guia de trabajos practicos final...
TRANSCRIPT
- 1 -
GUIA DE TRABAJOS
PRÁCTICOS
Planta de Bioprocesos Industriales- INTI
2014
Materia de Especialización CEBI_E18
Planta Piloto
- 2 -
El presente documento pretende orientar al estudiante en las distintas etapas de un
proceso biotecnológico. Las distintas etapas son desarrolladas como diferentes trabajos
prácticos en el orden en el cual deberían acontecer en un proceso real.
Por otro lado, se incluyen al final en forma de anexos, las diferentes técnicas empleadas
para los seguimientos de las diferentes etapas.
Información adicional y específica estará disponible y será entregada a lo largo de la
cursada.
- 3 -
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS DE PLANTA PILOTO
Índice:
T.P. Nro 1. Preparación de medios de cultivo ..............................................................4
T.P. Nro 2. Producción de una proteína verde fluorescente (GFP) ...............................6
T.P. Nro 3. Disrupción de las células y concentración................................................. 11
T.P. Nro 4. Purificación de proteína GFP .................................................................... 13
ANEXO I: Preparación de inóculo. .............................................................................. 24
ANEXO II: Determinación de la concentración de glucosa por método enzimático ..... 26
ANEXO III: Determinación de la densidad óptica a 600 nm ........................................ 29
ANEXO IV: Recuento de células viables en placa ...................................................... 30
ANEXO V: Determinación de Masa seca .................................................................... 33
ANEXO VI: Electroforesis desnaturalizante en gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) .... 37
ANEXO VII: Determinación relativa pureza por Densitometría.................................... 45
Referencias Bibliográficas .......................................................................................... 51
- 4 -
T.P. Nro 1. Preparación de medios de cultivo
Introducción y Objetivo.
Cualquier medio de cultivo de bacterias o levaduras debe incluir:
1. Una fuente de carbono
2. Agua
3. Una fuente de nitrógeno
4. Una fuente de fósforo
5. Una fuente de azufre
6. Otros nutrientes minerales y vitaminas.
Un medio de cultivo es definido o sintético, cuando se conoce exactamente su composición
química. Sin embargo es habitual en el trabajo de laboratorio, el empleo de medios
complejos. Por ejemplo, el extracto de levadura y las peptonas (proteína hidrolizada) son
los ingredientes básicos del medio Luria-Bertani (LB), utilizado muy frecuentemente para
crecimiento de E.coli. Estos materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de
carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos así como una
mezcla de cofactores.
Tanto los medios de cultivo como equipos y materiales deben ser esterilizado antes de ser
utilizados con las cepas puras. Los procesos de esterilización disminuyen la carga
bacteriana (la probabilidad de que un microorganismo esté presente en forma activa o
latente es igual o menor de 1 en 1.000.000 definido como coeficiente de seguridad de
esterilidad). Existen varios métodos de esterilización de líquidos, recipientes e
instrumentos utilizados en la manipulación de cultivos puros. En el trabajo práctico,
utilizaremos la esterilización por calor húmedo, empleando temperaturas de 121ºC
(utilizando vapor a 1,2 atm) durante un período de 20 minutos.
El objetivo de este TP es aprender a preparar y a esterilizar un medio de cultivo complejo y
acondicionar el biorreactor para su esterilización en autoclave.
Materiales
Caldo de Cultivo LB:
Peptona 10g/litro
Extracto de Levadura 5g/litro
NaCl 10 g/litro
- 5 -
Ajustar el pH hasta 7,0 con NaOH.
Autoclave Marca SCT
Biorreactor BIOSTAT® Bplus 5. Sartorius Stedim Biotech.
Métodos
Preparar 3 litros de caldo de cultivo LB.
Acondicionar el reactor, cubriendo con papel de autoclave todos los puertos de conexión al
exterior antes de ingresarlo al esterilizador.
Verificar el nivel de agua del autoclave, colocar la carga a esterilizar dentro del autoclave y
autoclavar durante un tiempo mínimo de 30 min a 1,2 atm y 121°C. Colocarse los guantes
de protección. Proceder a abrir la tapa del autoclave cuidando alejar el rostro de la boca
del autoclave y retirar el biorreactor.
Debido a los extensos tiempos de preparación, acondicionamiento y autoclavado del
biorreactor, este TP será solo mostrativo.
- 6 -
T.P. Nro 2. Producción de una proteína verde fluore scente (GFP)
Introducción y Objetivos
En biotecnología, el conocimiento de las características de crecimiento de un
microorganismo es esencial para lograr una eficiencia de transformación reproducible, y
para obtener rendimientos repetibles de plásmidos y proteínas recombinantes. Las células
que están creciendo en un cultivo discontinuo (Batch), normalmente experimentan cuatro
diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento
exponencial (log), una fase de crecimiento estacionario, y una fase de muerte. En la fase
de latencia “Lag”, las células comienzan su adaptación al medio fresco de cultivo y
comienzan a duplicarse lentamente. Terminada la fase Lag, las células comienzan su fase
de crecimiento exponencial, donde la tasa de crecimiento en la población microbiana es
exponencial y se mantiene constante. El comienzo y la duración de la fase exponencial es
variable, y debe establecerse para cada medio y cada cepa microbiana empleados.
Conforme se consumen los nutrientes en un sistema discontinuo, la velocidad de
crecimiento va disminuyendo hasta llegar a detenerse alcanzándose así la fase
estacionaria. En esta fase, las células no están todas en el mismo estado fisiológico;
algunas se están dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morir. Pero la
población se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los nutrientes, el
número de células que mueren sobrepasa al número de células que se reproducen, y el
cultivo entra en la fase de muerte.
La construcción de una curva de crecimiento que incluya las fases de latencia,
exponencial, estacionaria y de muerte, nos permitirá establecer los parámetros cinéticos de
crecimiento.
El objetivo del trabajo práctico es que el alumno realice una experiencia en un bioreactor a
escala de laboratorio, con el fin de producir la proteína GFP (Green fluorescent protein) a
partir de una cepa recombinante de E. coli. Inicialmente el sistema será operado de forma
Batch hasta consumo total de la fuente de carbono (Glucosa), para luego cambiar la
operación a un sistema Fed-batch o de cultivo en batch alimentado, con el fin de evitar
llegar a la fase estacionaria, prolongando la fase exponencial mediante el control y
agregado de nutrientes. Posteriormente, se inducirá la cepa para producir la proteína
recombinante de interés.
- 7 -
Se busca además que el alumno se familiarice con el análisis cinético de los parámetros
fermentativos; la operación, determinación y seguimiento del crecimiento celular y el
proceso de inducción de proteínas recombinantes en un cultivo microbiano,
Con el fin de realizar el seguimiento del proceso fermentativo se realizará el Control del
Proceso midiendo los parámetros de crecimiento: DO600 y Glucosa cualitativa (Ver método
de determinación en Anexo). Adicionalmente, se tomaran muestras para Control de
Calidad en los que se determinarán la concentración de glucosa, recuento de células
viables (Unidades formadoras de colonia por ml), masa seca y geles de poliacrilamida (Ver
procedimiento de determinación en Anexos I a V).
A partir de los resultados obtenidos durante la fermentación se buscará en caso de ser
posible, determinar la velocidad específica de crecimiento de un cultivo (µ) durante la
etapa Batch, así como también el tiempo medio de duplicación o tiempo de generación (t) y
el rendimiento del proceso en la fase de crecimiento (Yx/s).
- 8 -
Procedimiento:
Actividades de acondicionamiento:
A llevar a cabo por el personal de Centro de Biotecnología Industrial-INTI
1) Acondicionar el bioreactor Biostat B5 Plus para su esterilización. Ver figura 1.
2) Preparar el medio de cultivo LB, volumen de trabajo 3 litros (De acuerdo a T.P. No.1).
3) Esterilizar el medio de cultivo y el bioreactor por vapor húmedo a 121 °C y 1,2 atm en
autoclave.
4) Preparar el inoculo de la fermentación creciendo la cepa de E. coli recombinante
durante 16-18 horas en tres erlenmeyers conteniendo cada uno 100ml de caldo LB con
antibiótico de selcción (Ver Anexo I).
Figura 1: Esquema de un biorreactor de escala de laboratorio.
- 9 -
Actividades del T.P.:
1) Inocular el bioreactor con 10% del volumen final de fermentación (recordar adicionar al
medio los antibióticos de selección).
2) Durante todo el proceso de fermentación se deben seguir los parámetros de
fermentación suministrados de forma on-line por el controlador del equipo (Temperatura,
O2 disuelto, pH, agitación, aireación, dosificación de antiespumante y volumen de
dosificación de soluciones de regulación de pH). Registrar los valores en la “Planilla de
Fermentación”.
3) Tomar una muestra cada hora para Control de Proceso (Volumen=5ml) y otra para
Control de calidad (Volumen=10ml).
