Individualitzaci de les dosis de

ganciclovir/valganciclovir per predicci bayesiana, a partir dun model farmacocintic poblacional en

pacients transplantats drgan slid

Ariadna Padulls Zamora

Aquesta tesi doctoral est subjecta a la llicncia Reconeixement- NoComercial CompartirIgual 3.0. Espanya de Creative Commons. Esta tesis doctoral est sujeta a la licencia Reconocimiento - NoComercial CompartirIgual 3.0. Espaa de Creative Commons. This doctoral thesis is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0. Spain License.

FACULTAT DE FARMCIA

INDIVIDUALITZACI DE LES DOSIS DE

GANCICLOVIR/VALGANCICLOVIR PER PREDICCI

BAYESIANA, A PARTIR DUN MODEL

FARMACOCINTIC POBLACIONAL EN PACIENTS

TRANSPLANTATS DRGAN SLID.

ARIADNA PADULLS ZAMORA 2014

UNIVERSITAT DE BARCELONA

FACULTAT DE FARMCIA

PROGRAMA DE DOCTORAT RECERCA, DESENVOLUPAMENT I

CONTROL DE MEDICAMENTS

INDIVIDUALITZACI DE LES DOSIS DE

GANCICLOVIR/VALGANCICLOVIR PER PREDICCI BAYESIANA, A

PARTIR DUN MODEL FARMACOCINTIC POBLACIONAL EN

PACIENTS TRANSPLANTATS DRGAN SLID

Memria presentada per Ariadna Padulls Zamora per optar al ttol de doctor

per la Universitat de Barcelona

Les Directores de tesi:

Dra. Helena Colom Codina Dra. Nria Lloberas Blanch

La Tutora de tesi: La doctorand:

Dra. Helena Colom Codina Ariadna Padulls Zamora

2014

Les sotasignants, Dra Helena Colom Codina, Professora titular del Dpt. de

Farmcia i Tecnologia Farmacutica de la Universitat de Barcelona, Tutora i

Director de la present tesi; i Dra. Nria Lloberas Blanch, Co-Directora de la

present tesi.

FAN CONSTAR

Que la tesi Doctoral titulada: INDIVIDUALITZACI DE LES DOSIS DE

GANCICLOVIR/VALGANCICLOVIR PER PREDICCI BAYESIANA, A PARTIR DUN

MODEL FARMACOCINTIC POBLACIONAL EN PACIENTS TRANSPLANTATS

DRGAN SLID, realitzada a LHospital Universitari de Bellvitge (UB), sota la

nostra direcci per la llicenciada Ariadna Padulls Zamora per a optar al Grau de

Doctora en Farmcia, s en condicions de ser presentada i sotmesa a laprovaci

del tribunal convocat.

La qual cosa es fa constar per la present i a tots els efectes a Barcelona, 18 de

Novembre de 2014.

Dra Helena Colom Codina Dra. Nria Lloberas Blanch

Professora titular del Dpt. de Co-Directora de la tesi

Farmcia i Tecnologia Farmacutica

de la Universitat de Barcelona

Tutora i Directora de la tesi

Als meus pares i germana

AGRAMENTS

Aquesta tesi no shauria pogut dur a terme sense el treball en collaboraci.

Magradaria agrar a totes aquelles persones que han compartit amb mi la

realitzaci daquest projecte i que han fet possible que arribs fins aqu:

En primer lloc vull donar les grcies a les meves directores de tesi, la Nria

Lloberas, i lHelena Colom. Per donar-me loportunitat de participar en aquest

projecte de recerca, per tots els coneixements transmesos i el suport

incondicional. Moltes grcies pels vostres consells, pacincia i dedicaci en el

meu aprenentatge. Grcies Nria per la teva capacitat de motivaci i superaci

infinita. I a tu Helena, pel teu rigor cientfic, s un privilegi poder aprendre de tu.

Al Dr. Josep M Griny, ideleg del projecte, per haver-me donat la possibilitat i

confiana per dur a terme aquest projecte. Grcies per lesperit crtic, per

sempre constructiu, i la visi danlisi que han perms el desenvolupament

daquesta tesi.

Als metges del servei de Nefrologia de lHospital de Bellvitge i en especial als

responsables de la Unitat de Transplantament Renal. A lOriol, lEduardo, al Joan

i al Josep Maria, per reclutar la gran majoria de pacients transplantats renals i

realitzar el seguiment clnic durant lestudi. Merci per la vostra dedicaci i

disposici en tot moment.

A la unitat dassajos del Servei de Nefrologia, Eullia, Carol, M Jess i Meritxell.

Per tot el suport logstic en lorganitzaci del seguiment i les extraccions de

mostres als pacients. A lAnna, per la teva ajuda en tot moment i la pacincia en

la monitoritzaci de lestudi. Tamb a les infermeres dhospitalitzaci, que de

forma voluntria han extret mostres, per la sobrecrrega de treball que ha

suposat la realitzaci daquest estudi.

Al tot el grup del laboratori de Nefrologia, per acollir-me i ajudar-me en tot

moment. Sn un exemple magnfic de grup dinvestigadors. Voldria fer un

especial agrament a la Gema i la seva alegria, per les bones estones i daltres de

desesperaci davant lUPLC. Al Franc, pel suport analtic i a la Ins, per la seva

constncia, tot el temps invertit en lanlisi de les mostres i per la facilitat de

treballar conjuntament.

