galactosemia química biológica patológica dra. silvia varas [email protected] tema:9...
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TEMA 9: Galactosemia. Manifestaciones clínicas.
Metabolismo de la galactosa en la galactosemia. Defectos enzimáticos. Metabolito tóxico. Diagnóstico. Prevención. Detección de portadores.
Fructosuria. Metabolismo de la fructosa. Fructosuria esencial. Intolerancia hereditaria a la fructosa. Cuadro clínico. Mecanismo bioquímico. Diagnóstico.
Origen de Galactosa
Leche Ligada con enlaces tipo en ciertas
legumbres, verduras y frutas. En forma de galactocerebrósidos y
gangliósidos en algunas vísceras de animales
Absorción de Gal SGLT1 GLUT 2 GLUT 5 Familia
SGLT
Sodium-dependent glucose cotransporters,
symporter
GLUCEMIA SANGRE
Glucosa-6-Fosfatasa
Via de las Pentosas D-Ribosa-5-P +NADPH + CO2
Glucosa-6- Deshidrogenasa
Via Glicolitica Piruvato Acetil CoACiclo Krebs CO2+ H2O
80% Vía Glitica 20% Gp y Gl
(1906–1987), Premio Nóbel, 1970
“por su descubrimiento de los nucleótidos de azúcar y su rol en la biosíntesis de carbohidratos”
Papel de los UDP-azucares:
en los mamíferos, la mayoría de los grupos glucosilos son donados
por UDP-azúcares
Metabolismo Normal Galactosa: Vía Leloir
galactitol
Desarrollo de cataratas
Aldosa Reductasa (AR)
galactonato
Vía de las Pentosas
Galactosa
Deshidrogenasa (GDH)
UDP-GalDieta -D-galactosa Gal-1-P
Glu-1-P
UDP-Glu
Vía Glicolítica
GALK GALT
GALE
ATP ADP
UGP (Pirofosforilasa)
(3)
(4)
UTP
PPi
UGP (Pirofosforilasa)
+ UTP
(1)
(2)
IMPasa
Acido D-Galactónico Acido -ceto-D-Galactónico D-Xilulosa D-Xilulosa Fosfato Via de las Pentosas Fosfato CO2
VIAS ALTERNATIVAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA
Reducción a galactitol Oxidación a galactonato La “vía de la pirofosforilasa” y bypass a GALT
UDP-GalDieta -D-galactosa
Glu-1-P
UDP-Glu
Vía Glicolítica
GALK GALT
GALE
ATP ADP
Producción Endógena de Galactosa
Gal-1-P
UGP (UTP-glucosa/galactosa Pirofosforilasa)
(1)
(2)
(3)
IMPasa
UTP +
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DESORDENES HEREDITARIOS DEL METABOLISMO GALACTOSA
Galactoquinasa (GALK) Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa
(GALT) Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa
(GALE)
Galactoquinasa (GALK) El gen GALK1 se encuentra en el
brazo largo (q) del cromosoma 17 en la posición 24
La enzima se expresa en hígado, GR, leucocitos, fibroblastos, placenta
y varios tejidos fetales y adultos en humanos
El dominio N terminal de la enzima monomerica se muestra en azul y el dominio C-terminal en rojo. Se muestra el sitio activo donde se une galactosa y fosfato inorgánico
Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT)
El gen que codifica GALT esta localizado en el cromosoma 9p13 y tiene una extensión de 4,3Kb, constituido por 11 exones.
Las dos subunidades del dímero de la enzima se muestran en color rojo y azul. Se indica la posición de los metales en formas de esferas. En el sitio activo de la enzima se encuentra unido UDPglucosa.
Tiene regulación dietaria y hormonal
Se expresa en hígado, ID, ovarios,
cerebro, fibroblastos y eritrocitos
Exón: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Tamaño 82 170 76 49 130 57 123 133 83 155 78
(nt)
5’ 3’
4,3 Kb
Proteína: 379 aminoácidos
Gen GALT
Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa (GALE)
El gen GALE mapea en el cromosoma 1p36. El gen incluye 12 exones que se extienden alrededor de 4 kb de ADN genómico
Cada subunidad de la enzima dimerica se plega en dos dominios. Los dominios N y C terminal están en color azul y rojo, respectivamente. Unido al sitio activo NADH y UDP-glucosa. La enzima se expresa en hígado, mucosa intestinal, fibroblastos, eritrocitos.