4) Realizar la medición de DO600 y glucosa cualitativa para todas las muestras tomadas
durante la fermentación (y muestras intermedias que se consideren necesarias).
5) De acuerdo a la medición cualitativa de glucosa, determinar el tiempo de consumo total
de la fuente de carbono en el proceso Batch.
6) Una vez consumida completamente la fuente de carbono adicionar glucosa al 40% a
flujo constante por medio de una bomba peristáltica. El porcentaje de dosificación de la
bomba debe ser calculado para mantener una concentración de glucosa de 2g/L por hora,
durante todo el procedo de Fed-Batch.
7) Alcanzar una DO600 entre 6,00 y 8,00 para realizar la inducción de la proteína
recombinante.
8) Una vez alcanzada la DO600 adicionar extracto de levadura a una concentración final de
2 g/L.
9) Setear la temperatura a 28°C para dirigir la induc ción de proteína soluble en el
citoplasma celular.
10) Inducir con una concentración final de IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido) de
1mM en el fermentador.
11) Permitir el proceso de inducción durante dos horas.
12) Continuar con el registro de los parámetros de proceso y tomar las muestras para
control de proceso y control de calidad.
13) Una vez cumplidas las dos horas de inducción, cosechar el cultivo por medio de bomba
peristáltica.
14) Centrifugar el cultivo cosechado a 7000 rpm por 15 min.
15) Resuspender el pellet en Buffer de Ruptura suplementado con un inhibidor de
proteasas (Para el práctico se utilizará: PMSF-Fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y almacenar
en cámara fría.
- 10 -
16) Confeccionar una tabla para registro de todos los parámetros medidos:
Hora Tiempo (h) DO (Abs 600nm)
Peso Seco (g/L)
Concentración de glucosa (g/L) UFC/ml Operador
T1 T2 tn
- 11 -
T.P. Nro 3. Disrupción de las células y concentraci ón
Introducción y objetivos.
Los métodos de disrupción se pueden clasificar en dos categorías: métodos físicos y
métodos químicos.
Métodos físicos.
• Disrupción en molino de bolas
• Disrupción utilizando un molino de rotor
• Disrupción utilizando prensa francesa
• Disrupción utilizando homogenizador de alta presión
• Disrupción utilizando vibración ultrasónica.
Métodos químicos y físicoquímicos
• Disrupción utilizando detergentes
• Disrupción utilizando enzimas
• Disrupción utilizando solventes
• Disrupción utilizando shock osmótico
Los métodos físicos están más focalizados a la ruptura de la pared celular mientras que los
métodos químicos y fisicoquímicos se utilizan principalmente para desestabilizar la
membrana celular.
El objetivo del TP será el procesado del producto obtenido del biorreactor, de manera que
el alumno pueda observar y aprender los factores que requieren especial atención en esta
operación unitaria.
Materiales y métodos.
Se utilizará un homogeinizador de alta presión Marca APV Lab. Modelo 2000.
La cosecha del biorreactor deberá ser enfriada a 4ºC antes de proceder al primer paso por
el homogenizador. Registrar la presión de trabajo utilizada (aproximadamente será de 800
Bar) y el número de ciclos de ruptura (de 3 a 4). Controlar la temperatura al final de cada
ciclo para decidir, de ser necesario, una etapa de enfriamiento adicional antes de iniciar el
siguiente paso. Retirar muestras de 5 ml pre-ruptura y después de cada ciclo para:
• Controlar la ruptura por microscopía óptica y Densidad óptica (DO600)
• Guardar alícuotas para analizar pellet y sobrenadante de ruptura por electroforesis en
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y determinación de concentración de proteínas
cuantitativa.
- 12 -
Centrifugar el producto de la ruptura a 8000 rpm durante 20 minutos. Recuperar el
sobrenadante a 4ºC, ya que la proteína de interés se encuentra soluble. Entregar el
producto al área de purificación.
- 13 -
T.P. Nro 4. Purificación de proteína GFP
Durante este TP se realizará un esquema de purificación como se presenta a
continuación:
- 14 -
A continuación se desarrollarán los conceptos principales de cada etapa interviniente.
Los alumnos podrán regresar a este esquema para poder ubicarse.
Cromatografía de Intercambio Iónico (CII) La Cromatografía de Intercambio Iónico (CII) separa moléculas en función de las diferentes
cargas netas superficiales.
En las moléculas que tienen grupos ionizables, la carga neta superficial es altamente
dependiente del pH. Como las proteínas son anfotéricas, por estar formadas por muchos
aminoácidos que contienen grupos ácidos y básicos débiles, su carga neta superficial
cambiará con los cambios del pH del ambiente en el que están. Cada proteína tiene,
entonces, su propia relación carga neta/pH (la cual puede ser visualizada como una curva
de titulación) y este hecho se aprovecha en la CII para facilitar la separación.
En una separación por CII se van controlando las interacciones reversibles que ocurren
entre las moléculas cargadas y el medio cromatográfico (cargado con signo opuesto), a fin
de favorecer el pegado o la elución de moléculas específicas y conseguir la separación.
Una proteína que no posee carga neta, a un pH equivalente a su punto isoeléctrico (PI), no
interactuará con un medio cargado. En cambio, a un pH por arriba de su PI, la proteína se
pegará a un medio cargado positivamente (intercambiador de aniones) y, a un pH por
debajo de su PI, se pegará a un medio cargado negativamente (intercambiador de
cationes). La elección de utilizar un medio u otro, generalmente se define por el rango de
pH en el cual la proteína en cuestión es más estable.
Figura 2: Gráfica de comportamiento de una proteína frente a la variación del pH.
- 15 -
En CII, una buena selectividad (el grado de separación entre dos picos) se logra realizando
la separación a valores de pH elegidos cuidadosamente para maximizar las diferencias en
las cargas netas de los componentes de interés. La selectividad óptima se puede esperar a
valores de pH en los que la separación entre las curvas de titulación de la proteína de
interés y de las otras proteínas de la muestra (contaminantes) sea máxima.
En este Trabajo Práctico se usarán intercambiadores aniónicos. Como se conoce que el
Punto Isoeléctrico de la proteína GFP es de 6.2, se trabajará con buffers de pH=8.2, para
asegurar que la proteína esté cargada negativamente.
Este punto se discutirá más ampliamente durante el desarrollo del TP, analizando curvas
de titulación obtenidas por Isoelectroenfoque.
Etapas en una Cromatografía de Intercambio Iónico
En una CII se suele seguir una serie de pasos, los cuales se pueden ver en la Figura 3:
1) Equilibración: Un medio cromatográfico de CII comprende una matriz de partículas
esféricas, generalmente porosas para ofrecer una superficie interna de interacción
mayor. El medio es colocado dentro de una columna, para formar un lecho
empacado. El lecho se equilibra con buffer, el cual llena los poros de la matriz y los
espacios internos y externos de las partículas. El buffer de equilibrio debe tener un
pH y una fuerza iónica que aseguren que, cuando se carga la muestra, las proteínas
de interés se peguen al medio y que la mayor cantidad posible de impurezas no lo
hagan.
2) Inyección de la muestra: Las proteínas que tienen la carga correcta se van pegando
al lecho y quedan concentradas adentro de la columna, mientras que las proteínas
que no tienen la carga superficial correcta irán pasando a través de la columna a la
misma velocidad que el flujo del buffer.
3) Lavado: Cuando toda la muestra ha sido cargada, la columna es lavada con algunos
ml de buffer inicial (Buffer de Equilibrio), de manera tal que todas las proteínas que
no se pegaron al lecho salgan de la columna.
4) Elución: se cambian las condiciones para comenzar a eluir a las proteínas que
quedaron pegadas. Frecuentemente, las proteínas se eluyen incrementando la
fuerza iónica (concentración de sal) del buffer. A medida que la fuerza iónica
aumenta, los iones salinos (típicamente, Na+ o Cl-) compiten con las moléculas
- 16 -
pegadas por las cargas de la superficie del medio, y las proteínas comienzan a eluir
y salen de la columna. Las proteínas con la menor carga neta al pH seleccionado,
serán las que primero eluyan de la columna. En cambio, las proteínas con la mayor
carga neta a ese pH serán retenidas más fuertemente y serán las últimas en salir.
Cuanto mayor sea la carga neta de una proteína, mayor fuerza iónica se necesitará
para despegarla del medio. Controlando los cambios en la fuerza iónica y usando
diferentes formas de gradiente, las proteínas se eluyen diferencialmente, en forma
purificada y concentrada.
En el Trabajo Práctico se usara un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl.
5) Lavado final: Por último, se realiza una etapa de lavado con un buffer de mayor
fuerza iónica, el cual removerá las proteínas fuertemente pegadas, aún retenidas, al
final de la elución.
En el Trabajo Practico se usara NaCl 1 M.
La columna debe reequilibrarse nuevamente con buffer de equilibrio antes de aplicar más
muestra, en la corrida siguiente.