Al Ral, per lajuda en la determinaci analtica de les concentracions de GCV.

Grcies per respondre en els moments de crisi, sempre ens has ajudat i sense tu

no haurem pogut tirar endavant.

Als companys de la Unitat de Transplantament Heptic i Cardac, per la seva

collaboraci. De forma especial a la Nria Sab que tant bon punt vam iniciar

lestudi va estar disposada a reclutar pacients. Grcies per lajuda incondicional,

s un plaer treballar amb tu.

Al Jordi Niub, del Servei de Microbiologia, per lanlisi de les crregues virals i

avisar-me quan hi havia algun resultat positiu. Per la sobrecrrega de treball que

ha suposat la realitzaci daquest estudi i la seva collaboraci en lestudi durant

tot aquest temps.

Grcies a tots aquells que duna manera o una altra des dels meus inicis han anat

aportant-me coneixements i experincia, tant personals com professionals. Als

companys i amics del Servei de Farmcia de lHospital de Bellvitge que des de

que vaig arribar com a R1 han sigut una font de coneixement en tots els mbits.

Al Ramon, al Pep i a la Maybe, per donar-me la confiana i el suport per dur a

terme aquesta tesi. Als amics de residncia, amb els que he crescut professional i

personalment i amb els que he passat grans moments durant els anys de

formaci. A la Leti, la meva co-R, amb la que ens vam animar a iniciar el doctorat

i vam fer els dos primers anys juntes. A la Nria, la Sara, lEli i lEugnia, per la

seva constant ajuda i collaboraci. I tamb a tots els residents que sestan

formant, pel suport en el dia a dia. Al personal del Servei de Farmcia que

inconscientment, amb la feina diria em van facilitar fer el seguiment de la

medicaci dels pacients.

A tots els meus amics i companys, que sense saber-ho mhan ajudat en la

realitzaci daquest projecte. Grcies pels moments compartits i per comprendre

les absncies.

A la meva estimada famlia, pares i germana, per encoratjar-me i ajudar-me en

tots els meus projectes i animar-me a continuar en tot moment. Per

transmetrem la cultura de lesfor i dedicaci (sempre endavant).

Finalment, agrair a tots els pacients transplantats que de forma annima i

voluntria han participat en aquest estudi, sense ells no hauria estat possible la

realitzaci daquest estudi.

Aquesta tesis est basada en els segents articles.

I. Padulls A, Colom H, Armendariz Y, Cerezo G, Calds A, Pou L, Torras J,

Griny JM, Lloberas N. Determination of ganciclovir in human plasma by

ultra performance liquid chromatography-UV detection. Clinical

Biochemistry 2012;45(4-5):309-14.

II. Rigo-Bonnin R, Padulls A, Corral-Comesaa S, Cerezo G, Griny JM,

Colom H, Lloberas N, Ala-Ramos P. Measurement of ganciclovir

concentration in human plasma by ultra-performance liquid

chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta.

2013;427C:58-64.

III. Padulls A, Colom H, Calds A, Cerezo G, Torras J, Griny JM and Lloberas

N. Optimal sparse sampling for estimating ganciclovir/valganciclovir AUC

in solid organ transplant patients using NONMEN. Ther Drug Monit

2014;36(3):371-7.

IV. Padulls A, Colom H, Bestard O, Melilli E, Sab N, Rigo E, Niub J, Torras J,

Llad L, Manito N, Calds A, Cruzado JM, Griny JM and Lloberas N.

Contribution of population pharmacokinetics to dose optimization of

ganciclovir/ valganciclovir in kidney transplant patients. Manuscrit

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Padull%C3%A9s%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Colom%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Armendariz%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cerezo%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Caldes%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pou%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Torras%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Griny%C3%B3%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lloberas%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24120353

NDEX

1

INDEX

INDEX ....................................................................................................................... 1

ABREVIATURES ......................................................................................................... 3

I. INTRODUCCI ....................................................................................................... 7

1. CITOMEGALOVIRUS I TRANSPLANT DRGAN SLID ..................................... 9

1.1. FACTORS DE RISC ................................................................................... 9

1.2. EFECTES DEL CITOMEGALOVIRUS ....................................................... 12

1.3. PREVENCI DE LA INFECCI PER CMV ................................................ 14

1.4. TRACTAMENT DE LA MALALTIA PER CMV ........................................... 17

2. GANCICLOVIR I VALGANCICLOVIR ................................................................. 19

2.1. MECANISME DACCI I FARMACOCINTICA DEL GANCICLOVIR ............ 20

2.2. MONITORITZACI DEL GANCICLOVIR: ESTUDIS DEFICCIA I TOXICITAT CLNICA ........................................................................................................... 23

2.2.1. DETERMINACI ANALTICA DE GANCICLOVIR ............................... 26

2.2.2. ESTRATGIA DE MOSTREIG LIMITAT AMB GANCICLOVIR ............. 27

3. FARMACOMETRIA ......................................................................................... 28

3.1 FARMACOCINTICA POBLACIONAL ......................................................... 30

3.2. MODELS FARMACOCINTICS POBLACIONALS DE GANCICLOVIR ........... 32

4. ESTIMACI DE LEXPOSICI: INDIVIDUALITZACI DE LA DOSI MITJANANT LA UTILITZACI DUN PREDICTOR BAYESI. ..................................................... 35

