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RELAC ION ENTRE LA ESTABILIDAD TERMODINAMICA Y LA ESTRUCTURA DE LOS DOMINIOS DE LA PAPAINA
T e s i s que presenta
ANDRES <HERNANDEZ ARANA
P a r a l a obtenciBn del grado d e D o c t o r en C i e n c i a s
Junio de 1988.
D I V I S I O N D E C I E N C I A S B A S I C A S E I N G E N I E R I A
U N I V E R S I D A D A U T O N O M A M E T R O P O L I T A N A - I Z T A P A L A P A
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V LFI ESTRUCTURA DE LOS DOMINICIS DE LFI
PGIPAINFI
ANDRES HERHFINDEZ FIRQNA
JUNIO DE 1988
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E s t a t e s i s se r e a l i z i j bajo l a a s e s o r í a de los d o c t o r e s
A n t a n i o Carnpero Celis, del Clepartamentu de R u í m i c a de la U n i -
u e r s i d a d F4utcinoma Metropolitana-Iztapalapa, y Manuel Sor iano
G a r c i a , d e l I n s t i t u t o d e Quimica d e la Universidad Nacional
Flutljnama de l1éxico
i I I
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CAPITULO 1
IHTRODUCCION
1.1 El fenómeno de plegamiento de las proteínas
1.2 Características estructurales de la papaina
1.3 Contribución de esta tesis
PARTE EKPERXMENTAL
2.1 Materiales 10
2.2 Hidrdlisis de la papaina can enzimas proteolíticas 11
2.3 Desnaturalizacibn tdrmica de la papaína 12
CCIPITULO 3
RESULTADOS
3.1 Hidrblisis de la papaína por enzimas proteolíticas 17
3.2 Desnaturalizaci6n térmica de la papaína 19
3.3 Parbmetros termodin6micos de las transiciones
N - I e I - D 39
3.4 C5lculo de la estabilidad termodinhmica de l o s
I
I
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darninios de la papaina en basa a las característl-
cas estructuraLes de esta p r o t e i n @
3 .5 Transícibn t6rmica de la papafna en meZClaS3
agua-etanol 56
64
69
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el estado aleatorio o desplegado. Les fnteracciones o "fuerza&*
no-coualentos que contribuyen 155 e s t . a b i l i d a d de la e s t r u c t u r a
n a t i v a son [5?]1r los puentes de hidrbgana; al .fen6rnena, c o n ~ c i t ~ o
cama sfect;o hidrof 'bbica ; las interaccianes electrostLtfcesi l e s
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3
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1,
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1.2 Carac te r í s tSoas e s t r u c t u r a l e s de la tjapeíne.
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I
1 i 1 i
i
/
Figura 1.1. Diagrama esquematic0 de la estructura de la papaina ( tomado de la referencia [303 1 . Los cilindros y las flechas re- presentan hdlices y hojas B . respectivamente. La parte sombreada corresponde al segundo dominio de la molbula. Las estrellas señalan las posiciones de l o s residuos de cisteina e histidina que forman el sitio catalítico.
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1 . 3 Cantribwci.61~ de e s t a tesis.
. 1
J
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h i d r o x i m e t . l J - p r n p a n u - l , 3 - d . i u l ) O . 1 M, p H 8. O. En e l caso ds la
peps ina SE? us& un r e g u l a d o r rJe g l i c l n a O . 1 M , pH 2.6. En ambas
. 1"- I"" "
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12
.
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"C . Los espectros a s i obt.et7.idus son expresados corn~o absorc ión
mo3.ar diferencial, A € , en u n i d a d e s M-1 cm-1.
14
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1 6
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RESULTGDQS
3 . 1 Hidr6lisj.s; de la papaina por enzimss protealf t icas .
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1 - t
E s:
1
I I I I I 3 7 11
F i g u r a 3 . 1 . E l u c i d n d e los productos de h i d r d l i s i s d e 14 papaína en la columna TSK-POOG SW. Los cromatogramas corresponden, en orden descendente , a temperaturas de reacc ic in de 30, 40 y 50 " C ; Las flechas seiialan el voIumen de e l u c i d n de l a p a p a i n a i n t a c t a .