Figura 3: Etapas de una Cromatografía de Intercambio Iónico
- 17 -
Cromatografía por IMAC Las proteínas con una “cola” (tag) de histidinas tienen una alta afinidad selectiva por el Ni2+
y otros metales divalentes, los cuales son inmovilizados en un medio cromatográfico
usando ligandos quelantes. Por ese motivo, esta técnica cromatográfica suele
denominarse IMAC, por “Immobilized Metal Ion Chromatography” (Cromatografía por Iones
Metálicos Inmovilizados).
En la Figura 4 se muestra un esquema de las etapas de una típica purificación por IMAC:
Figura 4: esquema de las etapas de una purificación por IMAC
1. Carga del medio con el ion elegido
2. Equilibración de la columna con el Buffer de Equilibrio
3. Aplicación de la muestra
4. Lavado con Buffer de Equilibrio: se retira todo el material de la muestra que no se
pegó a la columna (“Pass Trough”)
5. Elución: remoción del material pegado a la columna con el Buffer de Elución
(generalmente, aplicado en forma de gradiente)
6. Lavado con el Buffer final, para remover todo lo que pudo haber quedado pegado a
la columna y terminar de limpiarla
7. Reequilibración: nuevamente con el Buffer de Equilibrio, para dejar preparada a la
columna para una nueva corrida
En la Figura 5 se muestra un resultado teórico de una cromatografía de este tipo, tal como
se realizará en el Trabajo Práctico, en el cual se visualiza la lectura de la Absorbancia a
280 nm y la concentración del Buffer de Elución (Buffer B).
- 18 -
Figura 5: Resultado de una cromatografía por IMAC típica
Luego de la siembra, se espera que la mayor parte de las proteínas que no son de interés,
no se peguen a la columna y salgan durante el lavado inicial. La proteína pegada en forma
específica a la columna debería salir en algún momento del gradiente de elución, en forma
de pico.
Si hubiese quedado alguna proteína muy fuertemente pegada a la resina, debería salir con
el lavado final.
Para la elución se utilizará en el Buffer de Elución Imidazol, una sustancia que compite con
las histidinas por los átomos de níquel disponibles. A medida que va aumentando la
concentración de Imidazol, ésta va desplazando a las moléculas que están pegadas a la
columna, de acuerdo a la fuerza de su unión (primero saldrán las moléculas más
débilmente pegadas y luego las que están fuertemente pegadas).
Desarrollo del Trabajo Práctico
Selección del medio cromatográfico
Se realizarán varios ensayos con columnas de volumen de lecho pequeño para determinar
qué medio cromatográfico resulta más conveniente para purificar la proteína de interés. Se
probarán diferentes medios, tanto de Intercambio Aniónico como de IMAC, haciendo
corridas en las mismas condiciones.
A lo largo de todo el Trabajo Práctico se ensayarán los siguientes medios:
- 19 -
Medio (Nombre comercial) Tipo Fabricante
1 Q Sepharose Fast Flow Intercambiador de aniones fuerte GE
2 Q Sepharose XL Intercambiador de aniones fuerte GE
3 Q Ceramic HyperD F Intercambiador de aniones fuerte PALL
4 ANX Sepharose 4 Fast Flow Intercambiador de aniones débil GE
5 DEAE Sepharose Fast Flow Intercambiador de aniones débil GE
6 DEAE Ceramic HyperD F Intercambiador de aniones débil PALL
7 Capto Q ImpRes Intercambiador de aniones fuerte GE
8 Source 15 Q Intercambiador de aniones fuerte GE
9 Ni Sepharose 6 Fast Flow IMAC GE
10 IMAC HyperCel IMAC PALL
Cada grupo realizará, por lo menos, dos cromatografías, una de intercambio iónico y una
de IMAC. Se analizarán y compararán los resultados obtenidos con todos los medios
ensayados en el TP.
Condiciones de las corridas:
Siembra: 500 µl de Sobrenadante de Ruptura
Intercambio Aniónico:
Buffer de Equilibración: Tris-HCl 50 mM, pH=8,2.
Buffer de Elución: Tris-HCl 50 mM + NaCl 1 M, pH=8,2.
Gradiente: lineal de 0-50% B (Buffer de Elución), en 10 Volúmenes de Columna (VC) + 5
VC a 100% B.
IMAC:
Buffer de Equilibración: Tris-HCl 50 mM + NaCl 300 mM, pH=7,5.
Buffer de Elución: Tris-HCl 30 mM + NaCl 300 mM + Imidazol 500 mM, pH=7,5.
Gradiente: lineal de 0-100% B, en 10 VC + 5 VC a 100% B.
En cada corrida se colectarán las fracciones correspondientes a los lavados iniciales (lo
que pasa de largo, sin pegarse a la columna: “Pass trough”) y a los diferentes picos
obtenidos con la elución.
Parámetros para evaluar el Scouting
Registrar los valores y, paralelamente, ir volcándo los a la PLANILLA 1.
- 20 -
a) PUREZA
La pureza se calcula mediante densitometría como: % de la banda de interés sobre el % de
proteína total.
Datos necesarios sobre la MUESTRA:
Pureza inicial (por SDS-PAGE) = _______ % (2) calculada mediante densitometría
Proteínas Totales (por Bradford) = _______ mg/ml (1)
Volumen sembrado = ________ ml (3)
b) EFICIENCIA
La eficiencia se calcula mediante la siguiente ecuación:
Eficiencia= (Pureza obtenida (4) / Pureza inicial (2)) x 100= (____(4)/____(2)) x100 =____ % (5)
Datos necesarios:
Pureza obtenida (por SDS-PAGE) de la fracción colectada del pico = ______ % (4) calculada
mediante densitometría
c) RECUPERACION
La recuperación se calcula mediante la siguiente ecuación:
Recuperación = (Masa de GFP recuperada (8)/ Masa de GFP sembrada (9)) x 100
Siendo:
Masa de GFP recuperada= Proteínas Totales del pico (6)x Volumen del pico(7)x Pureza del pico(4) (8)
Masa de GFP recuperada= ________ mg/ml x ________ ml x ______ __%
Masa de GFP recuperada= _________ mg
Y
Masa de GFP sembrada = (Proteínas Totales de la muestra (1) x Volumen sembrado(3) x Pureza
inicial(2) (9)
Masa de GFP sembrada = ________ mg/ml x ________ ml x _______ %)
Masa de GFP sembrada = ________ mg (9)
- 21 -
Datos necesarios:
Proteínas Totales del pico (por Bradford) de la fracción colectada = ______ mg/ml (6)
Volumen del pico (por Volumetría o Cromatograma) = ______ ml (7)
Pureza del pico (por SDS-PAGE) de la fracción colectada del pico = ______ % (4)
Pureza inicial (por SDS-PAGE) = _______ % (2)
Proteínas Totales (por Bradford) = _______ mg/ml (1)
Volumen sembrado = ________ ml (3)
Finalmente:
Recuperación = [(8) / (9)] x 100 = ( ______ mg / ______ mg) x 100 = ______ % (10)
Volcar los datos en la PLANILLA 1 y completar la TABLA 1.
Capacidad de pegado (“binding”)
La cantidad real de proteína que puede unirse a un medio cromatográfico, bajo
determinadas condiciones experimentales, se denomina Capacidad Estática de Pegado
(capacidad del medio). Si esas condiciones incluyen el flujo utilizado, la cantidad pegada
se refiere como Capacidad Dinámica de Pegado (DBC).
La Capacidad Dinámica de Pegado depende de las propiedades de la proteína, de las
propiedades del medio y de las condiciones experimentales utilizadas. Por ese motivo,
debe ser calculada en cada caso en particular.
Objetivo: en esta etapa del Trabajo Práctico se estimará la DBC de la resina que resultó
elegida luego del Scouting. Conocer la DBC de una resina puede ser útil, en dos
situaciones diferentes:
I. Teniendo una columna ya empacada, para calcular cuál es la cantidad máxima de
muestra que conviene sembrar.
II. Teniendo una cantidad de muestra definida para procesar, para calcular el
volumen de resina que conviene empacar en una columna.
Determinación de la DBC:
a. Medir la absorbancia máxima de la muestra con el cromatógrafo, haciendo pasar
muestra por la tubuladura (en lugar de la columna).
- 22 -
b. Utilizando la columna elegida, comenzar a sembrar la muestra y detener la siembra
cuando se alcance el 50% de la absorbancia máxima.
c. Lavar con buffer de equilibrio hasta llegar al 0% de absorbancia.
d. Realizar una elución rápida, con buffer de alta fuerza iónica (1 M). Colectar todo el
pico eluido y medir su volumen.
e. Calcular la cantidad máxima de proteína que puede unirse a la columna (A), al flujo
elegido, como:
A = C (12) x V (13) (11)
Donde:
C: Concentración de Proteína en el pico eluido = _____ mg/ml (12) a estimarse por
Bradford (o por integración de la curva)
V: Volumen del pico eluido = ______ ml (13)
f. La Capacidad Dinámica (DBC) se calcula como A/volumen del lecho empacado:
Volumen del lecho empacado = _____ ml (14)
DBC = ______ mg(A) / _____ ml (14)
DBC = ______ mg de Proteína / ml de medio (15)
Optimización por gradiente escalonado
Objetivo: intentar mejorar la Resolución de los picos y/o acortar la cromatografía.