4.1. CARACTERSTIQUES DEL MODEL APLICAT EN LA TESIS .......................... 35

4.2. AVALUACI DE LEXPOSICI ................................................................... 36

II. HIPTESI ............................................................................................................. 41

III. OBJECTIUS ......................................................................................................... 47

IV. RESULTATS ........................................................................................................ 53

Captol 1 ............................................................................................................ 55

Captol 2 ............................................................................................................ 63

Captol 3 ............................................................................................................ 73

Captol 4 ............................................................................................................ 83

V. DISCUSSI ........................................................................................................ 125

VI. CONCLUSIONS ................................................................................................. 145

VII. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 151

2

ABREVIATURES

3

ABREVIATURES

AUC: rea sota la corba de concentracions plasmtiques enfront el temps.

Cl: aclariment plasmtic

ClD1: aclariment intercompartimental

CLCR: aclariment de creatinina

CMV: citomegalovirus

D: donant

dGTP: trifosfat de desoxiguanosina

EBV: virus Epstein-Barr

F: biodisponibilitat

GCV: ganciclovir

HIV: virus de la immunodeficincia humana

HPLC: cromatografia lquida dalta eficcia

IC50: concentraci inhibitria 50

IL6: interleuquina 6

KA: constant dabsorci

OAT2: transportador danions orgnics tipus 2

PD: farmacodinmia

PEPT1: transportador de pptids intestinals tipus 1

PEPT2: transportador de pptids intestinals tipus 2

PCR: reacci en cadena de la polimerasa

PK: farmacocintica

R: receptor

TL: temps de latncia

Tmax: temps per assolir la concentraci plasmtica mxima

TNF-: factor de necrosi tumoral alfa

TOS: trasplantats drgan slid

UHPLC: cromatografia lquida dultra alta eficcia

UV: ultravioleta

ABREVIATURES

4

V2: volum de distribuci del compartiment central

V3: volum de distribuci del compartiment perifric

VGCV: valganciclovir

VVZ: varicella zoster

5

6

7

I. INTRODUCCI

8

INTRODUCCI

9

I. INTRODUCCI

1. CITOMEGALOVIRUS I TRANSPLANT DRGAN SLID

La immunosupressi desprs del trasplantament confereix una especial

susceptibilitat a infeccions virals. Epidemiolgicament, algunes sn resultat de

lexposici a la comunitat (influenza, adenovirus), altres sn transmeses amb

lempelt (citomegalovirus [CMV], virus Epstein-Barr [EBV]) i les ltimes sn

conseqncia de la reactivaci dinfeccions prvies (varicella, varicella zoster

[VVZ]). El CMV s el patogen viral ms com desprs del trasplantament i sense

tractament preventiu o profilctic, al voltant del 75% dels malalts transplantats

presenten infecci per aquest agent viral els primers 3 mesos desprs del

trasplantament.

1.1. FACTORS DE RISC

La infecci per CMV segueix essent una de les majors complicacions en receptors

de transplantament drgan slid (TOS) i es presenta entre el 30-80% dels

pacients1 tot i que la seva incidncia i les manifestacions clniques varien en

funci del tipus de transplantament, dels factors de risc de malaltia i de les

estratgies de prevenci.

Els principals factors de risc de malaltia per CMV (Taula 1) depenen de la

serologia del donant i receptor, del grau dimmunosupressi del receptor, de la

crrega viral i del tipus drgan transplantat. Aix doncs, els factors de risc ms

importants sn: a) transplantament de donant seropositiu a receptor

seronegatiu (D+/R-), b) immunosupressi amb corticosteroides i

immunoglobulines antitimoctiques utilitzades durant el tractament dinducci o

el rebuig i c) trasplantament dintest, pncrees i pulm.

INTRODUCCI

10

La serologia del donant i del receptor (IgG) sn els predictors clau del risc

dinfecci. El principal factor de risc, per desenvolupar una malaltia per CMV en

el post-transplantament s la combinaci dun receptor nave per CMV que rep

lempelt dun donant seropositiu per a CMV (D+/R-) essent el risc del 45% en

absncia de quimioprofilaxi. El CMV roman latent en moncits i macrfags

presents en diferents rgans de lanatomia i donat, que en el moment del

trasplantament, el receptor no presenta immunitat especfica, aquest

desenvolupa una infecci primria. En el cas de que tant el donant com el

receptor siguin seropositius (D+/R+), el risc de malaltia sense rebre profilaxis s

moderat (15-20%). Aquesta es pot presentar com a reactivaci o com a infecci

transmesa pel donant. Pel que fa a la situaci en que el donant s seronegatiu i

el receptor seropositiu (D-/R+), el risc tamb s moderat i la infecci es produeix

per reactivaci viral. El cas de risc ms baix, gaireb nul, s quan tant el donant

com el receptor sn seronegatius (D-/R-)2.

