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I Curso sobre Bioindicación en EDARS de fango activo.

ESTUDIO DE:

CARACTERÍSTICAS MACRO- Y MICROSCÓPICAS,

BACTERIAS FILAMENTOSAS Y

MICROFAUNA DE UN FANGO ACTIVO.

Laura Isac, Eva Rodríguez y Natividad Fernández

ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS MACRO- Y MICROSCÓPICAS DE UN FANGO ACTIVO

Características macro- y microscópicas de un fango activo

1. Introducción a la microbiología en depuradoras de fangos activos

2. Evaluación de las características macroscópicas y microscópicas de un fango activo

2.1. Observación macroscópica del fango activo

2.2. Observación microscópica del fango activo

2.3. Preparación de muestras para observación microscópica

3. Relación entre el estado estructural de un fango activo y los rendimientos de depuración en planta

Bacterias filamentosas en el fango activo 4. Estudio de las claves de identificación de bacterias filamentosas: principales características taxonómicas

5. Técnicas de tinción de bacterias filamentosas

5.1. Tinción Gram (Método Hücker modificado)

5.2. Tinción Neisser (Método de Eikelboom y van Buijsen, 1981)

5.3. Procedimiento de observación de muestras fijadas y teñidas

6. Cuantificación de bacterias filamentosas en una muestra

7. Protocolo para la identificación de organismos filamentosos

Microfauna de un fango activo 8. Nociones básicas en bioindicación.

9. Conocimientos básicos sobre Protistas.

10. Índice biótico de fangos (SBI, Sludge Biotic Index) o Método Madoni.

11. Instrucciones para la observación microscópica.

12. Formatos de recogida de datos.

13. Bibliografía.

I CURSO SOBRE BIOINDICACIÓN EN EDARS DE FANGOS ACTIVOS

Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández.

2

Microfauna de un fango activo

8. Nociones básicas en bioindicación.

PREMISAS: - Se requieren unos conocimientos mínimos en protozoología que permitan al

especialista la distinción de los grandes grupos de protistas (ciliados, flagelados, amebas testáceas, etc.), así como la pertenencia de éstos a los denominados “grupos funcionales” (Madoni, 1994) (sésiles, reptantes, nadadores, algunas especies en particular, etc.).

- El estudio microbiológico (microfauna y estado estructural) de un fango activo debe ser una actividad diaria en la EDAR, que permita un histórico de datos suficiente sobre el que aplicar estudios estadísticos, con los que establecer las relaciones bioindicadoras en la planta estudiada.

En este sentido, el estudio de los datos microbiológicos debe ser abordado en conjunción con los parámetros operacionales y físico-químicos de la EDAR.

-Cualquier estudio microbiológico de un fango activo en el que las característiscas macro- y microscópicas del flóculo y la población de organismos filamentosos no son tratados de forma conjunta al estudio de la microfauna, aporta información sesgada sobre el estado real del sistema de tratamiento.

NOCIONES BÁSICAS SOBRE BIOINDICACIÓN:

-Los flagelados son organismos poco frecuentes en sistemas de depuración maduros bajo condiciones estables de funcionamiento. Suelen observarse en las fases de puesta marcha del proceso en compañía de rizópodos, para seguidamente ser reemplazados por los ciliados. Una población de flagelados abundante indica la presencia de algún tipo de “alteración” en el sistema.

-Los rizópodos, al igual que los flagelados, son poco frecuentes en sistemas de depuración maduros. Pueden aparecer durante las fases de arranque junto con los flagelados, siendo sustituidos posteriormente por los ciliados. Sin embargo, las amebas testáceas pueden aparecer de forma estable junto con algunos ciliados en sistemas que funcionan a elevados tiempos de retención celular (TRC) y en los que las condiciones de oxigenación son favorables. Con frecuencia, las amebas testáceas están asociadas a estados de nitrificación en el reactor.