Una vez seleccionado el medio cromatográfico, se buscará optimizar la cromatografía en
cuanto a resolución alcanzada (grado de separación de los picos) y/o duración de la
corrida.
Para esto se diseñará un gradiente escalonado, acorde a la finalidad buscada, y se
compararán los resultados con los obtenidos con el gradiente lineal.
Los detalles se explicarán durante el desarrollo del Trabajo Práctico.
- 23 -
Escalado
Cuando se deben procesar grandes volúmenes de muestra, luego de optimizar la
separación a pequeña escala se transfiere el mismo proceso a una escala mayor,
utilizando una columna de mayor tamaño.
Las reglas generales para un cambio de escala en una cromatografía se muestran en la
siguiente Tabla:
MANTENER AUMENTAR
Altura del lecho de la columna Volumen de la columna (diámetro)
Flujo lineal (cm/h) Flujo volumétrico (ml/min)
Concentración de la muestra Volumen sembrado (*)
Volumen del gradiente de elución (**)
(*) Mantener la relación Volumen de Siembra/Volumen del lecho.
(**) Mantener la relación Volumen del Gradiente/Volumen de la columna.
Conversión entre flujo lineal y flujo volumétrico.
Para comparar resultados obtenidos a partir de columnas de diferentes tamaños, es
conveniente expresar el flujo en forma lineal (cm/hora). Sin embargo, el flujo usualmente
se expresa en forma volumétrica (ml/min).
Para hacer la conversión entre uno y otro, se utilizan las siguientes fórmulas:
a) De flujo lineal (cm/h) a flujo volumétrico (ml/min):
Flujo Volumétrico (ml/min) = (Flujo Lineal (cm/h) / 60) x (π x d2 / 4)
Donde d = diámetro interno de la columna, en cm.
b) De flujo volumétrico (ml/min) a flujo lineal (cm/h):
Flujo Lineal (cm/h) = Flujo Volumétrico (ml/min) x 60 x 4 / (π x d2)
Donde d = diámetro interno de la columna, en cm.
Durante el desarrollo de Trabajo Práctico se planteará un ejemplo teórico para que los
alumnos realicen los cálculos correspondientes.
- 24 -
ANEXO I: Preparación de inóculo.
Conservación de Microorganismos.
Existen varios métodos para conservar cepas:
• Liofilización
• Conservación a -70ºC o en nitrógeno líquido. Para evitar que las células se destruyan
durante la congelación, el medio de cultivo debe contener un agente crioprotector como
el dimetilsulfóxido (DMSO) al 7% (v/v), o el glicerol al 15%.
• A temperatura ambiente, en forma de cultivo en siembra profunda en tubos
herméticamente cerrados que contienen un medio sólido rico.
• Con refrigeración, en forma de cultivos en tubo inclinado (slant).
Inoculación y subcultivo
Como una gran cantidad de las células de un inóculo obtenido de un cultivo en un tubo
inclinado están muertas, la mayoría de los experimentos comienzan con el inóculo de un
pequeño volumen de un medio de crecimiento y después el crecimiento de estas células
durante la noche, a la mañana, el crecimiento se habrá detenido. Para obtener células en
crecimiento activo para un experimento en particular, se diluye el cultivo de la noche unas
10-100 veces y se vuelve a incubar durante varias horas, hasta que las células vuelven a
encontrarse en crecimiento exponencial. Además, si un cultivo en crecimiento exponencial
se enfría rápidamente por debajo de los 8º (introduciendo el matráz con el cultivo en un
baño de agua fría), se conserva a 4ºC, y después se atempera rápidamente a la
temperatura original a la que el cultivo había estado creciendo, el crecimiento se reanuda
sin fase de latencia.
Técnica aséptica y transferencia de cultivos
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para
mantener la esterilidad de los medios y soluciones, como así también, proteger al operador
de la contaminación con el cultivo. La técnica aséptica significa evitar cualquier contacto
entre el cultivo puro, el medio estéril, y las superficies estériles del recipiente de cultivo,
con microorganismos contaminantes. Para conseguir este objetivo:
1. Se desinfecta el área de trabajo para reducir el número de contaminantes
potenciales.
2. los instrumentos con los que se realiza la transferencia están esterilizados.
3. El trabajo se realiza rápido y eficientemente para minimizar el tiempo de exposición.
- 25 -
4. El trabajo también puede ser realizado en Flujo Laminar o Cabina de Seguridad
Biológica, minimizando los riesgos de contaminación de los inóculos y precultivos
preparados.
Los pasos típicos en la transferencia de un cultivo de un recipiente a otro son los
siguientes:
1. Flamear el ansa de siembra.
2. Abrir y flamear las bocas de los tubos de cultivo
3. Recoger un poco de cultivo crecido y transferirlo al medio fresco.
4. Flamear las bocas de los recipientes de cultivo antes de cerrarlos
5. Volver a flamear el ansa de siembra.
- 26 -
ANEXO II: Determinación de la concentración de gluc osa por método enzimático
Objetivo y fundamento del método.
Se busca determinar la concentración de glucosa en el medio para conocer la
cantidad de fuente de carbono de la que dispone el microorganismo, y luego, determinar la
tasa de consumo de fuente de carbono. Se determina la concentración de glucosa al
sobrenadante de las muestras del cultivo, tomadas a diferentes tiempos (por ejemplo cada
1 hora).
Para ello se utiliza el kit comercial “Glicemia enzimática AA” de Wiener Lab®. Este
método ha sido adaptado para lectura a 490nm en lectora de microplacas.
La técnica se basa en las siguientes reacciones enzimáticas que producen un
compuesto coloreado.
GOD
Glucosa + O2 + H2O Ácido glucónico + H2O2
POD
H2O2 + 4-AF + 4-hidroxibenzoato quiminona roja
Las enzimas provistas en el kit son la glucosa oxidasa (GOD) y la peroxidasa
(POD). Además el reactivo contiene el 4-aminofenazona (4-AF) y el 4-hidroxibenzoato.
Procedimiento.
Curva de calibración.
1. Preparar todas las soluciones estándar a partir de una solución 1 g/l de glucosa de acuerdo a lo indicado en la tabla I.
Nombre Concentración de glucosa
Volumen sl de glucosa
Volumen de agua
Blanco 0 g/L - 20 µl S1 0,125 g/L 50 µl S4 50 µl S2 0,25 g/L 50 µl S3 50 µl S3 0, 50 g/L 50 µl sc estándar 50 µl S4 0,75 g/L 75 µl sc estándar 25 µl S5 1g/L 20 µl sc estándar -
Tabla I: diluciones de la solución estándar para la construcción de la curva de calibración
- 27 -
NOTA: se sugiere preparar estas diluciones directamente en la microplaca, en los wells A12 a H12; ya que el volumen lo permite, no se requieren tubos extras, y además es más fácil pipetear el volumen requerido para la reacción.
Muestra.
1. Alicuotar 0,5- 1 ml del sobrenadante de cada una de las muestra de cultivo obtenida a distintos tiempos en un eppendorf.
2. Centrifugar 2 min a velocidad máxima, en la centrífuga de mesada. 3. Separar nuevamente en el sobrenadante obtenido en un eppendorf correctamente
rotulado. 4. Preparar varias diluciones del sobrenadante de modo de obtener alguna cuya
concentración de glucosa quede dentro del rango de la curva de calibración. A continuación se muestran las proporciones para las diluciones sugeridas.
Dilución Vol. de muestra (µl)
Vol. de H2O (µl)
Volumen final (µl)
1/2 50 50 100 1/5 20 80 100 1/25 20 480 500 1/30 10 290 300 1/40 10 390 400 1/50 10 490 500
Tabla II: posibles diluciones de la muestra
Reacción.
Antes de comenzar, se recomienda alicuotar en un tubo una cantidad de reactivo de Glicemia Enzimática AA (Wiener®) suficiente para todo el ensayo. Para la reacción, procurar que el reactivo esté a temperatura ambiente. 1. Agregar 190 µl del reactivo en cada well. 2. Agregar 10 µl de muestra, muestra diluida, solución estándar o blanco, según
corresponda. Depositar la muestra con la punta de pipeta apoyada sobre una pared del well. NOTA: la reacción comienza en el momento que la muestra se mezcla con el reactivo. Procurar que la reacción comience en todos los wells al mismo tiempo.