Altres factors pel desenvolupament de la malaltia per CMV sn el grau

dimmunosupressi rebuda, especialment ladministraci de terpia dinducci i

pel tractament del rebuig ja que condicionar la capacitat de resposta immune

efectiva enfront al virus. La terpia dinducci t lobjectiu devitar el rebuig i els

frmacs administrats actuen disminuint la proporci de precursors de cllules T.

La timoglobulina incrementa el risc de malaltia per CMV dun 15.7% al 28.3%3.

Per contra, les dades sobre el risc amb la terpia amb basiliximab sn

controvertides i probablement lincrement de risc s escs. En quan a la

immunosupressi de manteniment, la majoria dels estudis assumeixen que el

seu efecte s nul. La ciclosporina i el tacrolimus no solen donar lloc a una

reactivaci del CMV latent per si que poden accelerar la taxa de replicaci4. Els

inhibidors de la mTOR sassocien amb una disminuci de la incidncia de la

malaltia per CMV que es pot atribuir al bloqueig de certes quinases responsables

INTRODUCCI

11

de la sntesi proteica cellular, fet que podria impedir la sntesi de components

dels virions de CMV5,6.

La incidncia de malaltia s ms freqent en el trasplantament dintest,

pncrees i pulm que en lheptic, cardac i renal degut a que en lintest i

pncrees hi ha abundant teixit limfoide o macrfags amb una crrega elevada de

CMV latent o en replicaci7,8. Tamb shan descrit com a factors de risc les

coinfeccions amb altres herpesvirus i el rebuig de lempelt. Durant el rebuig es

secreten citoquines com el TNF- i interleuquina 6 (IL6) que actuen induint la

replicaci de CMV i el pas des de lestat de latncia a la fase replicativa9.

Taula 1. Factors de risc dinfecci per CMV en pacients TOS.

Infecci primria en receptors seronegatius (D+/R-)

Factors que afavoreixen la progressi de la malaltia

- Immunosupressors

Immunoglobulines antitimoctiques

Micofenolat

Metilprednisolona

- Factors virals

Crrega viral

Virus Herpes 6 (HHV6)

Virus Herpes 7 (HHV7)

- Factors immunolgics

Mutacions en els gens de TLR2 i TLR4

Deficincia en MBL o genotip associat a la baixa producci

Factors que afavoreixen la reactivaci de CMV en els receptors

INTRODUCCI

12

- Estrs

- Cirurgia

- Hiponatrmia intraoperatria

- Sepsis o Infeccions bacterianes greus (pneumococ o bactries gram-negatives)

- Coinfecci per altres virus

- Virus Herpes 6 (HHV6)

- Virus Herpes 7 (HHV7)

Factors que disminueixen la malaltia per CMV

- Immunitat del pacient enfront CMV abans del trasplantament

- Immunosupressors: inhibidors de mTOR (sirolimus i everolimus)

- Profilaxi antiviral

- Tractament antiviral preventiu o anticipat

1.2. EFECTES DEL CITOMEGALOVIRUS

La incidncia de la infecci per CMV en receptors TOS s del 30-80% i les

manifestacions clniques poden anar des de virmia asimptomtica fins a

malaltia teixit invasiva. El perode de mxim risc dinfecci est entre el primer i

el sis mes post-transplantament i la mxima incidncia es troba entre el segon i

tercer mes.

La infecci primria succeeix quan es detecta CMV en un individu que

prviament era seronegatiu mentre que la recurrncia de la infecci s el

resultat de la reactivaci del virus latent (endgena) o de la reinfecci (exgena).

En la infecci primria, la manca dimmunitat especfica del receptor condueix a

una replicaci viral augmentada normalment associada al desenvolupament de

malaltia per CMV. En el cas de les reactivacions, la immunitat humoral i cellular

del receptor redueix el procs replicatiu donant lloc a una menor incidncia i

INTRODUCCI

13

severitat de la malaltia, que noms es desenvolupa entre el 10 i 20% dels

pacients.

Globalment, la infecci per CMV s una de les principals causes de morbi-

mortalitat, secundries tant a la malaltia invasiva per CMV amb dany tissular i

cellular (efectes directes), com als efectes moduladors de CMV sobre el sistema

immune, que sn independents de la crrega viral (efectes indirectes) (Taula

2)10,11. Els efecte directes deriven de la infecci per CMV i es pot manifestar com

a virmia asimptomtica o com a malaltia per CMV. Aquesta ltima es considera

quan un pacient presenta infecci amb signes i smptomes associats. Aquests

smptomes poden presentar-se com un sndrome viral amb febre, leucopnia,

trombocitopnia i augment de les transaminases o b com a malaltia invasiva

amb pneumonitis, enteritis, meningitis, nefritis, retinitis, cistitis, miocarditis,

pancreatitis o encefalitis.