-Los ciliados nadadores son más abundantes en las fases de puesta en marcha que en fangos maduros. En las fases maduras de colonización, la presencia del flóculo de fango activo, sustrato de los ciliados sésiles, asegura la presencia de éstos, claros competidores con los nadadores por las bacterias en disolución.



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-En un fango activo, se entiende que la sucesión de microorganismos ocurre de la siguiente manera (Madoni, 1994) (Figura 2):

fangodebe ala faltdepenorgán

presen

apena

ningú

domin3).

es la alimen

Cara

Figura 2. Sucesión de microorganismos durante el establecimiento de la biomasa en unfango activo (En Madoni, 1994)

-Los ciliados reptantes y sésiles dominan de forma conjunta la microfauna de un activo maduro, bajo condiciones estables de funcionamiento. Esta situación se la dependencia de ambos grupos por la presencia de flóculos de fango activo y a a de competencia por el alimento. La relación entre ambas poblaciones está en dencia con ciertas condiciones ambientales como la concentración de carga ica en el reactor.

-Normalmente, un fango activo bajo condiciones estables de funcionamiento ta estas 3 características (Madoni, 1994): La población de protozoos se presenta en una densidad superior a 106 ind L-1 ٱ La microfauna se compone principalmente de ciliados reptantes y sésiles, sin ٱ

s presencia de flagelados Las especies y grupos de ciliados están muy diversificadas, de manera que ٱ

n grupo supera numéricamente a otro con un factor superior a 10 En el caso de que estas premisas no se cumplan, la identificación del grupo

ante permitirá obtener información sobre la situación particular del sistema (Tabla

En fangos activos, la clasificación de protistas empleada con mayor frecuencia que atiende a la relación establecida entre los protozoos, el flóculo y los hábitos ticios (Tabla 4).


cterísticas macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 26

Tabla 3. Algunas situaciones en planta reflejadas en la observación microscópica y puestas de manifiesto con la dominancia de un grupo u otro del conjunto de la microfauna (En Madoni, 1994):

Oxigenación insuficiente; sobrecarga orgánica; sustancias en fermentación TRC escaso; fango con aireación insuficiente Sobrecarga orgánica; fango pobremente aireado

---

--- Transitoriedad en la carga orgánica, extracción de fangos reciente, etc. Carga orgánica muy alta, poco degradable

---

Bajo

Mediocre

Mediocre

Bueno

Bueno

En descenso

Pobre

Bueno

Pequeños flagelados Pequeños nadadores (ciliados) Grandes nadadores (ciliados) Ciliados reptantes Ciliados sésiles y reptantes Ciliados sésiles Amebas desnudas y flagelados Amebas testáceas

POSIBLES CAUSAS

NIVEL DE DEPURACIÓN

GRUPO DOMINANTE

Tabla 4. Protistas más frecuentes en fangos activos atendiendo a los hábitos alimenticios y a la relación

con el flóculo de fango activo (Madoni, 1994).

Bacterívoros

Carchesium spp. Epistylis spp.

Opercularia coarctataOpercularia microdiscus

Opercularia minimaStentor spp.

Vaginicola crystallinaVorticella convallariaVorticella microstoma

Vorticella octava Zoothamnium spp.

Aspidisca cicada Aspidisca lynceus

Chilodonella uncinata

Euplotes affinis Euplotes moebiusi Euplotes patella Stylonychia spp. Trithigmostoma

cucullulus Trochilia minuta Acineria uncinata

Drepanomonas revoluta

Colpoda sp. Colpidium colpoda

Colpidium campylum Cinetochilum

margaritaceum Cyclidium glaucoma

Dexiotricha sp. Glaucoma scintillans

Loxocephalus sp. Paramecium spp.

Pseudochohnilembus pusillus

Sathrophilus sp. Spirostomum teres

Tetrahymena pyriformis Uronema nigricans

Holotricos Acineria incurvata

Amphileptus sp.Coleps hirtus Litonotus spp.