Biología Molecular Galactoquinasa Al menos 25 mutaciones
diferentes han sido identificados en los lugares de GALK galactocinasa en pacientes.
Frecuencia: 1/214.470 La enzima humana incluye 392 aminoácidos con
una masa molecular de 42 kDa Algunas de las mutaciones son: 1569CT en el exón 2 (R68C), 7093CT en el exón 6 (T 288M), 7538GC en el exón 8 (A384P) y una deleción de un par de bases en el exón 5
(2833del C).
Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa Las 6 mutaciones más comunes
p.Q188R, p.S135L, p.K285N, p.L195P, p.T138M y p.Y209C son el 80% de los casos de galactosemia clásica. Una 7ª mutación IVS 2-2 AG ha sido descrita en la población hispana.
Mutación N314D: Variantes
Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa Frecuencia Galactosemia Clásica: 1:42.894
Deficiencias Parciales: 1:14.623
VARIANTES ALELICAS DE GALT
La variante Duarte es un alelo polimorfico del gen GALT que resulta en actividad alterada de
la enzima. Este polimorfismo común en la población es sin signos clínicos o síntomas
Deficiencia de GALT: Alelos Duarte: La mutación N314D esta asociada con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de GALT alterada pero con fenotipos subclínicos diferentes.
Duarte-1 (Los Angeles) Esta asociado con
aumento de la actividad de GALT (110-130% de lo normal)
N314D esta en un desequilibrio de ligamiento con la sustitución silenciosa L218L (c.652CT).
La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7
Duarte-1 (Los Angeles) Esta asociado con
aumento de la actividad de GALT (110-130% de lo normal)
N314D esta en un desequilibrio de ligamiento con la sustitución silenciosa L218L (c.652CT).
La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7
Duarte-2 (D2) Esta asociado con
disminución de la actividad de GALT
El polimorfismo N314D es un ligamiento en desequilibrio con 3 sustituciones intrónicas (IVS 4nt-27gc; IVS 5nt-24ga y IVS 5nt+62ga) y una deleción de 4pb en el promotor de GALT
La frecuencia de los alelos D2 es de 5,1
El Alelo Duarte puede tener significancia clínica con otras mutaciones en el gen GALT, llamadas galactosemia DG (genotipo Duarte/Galactosemia).
La combinación de una mutación clásica (G) y la variante D muestra una disminución de la actividad de GALT pero no resulta típicamente en los síntomas de galactosemia clásica
Tabla II: Diagnostico de sospecha de la Galactosemia
I-Clínica de sospecha II- Bioquímica Inespecífica III- Bioquímica Específica
A- Síntomas TóxicosVómitosRechazo del alimentoDepresión neurológica
A- Disfunción HepáticaHiperbilirrubinemiaHipoalbuminemiaDéficit complejo protrombina GOT, GPT, GGT, LDHAcidos Biliares plasmáticos.Hipoglucemia
A-Galactosuria
B- Afectación oftalmo- lógica.
Cataratas
B- Tubulopatía proximal renal
Acidosis hiperclorémicaGlucosuriaAminoaciduriaAlbuminuria
B- Aumento de galactosa en plasma
C- Fracaso hepático grave
IctericiaHepato-esplenomegaliaAscitisDiátesis hemorrágica
C- Aumento de Gal-1-P en eritrocitos
D- Tubulopatía proximal D- Galactitol en plasma y orina
E- Déficit Inmunitario Sepsis E. coli
Diagnostico Bioquímico
Determinación de metabolitos
Determinación de actividad enzimática
Determinación de metabolitos:
Galactosa en Orina Gal-1-P en eritrocitos Gal TOTAL en eritrocitos
Tabla VIII: Resumen de los niveles de metabolitos Deficiencia Galactosa (Plasma u
Orina)Gal-1-P (sangre)
GALK Elevada Normal
GALT Elevada Elevada
GALE Normal - Elevada Elevada
Galactosa en Orina: Pesquisa Neonatal
Galactosa + O2 Ac.Galactónico + H2O2
H2O2 + Cromógeno Cromógeno oxidado + H2O
Galactosa oxidasa
Peroxidasa
Los valores normales en RN:
• hasta 60mg/dl de orina
Galactosuria Cuantitativa D- Galactosa es oxidada a D-galactonolactona (que
en un medio alcalino se hidroliza espontáneamente) en presencia de la enzima galactosa deshidrogenasa (EC1.1.1.48).
