Sistema LC bioinerte Agilent 1260 Infinity

Directrices• Proteínas básicas: SCX o WCX.• Tenga en cuenta el punto isoeléctrico (pI)

de la proteína de interés a la hora de elegir el pH de la fase móvil. Si pH < pI, la proteína tendrá una carga neta positiva.

• El pH del tampón inicial deberá tener un pH entre 0,5 y 1 unidades menor que el pI (inferior al pI para el intercambio catiónico).

• Si desconoce el pI, utilice un pH = 6 para el intercambio catiónico.

• Comience utilizando columnas SCX, que ofrecen el rango operativo más amplio; las columnas WCX pueden usarse para mejorar la selectividad.

• Los tampones para intercambio catiónico (pH entre 4 y 7) incluyen formiato, acetato, MES, fosfato y HEPS.

Fases móvilesLa fase móvil debe contener un tampón (con una concentración típica de 20 mM) para mantener el pH operativo. La sal de elución tiene habitualmente una concentración entre 400 y 500 mM.El software Agilent Buffer Advisor se utiliza para crear el perfil de gradiente necesario mediante la mezcla en diferentes proporciones de cuatro soluciones de partida.

Inyección de muestras (G5667A)Inyección de 1 a 10 µl para obtener una resolución máxima. La muestra debe ser soluble en la fase móvil.

Temperatura de la columna (G1316C)Temperatura máxima: 80 °C. Para optimizar la vida útil de la columna, debe utilizarse a una temperatura entre 10 y 50 °C.

Detección (G1315C)UV (G1315D) con una celda de flujo estándar bioinerte de 10 mm.

Flujo (G5611A)Flujo típico entre 0,5 y 1,0 ml/min para las columnas de 4,6 mm de d.i.

FLUJO DE TRABAJO DE CROMATOGRAFÍA CON INTERCAMBIO CATIÓNICO COLUMNAS HPLC AGILENT BIO IEX COLUMNAS HPLC AGILENT BIO MAB

En este documento, los químicos de aplicaciones de Agilent comparten sus recomendaciones para optimizar los sistemas LC y su configuración para caracterizar biomoléculas. También ofrecen consejos sobre un método general para comenzar e indican cómo puede optimizarse este método para satisfacer sus objetivos específicos de separación.Encontrará información adicional de las aplicaciones en www.agilent.com/chem/advancebio

Selección de columnasColumnas HPLC Bio IEX (PEEK)Bio SCX Bio WCX

Columnas HPLC Bio MAb (PEEK)

Descripción Referencia Referencia Referencia4,6 x 250 mm, 10 µm 5190-2435 5190-2455 5190-24154,6 x 50 mm, 10 µm 5190-2436 5190-2456 5190-24164,6 x 250 mm, 5 µm 5190-2427 5190-2447 5190-24074,6 x 50 mm, 5 µm 5190-2428 5190-2448 5190-24082,1 x 250 mm, 10 µm 5190-2439 5190-2459 5190-24192,1 x 50 mm, 10 µm 5190-2440 5190-2460 5190-24202,1 x 250 mm, 5 µm 5190-2431 5190-2451 5190-24112,1 x 50 mm, 5 µm 5190-2432 5190-2452 5190-2412

Fase ligadaSCX (intercambio catiónico fuerte): SO3HWCX (intercambio catiónico débil): COOH

Muestras ColumnaAnticuerpos monoclonales Bio MAbPéptidos y proteínas Bio SCX y WCXProteínas globulares y péptidos PL-SCX 1000ÅBiomoléculas muy grandes/análisis de alta velocidad

PL-SCX 4000Å

Proteínas y anticuerpos Bio-Monolith SO3 Nota: Para conocer las referencias de las columnas HPLC Bio IEX y Bio MAb de acero inoxidable, consulte la guía de selección de columnas Agilent BioHPLC (5990-9384EN).

Condiciones iniciales recomendadas

Anticuerpos monoclonales Anticuerpos monoclonales,proteínas y péptidos

Gradiente salino Gradiente de pH Gradiente salino

Columnas Bio WCX, 4,6 x 250 mm, 10 μmBio WCX, 4,6 x 250 mm, 5 μm

Bio MAb, 4,6 x 250 mm, 5 μm Bio SCX, 4,6 x 50 mm, 3 μmWCX, 4,6 x 50 mm, 3 µmBio MAb, 4,6 x 50 mm, 3 μm

Fase móvil A: AguaB: NaCl 1,6 MC: NaH2PO4 40,0 mMD: Na2HPO4 40,0 mMLa combinación de C y D en proporciones predeterminadas permite obtener disoluciones tampón de 20 mM dentro del rango de pH deseado.

A: AguaB: NaCl 1,6 MC: NaH2PO4 40,0 mMD: Na2HPO4 40,0 mMLa combinación de C y D en proporciones predeterminadas permite obtener disoluciones tampón dentro del rango de pH deseado y con la concentración necesaria.

A: Fosfato sódico 20 mM (pH = 5,0 para columnas WCX; pH = 6,0 para columnas SCX)

B: Tampón A + NaCl 1 mM

Gradiente De 0 a 50 % B, de 0 a 20 min (pH constante; por ejemplo, pH = 6,0); 50 % B, de 20 a 25 min; 0 % B, de 25 a 35 min

pH de 6,0 a 8,0, de 0 a 20 minNaCl de 0 a 800 mM, de 20 a 25 min; NaCl 800 mM, de 25 a 30 min

De 1 a 100 % B durante 30 min para las columnas de 50 mm; durante 60 min para las columnas de 250 mm

Flujo 1 ml/min 1 ml/min 0,5 ml/min

Temperatura Ambiente Ambiente AmbienteInyección 10 μl 10 μl 10 μlMuestra 2 mg/ml

(en tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0)2 mg/ml (en tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0)

Detección UV, 220 nm UV, 220 nm UV, 220 nm

5 10 15 20 25min

6 8 10 12 14 16min

6 8 10 12 14min

SCXWCXMAb 1

1

1

2

2

2

3

3

3

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© Agilent Technologies, Inc. 2015 Impreso en EE. UU. el 1 de agosto de 2015

Número de publicación 5991-6104ES

Separación de patrones de proteínas a pH = 7,0 con una columna Agilent Bio WCX, 4,6 × 250 mm, 10 μm.Ovoalbúmina (pI = 4,5)Ribonucleasa (pI = 9,4)Citocromo C (pI = 9,8)Lisozima (pI = 11)

Análisis de un anticuerpo monoclonal de IgG con un gradiente de pH de 6,5 a 7,5 (0-20 min), 50 mM, Agilent Bio MAb, 4,6 x 50 mm, 5 μm

Separación de patrones de proteínas en columnas de intercambio iónico de 3 μm de Agilent mediante cromatografía de intercambio catiónicoRibonucleasa (pI = 9,4)Citocromo C (pI = 9,8)Lisozima (pI = 11)