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Fermentación A: fed-batch (lote alimentado) fermentación con alimentación de galactosa

Producción de cutinasa por S. cerevisae fue estudiado por primera vez por la adopción de una estrategia típica de fermentación por fed-batch: un primer período de crecimiento de la biomasa en glucosa. Seguido de un período de fed-batch en galactosa para la producción de cutinasa.

Un perfil típico de un lote de fermentación de S. cerevisae en glucosa se obtuvo en el periodo inicial del lote: una primera etapa en la que la glucosa es consumida con una simultánea producción de biomasa y etanol, seguida por una segunda etapa, después de la depleción de glucosa, cuando el cultivo crese por la metabolización del etanol producido durante la etapa más temprana. La presencia de etanol en el tiempo cero es debido al etanol introducido con el inóculo.

La limitación de oxígeno nunca ocurrió a lo largo de la fermentación, dado su relativamente bajo volumen y una buena mezcla.

Por lo tanto la producción de etanol fue el resultado del efecto Crabtree (efecto glucosa).

De hecho la tasa específica de consumo de glucosa, qs, 1.75 g g ꜗ hꜗ. mayor que el umbral reportado qs (0.54g g ꜗ hꜗ Kappeli 1986: Cortassa y Son 1998). por encima del cual se satura la vía respiratoria y etanol se produce como resultado del inicio de la vía fermentativa. Cuando el metabolismo no es exclusivamente oxidativo el cociente respiratorio el cociente respiratorio (RQ) es mayor que 1 confirmado por mediciones en el inicio de la fermentación. Concentraciones de etanol y acetato siguieron un perfil similar durante el período de consumo de glucosa por lotes.

Después ambas concentraciones de etanol y acetato disminuyeron hasta el casi agotamiento de acetato y, después etanol. El RQ teórico durante la oxidación aeróbica de etanol es de 0,66 obtenido experimentalmente. Tras el agotamiento del etanol RQ aumentó a un valor bastante constante cerca de 1. A las 17:05 horas de fermentación de las 17:05 horas de fermentación, la galactosa comenzó a ser alimentados a una velocidad constante (160 ml / h) a partir de este momento en la acumulación de acetato se observó hasta el agotamiento completo de etanol, momento en el cual el acetato comenzó a ser hasta su agotamiento. Durante las primeras 10 h de la mayor parte de alimentación de la galactosa es simplemente acumulada. Sin embargo, todavía se produjeron tanto el crecimiento de la biomasa y la producción de proteínas. El acetato acumulado tanto en el inicio de la introducción y la espuma en el inicio de la absorción de galactosa. El crecimiento en galactosa mostró dos etapas diferentes: una fase exponencial seguido por el crecimiento casi lineal.

Fermentación B: lote de fermentación en galactosa

Una fermentación por lotes de galactosa se realizó para aclarar algunas observaciones durante la fermentación A, al saber, la tasa de absorción de galactosa específica limitada y la importancia aparente de etilo para interpretar el curso de tiempo de la fermentación. Inicialmente etanol

prorrogados del inóculo se consume. La concentración de acetato fue aparentemente aumentando en el momento de la primera muestra. La tasa de producción de dióxido de carbono RCP muestra un pico en los primeros 5,5 horas no fue acompañado por ningún pico detectable en la tasa de consumo de oxígeno OUR, lo que sugiere que el cultivo se fermenta la glucosa presente en el inóculo.

Se observa un pico grande en ambos perfiles OUR y CPR durante el período en el que el cultivo crecía en etanol. La brusca caída de OUR y RCP en alrededor de 16 horas coincide con el agotamiento de etanol. Debido a un problema en la calibración del espectrómetro de masas, el OUR fue consistentemente superior a la RCP, y por lo tanto no existe información cuantitativa se pueden extraer del análisis de gases de escape. Los resultados muestran claramente que el crecimiento fue lineal y fue acompañado por una disminución lineal en la concentración de galactosa, aunque no se produjo la limitación de oxígeno. El acetato estuvo presente en una concentración muy constante a lo largo de la fermentación a pesar del bajo flujo a través de la glucólisis.