3. Una vez que se agregaron todas las muestras, homogeneizar el contenido de todos los wells utilizando la pipeta multicanal, intentando que no se formen burbujas en la superficie.
4. Incubar la placa 5 min en estufa a 37°C. Si tien e tapa, colocársela. 5. Retirar la placa de la estufa y esperar 5 min más (para que se estabilice la
reacción). 6. Determinar la absorbancia a 490 nm en la lectrora de placas Sunrise de TECAN.
Cálculos.
Se realiza una curva de calibración con las diluciones de concentración conocida,
que se hacen a partir de una solución estándar de glucosa. Con los datos obtenidos se
grafica la curva Abs 490 vs. concentración de glucosa. A partir de ésta se obtiene la
ecuación de la recta que mejor ajusta, y luego se interpolan los valores de absorbancia
- 28 -
obtenidos para las muestras. Si la muestra fue diluida, es necesario multiplicar el resultado
por el factor de dilución.
Criterios de Aceptación.
- Para la curva de calibración, el R2 debe ser mayor a 0,98
- El CV% de los duplicados para la curva de calibración y las muestras debe ser
menor al 15%. No se pueden eliminar datos duplicados.
- Si alguno de los duplicados para una determinada muestra quedase fuera del
rango de calibración, descartar los datos, y repetir el ensayo a partir de una dilución más
adecuada.
- El resultado final será el promedio de los valores de concentración de glucosa
obtenidos para todas aquellas diluciones que cumplan. A su vez, el CV% no debe superar
el 15%.
- 29 -
ANEXO III: Determinación de la densidad óptica a 60 0 nm
Procedimiento.
1. Prender el espectofotómetro y esperar 30 min a que se estabilice. 2. Setear la longitud de onda del equipo en 600 nm. 3. Tomar 1 ml de medio de cultivo y colocarlo en la cubeta. 4. Introducir la cubeta en el espectrofotómetro procurando no tocar el lado por el cual
pasa el haz de luz. 5. Establecer esta medición como Blanco. 6. Tomar la muestra y, de ser necesario, diluirla para que la medición sea acorde al
criterio de aceptación de resultados. 7. Introducir la cubeta en el espectrofotómetro y leer la muestra diluida.
NOTA: de haber diluido la muestra, es necesario multiplicar el valor de DO 600 nm por el factor de dilución.
Criterios de Aceptación.
Para que una medición sea aceptable debe entrar en el rango de absorbancia entre
0,200 y 0,800. En caso de encontrarse por encima de dicho rango la muestra debe diluirse
con agua destilada hasta cumplir con este criterio. En caso de encontrarse por debajo
debe realizarse una dilución menor o, en caso de no ser posible, informar el dato obtenido.
- 30 -
ANEXO IV: Recuento de células viables en placa
Objetivo y fundamento del método.
El recuento microbiológico se realiza con el objetivo de determinar el número de
células viables en una muestra del cultivo, de modo de poder seguir el crecimiento
microbiano durante el proceso.
Dado que una célula puede multiplicarse sobre un medio de cultivo semi-solido
hasta formar una única colonia visible llamada Unidad Formadora de Colonia (UFC), el
número de colonias producidas a partir de un determinado volumen de cultivo indicará el
número de células viables en dicho volumen. Sin embargo, el número de colonias
obtenidas dependerá también del medio de cultivo que se utilice para el recuento, de la
habilidad de la cepa para crecer en el medio elegido y demás condiciones experimentales
que involucran incluso a la manipulación de la muestra por el operador.
Para un recuento confiable es necesario disponer de colonias bien diferenciables
una de otra, se comete menos error haciendo recuento de placas cuyo crecimiento se
encuentre entre 30 UFC y 300 UFC. Las contaminaciones en la placa podrían alterar el
correcto conteo e incluso algunos hongos podrían anularlo, por lo que se recomienda
seguir el procedimiento respetando las condiciones de asepsia que se indicarán en el
curso.
Procedimiento.
Se trabajará en condiciones asépticas bajo flujo laminar. Ingresar al flujo todos los
materiales a utilizar antes de comenzar con el plaqueo.
� Muestra de cultivo bacteriano
� Medio Agar-LB con y sin antibióticos (ampicilina [Amp] y Kanamicina [Kn]) en
placas plásticas de petri descartables
� Solución fisiológica estéril
� Tips y tubos tipo eppendorf estériles
� Gradillas
� Vaso de precipitado con alcohol 96%
� Espátula de Drigasky o rastrillo de vidrio estéril
� Mechero
� Recipiente de descarte con lavandina
- 31 -
1. Realizar los cálculos necesarios para obtener en la placa entre 30 y 300 UFC. Considerar que 1 unidad de DO 600 nm equivale a 7x108 bacterias/ml.
2. Una vez obtenidos los cálculos, realizar las diluciones de forma aséptica con solución fisiológica estéril. Preparar para cada muestra dos diluciones.
Tabla de Diluciones:
Dilución Muestra (µl) Sc. Fisiológica (µl)
1/2 500 500
1/3 200 400
1/5 200 800
1/8 100 700
1/10 100 900
1/100 10 990
Tabla 1: proporciones utilizadas para diluir la muestra de cultivo a plaquear según dilución.
3. Sembrar en cada placa 100 µl de la dilución preparada. Se sembrarán ambas diluciones elegidas por triplicado (4 placas por muestra).
4. Dispersar el volumen agregado con la espátula de Drigasky o rastrillo de vidrio previamente esterilizado por flameo con etanol 96%. NOTA: distribuir uniformemente el líquido sobre la superficie del ágar hasta que se haya absorbido toda la humedad y el rastrillo ofrezca cierta resistencia. Al finalizar, volver a sumergir el restrillo en el etanol 96%.
5. Rotular apropiadamente la placa con el nombre de la muestra y la dilución a la que corresponde.
Ejemplo: Se recibe una muestra de OD= 1. Según el factor de conversión, 1 OD= 7X108 Bacterias/ml. Deben realizarse entonces diluciones de modo tal de que 0,1 ml de muestra contengan entre 30 y 300 bacterias. Por lo que se realizan las siguientes diluciones utilizando la tabla 1: La primera serie representa una dilución 1/800.000 de la muestra, de modo que obtendremos un total de 875 bacterias/ml en la última dilución. Sembrando 0,1 ml se esperarían 87 bacterias, valor que se encuentra dentro del rango deseado de 30-300 UFC/Placa. Mientras que la segunda serie representa una dilución 1/400.000, por lo que obtendremos un total de 1750 bacterias/ml en la última dilución, sembrando 0,1 ml se esperarían 175 bacterias, un número apropiado, dentro del rango de 30-300 UFC/Placa.
Diluciones seriadas: 1/100 1/100 1/10 1/8 siembra de 100 ul por triplicado. 1/4 siembra de 100 ul por triplicado.
- 32 -
6. Incubar las placas de forma invertida (con la tapa hacia abajo y el ágar hacia arriba) a 37°C over night, o a temperatura ambiente por 2 d ías.
Cálculos.
Calcular UFC/ml empleando la siguiente fórmula:
UFC/ml = N°Colonias x Factor de dilución
Volumen Sembrado en ml
Donde N°Colonias es la cantidad de colonias detect adas al final de la incubación.
Criterios de aceptación.
Son criterios pre-establecidos con el fin de determinar un margen de error
razonable y así asegurar resultados confiables. La calidad en las determinaciones se logra
estandarizando los procedimientos de modo reducir la variabilidad de los datos.
- La cantidad de UFC por placa debe estar entre 20-500, si esto no se cumpliera, no
reportar el resultado.
- El CV% entre los triplicados de una misma dilución debe ser menor al 25%.
- Si esto no se cumpliera, se podrá eliminar 1 sólo resultado de los triplicados. Si
aún así no se cumple la condición, el dato se considera no válido.
- El resultado final es el promedio de todas las diluciones que cumplan con el
criterio. En caso que sólo una dilución cumpla con el criterio, ésta sola representará el
resultado final.
- 33 -
ANEXO V: Determinación de Masa seca
Objetivo y fundamento del método.
El crecimiento de una población o cultivo celular se encuentra ligado al
incremento de masa del cultivo y al aumento del número de células en un tiempo
determinado, ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que se
encuentren en crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan en
proporción por unidad de tiempo)
La determinación de masa seca, es un método directo para describir el
crecimiento celular que consiste en el secado de los sedimentos de una muestra a 105°C
hasta peso constante. Las medidas del peso seco del sedimento suelen representar el 10-
15% de los valores esperados para un sedimento húmedo. Este indicador “masa seca” es
considerado como una mejor aproximación que la determinación de masa húmeda del
sedimento ya que elimina grandes errores debidos al líquido intercelular retenido. La mayor
complicación que presenta este método, consiste en la determinación de pequeñas
cantidades de variación de peso, por lo que cuanto mayor sea la exactitud de la balanza
que se utilice, más fiable serán los resultados.