Els efectes indirectes estan causats per la resposta inflamatria amb producci i

alliberament de citoquines o per les alteracions en la resposta immune i resposta

inflamatria de l'hoste. La replicaci viral del CMV produeix una situaci

d'immunosupressi com a conseqncia de les alteracions funcionals en els

limfcits i moncits, modificant la capacitat de resposta i la producci de

citoquines. A ms, la infecci viral pot alterar lexpressi dantgens de superfcie

provocant rebuig i/o causant la desregulaci de la proliferaci cellular. Aquests

efectes indirectes shan descrit en tots el tipus de TOS i inclouen rebuig agut i

crnic (conegut com nefropatia del rony en transplantament renal, vasculopatia

de lempelt en el transplantament cardac i bronquilitis obliterant en el

transplantament pulmonar), arteriosclerosi, diabetis mellitus post-

transplantament, associaci de CMV amb altres infeccions (bacterianes o

fngiques) i malaltia cardiovascular. La infecci per CMV tamb s'ha associat a

l'activaci d'altres herpes virus com a herpes simple, VVZ, EBV (associat amb els

INTRODUCCI

14

sndromes limfoproliferatius associats al transplantament) o herpes virus

humans (HHV-6, -7, -8).

Taula 2. Efectes directes i indirectes de la infecci per CMV

Efectes directes de la infecci per

CMV

Efectes indirectes de la infecci per

CMV

Febre i neutropnia (leucopnia,

trombocitopnia, hepatitis, nefritis,

fatiga, milgia, febre,)

Mielosupressi

Neumonia

Malaltia enteroinvasiva amb colitis,

gastritis, lcera sagnat o perforaci.

Hepatitis

Pancreatitis

Corioretinitis

Augment del risc dinfecci

secundria bacteriana, fngica o viral

Augment del risc de rebuig

Augment del ric de desordre

limfoproliferatiu post-

transplantament

Augment del risc dinfecci per HHV-

6 i 7

Diabetis mellitus

Events cardiovasculars

1.3. PREVENCI DE LA INFECCI PER CMV

Les dos principals estratgies per la prevenci de la malaltia per CMV sn la

profilaxi universal i el tractament preventiu. Les dues estratgies presenten

avantatges i inconvenients (Taula 3). La profilaxi implica ladministraci de

valganciclovir (VGCV) oral o ganciclovir (GCV) intravens (iv) entre 3 i 6 mesos a

tots els pacients o aquells considerats de risc i sinicia en el post-transplantament

INTRODUCCI

15

immediat. La terpia anticipada o preventiva (preemtive therapy) consisteix en la

monitoritzaci setmanal de la crrega viral i en linici de VGCV oral o GCV iv en

cas de detecci de replicaci viral. La primera preveu la reactivaci daltres

herpesvirus aix com els efectes indirectes, per per contra lexposici

perllongada als antivirals pot incrementar el risc de resistncia i toxicitat i sha

relacionat amb malaltia tardana per CMV. La terpia preventiva pot contribuir a

reduir el cost i toxicitat associada a la medicaci antiviral per no preveu el

efectes indirectes de CMV i la seva aplicaci depn de la logstica de cada un dels

centres. La taula 3 presenta de forma comparativa els efectes beneficiosos y les

limitacions de la profilaxis universal vs el tractament preventiu12.

Taula 3. Comparaci del efectes beneficiosos i les limitacions de la profilaxis vs la

terpia preventiva

Efecte Profilaxis Preventiu

Malaltia per CMV

Malaltia tardana per CMV

Recidiva/Fracs del tractament

Menys infeccions oportunistes

Millor supervivncia de lempelt

Prevenci del rebuig

Supervivncia

Altres virus

Limfoma post-transplantament

Sarcoma de Kaposi

+++

++

++

+++

++

++

++

+

+

+

+++

-

++

+

-

-

-

-

-

-

INTRODUCCI

16

Seguretat

Logstica

Menor cost de frmacs

Menor cost de monitoritzaci

Resistncia a CMV

++

+++

+

+++

++

+++

+

+++

+

+

Facilitat daplicar i fora de levidncia essent +++ la de major evidncia i - quan no hi ha evidncia

Les recomanacions generals segons les guies de consens sn les segents12:

- En pacients D+/R- la profilaxi universal i terpia preventiva sn aplicables

malgrat la profilaxi universal est ms recomanada i podria tenir certs

avantatges. La duraci de la profilaxi ha de ser de 3 a 6 mesos i degut a

lelevat risc de malaltia tardana es recomana la terpia preventiva durant

els 3-6 mesos desprs de la finalitzaci de la profilaxi. La incidncia

dinfecci per CMV en pacients D+/R- sense tractament s del 50%13.

- En pacients R+ (amb D+ o D-) es recomana la terpia preventiva excepte

en aquells pacients delevat risc. Aix doncs, en els pacients que reben

transplantament de pulm o intest o que hagin rebut inducci amb

immunoglobulina antitimoctica es recomana profilaxis durant 3 mesos.

- Els pacients D-/R- es consideren de baix risc i no es recomana la profilaxi.

El frmac delecci per a la profilaxi s el VGCV oral a les dosis de 900 mg cada

24h. Tal com sindica a la Taula 4, aquestes dosis shan dajustar dacord a la

funci renal del pacient utilitzant la frmula de Cockcroft-Gault de manera que

ls daltres frmules pot implicar una infradosificaci14,15. Existeix un estudi que

INTRODUCCI

17

demostra que ls de la frmula modification of diet in renal disease MDRD pel

clcul del filtrat glomerular comporta una infraestimaci del 20% en el 63.6% de

la cohort estudiada i que potencialment resultaria en una infradosificaci de

VGCV en el 45.5% dels pacients16. Aquest fet s un factor de risc, que sha de

sumar als prviament descrits, per desenvolupar malaltia per CMV i ja shan

descrit alguns casos en la literatura17.