Fermentación C: fermentación fed-batch alimentada con la glucosa y galactosa

La tasa de absorción de galactosa que conduce a mayores tiempos de crecimiento y de producción (es decir, baja productividad volumétrica) cuando se utiliza galactosa como única fuente de carbono. Sería ventajoso si la cepa pudiera crecer en glucosa y, al mismo tiempo producir cutinasa debido a la presencia de galactosa. El transporte de galactosa en la célula, es necesario para la inducción de la galactosa que se produzca es reprimida por la presencia de glucosa (Özcan y Johnston 1999). Además, las cepas silvestres de S. cerevisiae continuo crecimiento en galactosa dejan metabolizar la galactosa tras la adición de un pulso de glucosa, pero se reinician metabolizar la galactosa cuando se deja caer la concentración de glucosa en gotas (. Sicrkstra et al 1992). Para investigar la influencia de la glucosa en la absorción de galactosa y la producción de proteína de un lote alimentado con una alimentación mixta de glucosa y galactosa se realiza. Un lote de crecimiento se llevó a cabo para la biomasa acumulación antes del período de alimentación. En un medio que contiene glucosa y galactosa de manera que cuando se inició la fase de alimentación por lotes las células ya eran capaces de metabolizar la galactosa.

El comportamiento del cultivo durante las primeras 12h seguido de cerca que se obtenga cuando el crecimiento de la cepa sobre la glucosa en forma discontinua. La glucosa se consume fácilmente, con la producción concomitante de etanol y acetato. Tras el agotamiento de glucosa no se observó consumo de galactosa inmediata, la fuente de carbono es etanol. La síntesis de las enzimas necesarias para la utilización de galactosa explica este retraso en la absorción de galactosa. La concentración de acetato aumentó hasta alrededor de 15 horas de fermentación, 3 h después de agotamiento de la glucosa, y sólo entonces se inició el consumo de galactosa. En esta etapa, la galactosa y etanol se consumieron simultáneamente. Un ligero incremento en la concentración de proteína también se absorbió tras el agotamiento de glucosa. Es decir, cuando el cultivo se convirtió en no reprimido y fue capaz de tomar hasta galactosa.

Al comienzo del período de alimentación exponencial, la concentración de galactosa disminuye alrededor de 20 horas y se detecta una ligera acumulación de la glucosa. La galactosa se comienza a acumular a partir de entonces, mientras que casi toda la glucosa se consume alimentados con la consiguiente formación etanol adicional a la masa celular. Se alcanza la concentración de galactosa entre 4 y 4,5 g / l a pesar de la entrada creciente galactosa. Este nivel de concentración también se mantiene cuando la tasa de alimentación se mantiene constante. Durante el período de alimentación, tanto el etanol y el acetato se acumulan. La RCP aumenta bruscamente mientras que la alimentación es exponencial, lo que indica que la fuente de carbono se metaboliza principalmente a través de la vía fermentativa. Durante el período de alimentación constante, la RCP disminuye como resultado de una absorción de carbono específico inferior al aumento de las concentraciones de biomasa. Esto significa que el flujo de carbono a la célula individual disminuye y por lo tanto está fermentado fracción también disminuye. Durante este período se observó un aumento en la concentración de proteína.

De 32h a 52h disminuye la concentración de etanol y galactosa y el RQ se mantiene cercano al 1g/ml. aunque similares hacia el final de la fase de lote. al final de este período, la tasa de absorción de galactosa es muy baja, aunque la concentración de galactosa es todavía 1 g / l. Entre 52h y 63.5h el etanol restante se consume totalmente, lo que resulta en un aumento significativo en la concentración de la biomasa a partir de 12,7 g / l a 19,3 g / l. la concentración de proteína se mantuvo constante. Durante este período la disminución QR (a un valor promedio de 0,65) como ya se observó cuando el cultivo se estaba apoderando de etanol. Una vez se agotó el acetato del etanol se consumió hasta su agotamiento a 67h. Posteriormente, aunque cerca de uno galactosa permaneció en el caldo, tanto el crecimiento como la producción de proteínas cesaron.