Spathidium spp.

Suctores Acineta spp.

Metacineta sp. Podophrya spp. Tokophrya spp.

Sésiles Reptantes Nadadores

Carnívoros



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9. Conocimientos básicos sobre Protistas. Las bacterias consituyen aproximadamente el 90-95% de la biomasa de un reactor y son los principales responsables de la transformación/oxidación de la materia orgánica y otros contaminantes como los nutrientes (nitrógeno y fósforo). Los protistas representan un 5% de la biomasa y cumplen funciones esenciales para el desarrollo del proceso: 1 las poblaciones bacterívoras mantienen activas las poblaciones bacterianas y contribuyen a la eliminación de bacterias patógenas; 2 participan en el proceso de floculación secretando exopolímeros, configurando la estructura del flóculo. Además, los protozoos son excelentes indicadores del estado de funcionamiento del sistema. Tanto las bacterias como los protistas se pueden dividir en dos grandes grupos en función del nicho ecológico ocupado en el reactor biológico: microorganismos asociados al flóculo (bacterias y protistas "floculantes") y microorganismos dispersos, no asociados al flóculo. Los primeros son los más significativos en la planta y constituyen la comunidad autóctona de los reactores biológicos pues se reciclan por un sistema de recirculación y no son eliminadas con el efluente.

Dentro de los protistas, los ciliados se han clasificado siguiendo un criterio ecológico en los siguientes grupos "funcionales" (Serrano et al., 2004): - Sésiles: asociados al flóculo de forma permanente por medio de pedúnculos de fijación.

Epistylis sp.

oVorticella sp.

- Reptantcirros que se disppueden desprendla comunidad flo

Características macro- y

Ciliado sésil colonial

es: ciliados aplanados queonen de forma preferente erse y nadar ocasionalmenculante.

Aspidisca sp.

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microscópicas, bacterias filamentosas y mic

Ciliado sésil solitari

se asocian al flóculo a través de cilios o en una de las superficies corporales. Aunque te en el medio, se consideran como parte de

Chilodonella sp. EN EDARS DE FANGOS ACTIVOS

rofauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 28

Algunos de estos ciliados se han llamado reptantes-nadadores, pues se pueden encontrar tanto asociados al flóculo como en el licor mixto. Estos ciliados suelen ser aplanados, si bien los cilios somáticos se distribuyen de forma diferente a ambos lados del cuerpo.

Litonotus sp.

- Nadadores: ciliados que se mueven libremente en el licor mixto, por lo que no forman parte de la comunidad estable en el sistema de depuración. La comunidad de protistas en las estaciones depuradoras de fangos activos es menos diversa en cuanto a número de especies que en los medios naturales, puesto que las condiciones del sistema están restringidas por el diseño de las plantas y las características de los vertidos, podríamos definirlo como un "ecosistema artificial" que opera bajo condiciones restringidas.

Glaucoma sp. Paramecium sp.

Para la identificación de los géneros y especies de protistas presentes en una muestra de fango activo se recurre al empleo de claves de identificación, en las que se utilizan características observables con los métodos de microscopía óptica convencional o tinciones simples. Es frecuente recurrir a técnicas de tinción específica que permiten la observación de estructuras difícilmente observables en vivo. Sin embargo, la observación en vivo es también un paso fundamental en la identificación, ya que algunas características sólo son observables de esta manera y en algunos grupos permiten la confirmación a nivel específico. La primera clave propuesta es la realizada en función del tipo de movimiento y los apéndices implicados en el mismo, puesto que este carácter morfológico es relativamente fácil de distinguir en las observaciones microscópicas. No obstante, profundizaremos en esta cuestión durante las sesiones prácticas.