La formación de NADH es medido en un intervalo de 10’, por incremento en la absorbancia a 340nm que es proporcional a la cantidad de D-Galactosa en la muestra.
Gal-1-P= Gal Total (2º) – Gal (1º)
Determinación Enzimática
Galactosa 1- Fosfato Uridil
Transferasa (GALT) en eritrocitos
Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferase (GALT), en Sangre
Hemolizado de GR
Ausencia NADPH – No hay decoloración del Azul de Metileno
NADPH actividad de GALT rapidez de decoloración de AM
Diagnóstico Neonatal Sistemático del Recién Nacido I
Usado por ABA Lab. Dr. Gustavo Borrajo
Diagnóstico Neonatal Sistemático del Recién Nacido II UMTEST GAL de SUMA:usado en CSSL
Análisis Molecular:
Detección de Mutaciones por
amplificación por PCR+ER
En Brasil la galactosemia tiene una frecuencia de 1:19.984 recién nacidos.
Q188R: exon 6, Por PCR se amplifica PA: 256 bp. El cambio de de una A por G crea un sitio de corte para la enzima de
restricción HpaI. El alelo Q188R genera dos bandas de 158 y 98 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 256pb.
N314D, Duarte variant:exon 10, Por PCR se amplifica PA: 166pb La mutación genera un sitio de corte para la enzima Ava II El alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 166pb.
S135L: exon 5, Por PCR se amplifica PA: 252 bp. La mutación genera un sitio de corte para la enzima TaqI en el exón 5.
El alelo S135L genera dos bandas de 192 y 60 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 252pb.
Mutación Q188R
Mutación N314D
Mutación S135L
After amplification, the PCR products were digested overnight at 37-C using the enzymes HpaII for exon 6, AvaII for exon 10 and TaqI for exon 5.
(A) Q188R – exon 6 GALT gene. L, marker; lane 1, mutated homozygous (referred case); lanes 2 and 3, heterozygous (two screened cases) and lanes 4–10, homozygous wild-type allele.
(B) N314D – exon 10 GALT gene. L, marker; lane 4, homozygous mutated allele (referred case); lanes 1, 2, 5 and 6, heterozygous and lines 3, 7–10, homozygous wild-type allele
??
Duarte 2 homocigota, DG??
Diciembre 2010 con un total de 643.409 RN 15 pacientes con Galactosemias Clásicas
(Frecuencia 1:42.894), 44 pacientes con Deficiencias Parciales de
GAL-T (Frecuencia 1:14.623), 3 pacientes con Deficiencias de GAL-K
(Frecuencia 1:214.470) y 2 pacientes con Deficiencias de GAL-E
(Frecuencia 1:321.705).
Gracias al Dr. Gustavo Borrajo por la casuística !
Etiología Incidencia global: 1/50.000
Patogenia I La deficiencia de GALK impide la
fosforilación de galactosa a Gal-1-P, lo que supone un acúmulo de galactosa en sangre, y la consiguiente producción de galactonato y galactitol
El acúmulo de galactitol produce edema de las fibras del cristalino, y una desnaturalización de las proteínas, responsable del desarrollo de la catarata.
Aumento de Galactitol Catarata nuclear “en gota de aceite” que puede
tener un inicio intrauterino, en casos excepcionales
Patogenia II El déficit GALT se produce un
aumento de Gal-1-P eritrocitaria y de la galactosa plasmática con la consiguiente galactosuria
La galactosa en exceso en el plasma es convertida en galactonato, y en galactitol.
