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PROYECTO FIN DE MASTER

MASTER OFICIAL EN NEUROCIENCIAS

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

TRABAJO REALIZADO EN EL “DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA

MOLECULAR” DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA, BAJO LA DIRECCIÓN DE

LOS DOCTORES JUAN PEDRO BOLAÑOS HERNÁNDEZ Y ÁNGELES ALMEIDA

PARRA.

PATRICIA RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ

2009

“FORMACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO POR INTERFERENCIA EN LA EXPRESIÓN DE LA GLUTAMATO-

CISTEÍNA LIGASA”

FORMACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO POR INTERFERENCIA EN LA EXPRESIÓN DE LA GLUT AMATO- CISTEÍNA LIGASA

1

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………. Página 2

- Mitocondria y estrés oxidativo………………………. Página 2

- Glutatión (GSH): Función biológica y síntesis…... . Página 4

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVO…………………………………... Página 6

3. MATERIAL Y METODOS …………………………………… Página 7

- Especie ensayada, condiciones del animalario y

control de la edad gestacional………………………

Página 7

- Cultivo primario de neuronas……………………….. Página 7

- Transfecciones…………………………………………. Página 9

- Tratamiento con MitoSOX TM…………………………. Página 10

- Transferencia de Western……………………………. Página 10

- Citometría de flujo……………………………………... Página 11

- Análisis estadístico de los resultados……………... Página 12

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………….. Página 12

- Cultivo primario de neuronas corticales de rata…. Página 12

- Disminución de la expresión de la GCL mediante

SiRNA…………………………………………………….

Página 13

- Citometría de flujo……………………………………... Página 15

- Microscopía……………………………………………... Página 16

5. CONCLUSIONES……………………………………………… Página 17

6. REFERENCIAS………………………………………………… Página 18


2

1. INTRODUCCIÓN

Las enfermedades neurodegenerativas son un grupo de patologías

caracterizadas por la pérdida progresiva de neuronas en áreas concretas del cerebro.

Entre ellas cabe destacar la Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson,

Esclerosis Lateral Amiotrófica y Enfermedad de Huntington.

Las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson son las dos enfermedades

neurodegenerativas mas prevalentes. La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por

una degeneración cognitiva progresiva. Se observan placas seniles compuestas de

péptido beta amiloide y ovillos neurofibrilares constituidos principalmente por proteína

tau hiperfosforilada. Existe una variante familiar que aparece a edades tempranas,

aunque esto solo supone un 5-10% de los casos.(Brundin et al. 2008) (Linazasoro

2008)

La Enfermedad de Parkinson se caracteriza por la pérdida de neuronas en la

substantia nigra, y la aparición de inclusiones intraneuronales denominadas cuerpos

de Lewy, que son inclusiones citoplasmáticas con alfa sinucleína y ubiquitina. A nivel

clínico se caracteriza por una serie de defectos motores, como temblor, rigidez y

bradicinesia, además de otra serie de síntomas no motores. Al igual que ocurre con la

enfermedad de Alzheimer existen formas familiares en las que están implicadas al

menos 10 loci genéticos distintos: PARK1-PARK10 (Olzmann et al. 2004).

- MITOCONDRIA Y ESTRÉS OXIDATIVO

Cada vez existen mas evidencias que relacionan los defectos en la función

mitocondrial y el estrés oxidativo con la patogénesis de las enfermedades

neurodegenerativas. Se sabe que la mitocondria contribuye al envejecimiento

mediante la acumulación de mutaciones en el DNA mitocondrial y la producción de

especies reactivas de oxígeno (ROS).

La generación de especies reactivas de oxígeno a partir del oxigeno molecular

es un proceso fisiológico que tiene lugar en las células de todos los organismos

aeróbicos. Entre las principales especies reactivas de oxigeno se encuentran el anión

superóxido (O2.-) y el peróxido de hidrogeno (H2O2) que se presentan en las células en

concentraciones basales del orden de nanomolar y micromolar, respectivamente


3

O2.-

H2O2.OH

Cadena de transporte electrónico mitocondrial Xantina Oxidasa

ONOO-SOD

Monoamino Oxidasa

.NO

Reacción de FentonOH- +

Reacción de Haber- Weiss

.OHO2 + OH- +

Fe 2+Fe 3+

O2

Esquema 1: Generación de especies reactivas de oxígeno.