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Existe una primera clasificación1, muy elemental, que responde al tipo de movimiento: Apéndices locomotores

FLAGELADOS CILIADOS

Pseudópodos

HELIOZOOS

AMEBAS DESNUDAS AMEBAS TESTÁCEAS

1 Los esquemas de los organismos aquí recogidos, con excepción del "Ciliado tipo", proceden del manual Streble y

Krauter (1987)



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Características morfológicas en FLAGELADOS:

Euglena viridis

Cloroplasto

Sáculo de los flagelos

Flagelo

Flagelos Estigma

Núcleo

Peranema tricophorum

I CURSO SOBRE BIOINDICACIÓN EN EDARS DE

Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fang

Heteronema acus

2 Flagelos
Estriación de la membrana
Bodo sp.

FANGOS ACTIVOS

o activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 31

Características morfológicas en SARCODINOS: AMEBAS DESNUDAS

Amoeba sp.

Pseudópodos

i

End

Ectoplasma

Núcleo Vahlkampfia limax AMEBAS TESTÁCEAS

Testas aglutinadas

Difflugia spp.

I CURSO SOBRE BIOINDICA

Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas

Vahlkampfia vahlkampf

oplasma

Pseudópodo

Nebela collaris

Opérculo

CIÓN EN EDARS DE FANGOS ACTIVOS

y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 32

AMEBAS TESTÁCEAS (continuación)

Testas transparentes

Arcella sp. Euglypha alveolata

HELIOZOOS

Endoplasma

Axópodos

Vacuolas de turgencia

Actinophrys sp.

Ectoplasma

Núcleo

Actinosphaerium sp.



Vacuolasdigestivas

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Características morfológicas en CILIADOS (I):

Ciliado tipo

4

Cirros frontales

Cirros frontoventrales

Cirro

Vacuola contráctil

Cirros transversos

Cirros ventrales

Ciliado tipo Espirotrico

Zo

Ciliado tipo Espirtotrico ZAM

Macronúcleo

I CURSO SOBRE BIOINDICACIÓN EN EDARS DE FANGOS ACT

Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac

Serrano et al., 200

s caudales

na adoral de membranelas (ZAM)

IVOS

, E. Rodríguez y N. Fernández. 34

Características morfológicas en CILIADOS (II):

Estriación

Ciliación oral

Pedúnculo

Espasmonema

Zooide

Ciliado tipo Oligohimenóforo peritrico

Macronúcleo

Cinturón aboral

Formación de larva trocófora

Núcleo

Tentáculos

Pedúnculo

Ciliado tipo Suctor

Vacuola contráctil



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10. Índice biótico de fangos (SBI, Sludge Biotic Index) o Método Madoni (Madoni, 1994).

Procedimiento que permite estimar la calidad del fango activo y su nivel de

actividad biológica. Es decir, proporciona información sobre el estado depurador del sistema y en consecuencia sobre la eficiencia depuradora de la planta.

Para la determinación del SBI es necesario llevar a cabo la caracterización de la microfauna y la determinación de las siguientes variables:

- Grupo funcional dominante: Como "grupo funcional" se entienden diferentes grupos de protozoos, especies y

asociaciones de grupos de protozoos ciliados que, por las condiciones ambientales a las que están asociados, son tenidos en cuenta en la determinación de este índice cuando aparecen de forma dominante sobre el conjunto de la microfauna.

• Ciliados reptantes + sésiles* y/o amebas testáceas • Ciliados sésiles* > 80% • Opercularia spp. • Vorticella microstoma • Ciliados nadadores bacteriófagos • Pequeños flagelados nadadores (>100)**

*Opercularia spp. y Vorticella microstoma no abundantes **Diagonal completa de la cámara de Fuchs-Rosenthal - Densidad de individuos: número de individuos por litro. Calculados como

media de varios recuentos. - Diversidad de la microfauna: número de unidades taxonómicas diferentes

identificadas en la muestra. En el SBI se entiende como "unidad taxonómica" la determinación de un organismo a nivel especie y nivel género en el caso de protozoos ciliados y amebas testáceas, respectivamente; en el caso de los metazoos (rotíferos y nematodos) y flagelados, no es necesaria la identificación para ser considerados como unidades taxonómicas, tan sólo el reconocimiento del grupo "rotíferos" o "nematodos", respectivamente.