Patogenia II: Metabolitos tóxicos Gal-1-P: ATP y Pi AMPdeaminasa
Ac. Urico; inhibición de enzimas
Balance UDP-Gal / UDP-Glu
Defectos en la glicosilación
Patogenia III En el déficit GALE se produce un
acúmulo de UDPGal e incluso de Gal-1-P
Hay un déficit en la síntesis endógena de galactosa y en la producción de galactolípidos y galactoproteínas
Tratamiento La galactosa de la dieta debe ser
eliminada ante la menor sospecha La ingesta diaria no debería contener
nunca más de 125 mg de galactosa (frente a los 6.500 mg que por término medio tiene una dieta de un adulto normal);
Una dieta estricta contiene aproximadamente unos 40 mg
Alimentos lácteos
La leche y todos sus derivados son la principal fuente de galactosa liberada en el intestino mediante hidrólisis de la lactosa; y por tanto deben ser excluidos de la dieta en cualquiera de sus formas.
La caseína es probablemente también una fuente importante de galactosa libre, ya que 100 gr. aportan 184 mg, y una fórmula láctea cuyas proteínas sean un hidrolizado de caseína, puede llegar a tener 60-75 mg por litro.
Tabla IV: Contenidos aproximados en galactosa soluble de algunos alimentos (mg/100 gr de alimentos)
Menos de 5 mgMelón, uva, pomelo, naranja, fresasEspárragos, remolacha, repollo, coliflor, apio, pepino, berenjena, espinaca,
lechuga y maíz.
Entre 5-10 mgManzana, banana, pera.Brócoli, zanahoria, cebolla, nabo.
Entre 10-20 mgKivi, sandia, piña.Col de Bruselas, calabazas, sandia, batata.
Entre 20-30 mgArándanoTomate
Entre 30-50 mgSoja, alubias
Más de 100 mgLentejas, guisantes, porotos
Más de 400 mgHigos secos, pasas, avellanasGarbanzos
Control del tratamiento: Los marcadores utilizados para el
seguimiento del tratamiento dietético son los niveles de Galactosa-1-P eritrocitarios, y galactitol plasmático.
Valores de 4 mg % de Gal-1-P, y de 25-30 mol/L de galactitol plasmático
(mg/dl =38 x mol/L), es lo máximo que puedan aceptarse como buenos
Gal 20 o GALT 40?
GALT 40?
Gal-1-P25%?
Si
No
No
Positivo: Posible
Deficiencia GALTPositivo: Posible
Deficiencia GALK
Positivo:
Posible
Deficiencia
GALESi No
Si
Unidades: Galactosa mg/dl y GALT mol/L
Posible ausencia de Galactosemia
Resultado Pesquisa Neonatal gal y enzima GALT o gal y GALT: N
GALT< 1%
Gal-1-P
GALT 1-10%
Gal-1-P
GALT 10-75%
N/ Gal-1-P
GALT: N GalGal-1-P: N
Mutación GALT presente
Mutación GALT presente
Mutación GALT presente
Galactitol
GALT: N
Gal-1-P
Galactitol
Galactitol Normal
Galactosemia Clásica
Variante de Galactosemia
Variante/ Galactosemia Benigna o Portador
Actividad GALK
Actividad GALE
Deficiencia GALK
Deficiencia GALE
Falso Positivo
Bibliografía: - Baldellou A.; Briones P. y Ruiz M. AECOM: Asociación Española para Estudio de Errores Congénitos del Metabolismo:
Protocolo 9: Galactosemia. Protocolo de diagnóstico y tratamiento de los errores congénitos del metabolismo de la galactosa
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- Annet M. Bosch. Classical galactosaemia revisited. J Inherit Metab Dis (2006) 29:516–525
- J. DíazRuiz, A.CordónMartínez,J.LópezLópezyA.JuradoOrtiz. Galactosemia. An Pediatr (Barc). 2011
JM Flanagan, G McMahon, SH Brendan Chia, P Fitzpatrick, O Tighe, C O’Neill, P Briones, L Gort, L Kozak, A Magee, E Naughten1, B Radomyska, M Schwartz, JS Shin, WM Strobl,
LA Tyfield, HR Waterham, H Russell, G Bertorelle, JKV Reichardt, PD Mayne and DT Croke. 2010. The role of human demographic history in determining the distribution and frequency of transferase-deficient galactosaemia mutations. Heredity 104, 148–154
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