(Dawson y Dawson 1996). En general, y en el sistema nervioso central (SNC) en

particular, el anión superóxido se forma in vivo como consecuencia de la reducción

incompleta del oxigeno en la cadena de transporte de electrones mitocondrial, aunque

también puede generarse por la acción de enzimas como la xantina oxidasa. Su

reacción con la enzima superóxido dismutasa (SOD) da lugar a la generación de H2O2,

una sustancia poco reactiva pero con capacidad oxidante. El H2O2 puede generarse

además por la acción de otras enzimas como la monoamina oxidasa (catabolismo de

la dopamina). El O2- puede reaccionar en presencia de hierro dando lugar a la

formación de radicales hidroxilo (.OH) mediante la reacción de Fenton. Asimismo, el

H2O2 y el O2- pueden reaccionar entre sí, en presencia de cationes metálicos,

mediante la reacción de Haber-Weiss, generando igualmente radicales hidroxilo, que

son especies altamente reactivas y oxidantes (Halliwell 1992; Peuchen et al. 1997).

(Ver Esquema 1)

Cuando se incrementa la producción de sustancias oxidantes, o bien se

produce una deficiencia en los mecanismos antioxidantes intracelulares, las especies

reactivas de oxigeno resultan dañinas para la célula. Esta situación de desequilibrio en

la homeostasis redox intracelular, es decir, entre oxidantes y antioxidantes, es lo que

se conoce como “estrés oxidativo”. Los daños celulares producidos por estas

sustancias son de naturaleza variada y afectan a la estructura del DNA, de los lípidos

de membrana y de muchas proteínas. En el sistema nervioso central, se ha descrito la

implicación de las especies reactivas de oxigeno en los efectos tóxicos y


4

neurodegenerativos que tienen lugar en patologías como la isquemia cerebral o las

enfermedades de Parkinson y Alzheimer (Halliwell 1992; Moro et al. 2005).

- GLUTATIÓN (GSH): FUNCIÓN BIOLÓGICA Y SÍNTESIS.

El tripéptido glutatión (γ-L glutamil-L-cisteinílglicina) se encuentra ampliamente

distribuido en las células de animales, plantas y microorganismos. Es el compuesto

tiólico presente en mayor concentración en todas las células (Meister 1988). Participa

en distintas funciones como la detoxificación de xenobióticos, el mantenimiento de los

grupos sulfhidrilo de las proteínas en su estado reducido, es cofactor de varias

enzimas y constituye la forma de almacenamiento y transporte de la cisteína en la

célula, pero su función más importante es la de antioxidante intracelular,

desempeñando un papel crucial en la defensa celular frente al estrés oxidativo y

nitrosativo.

En su acción antioxidante, el glutatión puede combinarse de forma no

enzimática con distintos radicales libres como superóxido, hidroxilo y óxido nítrico, o

actuar como donador de electrones en la reducción de peróxidos, en una reacción

catalizada por la glutatión peroxidasa. En ambos casos, el producto final es el glutatión

oxidado o disulfuro de glutatión (GSSG) (Dringen 2000). El peróxido de hidrógeno, el

oxido nítrico y el peroxinitrito reaccionan con el GSH mayoritariamente (>90%)

mediante este mecanismo (Radi et al. 1991). El GSSG así formado es el sustrato de la

flavoenzima glutatión reductasa que transfiere electrones del NADPH al GSSG,

regenerando de esta forma el GSH. El estado redox celular viene determinado por la

relación entre moléculas oxidadas y reducidas en la célula. En condiciones normales,

el GSH representa el 98% del glutatión total intracelular. Al ser el glutatión el

antioxidante mayoritario, incluso la oxidación de una pequeña cantidad de GSH a

GSSG, puede producir importantes cambios en el estado redox celular.

Otros compuestos como los xenobióticos, se unen al glutatión por acción de las

glutatión- S- transferasas formando aductos de glutatión que se excretan al espacio

extracelular (Meister 1988). En el sistema nervioso central, este mecanismo de

detoxificación está presente en astrocitos, pero no en neuronas (Johnson et al. 1993).

El GSH y sus aductos se liberan al medio extracelular, donde son metabolizados a

través de reacciones enzimáticas catalizadas por la γ-glutamíltranspeptidasa y la

dipeptidasa, regenerándose de este modo la glicina y la cisteína. Este último es el

aminoácido precursor limitante de la síntesis de GSH (Sagara et al. 1993). En


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situaciones de estrés oxidativo se produce además la eliminación al exterior celular de

parte del GSSG formado (Meister 1988).

La concentración intracelular de GSH es un factor determinante de la

vulnerabilidad neuronal al anión peroxinitrito (ONOO-) (Radi et al. 1991; Bolanos et al.