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d i f a r en t . e s . E n la zana d e l UU-- lE jano (198-250 nrn) los cambios
espcctrales que se observan W n debidas fundsmenta lments 8
rfiudif'icacianes en el e n t o r n o asim6trico d e r e s i d u o s aromáticas
[ t r l p t o f a r r c ~ y t i r o s i n a p r l n c i p a I m o n t 8 ) que ocu r ren al cambiar la
t.ernporatura [ 44., 45 1.
Las CIJ.T'U~S de t r a n s i c i 6 n soguldas por el cambio de
s l i p ' t i c i c l a d a 2UB y 220 nm se presentar t en la figur-,a 3 . 3 . Ambas
cur-vas s o n c l a r a m e n t e b i f 6 s i c a s , a s t u e s , muestran una meseta a
t .a tnpara t .u ras in te rmed ias . Este hecho i n d i c a que e x i s t a un es tada
i n t . r ; rmec l iu r io (I) un el proceso d e d s s d u b l a m f e t i t a de La moldcula,
ademcjs de .Las estados n a t i v o { N ) y desdoblado (D) , E l
i n t . e r m o d i a r i o es pues una especie con estructura secundar ia
sstab.le? clentro de los 40 8 los 48 * C . Err experimentos de
.
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1 I
X
* c p
- -8 Y
. I
I I
I 200 220 240
I I I I I I
260 280 300
Longitud de onda ( nm )
Figura 3.2. Espectros de dicroismo circular de la Papaína a tres temperaturas diferentes: 16 - ) , 45 \
1 .... 1 y 7 0 .C t ""
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1 I \
" 5
-7
-F
1 I I I I I 1 I
o o
U
I I 1 I 1 I I I 20 40 60 a0
Temperatura
Figura 3.3. Desnaturalizacidn termica de la papaína qewida por dicroísmo circular a 220 ( 'circulos 1 y 206 nm ( cuadros J . Los resultados de la renaturalizacl6n se muestran con símbolos vacíos
.
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que l a t r a n s i c i . 6 n d a U 8 1 e r a comp1etanlcnt.e r e v e r s i b l e , m i e n t r a s
. una uelcccidacl de en.friam.ier1t.o de 3prQxirnadament.e 2 "C/hora. En
e6.t .a~ cI;odiciones alredoclor de un 60 X de los cambl.os en
e l i p t i c j . d a d observados sl aurner-Itar la temperatura , f u.et-ocln
r e u e r l l d o s al e n f r i a r 13 s o l u c i ó n de p r o t e í n a .
Runque S@ sabe qw. l a p a p a í n a e s i n a c t i v a en v a l o r e s de pH
i n T erior-ss 8 3 , decidirnos i n v e s t i g a r si l a i r r e v e r s i b i l i d a d
paPCfi3.l. e r ~ 3.3 t r a n s i c i h n tiarmica pudiera s e r Uebida a c i e r t a
aut61 . is . i s I producto d e una poqueiíe a c t i v i d a d r e s i d u a l a pH 2 . 6 0 .
Para e s t o SE? u s 6 una rnuestra de papaína can el grupo ti01 d e l
s i t . i a a c t i v o bloqUeadQ can Indoacelamida. tos p e r f i l e s de
desdobl.aml.etl2;o LQrrnico do ostc clt-tr'iuado fueron mug s i m l . l a r e s a
l o s d e l a proto ína n a t i v a ; en e s t o s e s t u d i a s l a t r a n s i c i ó n de N a
T f u e tarnbi8n reversible sala parc.la1ment.e. Estos resul t .ados
desCat7tan definit ivamnnte que l a a u t t t l i s i s sea l a c a u s a de la
reversibll idad obsercJada; es rnuy p o s i b l e que al or igen d e este
61.Lima ferrijrneno SE enCus'ntPe en Irj formsci6n de agregados
moleculares, en competencia cot"^ el proceso be r e n a t u r a l l z a c i h n ,
ta l . corno sucede en los c a s o s de a lgunas o t l -as prote ínas [ 4 S ] , o
alglin o t r o Fenómeno n u d e s c r i t o en l a l i t e r a t u r a .
La dependencia con l a 'Lernperatura de l a sef ia1,de DC en la
zona de absoro16n arat'ftbt.icB se muestra en l a ffgura 3 . 4 . Es
22
I
.
