación de aroma y sabor en
el queso
Yvon & Rijnen, 2001
Si la síntesis de aminotranferasas, por el contrario, se aumenta, el sabor y aroma del queso se incrementan
En quesos madurados únicamente con bacterias lácticas, la mitad de los componentes clave en el flavour provienen del catabolismo de los aminoácidos.
Patentes:
• FR 97 05133, PCT/FR98/00828 – 2000 - M. Yvon y J-C Gripon.
Utilización de cetoácidos para incrementar el flavour de productos a base
� Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesosLa calidad
Utilización de cetoácidos para incrementar el flavour de productos a base de queso
• WO2003056025 - 2003 - M. Yvon, E. Chambellon, A. Gori. Selección y utilización de cepas de bacterias lácticas capaces de producir a-cetoglutarato a partir de citrato y de glutamato a lo largo de la maduración de quesos para la transformación de aminoácidos en moléculas de aroma.
• EP1789542 - 2006 - M. Yvon, C. Tanous, E. Chambellon, M. Nardi . Gene que codifica una glutamato dehidrogenasa, plásmido conteniendo dicho gene y sus utilizaciones.
� Diversificación de notas de aroma
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesosLa calidad
� Diversificación de notas de aroma
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesosLa calidad
500
1000
1500
2000
Áre
a (u
nid
ades
arb
itra
rias
)
Diacetilo
Acetoína
Peralta et al., 2010
0
500
C1-60 días E1-60 días C2-60 días E2-60 días
Tipo de queso
Áre
a (u
nid
ades
arb
itra
rias
)
Wolf et al., 2009
� Diversificación de notas de aroma
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesosLa calidad
Adjunto de Lb. paracasei I90
En queso cremoso mini
Peralta et al., 2012
� Diversificación de notas de aroma
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesosLa calidad
Adjunto de Lb. paracasei I90
En modelo de queso Reggianito
Peralta et al., 2012
� Potencial probiótico
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Algunas cepas de origen NSLAB han demostrado potencial probiótico in vitro y se han probado exitosamente en matrices alimentarias
500
200
250
300
350
400
450
500
Control Control cheese Cheese + Lp I90 Cheese + Lp I91
Nº
IgA
+ c
ells
/10
fiel
ds
Burns et al., 2012
La estrategia de los fermentos adjuntos
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
� Cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos de buena
Busca reunir las ventajas de la presencia de las NSLAB en quesos, incrementando el control sobre la maduración
� Cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos de buena
calidad, identificadas y caracterizadas.
� Se agregan a la leche de elaboración además del fermento
primario (starter)
Requisitos de un adjunto
Obligatorios
� No contribuir a la acidificación
� Proliferar rápidamente en la cuajada y mantener la
viabilidad durante la maduración del queso
Fermentos adjuntos
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Fermentos adjuntos
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
viabilidad durante la maduración del queso
� No producir ningún defecto
Facultativos
�Aumentar la proteólisis secundaria
� Disminuir el gusto amargo
� Incrementar la bioformación de flavour
� Tener potencial como probiótico
Fermentos adjuntos
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
“Gracias a un mejor conocimiento, a través de la investigación en todo el mundo, la industria quesera tiene hoy acceso a una serie de herramientas para obtener quesos de calidad y mejores ingredientes de flavour para quesos. Una aplicación exitosa es la mejora en la constancia del flavour mediante el agregado de fermentos adjuntos de origen NSLAB, con propiedades de formación de flavour de origen NSLAB, con propiedades de formación de flavour comprobadas, a quesos con una mínima cantidad de NSLAB adventicias; esto quiere decir: quesos limpios”
Johnston et al., 2010, Fonterra
Materia prima adecuada + fermentos primarios y adjuntos adecuados + manejo de la temperatura
+ bajo contenido inicial de lactosa/galactosa/citrato
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Mayor control de la maduración
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Troubleshooting Problema Causa SoluciónProducción de CO2 con ojos y aberturas no deseadas provocado por bacterias lácticas no fermento
Altos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Funcionamiento prolongado del
pasteurizador
Fermento primario lento
Agregado de polvos o retentados para
aumentar rendimiento
Enfriado lento de las hormas, cortes en
cadena de frío, altas temperaturas de
maduración
Mejora de la calidad microbiológica
de la leche cruda (Buenas prácticas
de ordeño, Microfiltración)
Ciclos adecuados de trabajo y
limpieza
Fermento primario adecuado
Fermento adjunto
Lavado de la cuajada
Adecuada capacidad de
salado/enfriado
Mantenimiento de la temperatura Mantenimiento de la temperatura
consigna
Producción de cristales de lactato de calcio
Altos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Valores de pH bajos
Altas temperaturas de maduración
Mejora de la calidad microbiológica
de la leche cruda (BPO, MF)
Mantenimiento de pH y temperatura
de maduración adecuados
Producción de off flavors Altos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Predominio de cepas que producen
notas de flavour no buscadas
Mejora de la calidad microbiológica
de la leche cruda (BPO, MF)
Fermento adjunto
Sabor poco intenso (mild/flat) Bajos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Predominio de cepas que no producen
flavour
Fermento adjunto
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Control de las NSLAB: las tres K
Las tres K CausaKeep them out
Mantenerlas fuera
Minimizar la contaminación:
Calidad de la materia prima
Sanitización de la planta
Kill themMatarlas
Pasteurizar
Keep them from growing
Mantenerlas en bajo número
Temperatura
Condiciones ambientales
Nutrientes
Bacteriocinas
James Steele, 2012
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Muchas gracias!