1995) (Bolanos et al. 1996) (Almeida et al. 1998; Clementi et al. 1998). De hecho, la

concentración intracelular de GSH disminuye dramáticamente cuando las neuronas se

exponen a ONOO- endógeno o exógeno (Bolanos et al. 1995) (Bolanos et al. 1996;

Almeida et al. 1998; Almeida et al. 2001). Es más, el ONOO- únicamente provoca el

daño mitocondrial y la subsiguiente muerte celular en los astrocitos cuando en éstos

se disminuyen drásticamente las concentraciones intracelulares de glutatión (Barker et

al. 1996). En este sentido, es importante resaltar que los astrocitos disponen de una

alta concentración intracelular de antioxidantes, como el glutatión (Raps et al. 1989)

(Sagara et al. 1993; Bolanos et al. 1995) y vitamina E (Makar et al. 1994), que no

poseen las neuronas, diferencia que puede explicar, al menos en parte, la resistencia

de los astrocitos frente a la citotoxicidad del ONOO-.

Por otro lado, la activación del ciclo de las pentosas fosfato por H2O2 (Ben-

Yoseph et al. 1996) o peroxinitrito (Garcia-Nogales et al. 2003) incrementa la

disponibilidad de NADPH, necesario para la regeneración de GSH a partir de GSSG.

El glutatión se sintetiza de novo en el citosol celular en dos reacciones ATP-

dependientes consecutivas, catalizadas por la glutamato-cisteína ligasa (GCL, EC

6.3.2.2) y la glutatión sintetasa (GSHS, EC 6.3.2.3) (Ver esquema 2). La primera es

limitante y se inhibe por retroalimentación por producto final (GSH) (Dringen 2000). En

ésta, el L-glutamato y L-cisteína forman L-γ-glutamil-L-cisteína (γ-GC). En la segunda

reacción, la γ-GC se une a la L-glicina generando GSH.

La GCL es una proteína heterodimérica, compuesta por una subunidad

catalítica (GCLCat, PM ~ 73000 Da) y una subunidad moduladora (GCLMod, PM

~30000 Da). Ésta modula la afinidad de la catalítica por los sustratos y los inhibidores,

reduciendo así la Km de la GCLCat por el glutamato, e incrementando la Ki para el

GSH. Ambas subunidades han sido clonadas y secuenciadas (Yan yMeister 1990;

Huang et al. 1993), de forma que están codificadas por diferentes genes con diferentes

localizaciones cromosomales. La expresión de ambas subunidades está poco

coordinada, posiblemente por estar situadas en cromosomas diferentes, de forma que

el control de la transcripción de ambas subunidades es independiente y diferente


6

L- Glu

L- Cys ATP ATPADP + Pi ADP + Pi

GSHSGCLγ- GC GSH

L- Gly

Esquema 2: Síntesis de glutatión (GSH)

según los tejidos (Dahl yMulcahy 2001). Ambas subunidades están unidas mediante

un puente disulfuro (Seelig et al. 1984; Chang yChang 1994) (Misra yGriffith 1998)

aunque a juzgar por la resistencia frente a tioles, es evidente la presencia de fuerzas

no covalentes como decisivas en la estabilidad del dímero (Chang yChang 1994).

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVO

Dado que la GCL es la enzima limitante en la biosíntesis de novo del GSH, su

regulación es de especial importancia en la defensa celular frente al estrés oxidativo

y/o nitrosativo. Por lo tanto, conocer las vías de señalización en las que está

involucrado el glutation podría ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares

implicados en la muerte neuronal que se asocia a las enfermedades

neurodegenerativas.

Actualmente, la única herramienta conocida para estudiar la función del

glutatión es el compuesto denominado L-butionina-sulfoximina (L-BSO), un análogo

del L-glutamato que inhibe competitivamente la GCLcat. Sin embargo, L-BSO presenta

el inconveniente de su inespecificidad, ya que también inhibe la glutation sintetasa, e

imposibilidad de su uso in vivo, dado que no atraviesa la barrera hematoencefálica.

Por este motivo, en el presente trabajo nos planteamos diseñar e implementar una

herramienta molecular, a ser posible más específica, que nos permitiera interferir en la

biosíntesis de glutation en cultivos primarios de neuronas. Con los resultados

previsibles pretendemos establecer una herramienta útil para el estudio de los

mecanismos moleculares implicados en la neurodegeneración asociada a ciertas

enfermedades neurodegenerativas, tales como la Enfermedad de Parkinson.