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8 A
A
- 1 I I I I I I
10 3 0 5 0 7 0
Temperatura ( OC )
Figura 3.4. Dependencia de la temperatura de la geilal de dicroísmo Circular a 270 (círculos), 278 (cuadros, y 287 nm itrihgulosl
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1 1
/
1.0 -
0.8 - 0.6 -
LL
0.4 -
0.2 -
0 -
1 1 I I I I I I I 20 40 60 8C
Temperatura PC)
Figura 3.5. Desnaturalizacidn térmica de la papaína seguida por dicroísmo circular a 220 (círculosi y 27b nm (cuadros), Y por absorcibn diferencial a 280 nxn ctriAngulos). En la8 ordenadas, F representa la fracci6n del cambio mbximo observado.
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I I 1 I I
3
I I I I I 260 280 300
Longitud de onda ( nm 1
Figura 3.6. Espectros de absorción diferencial de la papains a 25 (curva l i , 42 (curva 2 j y 75 O C (curva 3 , .
.
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e s t r u c t u r a l i m p n r t a n t e sobre la tno lkcula , pud i6ndase atribuir la
ausonc ia de act . iuidad an rneclio & c i d 0 a cambias ds p r o t o n a c i h n an I
2 '7
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Temperatura
Figura 3.7. Actividad residual de la papaína en función de la temperatura. Con cuadros se indica la fracci6n de actividad rema- nente. Los círculos corresponden a los cambios de elipticidad a 220 nm, como se indica en la figura 3.5.
1
.
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c o c i e n t e [ GI usando .Los d a t o s experimentales de l a papeína y de
1s hsrnaglobina desnatura l izada ; Is uarIac i6n de 4 con l a
t.amperat,ura so tnuestra en la f i g u r a 3 .9 , Fuode obseruar-se que a
temperaturas elevadas, en las cuales predomina la .forma
d e s c l u b l a d a de l a papailia, los v a l o r e s de Q son de c u a t r o a c i n c o
I '
.
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o O o
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gearnetria deJ. s i t i o activo.
rluchn 8 8 ha c j f scu t ido sobrs si el e s t a d o de una prateina
apoyan la idea de que las fopmas d e s n a t u r a l i z a d a s pur aumento de
13 ternper*atl.+wa u de la concentraci6n de g u a n i d i n e son mug
semejant.es, Ut-la postut7a opuesta ha sido a d o p t a d a por o t r a s
a u t o r e s I qui4r-tes Racen r e s a l t a r las d i f e renc ia s e s p e c t r o s c d p i c a s
entro Las dos tipos de e s t a d a d e s d o b l a d a [26,55] . E n p a r t i c u l a r ,
8 8 ha menc.iunadct que l a eliptlcldad a l r e d e d o r de l o s 220 nm t.isnc ,
32
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1 3 .. .
una magnl t .ud c o n s i d e r a b l s en el es tado f i n a l t&rmica, mi,enZ.rsQ
casos. La p o s i b i l i d a d de que t a l cosa acurr7a clerrtra de un grupo
dn p r - o t e i n a s con es t ruc tu . ras t ,ridfrnensianales muy d i s t i n t a s en t re
si p a r + e c @ r í a ser bastaante remuta . Una expl icación a . l . t .arnet iua
que e x l s t e en altas concsnt.rac.ionas de yuanidlna 15,551. E s t a
menor expansi6n trle l u ga r a una d i s t a n c i a menor y , t a l v e z , a cm8
~ é I $ j C J r " c o r r e l a c i ó n espacíal entra las grupos de amida d e l pol lpBp-
33
. "
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espectr-as de bass r e p o r t a d o s par Hennessey y Johnson f42 J. Na se
34
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35
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Tabla 3.1-
CONTENIDOS PORCENTUALES DE ESTRUCTURAS SECUNDARIAS EN LOS ESTADOS NATIVO E INTERMEDIARIO DE LA PAPAINA.
ESTADO HELICES HOJA B HOJA B ANTIPARALELA PARALELA GIROS IRREGULARES TOTAL
NATIVO 24 17 1 20 47 109 I INTERMEDIARIO 19
NATIVO* 28
DOMINIO 1* 37
DOMINIO 2* 19
26
14
O
29
06
O
O
O
22
20
20
20
44 117
41 100
43 100
32 100
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37
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38
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3 . 3 Par6rnetros termadin6rnicos de las transiciones N ."*X ~9
1. -0.