En el laboratorio se suelen utilizar dos técnicas para la determinación de la masa
seca: El método tradicional, mediante secado en estufa, o utilizando un analizador de
humedad.
Procedimiento.
Mediante analizador de húmedad: Materiales: Analizador de humedad Sartorius Micropipetas Tubos tipo Corning® de 15 ml Centrifuga Platillos de aluminio
1. Centrifugar 4 ml de muestra en un tubo Corning® de 15 ml a una velocidad de 5.000 rpm durante 10 min. (cada muestra se prepara por simplificado).
2. Descartar el sobrenadante. 3. Resuspender en aproximadamente 2 ml de agua purificada.
NOTA: El volumen de agua adicionado sirve únicamente para poder tomar las células, para pasarlas al platillo. Debido a que mientras menor sea el volumen de agua utilizado menos tiempo llevará el secado, se recomienda resuspender las células con la menor cantidad de agua posible.
4. Colocar un nuevo platillo de aluminio en la balanza y tarar el equipo. 5. Agregar la muestra resuspendida al platillo de aluminio con una micropipeta gota a
gota, buscando abarcar la mayor superficie posible del mismo. 6. Secar utilizando el programa Masa seca 105/105/105°C 1% 300 s. 7. Esperar la señal de finalización de secado (Aproximadamente 15 minutos)
- 34 -
8. Hacer la conversión de volumen para obtener el resultado de masa seca en g/L.
Mediante secado en estufa: Materiales: Estufa de secado Tubos Eppendorf® 1,5 ml. Micropipetas Centrifuga Balanza analítica
1. Rotular cada tubo Eppendorf® con el nombre de la muestra (cada muestra se
prepara por triplicado). 2. Secar a 60°C en estufa la totalidad de tubos a u tilizar con las tapas abiertas durante
aproximadamente 30 minutos. 3. Tapar los tubos dentro de la estufa de secado y colocarlos en el disecador (dejarlos
hasta que alcancen la temperatura ambiente). 4. Pesar cada tubo en balanza analítica y registrar su peso como “Peso inicial”. 5. Dispensar 1,5 ml de muestra en cada tubo. Procurar homogeneizar bien las
muestras antes de tomar la alícuota. 6. Centrifugar durante 7 min a 12.000 rpm. 7. Descartar el sobrenadante, en descartes para residuos de medio de cultivo y
patógenos. 8. Secar los tubos conteniendo los pellets de células -con las tapas abiertas-, a 105°C
Overnight, o hasta peso constante. 9. Tapar los tubos dentro de la estufa de secado, colocarlos en un disecador hasta
alcanzar la temperatura ambiente. 10. Pesar cada tubo en balanza analítica y registrar su peso como “Peso Final”. 11. Calcular la diferencia entre el peso final y el peso inicial para cada tubo. Promediar
los valores obtenidos para los triplicados, y extrapolar el resultado a 1L (El resultado debe expresarse en g/L).
- 35 -
ANEXO VI: Cuantificación de proteínas totales por e l método de Bradford
Objetivo y fundamento del método.
Se utiliza la técnica de Bradford con el objetivo de cuantificar las proteínas totales
en muestras como las de ruptura celular y las de fracciones cromatográficas, entre otras.
Esta técnica se ha convertido en el método preferido para la cuantificación de proteínas ya
que es más simple, rápido y más sensible que el método de Lowry.
El método de Bradford se basa en la unión del colorante Coomassie Blue G250 a
las proteínas. Donde la cantidad de proteína es proporcional a la coloración resultante.
Aunque el colorante libre puede existir en cuatro formas iónicas diferentes (cuyos
valores de pKa son 1,15, 1,82 y 12,4), las tres formas cargadas que predominan en la
solución acidificada del ensayo son las formas catiónicas roja y verde tienen una
absorbancia máxima a 470 nm y 650 nm respectivamente. En contraste, la forma más
aniónica del colorante, la que se una a las proteínas, tiene una absorbancia máxima a 590
nm. Así la cantidad de proteína puede ser estimada si se determina la cantidad de
colorante obtenido en su forma iónica azul. Esto se logra usualmente midiendo la
absorbancia de la solución a 595 nm.
Procedimiento.
Curva de calibración.
1. Preparar la solución de trabajo de BSA (concentración final = 100 µg/mL) haciendo una dilución 1:10 de la solución stock de BSA 1mg/mL. Se recomienda preparar por lo menos 1,5 mL de esta solución de albumina.
2. A partir de la solución de trabajo de BSA (100 µg/mL), preparar directamente en la microplaca las diluciones para la curva de calibración de acuerdo a lo indicado en la Tabla II. Cada punto debe realizarse por triplicado.
Curva de calibración (vol final = 160 µL)
µg/ml de BSA 0 (Blanco)
10 15 20 25 30 35 40
µL de agua Milli Q 160 144 136 128 120 112 104 96
µL de solución de trabajo de BSA 100 µg/mL
0 16 24 32 40 48 56 64
Tabla II: diluciones de la solución de trabajo para construir la curva de calibración
- 36 -
Muestra.
Preparar varias diluciones de la muestra (con agua) de modo de obtener alguna
cuya concentración de proteínas totales quede incluida en el rango de la curva de
calibración.
Realizar estas diluciones en un tubo eppendorf aparte y de cada una, alicuotar 160
µL por pocillo; y a su vez, ensayar cada muestra por triplicado. Otra opción es realizar por
triplicado la dilución final directamente sobre la placa, considerando que el volumen final es
de 160 µL.
Reacción.
1. Agregar 30 µl del Reactivo de Bradford a cada well (a cada punto de la curva de calibración, cada muestra y sus respectivas diluciones) utilizando la micropipeta multicanal.
2. Homogeneizar con la micropipeta multicanal evitando originar burbujas. 3. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. 4. Leer en la lectora de microplacas a una longitud de onda de 595 nm.
Cálculos.
Se realiza una curva de calibración con los datos obtenidos, graficando Abs 595 vs.
concentración de BSA. A partir de ésta, se obtiene la ecuación de la recta que mejor
ajusta, y luego se interpolan los valores de absorbancia obtenidos para las muestras. Si la
muestra fue diluida, será necesario multiplicar dicho resultado por el factor de dilución.
Criterios de aceptación.
- El ensayo se considera válido cuando el coeficiente de variación (C.V. %) de la
regresión de la curva es mayor al 98%.
- El C.V. % de cada punto de la curva patrón debe ser menor o igual a 15%
- Si alguna de estas condiciones no se cumpliera, se podrán eliminar hasta 2
puntos correspondientes a triplicados independientes de la curva.
- El C.V. % de los triplicados de las muestras, debe ser menor o igual a 15%. Si
esto último no se cumpliera, se puede eliminar un punto de las tres lecturas independientes
de las muestras.
- 37 -
ANEXO VI: Electroforesis desnaturalizante en gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
Objetivo y fundamento del método.
El SDS-PAGE es el método que se utiliza para analizar mezclas de proteínas
cuantitativamente y se basa en la separación de proteínas de acuerdo a su tamaño.
Existen varios métodos de electroforesis en geles de poliacrilamida (o PAGE del inglés
Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Entre las diferentes variantes de ésta técnica, la
electroforesis en geles discontinuos de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio o SDS-
PAGE (del inglés de Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
descripta originalmente por Laemmli (1), es el sistema más comúnmente usado. Esta
técnica se utiliza para el análisis de proteínas mediante la separación según su relación
carga/masa dentro de una matriz de acrilamida.
Dado que las proteínas nativas tienen distintas formas, pesos moleculares y cargas,
se utiliza la desnaturalización mediante el tratamiento con agentes reductores (como el β-
mercaptoetanol) y agentes caotrópicos (como el detergente dodecil sulfato de sodio ó
SDS) de modo que las proteínas conserven solamente su estructura primaria y queden con
carga negativa proporcional a su tamaño. Estas proteínas sometidas a un campo eléctrico
se desplazan a una velocidad proporcional a su relación entre carga y masa.
Cuando las proteínas se solubilizan en presencia del detergente aniónico SDS, éste
se une a las proteínas, rompiendo interacciones hidrofóbicas y desnaturalizándolas. Las
proteínas desnaturalizadas de la muestra adoptarán una estructura en forma de bastoncillo
con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena
polipeptídica.
Debido a que la cantidad de SDS que se une a las proteínas es prácticamente
proporcional a su tamaño, los complejos SDS-proteínas presentan un valor carga/masa
constante y por lo tanto se separan de acuerdo a su tamaño cuando migran desde el
cátodo al ánodo a una velocidad relacionada con su peso molecular.
El sistema aquí utilizado es discontinuo, donde la composición del gel concentrador
y el gel separador son heterogéneos. Es decir, se varían el tamaño de poro y el pH de
modo que se producir el apilamiento de la muestra, para lograr una mejor resolución de las
bandas.