7

3. MATERIAL Y MÉTODOS

- ESPECIE ENSAYADA, CONDICIONES DEL ANIMALARIO Y CO NTROL DE

LA EDAD GESTACIONAL

Para la realización de todos los cultivos se emplearon ratas albinas de raza

Wistar, criadas y suministradas por el Servicio de Experimentación Animal de la

Universidad de Salamanca. Los animales se criaron en jaulas manteniendo un ritmo

de luz-oscuridad de 12 horas, con fase de oscuridad entre las 20:00 y las 8:00 horas

del día siguiente. La humedad osciló entre el 45 % y el 65 % y la temperatura entre los

20 ºC y los 25 ºC. Los animales se alimentaron ad libitum con una dieta sólida

estándar (17 % de proteínas, 3 % de lípidos, 58,7 % de glúcidos, 4,3 % de celulosa, 5

% de minerales y 12 % de humedad) y tuvieron en todo momento acceso libre al agua

de bebida.

La edad gestacional de la rata se controló limitándose a una noche el tiempo de

cohabitación de las ratas vírgenes con los machos. A las 9:00 horas de la mañana

siguiente se separaron aquellas que presentaban espermatozoides en el frotis vaginal,

acompañados de células epiteliales de la vagina características del día fértil del estro.

Bajo estas condiciones, el periodo de gestación de la rata se asume que es de 21,7

días.

Todos los tratamientos con animales cumplen con la normativa vigente de la

comisión europea del 18.06.2007 (2007/526/CE) y la legislación española (RD

1201/2005) sobre las líneas directrices relativas al alojamiento y cuidado de los

animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, y los protocolos

fueron aprobados por el Comité ético para la Experimentación Animal y Humana del

Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCyL).

- CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS

Para la realización del cultivo primario de neuronas se emplearon fetos de rata

de 16 días de gestación (Almeida et al. 1998). Las ratas gestantes fueron

anestesiadas con éter etílico y sacrificadas mediante dislocación cervical.

Posteriormente se extrajeron los fetos mediante una histerectomía. Los fetos se


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trasladaron en una placa petri a una cabina de flujo laminar (TC48, Gelaire Flow

Laboratories, McLean, Virginia, EEUU) para garantizar las condiciones de esterilidad

del cultivo. Con la ayuda de tijeras, pinzas y papel impregnado en etanol al 70 %, se

retiró el cráneo y se extrajeron ambos hemisferios cerebrales.

El tejido así obtenido se depositó sobre una placa Petri de poliestireno que

contenía la solución de disgregación (NaCl 116 mM, KCl 5,4 mM, NaH2PO4 1,01 mM,

MgSO4 1,5mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 4 mM, rojo fenol 10 mg/mL, albúmina 0,3 %

p/v y DNAsa tipo I 20 µg/mL a pH 7,2) y, empleando un bisturí, se disgregó

parcialmente y se dejó decantar en un tubo de 50 mL (BD, Falcon, Bedford,

Massachussets, EEUU) durante 4 minutos. El sedimento obtenido se resuspendió en

la solución de tripsinización (solución de disgregación suplementada con tripsina al

0,025 %, p/v) y se incubó a 37 ºC durante 15 minutos, en un baño agitando

suavemente cada 2-3 minutos para facilitar la tripsinización. Transcurrido este tiempo,

la digestión se detuvo añadiendo suero fetal de ternera (FCS; Roche Diagnostics,

Heidelberg, Alemania) a una concentración final del 10 % v/v y el tejido se centrifugó a

500 x g durante 5 minutos (Beckman Instruments, Palo Alto, California, EEUU).

El sedimento resultante se resuspendió en 12 mL de la solución de

disgregación y, para conseguir su disociación, se hizo pasar 9 veces a través de una

pipeta Pasteur previamente siliconada y con la punta redondeada. Tras dejar reposar

la solución celular durante 4 minutos, se recogió cuidadosamente el sobrenadante

conteniendo las células disociadas en un tubo de 50 mL. Este proceso se realizó otra

vez resuspendiendo el sedimento en 9 mL de la solución de disgregación para

incrementar la eficiencia. Los sobrenadantes obtenidos se combinaron y las células

disociadas se centrifugaron de nuevo a 500 x g durante 5 minutos. El sedimento

celular se resuspendió primero en 1 mL de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle

Medium; Sigma-Aldrich Chemical Co., Barcelona, España) y, a continuación, en 20 mL

de DMEM, y una pequeña alícuota de esta suspensión celular (10 µL) se diluyó cuatro

veces y se mezcló con un volumen igual de azul de tripano (Sigma-Aldrich) al 0,4 %

para el recuento celular, empleando para ello una cámara cuentaglóbulos de

Neubauer (Zeiss, Oberkochen, Alemania) y un microscopio de contraste de fases,

modelo CK30 (Olympus, Japón).