- Número de pequeños flagelados: recuento realizado sobre la diagonal completa de la cámara Fuchs-Rosenthal. Serán tenidos en cuenta cuando superen el número de 10.

Una vez conocidos los datos concernientes a las variables anteriormente expuestas (grupo dominante, diversidad, etc.), el procedimiento se limita a la determinación de un valor numérico (0-10) en una tabla de doble entrada. Dicha tabla de doble entrada (Tabla 5) ha sido elaborada a partir de estudios de correlación desarrollados sobre los datos de microfauna y algunos de los parámetros operacionales



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más importantes, tomados en diversas EDAR. Son dos los principios básicos en la determinación de este índice: (1) La dominancia de los distintos grupos funcionales que componen la microfauna está en relación con las condiciones ambientales y operacionales de la planta. (2) El funcionamiento del proceso empeora conforme se reduce el número de especies y grupos funcionales de la microfauna.

Tabla 5. Tabla de doble entrada para la determinación del valor del SBI.

>10 8-10 5-7 <5 Grupo

dominante

Densidad

(ind./L) F <10 10<F<100 F <10 10<F<100 F <10 10<F<100 F <10 10<F<100

> 106 10 8 9 7 8 6 7 5 1

< 106 9 7 8 6 7 5 6 4

> 106 9 7 8 6 7 5 6 4 2

< 106 8 6 7 5 6 4 5 3

> 106 7 5 6 4 5 3 4 2 3

< 106 6 4 5 3 4 2 3 1

> 106 6 4 5 3 4 2 3 1 4

< 106 5 3 4 2 3 1 2 0

> 106 5 3 4 2 3 1 2 0 5

< 106 4 2 3 1 2 0 1 0

> 106 4 3 2 1 6

< 106 3 2 1 0

Notación:

1. Ciliados reptantes + sésiles* y/o amebas testáceas

2. Ciliados sésiles* > 80%

3. Opercularia spp.

4. Vorticella microstoma

5. Ciliados nadadores bacteriófagos

6. Pequeños flagelados nadadores (> 100) **

*Opercularia spp. y Vorticella microstoma no abundantes

**Diagonal completa en la cámara de Fuchs-Rosenthal

F<10 Menos de 10 pequeños flagelados en la diagonal de la cámara de recuento

10<F<100 Entre 10 y 100 pequeños flagelados en la diagonal de la cámara

>10, 8-10, 5-7, < 5 Número de unidades taxonómicas

Finalmente, una vez determinado el valor númerico del SBI, es necesario buscar

la correspondencia con la calidad de fango que determina este método (Tabla 6).



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Tabla 6. Clases de fango según el valor del SBI.

SBI CLASE DIAGNOSIS

8-10 I Fango estable y muy bien colonizado, excelente actividad biológica y

muy buen funcionamiento

6-7 II Fangos estable y bien colonizado, actividad biológica en descenso;

buen funcionamiento

4-5 III Depuración biológica insuficiente en la balsa de aireación;

funcionamiento medio

0-3 IV Depuración biológica escasa en la balsa de aireación; bajo rendimiento

Índice Shannon-Weaver: La expresión para el cálculo de este índice es la siguiente: H = - Σ (pi) (log2 pi) (bit/individuo) Siendo, Σ (pi) = 1 pi = nº individuos de la especie i/nº total de individuos de la muestra Es el índice de diversidad más empleado en ecosistemas acuáticos. Es una

medida cuantificable y objetiva que define los taxones y su proporción en el ecosistema. 11. Instrucciones para la observación microscópica.