1.4. TRACTAMENT DE LA MALALTIA PER CMV

Les guies de consens publicades indiquen com a tractament delecci pel CMV el

VGCV oral o GCV iv1,12. Durant el tractament cal monitoritzar la funci renal i

ajustar les dosis de frmac utilitzant la frmula de Cockcroft-Gault com es mostra

a les Taules 4 i 5. Una dosificaci insuficient pot comportar una manca deficcia

clnica i el desenvolupament de resistncies18,19, mentre que dosis

suprateraputiques poden implicar increments de la toxicitat20.

Taula 4. Ajust posolgic de VGCV segons la funci renal

CL creatinina (mL/min) Dosi profilaxi Dosi Infecci

60 900 mg/24h 900 mg /12h

40-59 450 mg/24h 450 mg/12h

25-39 450 mg/48h 450 mg/24h

10-24 450 mg, 2 cops per setmana 450 mg/48h

INTRODUCCI

18

Taula 5. Ajust posolgic de GCV segons la funci renal

CL creatinina (mL/min) Dosi

>50 5 mg/kg/12h

25-50 2,5 mg/kg/12h

10-25 2,5 mg/kg/24h

La reducci de les dosis de VGCV o GCV per efectes secundaris com leucopnia

sha devitar sempre que sigui possible i abans de procedir a disminuir les dosis

es recomana reduir les dosis daltres frmacs mielotxics com sn el micofenolat

de mofetil, els inhibidors de mTOR (sirolimus i everolimus) i/o cotrimoxazol. En

cas de leucopnies severes, amb recompte absolut de neutrfils inferior a 1000

L-1, caldria considerar ls de factors estimulants de granulcits.

La duraci ptima del tractament depn de la resposta clnica i virolgica. La

quantificaci de la crrega viral mitjanant la reacci en cadena de la polimerasa

(PCR) sha de determinar setmanalment per tal de monitoritzar la resposta al

tractament i el desenvolupament de resistncies a GCV. Es recomana mantenir el

tractament durant mnim dues setmanes i fins que la crrega viral sigui negativa,

essent necessari obtenir dos resultats negatius separats una setmana per

assegurar laclariment viral21,22,23. En alguns casos, un cop finalitzat el tractament,

es duu a terme una profilaxi secundria amb VGCV oral durant dos o tres mesos

en funci dels factors de risc de presentar recurrncia (infecci primria, crrega

viral basal elevada, persistncia de virmia a linici de la profilaxi secundria,

afectaci multiorgnica i increment de la immunosupressi degut a la terpia pel

rebuig)24,21.

INTRODUCCI

19

Laparici de resistncies al tractament shan descrit principalment en la

subpoblaci de pacients D+/R- en la qual, la incidncia desprs de la virmia s

del 5-12% i s superior en els pacients receptors de transplantament de

pulm25,26,27. Les resistncies estan relacionades amb mutacions en el gen UL97 i

UL54. Les presentacions clniques inclouen des de casos asimptomtics fins a

infeccions severes. Els factors de risc descrits sn: exposici perllongada a

frmacs antivirals i replicaci viral activa, elevada immunosupressi o exposici

inadequada a lantiviral28. Durant la profilaxis la incidncia de resistncia s

baixa, essent del 0 al 3%29.

2. GANCICLOVIR I VALGANCICLOVIR

El GCV s un anleg del nuclesid acclic de la guanina (Figura 1) considerat com

a primera lnea pel tractament i profilaxi enfront a infeccions per CMV en

pacients immunodeprimits i lestndard per la prevenci i tractament de CMV en

pacients TOS30. Ladministraci de GCV oral t una baixa biodisponibilitat i com a

conseqncia s necessria ladministraci iv i lhospitalitzaci del pacient i est

associat a un elevat cost, augmentant de la incidncia dinfeccions de catter i

molsties pel pacient.

Aquests motius van portar a la necessitat de desenvolupar el VGCV, un profrmac

del GCV. El VGCV s l1-valil ster del GCV (Figura 1) i s substrat dels

transportadors de pptids intestinals31,32 la qual cosa fa que presenti una

biodisponibilitat superior a la del GCV oral. En el tractament profilctic, els

resultat dels estudis dequivalncia de Wiltshire H i col33 van mostrar que

desprs de ladministraci de VGCV oral sassoleixen exposicions a GCV superiors

a les obtingudes desprs de ladministraci de GCV oral i sassocien a una

superioritat en leficcia al tractament34. Pel que fa al tractament de la malaltia

per CMV, en lestudi VICTOR24 es va demostrar la no inferioritat en leficcia de

INTRODUCCI

20

VGCV oral (900 mg/24h) vs GCV iv (5 mg/Kg/12h) en pacients TOS. El perfil de

seguretat va ser similar en els dos grups.