Una vez determinado el número de células, la suspensión se diluyó en el medio

de cultivo (DMEM suplementado con FCS al 10 %) y se sembraron a una densidad de

de 250.000 células/cm2 en placas de cultivo (Nunc; Roskilde, Dinamarca) previamente


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recubiertas con poli-D-lisina (10 µg/mL; Sigma-Aldrich). Las placas se colocaron en un

incubador termostatizado a 37 ºC (Thermo Forma 310, Thermo-Fisher Scientific, Ohio,

EEUU) con una atmósfera saturada de vapor de agua, compuesta por un 95 % de aire

y un 5 % de CO2.

A los dos días de cultivo, el medio se cambió por DMEM suplementado con

suero de caballo (Sigma-Aldrich) al 5 % v/v, glucosa 20 mM (Sigma-Aldrich). Al cuarto

día de cultivo se añadió arabinósido de citosina 10 µM (Sigma-Aldrich) para impedir la

proliferación de células no neuronales. Las células se utilizaron a los 6-7 días de

cultivo. Bajo estas condiciones, los cultivos de neuronas mostraron una pureza

aproximada del 97-99 %, determinada mediante inmunorreacción con el marcador

neuronal Map-2 (Almeida et al. 2005).

Todos los medios de cultivo se suplementaron con penicilina (100 U/mL),

estreptomicina (100 µg/mL) y anfotericina B (0,25 µg/mL) suministrados por Sigma-

Aldrich.

- TRANSFECCIONES

Las transfecciones celulares se realizaron con el reactivo catiónico

Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Madrid), siguiendo las instrucciones detalladas por el

fabricante. Para reducir la expresión de GCL decidimos emplear la tecnología del RNA

de interferencia. Basándonos en criterios de diseño racional de siRNA (Reynolds et al.

2004), seleccionamos la secuencia mostrada en la Tabla 1, que está dirigida contra la

subunidad catalítica de la GCL. Como control empleamos un siRNA dirigido contra la

luciferasa, por emplearse de forma rutinaria en nuestro laboratorio (Tabla 1). La

concentración final de siRNA empleada fue de 100 nM. Los dúplex siRNAs se

adquirieron comercialmente (Dharmacon, Lafayette, Colorado, EEUU).

SiRNA GCL 5´-GAAGGAGGCTACTTCTATA-3´

SiRNA Luciferasa 5´-CTGACGCGGAATACTTCGA-3´

Por otro lado, estas mismas secuencias se utilizaron también en forma de RNA

en horquilla de pequeño tamaño o small hairpin RNA (shRNA) mediante el empleo del

Tabla 1: Secuencias del SiRNA empleado para disminuir la expr esión de la GCL y como control (SiRNA Luciferasa).


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vector de expresión pSuper-neo/GFP (Oligoengine, Seattle, Washington, EEUU). La

elección de este sistema nos permitió identificar las células eficientemente

transfectadas por selección del marcador (GFP) mediante citometría de flujo. Como es

sabido, la estructura en horquilla del shRNA se reconoce por la enzima Dicer, que la

digiere en los RNA pequeños de interferencia (siRNA) funcionales. Así, tanto por el

método del siRNA como del shRNA, la separación de las hebras del siRNA permite la

unión de una de ellas a la secuencia complementaria del RNA mensajero. Como

consecuencia se produce la degradación del mRNA por el complejo RISC, que

conduce a una disminución de la abundancia de la proteína.

- TRATAMIENTO CON MITOSOX

MitoSOXTM Red es un reactivo derivado de hidroxietidina (HE) que permite

detectar de manera selectiva la producción de anión superóxido en células vivas

mediante citometría de flujo y microscopia confocal. La oxidación del anión superóxido

produce la liberación de un producto fluorescente que se excita a una longitud de onda

de 480 nm, con un máximo de emisión de 567 nm. MitoSOXTM Red se dirige

específicamente hacia la mitocondria, donde se une al DNA mitocondrial y muestra

fluorescencia en función del grado de oxidación.