( 3.1 )
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Tabla 3.2
PARAMETROS TERMODINAMICOS PARA LA DESNATURALIZACION DE LOS DOMINIOS DE LA PAPAINA
Dominio A H m ASm m AG* T* AG (25OC1 (Kcal mol-') (cal mol-' ' K - l ) (OC) (Kcal mol-') (OC) (Kcal mol ')
1 1 + 5 7 . 2 + 1 8 9 30 . O + 3 . 5 + 0 . 8
2 + 7 1 . 5 + 2 1 8 5 4 . 7 + 5 . 1 10 + 4 . 5
E l s u b f n d i c e " m " i n d i c a q u e e l p a r á m e t r o s e e v a l u ó a l a t e m p e r a t u r a a l a c u a l l a c o n s t a n t e d e e q u i l i b r i o e s i g u a l a l a u n i d a d .
. .
AG* y T* c o r r e s p o n d e n a l a s c o n d i c i o n e s d e . m á x i m a e s t a b i l i d a d .
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I
sl misr'riu pH. P o r o t r a par-t..e, s í las ent.slpias específicas de las
43
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6
4
2
O
- 2
- 4
I I I I I I I
-1 o O 10 20 30 40 s o
Temperatura ( 'C 1
Figura 3.11. Estabilidad térmica de los dominios 1 (curva 1 ) y 2 (curva 2) de la papaína. La ordenada representa el cambio de energía libre que acompaila a l desdoblamiento de cada un,a de estas partes de la proteína.
,
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Tabla 3 . 3
PUENTES DEI HIDROGENO EN LOS DOMINIOS
DE LA PAPAINA*
T i p o de enlace Dominio 1 Dominio 2 ~ -~ -
Entre dtomos del esqueleto .ipeptSdico :
Entre cadenas laterales otras cadenas laterales &tomos del esqueleto:
TOTAL
30 4 9
Y O
28
71 -
10 27 4
23
64 -
* .REFERENCIA [ 6 4 ]
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Tabla 3.4
CADENAS LATERALES QUE CONTRIBUYEN AL EFECTO HIDROFOBICO"
Residuo Dominio 1 Dominio 2
TrP
Tir
Fen
Val
Ile
Len
Pro
Treo
Ala 2
*Con (S) se indican residuos "semiocultos", de acuerdo al drea superficial accesible de los mismos [ 6 4 ] .
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49
I
.
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Tabla 3.5
A G ~ (SOLVENTE ORGANICO + AGUA) PARA LAS CADENAS LATERALES DE AMINOACIDOS HIDROFOBOS.
Los valores se expresan en Kcal mol-'.
A.A. Brandts.' Tanford. Promedio
TrP Fen Tir Pro Leu Ile Val Ala Treo
+ 2.5 + 2.5 + 2.5 + 2.5 + 2.5 + 2.5 + 1.5 + 0.6
O
f 3.4 + 2.5 + 2.3 "
+ 1.8 "
+ 1.5 + 0.5 4- 0.4
-
2.95 2.5 2.4 2.5 2.15 2.15* 1.5 0.55 0.2
'Referencia [ 121
2Referencia [ 671
. " . . ."
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y pot-. Jrs t.ar"t.c),
52
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Tabla 3.6
FACTORES QUE DETERMINAN LA ESTABILIDAD DE LOS - DOMINIOS DE LA PAPAINA, A 25OC
AGH (Kcal moi”)
A G ~ (Kcal mol-’ )
- TAS AGD (Kcal mol-’ ) (Kcal mol- ’ )
Dominio 1 + 88.8 - 133.9 - 3
Dominio 2 + 80.0 + 55.1 - 131.4 + 3.7
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300
200
loa
200
100
" ..l_".
300
200
100
I I 1 60 120 180
60 120 180 nh
1 O 0 'C
r = 0.941
I I 1 60 120 180
80 'C
I I I 60 120 180
Figura 3.12. Relación entre el cambio de entalpía molar de desnaturalizaci6n. H. y el número de enlaces de hidrbgeno. nh, Para ocho proteínas diferentes.