- 38 -
Mediante esta técnica se puede determinar el peso molecular de las proteínas de
una muestra, comparando su movilidad relativa en el gel con la de un estándar (una
mezcla de proteínas de peso molecular conocido) o marcador de peso molecular.
En este Trabajo Práctico, se analizarán mediante esta técnica, muestras de cultivo
para verificar la inducción de la expresión de la proteína, muestras de la ruptura celular y
de la purificación mediante FPLC.
Procedimiento.
Armado del cassette de gel
1. Corroborar la limpieza de las placas de vidrio: la placa de vidrio corto (y fino) y la placa de vidrio espaciadora (mas gruesa y con los espaciadores). Repasar los vidrios con etanol 96% y papel.
2. Armar el molde del vidrio ubicando las placas de manera tal que la placa de vidrio espaciadora quede detrás de la placa corta, y en la placa espaciadora se pueda leer la palabra “UP” del lado superior.
3. Colocar el marco de molde hacia arriba con ambas aletas abiertas, es decir, con
ambas aletas en posición perpendicular con respecto al marco. Introducir ambas placas de vidrio.
- 39 -
4. Cerrar ambas aletas, llevándolas simultáneamente hacia afuera. Realizar esta operación sobre una superficie plana, controlando que parte inferior de las placas de vidrio estén niveladas entre sí y con respecto a la base del marco de molde.
5. Colocar el marco de molde con los vidrios ensamblados en el soporte del molde,
asegurándose de que el espacio entre los vidrios quede sellado por la junta gris de la parte inferior del soporte.
6. Llenar los vidrios con agua y controlar de que no se produzca ninguna pérdida por
la junta. Si esto ocurriese, repetir el ensamblado del casette y volver a realizar esta prueba con agua.
7. Vaciar el molde de los vidrios sólo Si NO se observan pérdidas de agua, y secar el espacio entre ambas placas de vidrio con tiras de papel secante (procurar que no queden residuos del papel entre los vidrios).
- 40 -
Preparación de los geles
- Gel separador al 16%:
Las proteínas deben correr primero a través del gel concentrador y luego por el gel
separador, para ello, en primer lugar se prepara (y se coloca entre los vidrios del molde) el
gel separador; y por último el gel concentrador.
1. Preparar la mezcla del gel separador colocando los reactivos de a cuerdo a los
volúmenes y en el orden en que se presentan en la siguiente tabla.
Gel 16%
1 gel 2 geles 4 geles 1) Agua destilada 0,95 mL 1,9 mL 3,8 mL 2) Tris-HCl 1,5M pH 8,8 1,25 mL 2,5 mL 5 mL 3) SDS 10% 50 µL 100 µL 200 µL 4) Acrilamida 30% 2,7 mL 5,4 mL 10,8 mL 5) APS 10% 50 µL 100 µL 200 µl 6) TEMED 3,5 µL 7,0 µL 14,0 µL Volumen final 5 mL 10 mL 20 mL
NOTA: Los geles se forman por la polimerización del monómero de acrilamida en presencia de pequeñas cantidades de bis-acrilamida como cross-linker. Dicha polimerización es un ejemplo de catálisis por radicales libres. Es el TEMED el que cataliza la descomposición del ión persulfato (APS) para dar un radical libre. Por lo tanto, al agregar el TEMED comenzará la reacción de polimerización (reacción exotérmica). A partir de este momento se cuenta con tiempo limitado para el vaciado del gel entre los vidrios.
2. Colocar la mezcla del gel entre los vidrios utilizando una pipeta automática de 5 mL. Considerar que deben quedar 3 cm libres hasta el borde del vidrio corto (que es el espacio necesario para luego colocar el gel concentrador y el peine).
3. Agregar cuidadosamente aproximadamente 1 mL de alcohol isobutílico saturado en agua.
4. Dejar reposando hasta que concluya la reacción de polimerización (verificar la polimerización observando el resto de mezcla que quedó en el tubo).
5. Una vez que terminó la reacción, quitar la solución de alcohol de la parte superior del gel. Lavar con agua una o dos veces. Secar cuidadosamente la parte superior entre los vidrios con papel secante, sin dañar el borde superior del gel.
- Gel concentrador (o stacking):
6. Preparar los peines sobre la parte superior de los geles. 7. Preparar la mezcla del gel concentrador añadiendo los reactivos de a cuerdo a los
volúmenes y en el orden en que se presentan en la siguiente tabla.
- 41 -
Gel concentrador 1 gel 2 geles 4 geles 1) Agua destilada 0,95 mL 1,9 mL 3,8 mL 2) Tris-HCl 0,5M pH 6,8 375 µL 750 µL 1,5 mL 3) SDS 10% 15 µL 30 µL 60 µL 4) Acrilamida 30% 200 µL 400 µL 800 µL 5) APS 10% 17,5 µL 35 µL 70 µl 6) TEMED 3,5 µL 7,0 µL 14,0 µL Volumen final aproximado 1,6 mL 3,1 mL 6,2 mL
NOTA: En este caso la reacción de polimerización es aún más rápida que la que sucede con el gel separador dada la mayor concentración de catalizador, por lo cual se cuenta con menos tiempo para colocar el gel entre los vidrios.
8. Llenar el espacio entre los vidrios hasta el borde. Inmediatamente luego colocar los peines en la posición correcta. Cuidar que no queden burbujas atrapadas, ya que la base de las calles podrían no quedar rectas.
9. Dejar reposando hasta que concluya la reacción de polimerización (verificar la polimerización observando el resto de mezcla que quedó en el tubo).
Montaje de los geles en la cuba
1. Retirar los casettes del soporte del molde, moviendo simultáneamente las dos aletas hacia el centro.
2. Colocar ambos casettes en el montaje de los electrodos, esta vez con el vidrio más corto hacia adentro. Registre la posición de cada gel dentro del montaje de electrodos.
- 42 -
3. Colocar los geles en el cuadro de abrazaderas. Cerrar las abrazaderas presionando con los dedos índices de cada mano el montaje de los electrodos mientras que con los pulgares se cierran las aletas hacia el centro, tal como se observa en el lateral del cuadro de abrazaderas.
4. Colocar los geles y el cuadro de abrazaderas ensamblado en el tanque de corrida.
5. Verter el buffer de corrida en el espacio que queda entre ambos casettes hasta que
desborde, permitiendo que el espacio entre el cuadro de abrazaderas y el tanque se llene hasta aproximadamente 3- 4 cm. desde del fondo del tanque.
6. Dejar reposar el buffer por unos minutos hasta que le nivel del buffer se estabilice entre los vidrios. Si el nivel del buffer no se estabiliza y no se mantiene constante retirar el recuadro de abrazaderas sacar los geles y repetir todos los pasos desde el punto 2.
- 43 -
7. Retirar los peines desde parte superior deslizándolos hacia arriba cuidando de no deformar los pocillos de siembra (wells). Completar el nivel de buffer hasta el borde superior de los vidrios entre los geles.
Preparación y siembra de la muestra
1. Acondicionar cada muestra según la cuantificación de proteínas surgida de la cuantificación de Bradford. Para una correcta visualización con tinción de Coomassie, debe sembrarse una masa de entre 4,5-9 µg de proteína; y el volumen de siembra final debería estar entre 15-20 µl, que es volumen que soporta el well.
2. Crackear las muestras, hirviendo la mezcla de proteínas con buffer muestra a 100° C durante 5 minutos. Pasar a hielo y centrifugar unos segundos de modo de bajar el agua condensada.
3. Colocar la guía para siembra y sembrar dentro de los pocillos. Registrar el orden de siembra para cada calle.
Preparación del equipo e inicio de la corrida
1. Coloque la cubierta del tanque, observando la correspondencia entre los colores de los bornes y los orificios de la cubierta.
2. Conectar los cables, considerando la misma correspondencia observada en el punto anterior.
3. Establecer el voltaje en 100 V e iniciar la corrida (botón “start”). 4. Dejar correr hasta que observar que el frente de corrida salga del gel.
Finalización de la corrida
1. Detener la corrida con el botón de “stop”. 2. Apagar y desconectar la fuente de poder. Retirar la cubierta. 3. Retirar el cuadro de abrazaderas del tanque. 4. Abrir el cuadro de abrazaderas y retirar el montaje de electrodos. 5. Retirar los geles del montaje de electrodos. Mantener identificado cada gel durante
todo el proceso. 6. Eliminar el gel concentrador con la espátula. Identificar el lado de cada gel
(muesca) 7. Lavar el gel con agua de la piseta. Despegarlo cuidadosamente del vidrio con el
chorro de agua y volcarlo en el recipiente para tinición. El gel debe quedar extendido y sin arrugas.