Para el tratamiento con MitoSOXTM Red se lavaron las células una vez con el

medio Hanks (glucosa 5.5 mM, Ca2+, Mg2+, pH=7.4) a 37 ºC. Posteriormente se realizó

una incubación con MitoSOXTM Red durante 30 minutos en un incubador

termostatizado a 37ºC. Luego se realizaron lavados nuevamente con Hanks y se

tripsinizó con EDTA al 10%. Las muestras así obtenidas se pusieron en tubos de

citómetro, centrifugando durante 5 minutos a 500g. El sobrenadante obtenido en la

centrifugación se desechó y se realizo un nuevo lavado con 500 µL de Hanks,

volviendo a centrifugar 5 minutos a 500g. Finalmente, el pellet obtenido se

resuspendió en un volumen final de 500 µL de Hanks frío y se analizó por citometría

de flujo.

- TRANSFERENCIA DE WESTERN

Para obtener los extractos proteicos totales, las células se lavaron con PBS y

se lisaron en tampón de lisis, compuesto por RIPA (SDS al 1 %, EDTA 0,5 M, Triton

Tx-100 al 1 % v/v, NaCl 150 mM, Na2HPO4 10 mM a pH 7,0) al que se le añaden

inhibidores de proteasas y fosfatasas (aprotinina 50 µg/mL, leupeptina 50 µg/mL,


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inhibidor de tripsina (soybean) 50 µg/mL, TLCK 100 µM, NaF 50 mM, ortovanadato

sódico 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 100 µM, N-p-tosil-L-fenilamina

clorometil cetona (TPCK) 100 µM, fenantrolina 1 mM y pepstatina A 50 µg/mL). Los

extractos se hirvieron durante 5 minutos, se centrifugaron a 13.000 x g durante 10

minutos y se recogió el sobrenadante. La concentración de proteínas se determinó

mediante el sistema BCA (Pierce, Rockwell, Illinois, EEUU).

Las proteínas (50 µg aprox.) de los extractos obtenidos se separaron mediante

electroforesis en gel de poliacrilamida (solución de acrilamida/bisacrilamida 29/1;

BioRad Labortories S.A., Alcobendas, Madrid) al 8 %, con un marcador de peso

molecular de proteínas (BenchmarkTM, Invitrogen, Carlsbad, California, EEUU),

utilizando un sistema de electroforesis vertical (MiniProtean-3®, BioRad Laboratories,

California, EEUU). Posteriormente, las proteínas se transfirieron electroforéticamente a

membranas de nitrocelulosa (Hybond®, Amersham Biosciences) que, tras la

transferencia, se bloquearon con leche al 5 % p/v en TTBS (Tris 20 mM, NaCl 500

mM, Tween 20 al 0,1 % v/v a pH 7,5), durante 1 hora. Las membranas se incubaron en

la solución de anticuerpos (TTBS suplementado con BSA al 2 % p/v) que contenía el

anticuerpo para la GCL (1/500, Abcam, Cambridge, UK) a 4 ºC durante toda la noche.

Tras lavar 3 veces con TTBS, las membranas se incubaron en TTBS con BSA al 2 %

en presencia del anticuerpo secundario adecuado; conjugado con la peroxidasa de

rábano a 25 ºC durante 45 minutos.

Finalmente, las membranas se incubaron con el reactivo de

quimioluminiscencia SuperSignalTM West Dura (Pierce) y se expusieron a una película

Kodak XAR-5 (Sigma-Aldrich).

- CITOMETRÍA DE FLUJO

El análisis se realizó utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (BD,

Bioscences) y los programas CellQuestTM PRO y Paint-A-Gate TM PRO (BD

Bioscences). Se seleccionaron únicamente las células que presentaran fluorescencia

verde, posteriormente cuantificando la fluorescencia roja debida al MitoSOXTM Red

para determinar el incremento de estrés oxidativo en las células transfectadas con el

RNA para la GCL frente a los controles, transfectados con RNA para la Luciferasa.


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- ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

Todos los valores se expresaron como medias ± S.E.M. (error estándar de la

media). La significatividad se determinó mediante análisis de la varianza, seguido del

test de la menor diferencia significativa de rango múltiple (para comparaciones

múltiples) o el test de la t de Student (para comparaciones entre dos únicos grupos de

valores). En todos los casos, un valor de p<0,05 se consideró estadísticamente

significativo.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN - CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS CORTICALES DE RATA

Se realizaron cultivos primarios de neuronas corticales de rata mediante el

protocolo establecido en nuestro laboratorio (ver material y métodos). Para ello se

utilizaron fetos de rata de 16 días de gestación puesto que es en este momento del

desarrollo fetal cuando hay una mayor proporción de neuroblastos respecto a otros

tipos celulares como puede ser la glía, lo que nos permite obtener cultivos neuronales

de una mayor pureza.