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n a, Y
I I I I I I I
200 220 24 O
Longitud de onda ( nm
Figura 3.14. Espectros de dicroísmo circular de la papaina, en presencia de etanol al 5 X , a tres temperaturas diferentes: 10 t - I , 45 ( * - = * 1 y 72 OC ( ---- 1 .
g
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X
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10 30 50 70 Temperatura ( *C
Figura 3 . 1 5 . Transiciein tkmica de l a papaina, e n etanol al 5 X, seguida por cambios de elipticidad a 220 (círculos) y 208 nm (cuadros).
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-7
-9
-1 1
I I I I I I I 20 40 60
Temperatura ( OC 1
Figura 3.16. Desnaturalizacidn tehrnica de la papaina, en etanol al 20 %, seguida por cambios de elipticidad a 220 (círculos) y 208 nm (cuadros).
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d e pt-'otf; '1 '. ria.
E l análisis du 13 e s t r u c t u r a aecutidaria en e l estado
in termediar io muetr6 que é s t e 8s mug similar al s e g u n d o dominio
de la tno.I.ti!cn.l.a, Es tos r'asu,lt.edus nos permiten pos t .u la r que en e.1
mecanisrno ds desnatwural izaciSn 13 primera etapa i . n v a l u c r a
pr.incipa:lmente EJ.. desdoblamiento del p r i r n e r dominio . Exis te
c i e r t a s u i d e n c i a p r e v i a y aunque Indirecta , en f a v o r de esta
r-edtlccf6t-1 s e l e c t i v a de uno d e l o s tares e n l a c e s d i s u l f u r u de lo
papair la ; estos a u t o r a s encontraron que en p r e s e n c i a de urea 6 M 9
a 37 OC, e l e n l a c e d i s u l f u r c r entre l o s r e s i d u o s de c i s t e i n a
E n condic iones rn&s f u.ertsmente desnaLural izantes (guanidina 6 M)
Ius t r e s dfsulfuras de l a p r o t e í n a sun reducidas completamente.
E s t o :Lnclica que una par-te d e 1 dominio 1 e s la m&s inestable
f're,nte a la d e s n a t u r a l i z a c i d n inducida por s o l u t w o r g j n i c o s ,
Supclniandcs que 10s fenrjmenoa de desdoblamiento de los domi-
n i o s son prmucesos independientes , lo c u a l p a r e c e s e r u e l i d a a l
rnenos cama una aproximaci6t-1, ca1Gulamos los parkmetros termodi-
n6rnicns cor-respondientes a e ~ o s procesos (Tab la 3.2). L a validez
de este C á l c u l a parece ser aualada p a r la suma d e entalp ías ob-
t .enida (h28.7 Kcal mol-i), que e s cercana al u a l a r de 1 2 2 . 6 Kca l
mo.l.-~ c?et.errninado ca lur im6tr i camenla [ 31 3, L a e s t a b i l i d a d
tetvnudinSmica de ambos clorninios e s mug similar a ,20 OC; los
v a l o r e s de A G O dif ieren en t re s í únicarnente unas 4 Kcal ma1-L
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s iendo rrlayor e s t e parSmetra pars el dominfo 2,
Ya que l a est . rucLura m o l e c u l a r de la papaína es conocida, an
este t r abaJo Lrat.amns de determlnarS que t . i p o de i n t e r a c c i o n e s
dan l u g a r a las d i f e r t e n c i a s de e s t a b i l i d a d ent.re las dos mita-
des de la proteirla, Considerando quo l a s Fuerzas m6s i m p a r t a n t e s
que cont r ibuyen a la e s t a b i l i d a d de une p r o t e í n a s o n 10s en laces
de h id r6gena y el e f e c t o h i d r o f & b f e o , calcularnos A Q B p a r a l o s
dos dominios. Fara est.@ f i n usamos va lo res p romedio de las enSr-
gias deJ.. en lace de h idr6yer io y de AG pa" la t r a n s f e r e n c i a de
gr-LqI)@s hldrc5f'obos h a c i a 1 . m medio ~ C U O S ~ J . A pesar de las muchas
limitacianes fnvulucr 'adas 8t-1 e s t e c S l c u l u , los r e s u l t a d o s (Ta-
b l a 3.6) son a len tadores ya que p r e d i c e n una rnaljor e s t a b i l i d a d
del domin io 2 que del dorrtinfo 1, d e l orden de 7 Kcal mol-&; an
comparacibn con 13s 4 Kcax mol-1 sncantradas exper i tnentalmente,
el r7esultado parece bastante s a t i s f a c t o r i a . En consecuene&a, la
magrlit.Ctd de los f a c t a r e s qua determinan la estabi l idad de l o s
dotnlnias, segGn 1s Tabla 3.6, i n d i c a que el efecto hidrofóblco
j u e g a un papel muy imLtat-tan%e en la mayor e s t a b i l l d a d de .la se-
guncja p a r t e d e la molkcu la . E n relacidn con e s t e punto, se
observJ que el o t a n o l t i e n e ut-I e f e c t o rnug i m p o r t a n t e sobre l a
n a t u r a l e z a de l a t r a n s i c i b n tQrmlca de l a papaina; sin embargo,
la informacit5t-t e x i s t e n t e r e s p e c t o a la i n f l u e n c i a de 3.08
a l c o h o l e s s o b r e la a s t a b i l l d a d de las p r o t e i n a s es t a n escasa qua
no p e r m i t e una int .erpretaci6n c u a n t i t a t i v a de los result.ados.