Figura 1. Estructura qumica

Ganciclovir Valganciclovir

2.1. MECANISME DACCI I FARMACOCINTICA DEL GANCICLOVIR

El GCV s un anleg del nuclesid acclic de la guanina que actua inhibint la

replicaci viral. Competeix amb el trifosfat de desoxiguanosina (dGTP), substrat

de la DNA polimerasa20 que s responsable de la sntesis del DNA viral. Per aix,

el GCV requereix una activaci prvia en forma de fosforilacions. La Figura 2

mostra les etapes dactivaci del frmac. El GCV entra en les cl.lules infectades

mitjanant transportadors de nuclesids i una vegada dins s fosforilat a GCV

monofosfat (etapa limitant) per una protena codificada per la UL97. A

continuaci s fosforilat a GCV di i tri-fosfat a travs de lacci de quinases

cellulars humanes. El GCV trifosfat s el responsable de la inhibici de la

replicaci viral. Daltra banda, tal com es descriu en la segent figura, desprs de

ladministraci oral de VGCV, aquest es transforma en GCV i s aquest ltim el

que actua inhibint la replicaci viral (Figura 2).

INTRODUCCI

21

Figura 2. Esquema representatiu de les etapes de trnsit i bioactivaci del GCV i

VGCV a lorganisme desprs de les respectives administracions IV i oral i del

mecanisme dacci una vegada accedeixen a les cllules infectades.

dGP=desoxiguanina trifosfat; GCV=ganciclovir; PEPT1=transportadors de pptids

intestinals; P-GCV=GCV monofosfat; PP-GCV=GCV bifosfat; PPP-GCV=GCV

trifosfat; VGCV=valganciclovir.

GCV

TRACTE GASTROINTESTINAL

VGCV

MEMBRANA GASTROINTESTINAL Transportador PEPT1

SANG

Hidrolasa Valaciclovirasa

Valina

CLLULA

MEMBRANA CELLULAR Nucleobase amb

Transportadors de nuclesids

GCV

P-GCV

PP-GCV

PPP-GCV

Quinasa viral

Quinasa cellular

Quinasa cellular

Inhibici de la sntesis DNA viral

DNA polimerasa viral

PURINA CELLULAR ENDGENA

dGTP

DNA VIRAL

INTRODUCCI

22

El GCV presenta una potent activitat antiviral enfront CMV. Malgrat t un

mecanisme dacci similar a laciclovir, s 26 vegades ms potent enfront al CMV

en base a la concentraci necessria per assolir la inhibici del 50% de la crrega

viral (IC50). Les concentracions intracellulars de GCV trifosfat en cllules

infectades sn aproximadament 10 vegades superiors a les existents en cllules

no infectades. La replicaci viral s inhibida in vitro (IC50) a concentracions entre

0.1 i 1.6 mg/L35,36.

El comportament farmacocintic (PK) del GCV sha caracteritzat en diferents

poblacions (voluntaris sans, pacients de SIDA i pacients transplantats)37,38,39, i els

primers estudis es van dur a terme en voluntaris sans o pacients HIV37. El GCV

administrat per via iv presenta un perfil de disposici biexponencial, amb una

fase inicial que reflexa una distribuci relativament rpida a teixits, i una fase de

disposici terminal ms lenta que reflexa la seva cintica deliminaci. La majoria

destudis PK que utilitzen laproximaci compartimental han descrit el perfil PK

del GCV amb un model de dos compartiments37.

La seva eliminaci s principalment per excreci renal de forma inalterada (87%),

per filtraci glomerular i secreci tubular activa mitjanant els transportadors

danions orgnic tipus 2 (OAT2)40. Per aquest motiu laclariment de GCV es

correlaciona directament amb la funci renal determinada pels valors de

laclariment de creatinina (CLCR). Aquest fet obliga a lajust de dosi per la funci

renal. La seva uni a protenes plasmtiques s baixa (1-2%) dins dun marge de

concentracions de 0-5-51 mg/L20. La relaci entre concentracions en eritrcits i

plasma s molt propera a 1 (0.8) i lequilibri de distribuci entre concentracions

plasmtiques i dins de leritrcit sassoleix rpidament41. En un dels primers

estudis PK realitzats en 4 pacients receptors de transplantament renal38, els

valors de semivida associats a la fase de disposici inicial rpida (fase alfa) van

ser de 0.29-0.47 h, la semivida associada a la fase de disposici lenta (fase beta)

INTRODUCCI

23

o eliminaci va ser de 4.29 a 10.3 h, el volum de distribuci en compartiment

central va presentar valors de 0.22 a 0.29 L/kg, el volum de distribuci en estat

estacionari va ser de 0.63 a 0.82 L/kg i els valors de laclariment plasmtic de

0.04-0.13 L/h/kg.

El GCV administrat per via oral presenta una biodisponibilitat baixa,

daproximadament el 5.6%, fet que limita lexposici sistmica. Per obtenir una

exposici del 40-50% de lobtinguda via iv a dosis de 5 mg/Kg/24h s necessria

ladministraci de 1g/8h de GCV oral42,43. A diferncia del GCV, el VGCV presenta

una biodisponibilitat 10 vegades superior al GCV (66%10%) degut al

reconeixement com a substrat dels transportadors de pptids intestinals (PEPT1 i

PEPT2). Quan sabsorbeix s rpidament hidrolitzat a GCV per acci duna

hidrolasa dsters daminocids (valaciclovirasa)44,45 present tant a la paret

intestinal com al fetge, de forma que VGCV no es troba com a tal en circulaci

sistmica46,47. El GCV entra a la cllula a travs del transportador de nuclesids.