Como se observa en la figura 1, las células a los dos días de cultivo son más

pequeñas y están menos diferenciadas, se van diferenciando progresivamente y

desarrollando dendritas y axones. A los 7 días de cultivo ya se observa una población

más diferenciada que tiende a formar agrupaciones o “clusters”. En este momento hay

que tener especial cuidado en la manipulación para evitar que las neuronas se

despeguen de la placa. En la última figura (D) se muestra el aspecto de neuronas en

cultivo transfectadas con el plásmido pSuper-neo-GFP. La eficacia de transfección fue

de un 5-10%.


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- DISMINUCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA GCL MEDIANTE si RNA.

Como se puede observar en la figura 2, la transfección de neuronas corticales

en cultivo primario con siRNA produjo un descenso considerable en la abundancia de

la proteína GCL, fundamentalmente a partir de las 72 horas post- transfección en

comparación con los controles. Aunque en un principio pueda parecer que no se

produce un descenso significativo en la expresión de la GCL a las 48 horas, el

posterior al análisis de la intensidad de las bandas con el programa NIH Image 1.63 y

el cálculo del cociente de la intensidad de banda de la GCL respecto al control de

carga, nos muestra que se produce un descenso igualmente notable en la expresión

de la GCL a las 48 horas post- transfección. Sin embargo, puesto que el efecto fue

mayor a partir de las 72 horas, nos propusimos emplear este tiempo de incubación

para los experimentos posteriores.

A B

C D

Figura 1 : Neuronas corticales de rata en cultivo primario. (A) Neuronas a los dos días de cultivo. (B) Neuronas a los cinco días de cultivo. (C) Neuronas a los siete días de cultivo. (D) Neuronas a los siete días de cultivo tres días después de haber sido transfectadas con el plásmido pSuper-neo-GFP. (Objetivo 63X)


14

Figura 2: Disminución de la expresión de glutamato -cisteína ligasa en neuronas mediante RNA de interferencia . Las neuronas fueron transfectadas a los tres días de cultivo con SiRNA GCL (100nM) o su correspondiente control (SiRNA Luciferasa, 100nM). Las neuronas se recolectaron a las 48 y 72 horas post-transfección para estudiar la expresión de la proteína GCL mediante transferencia de Western, incubando con el anticuerpo Anti GCL (Abcam). La intensidad de la banda se cuantificó utilizando el programa NIH Image 1.63.

CONTROLDE CARGA

GCL

CONTROL SiRNA

48 Horas. 72 Horas.

GCL SiRNA

++

++--

--

Inte

nsid

ad d

e la

s ba

ndas

(u.

a.)

(GC

L/C

ontr

ol d

e ca

rga)

El interés de este sistema como método para inducir estrés oxidativo in vitro

radica en que los ROS se deberán producir de manera endógena y progresiva, ya que

dependen de la progresiva disminución de la proteína limitante de la biosíntesis de

glutation. Este mecanismo contrasta y, a nuestro parecer mejora, los métodos

utilizados tradicionalmente, basados en la adición al medio de cultivo de agentes pro-

oxidantes que desencadenan estrés oxidativo exógeno, rápido y transitorio.

Anteriormente, en nuestro laboratorio, ya se había utilizado un sistema similar (Diaz-

Hernandez et al. 2007), pero mediante la utilización de shRNA, y no siRNA como en la


15

Figura 3: Formación de ROS en la mitocondria de neuronas por disminución en la expresión de la GCL. Las neuronas corticales en cultivo primario fueron transfectadas a los 4 días de cultivo con p-super neo GFP-GCL o con su correspondiente control (p-super neo GFP-Luciferasa). A los 3 días post- transfección se utilizaron para determinar los niveles de ROS, mediante el análisis de la emisión de fluorescencia de la sonda MitoSox por citometría de flujo. Los valores obtenidos se expresaron en Media ± SEM (n=3). * p< 0,05 vs control.

SiRNA c

ontro

lSi

RNA GCL

Inte

nsid

ad d

e Flu

ores

cenc

ia d

e M

itoS

ox (u.

a.)

*

presente Memoria. La principal ventaja que presenta la utilización directa del siRNA

radica en que el tamaño del material a encapsular para posteriormente ser incorporado

por las neuronas es mucho menor, lo que aumenta considerablemente la eficacia de la

transfección respecto al sistema por shRNA.