L l e n d o más l e j o s t .odauia , sería importanle d i l y c i d a r s i la
d1ferent.e e s t s b f l i d a d de 10s dom$nios de ia p a p a i n a t i e n e alguna
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i m p l . i c s c i 6 n en la f ' t tnci t jn b i o l h g i c a o en el proceso d e
pl.agamient,o JJ. U.UQ de la prute ina. Runque en e3t.e punto
E n pt".i.rr\ep .I.tAgar, sa I-13 s u g e r i d o que la estabi . l idad marginal
de l a s p r o t e í n a s g l o b u l a r e s t . iene un8 gran i m p o r t a n c i a para el
desempei'io F3.ficient.e de la a c t . . i u i d a d biol6giea, ya que p e r m i t e
f l u c t u a c i o r l e s e s t r u c t u r a l e s en es tas macromol4culas [ 3,63; estas
procesos dindrnicas san necssarios para que, par ejemplo, una
c a - L a l i t I c a sobre e l mismo. En el ~ 8 9 ~ 3 de 13 papaína 8e sebe que
arnhas do r r t i n ins con t r i buyen tan to a la a c t i u i d a d c a t a l f t i c a como a
la unirjrt d e l . s u s t r a t o fe7]; p o r lo t a n t o , podría pensarse que
para 3.3 act. í .uidad anzimátice son n18s importantes l a s
~ l . L ~ ~ ~ . l - ~ ~ ~ ~ : i ~ t - l ~ s l o c a l e s en la i n t e r f a s e de los dorninias que la
e s t a b i l i d a d de da tos corno un todw.
P o r ot.ra l a d o , el praceso de p legamiento o dablado de una
prote ína pr-obablemente SB i n i c i a desde el momento mismo d e ' la
b i o s í n t e s i s , es d e c i r r desde que un fragmento de la cadena
p o l i p & p t j . d i c a n a c i e n t e adquiet's el tamaiio necesario para
e s t e b i l i z a r s e a t r a v e s de las i n t e r a c c i o n e s ya mencionadas
a n t e r l o r m e n t e . En otras palabras, e s t e p r a c e s o se i n i c i a por el
extremo arnina t.erm9nal de la cadona. E n una p r o t e í n a como la
papaina, -formada por dos domlnias, el prSmero de eLlr)s i n i c i a ,
cluiz6, el doblado 8n farrna i n d e p e n d i e n t e p a r a a d q u i r i r una
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estruct.ura cjlnhLLlat- t i p i c a ; despuds del plegamianto d e l segundo
dominio el procesa debe continuar~ con un Pearreglo f i n a l que
Inwolucr--e in t .e racc iones e n t r e ambas p a r t e s de la molécula. En la
p a p a i n 3 los primet-*cIs nueue m i n o á c i d o s a p a r t i r del e x t r e r n ~ amino
tarminal forman p a r t e del s i s t e m a d e h o j a p a n t i p a r a l e l a del
seyur'ldu dorninio ( , f i g u r a 1.1 1 ; BS probabls en tonces que estos
nu.ev@ r e s i d u o s sufran un rearreg lo cons ide rab le d u r a n t e La etapa
F i n a l ds a j u s t e int.er-dominia, r e a r r e g l o que s e r i a facilitado pur
la ~scasa e s t a h i l i d a d e s t r u c t u r a l del primer dominio molecu la r .
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