La observación de una muestra de fango activo requiere los siguientes pasos: - Observación cualitativa: para este procedimiento se puede proceder a

concentrar la muestra. Consiste en realizar la identificación de todas las especies presentes. En las preparaciones en fresco, los microorganismos se encuentran vivos y pueden observarse directamente, empleando el contraste aportado por el propio material biológico o empleando el contraste de fases si es que el material biológico es de densidad homogénea. También pueden utilizarse diversos colorantes que pongan de manifiesto alguna estructura de interés como la tinción verde de metilo en protozoos (específica para núcleos), por ejemplo.

Para la determinación de organismos es necesario observar sus estructuras internas: núcleo, vacuolas pulsátiles, flagelos, patrones de ciliación, etc. Algunas de



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estas estructuras sólo son observables mediante métodos de tinción y por ello, a veces, es necesario cultivar los organismos. Estos métodos de tinción, especialmente indicados para la identificación de ciliados son, sobre todo, técnicas de impregnación argéntica (Fernández-Galiano, 1994; Impregnación con nitrato de plata de Klein, 1926) que permiten poner de manifiesto patrones de ciliación, núcleos, etc.

- Recuento de microorganismos u observación cuantitativa: este procedimiento requiere realizar un mínimo de 3 recuentos de la microfauna sobre 25 µl de volumen. Es importante no olvidar que los microorganismos presentes en los bordes de la preparación también han de ser contabilizados. Posteriormente, se efectúan medias y se obtienen los porcentajes de especies y de grupos funcionales.

El recuento de microfauna también puede efectuarse sobre una muestra previamente fijada con “Líquido de Bouin”.

importante contabilizar los microorganismos aquí presentes

Una vez efectuada la observación de la muestra y los recuentos de microfauna,

se llevan a cabo los siguientes análisis: - Análisis de la diversidad de la muestra (protozoos ciliados) mediante la

aplicación de índices de diversidad (Shannon-Weaver (1949), Margalef (1951), etc.). - Análisis del conjunto de la microfauna según el Método Madoni o SBI, índice

de aplicación específica a fangos activos que permite extraer de una forma relativamente sencilla, información sobre el estado de depuración del sistema (Madoni, 1994).

Sin embargo, la información aportada por dicho índice debe ser completada y

contrastada con otros datos como el estado estructural del fango (bacterias filamentosas, IVF, etc.), la diversidad, parámetros de control y físico-químicos, o la propia experiencia del observador.



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13. Bibliografía •Arnáiz, C., Jiménez, C. y Estévez, F. (1999). Determinación rápida de microorganismos filamentosos en fangos activos. Tecnología del Agua 193, 102-107.

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•Isac Oria, L. (2003). Determinación de la actividad biológica aerobia. Aplicación en procesos de depuración de aguas residuales urbanas e industriales. Tesis doctoral. Universidad de Sevilla. •Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (1993). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. WRC, Pretoria y USEPA, Cincinnati.

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•Laboratorio Central del Departamento de Saneamiento del Ayuntamiento de Madrid (1996). Observación microscópica del fango activo: caracterización del flóculo e identificación de microorganismos filamentosos. Jornadas Prácticas del 20-24 de mayo de 1996.

•Madoni, P. (1994). A Sludge Biotic Index (SBI) for the evaluation of the biological performance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

•Serrano, S., Pérez-Uz, B., Arregui, L. y Calvo, P. (2004). Claves de identificación de Protistas en estaciones depuradoras de fangos activos. Universidad Complutense de Madrid. Ponencia en el curso: "Protozoos en el fango activado". Fundación Emasesa. Sevilla, 15-18 marzo de 2004.

•Streble, H. y Krauter, D. (1987). Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua. Ed. Omega, Barcelona.

www.grupobioindicacionsevilla.com

Bibliografía empleada en los esquemas de microorganismos:

•Streble, H. y Krauter, D. (1987).

•Serrano, S., Pérez-Uz, B., Arregui, L. y Calvo, P. (2004).



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