- CITOMETRÍA DE FLUJO.

Para el análisis por citometría de flujo las células fueron tratadas con

MitoSOXTM Red y transfectadas con el plásmido pSuper-neo-GFP-GCL y pSuper-

neo-GFP-Luciferasa como control, que presentan fluorescencia verde. Se

seleccionaron únicamente las células verdes y se cuantificó la intensidad de

fluorescencia roja emitida por MitoSOXTM Red, que es proporcional al grado de estrés

oxidativo mitocondrial, mediante el programa Paint-A-Gate TM PRO (BD Bioscences).

Como puede observarse en la figura 3, el silenciamiento de la GCL, al ser la enzima


16

limitante de la síntesis de glutatión, provoca un desequilibrio entre la producción de

radicales libres y su eliminación por parte de los mecanismos antioxidantes celulares.

Ello conlleva un estrés oxidativo mitocondrial significativamente superior en las células

en las que se ha producido la disminución en la expresión de la GCL en comparación

con los controles.

- MICROSCOPÍA

Los resultados presentados en esta Memoria demuestran que la disminución

de la expresión de la GCL mediante la tecnología del siRNA es posible en neuronas

corticales en cultivo primario. Por otro lado, también demostramos que este método es

eficaz para inducir estrés oxidativo endógeno mitocondrial, puesto que la oxidación de

la sonda mitocondrial MitoSoxTM aumenta en las neuronas eficientemente

transfectadas con la secuencia del siRNA. Por lo tanto, pensamos que esta técnica

puede ser utilizada para el estudio de la señalización molecular inducida por ROS en

la mitocondria. Por ejemplo, la localización subcelular de la proteína denominada DJ-1

parece depender del estado redox intracelular (Zhang et al. 2005; Lev et al. 2008),

aunque la función específica de esta proteína se desconoce, si bien se ha encontrado

alterada en pacientes que padecen de la Enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, el

estudio de la influencia del estrés oxidativo endógeno sobre la localización subcelular

y efectos moleculares de DJ-1 podría resultar de interés en el conocimiento de la

etiología de esta enfermedad. Así, decidimos investigar si DJ-1 se localiza, o no, en la

mitocondria. Para ello, sobreexpresamos el cDNA completo de DJ-1 junto con un

vector de expresión que confiere fluorescencia roja a la mitocondria (DSREd). Como

puede observarse en la figura 4, DJ-1 no se localiza preferentemente en la

Figura 4: Fotografías de la localización subcelular de DJ -1 en condiciones normales: DJ-1 no se localiza preferentemente en la mitocondria en condiciones normales. Las neuronas en cultivo primario fueron transfectadas a los 4 días con el cDNA completo de DJ-1 y con el vector pDSred2-Mito (Clontech), que se localiza específicamente en la mitocondria. Al día siguiente se tomaron fotografías con el objetivo de estudiar la localización subcelular de DJ-1, observándose que no localiza en la mitocondria. (Objetivo 63X).


17

mitocondria en condiciones normales. Con la técnica de estrés oxidativo endógeno

que en esta Memoria hemos puesto a punto pretendemos, ahora, investigar la posible

internalización de DJ-1 a la mitocondria. Los resultados previos de otros autores así lo

sugieren (Zhang et al. 2005), pero nuestra aproximación al estudio del estrés oxidativo

bajo condiciones, a nuestro parecer, más compatibles con las situaciones

fisiopatológicas, podrían aportar nuevos datos sobre la localización subcelular de esta

proteína.

5. CONCLUSIONES

A la vista de los resultados presentados en esta Memoria hemos alcanzado las

siguientes conclusiones:

1. La utilización de RNA pequeño de interferencia (siRNA) es un método eficaz

para disminuir la expresión de GCL en cultivos de neuronas corticales en cultivo

primario.

2. La disminución de GCL induce estrés oxidativo en la mitocondria en

neuronas corticales en cultivo primario.

La herramienta puesta a punto en este Trabajo podrá permitir su uso para conocer los

cambios en la localización subcelular de proteínas sensibles al estado redox

mitocondrial. Este es el caso de DJ-1, proteína que parece estar implicada en la

etiología de la Enfermedad de Parkinson y cuya localización subcelular varía por el

estrés oxidativo. Así, nuestro Trabajo permitirá investigar el efecto de la modulación

endógena de especies reactivas de oxígeno sobre la función de DJ-1, y de otras

proteínas, y su implicación en la Enfermedad de Parkinson.


18

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