Tinción del gel
1. Llenar el recipiente para tinción con solución de Coomasie coloidal y cerrar el recipiente.
2. Dejar en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas aproximadamente (over night).
3. Enjuagar con abundante agua. Cambiar el agua sucesivas veces hasta que el fondo del gel quede claro.
- 44 -
Registro y análisis de los resultados
El registro del gel obtenido se realiza fotografiándolo o escaneándolo. Al tenerlo en
formato digital se puede realizar su análisis (por ejemplo: densitometría) por medio de
algún software adecuado.
Para analizar el peso molecular de las proteínas de la muestra, debe sembrarse en
el mismo gel una mezcla de proteínas de peso molecular conocido denominada calibrador
o “marcador de peso molecular”.
Para la mayoría de las proteínas un gráfico de log 10 de la masa molecular vs.
movilidad relativa arroja un grafico lineal, aunque se debe ser conciente para una
determinada concentración de gel esta relación es solamente lineal en un rango limitado a
masas moleculares1.
Para determinar el peso molecular de una proteína desconocida es necesario
establecer la relación entre la movilidad relativa (Rf) de las proteínas del estándar de
proteínas. Para ello, se grafica log del peso molecular (PM) vs. Rf donde:
distancia que recorrió la proteína Rf=
distancia recorrida por el frente
Una vez construido el gráfico y establecida la relación entre movilidad y masa,
conociendo el Rf de las proteínas desconocidas puede ser determinado el PM de la
proteína de interés.
Conservación
Dado que gel es muy frágil, y se hace difícil su manipulación, es muy conveniente
secar el gel obtenido. Para ello, luego de enjuagar el gel se lo monta sobre papel secante y
se cubre con papel de celofán. Se seca durante 1 hora a 80°C, en la secadora con vacío.
1 Cabe mencionar que ésta relación se mantiene real para proteínas que unen SDS en una proporción constante. Esto es
así para muchas proteínas pero algunas otras, por ejemplo aquellas altamente básicas, pueden correr diferente a lo
esperado según lo que indica su peso molecular conocido. En el caso de las histonas, las cuales son altamente básicas,
migran mas lentamente de lo esperado, presumiblemente por una reducción total de la carga negativa debido a la alta
proporción de aminoácidos cargados positivamente. Las glicoproteínas también tienden a correr de forma anormal
presumiblemente porque el SDS solo se une a la parte polipeptídica de la molécula.
- 45 -
ANEXO VII: Determinación relativa pureza por Densitometría
Objetivo y fundamento del método.
Se utilizará la densitometría para determinar aproximadamente qué porcentaje
representa una banda determinada en un gel de poliacrilamida, respecto del resto de las
bandas detectadas en una misma calle. Esto permite comparar la abundancia de una
determinada proteína en las diferentes calles que tengan sembradas la misma masa de
proteína total por calle. Es útil por ejemplo, para determinar la eficiencia en la recuperación
de proteína luego de los procesos de purificación.
El método se basa en la cuantificación relativa de la señal (en este caso, el ancho
de la banda) mediante un software de análisis de imágenes.
Procedimiento
En primer lugar es necesario obtener una imagen del gel de la mayor calidad
posible. Esto se puede realizar con un fotodocumentador para geles, o bien, un scanner o
cámara digital convencional con la mayor resolución posible. Además se requiere contar
algún software adecuado para realizar el análisis de imágenes (e.g.: Image J, Doc-ItLS,
Image Lab, Scion Image, LabScan).
A continuación se describe particularmente el procedimiento para utilizar el
programa de análisis de imágenes Doc-ItLS.
1. Abrir el programa Doc-ItLS y seleccionar la imagen a analizar, arrastrándola hacia la pantalla principal. NOTA: En la imagen a analizar NO deben verse bordes en blanco, que no pertenezcan al gel. Puede que sea necesario editar la imagen original recortando cualquier superficie de la imagen que no corresponda al gel, usando con cualquier programa editor de imágenes, como el Microsoft Office Picture Manager o similares. El formato aceptado depende del programa a utilizar, generalmente los formatos aceptados son (JPEG, TIFF, GIF, PNG, TGA y BMP). En este caso se utiliza formato JPEG.
2. Hacer click en “Analisys” en la barra de tareas, “1D análisis/ Lane Tools/ Add Lane”. 3. Hacer click en “OK”, en la ventana emergente seleccionando la opción “Create
grayscale image using all chanels”. 4. Seleccionar, haciendo clic, todas las calles de la imagen blanco y negro generada
en el punto 3. 5. Click en “1D análisis/ Masters Tool/ find Lanes and bands”. Se abrirá una ventana
(ver Figura 1).
- 46 -
Figura 1: Imagen que muestra las opciones que aparecen en el programa Doc-ItLS como opción para análisis de imágenes de geles 1D.
En un análisis de rutina, es importante que los parámetros de análisis de imágenes se mantengan invariables para evitar incluir errores de apreciación del operario en la edición de imágenes.
Los parámetros a utilizar en la rutina, figuran en la Figura 1. Estos son: • Search mode: “Bands Only”. • Search options: “Constant lanes witdth across all lanes” y “Force all lanes
straight”. • Search parameters: “Image Background White” y “Bands sensitivity 98.000”. • Background correction 255.
6. Hacer click en “Ok”. 7. Editar las bandas seleccionando “1D análisis/ Master Tools/ edit Object”. Eliminar
las bandas autodetectadas que no correspondan haciendo click sobre las mismas, y luego presionar la tecla “Supr”. Achicar las bandas que el programa extienda excesivamente, seleccionando el borde inferior de cada banda y arrastrándolo hasta el tamaño correcto (ver Figura 2).
- 47 -
Figura 2: Se muestra una banda seleccionada utilizando la herramienta “Edit objects”.
8. Una vez finalizada la edición de bandas, hacer click en “Analisys/ 1D análisis/ Masters Tools/ data explore”.
9. Clickear en “To Excel”. Y guardar el archivo en el disco rígido de la computadora. Por default, el programa proporciona todos los datos detectados en el archivo.
10. Una vez abierto el archivo de Excel para visualizar los datos, realizar click sobre el número “4” ubicado cerca del borde superior izquierdo del archivo como lo muestra la Figura 3. Una vez realizado esto los datos se desplegarán.
- 48 -
Figura 3: Muestra el archivo Excel arrojado por el programa. Un círculo rojo muestra la opción 4 para desplegar todos los datos del archivo.
11. Sobre los datos I-VOL obtenidos determinar el porcentaje correspondiente a cada banda sobre el total de las bandas en la calle. Para ello: sumar el I-VOLtotal por calle (equivalente al 100%), dividir el I-VOL de cada banda por el I-VOL total y multiplicarlo por 100.
I-VOLbanda (%)= (I-VOLbanda / I-Voltotal) x 100
El resultado se expresa como porcentaje.
- 49 -
CEBI 2014 Trabajo Práctico Area de Purificación
TABLA 1
Equipo Medio Pureza Eficiencia Recuperacion DBC
% % % mg/ml
- 50 -
PLANILLA 1
Fecha: Equipo:
Cromatografia:
Referencia Dato Fuente Resultado Unidad
(1) Proteinas Totales Muestra CONTROL CALIDAD (Bradford) mg/ml
(2) Pureza Muestra CONTROL CALIDAD (SDS-PAGE) %
(3) Volumen Siembra Medido ml
(4) PUREZA PICO GFP CONTROL CALIDAD (SDS-PAGE) %
(5) EFICIENCIA ( (4) / (2) ) x 100 %
(6) Proteinas Totales Pico GFP CONTROL CALIDAD (Bradford) mg/ml
(7) Volumen Pico GFP Medido ml
(8) Masa GFP Recuperada (6) x (7) x (4) mg
(9) Masa GFP Sembrada (1) x (3) x (2) mg
(10) RECUPERACION ( (8) / (9) ) x 100 %
(11) Màximo Pegado de Proteinas (12) x (13) mg
(12) Proteinas Totales Pico Eluido CONTROL CALIDAD (Bradford) mg/ml
(13) Volumen Pico Eluido Medido ml
(14) Volumen Lecho Empacado Medido ml
(15) DBC (CAPACIDAD DINAMICA) (11)/ (14) mg/ml
- 51 -
Referencias Bibliográficas
- Becker JM, Caldwell GA, Zachgo EA. (1999). Biotecnología. Curso de Practicas de
Laboratorio. Ed Acribia, Zaragoza, España.
- Guía de Trabajos Práctico, Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología. (2006).
Disponible desde: http://www.ffyb.uba.ar/micro_ind/biot1/tps/gtp2007.doc
- Manual de operación del sistema Millipore. (2009). Pellicon Laboratory.
- Najafpour, Ghasem D. (2007). Biochemical engineering and biotechnology. 1st. ed.
Elsevier, Ámsterdam.
- Raja Ghosh. (2006). Principles of Bioseparations Engineering. World Scientific, New
Jersey .
- “Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing. Principles and Methods”.
Amersham Bio-Sciences. 2004.
- “Recombinant Protein Purification Handbook. Principles and Methods”. GE Healthcare
Bio-Sciences. 2009.