La cintica dabsorci/transformaci del VGCV ha estat descrita com dordre en

la majoria destudis33,48. La presncia duna dieta rica en greixos afavoreix

laugment de la biodisponibilitat del GCV en comparaci amb ladministraci en

dej sense que sobservi un increment significatiu del temps per assolir la

concentraci plasmtica mxima (tmax)49.

2.2. MONITORITZACI DEL GANCICLOVIR: ESTUDIS DEFICCIA I TOXICITAT

CLNICA

Shan dut a terme diferents estudis farmacocintics-farmacodinmics (PK/PD)

clnics en la poblaci de transplantats amb lobjectiu dinvestigar la relaci de

lexposici sistmica a GCV i la prevenci de la virmia, malaltia per CMV i

laparici defectes adversos. En el primer estudi publicat50 es va avaluar

INTRODUCCI

24

leficcia en la prevenci de la malaltia per CMV de 900 mg/24h de VGCV oral vs

1000 mg/8h de GCV oral en pacients TOS dalt risc immunolgic (D+/R-) (N=364).

Els resultats van mostrar que leficcia era similar entre els dos grups de

tractament amb un perfil de seguretat comparable. Tamb van observar que els

valors dAUC desprs de ladministraci de VGCV oral eren superiors als

obtinguts desprs de ladministraci de GCV oral i els autors ho van relacionar

amb la millor supressi de la virmia i el retard en les primoinfeccions en

comparaci amb el grup GCV oral. Els efectes adversos reportats van ser

hematolgics, principalment leucopnia i neutropnia seguit de plaquetopnia i

anmia.

Amb aquestes mateixes dades, Wiltshire H i col34 van realitzar un estudi PD per

relacionar les exposicions obtingudes amb leficcia i toxicitat. Van demostrar

que la supressi de la virmia durant el tractament profilctic estava relacionat

amb lexposici a GCV estimat a travs lrea sota la corba de les concentracions

plasmtiques enfront del temps (AUC). Dacord amb aquests autors, valors

dAUC de 40-50 gh/mL permeten la supressi de la virmia durant el

tractament profilctic i redueixen la incidncia del desenvolupament de la

mateixa un mes desprs de finalitzar el tractament a valors dun 20% i 10% per a

valors dAUC de 33 i 50 gh/mL, respectivament. En lestudi sobre la

mielotoxicitat es va observar una tendncia a una menor incidncia danmia

per major incidncia de leucopnia i neutropnia en els pacients tractats amb

VGCV oral. La correlaci entre lexposici i laparici defectes adversos va

mostrar que noms hi havia una dbil tendncia a augmentar la neutropnia i

leucopnia amb lincrement de lexposici a GCV.

Posteriorment, en lestudi VICTOR24 es va estudiar leficcia del tractament de la

malaltia per CMV amb 900 mg/12h de VGCV oral vs 5 mg/Kg/12h de GCV iv

durant 21 dies seguit de tractament amb VGCV oral fins al dia 49 en tots els

INTRODUCCI

25

pacients TOS (N=321). Es va demostrar la no inferioritat de VGCV oral per no es

va relacionar amb dades dexposici al frmac. El temps mig deradicaci va ser

de 21 dies pel grup VGCV oral vs 19 dies pel grup GCV iv i les discontinuacions de

tractament van ser similars en les dos branques de tractament. La incidncia

defectes adversos va ser similar i els principalment reportats en els dos grups

van ser anmia, leucopnia, infecci del tracte urinari i diarrea.

En lestudi de seguiment dels pacients inclosos en lestudi VICTOR es van avaluar

els resultats del tractament a lany i sincloen les variables de recurrncia,

resistncia a GCV i supervivncia. Els resultats van mostrar que les taxes de

recurrncia (15.1%) eren independents del tractament inicial i que el factor

predictor de recurrncia en lanlisi multivariant era la persistncia de la virmia

al dia 21 dinici del tractament de la malaltia per CMV. Pel que fa a laparici de

resistncies i a lanlisi de supervivncia, no hi van haver diferncies en les dos

branques de tractament.

Les guies de consens sobre la prevenci i tractament de CMV remarquen la

necessitat de la dosificaci adequada per evitar la ineficcia i laparici de

toxicitat12. Malgrat aix, no indiquen la necessitat de la monitoritzaci dels

nivells de GCV en plasma, per a la posterior optimitzaci de dosis en cas dinfra o

sobreexposici, en base als estudi PD que defineixen com a diana teraputica un

AUC=40-50 gh/mL. Tot i aix, existeixen a la literatura autors que remarquen la

necessitat de monitoritzar els nivells principalment en aquells pacients amb

infeccions per CMV greus51.

Existeixen casos en que shan monitoritzat les concentracions predosi de GCV

per no hi ha cap estudi que demostri la correlaci entre la predosi i lexposici.

Calds A i col52 van demostrar la necessitat dajust de dosi en base als nivells

plasmtics de GCV per poder assolir lAUC diana i segons la funci renal. En la

INTRODUCCI

26

poblaci de pacients peditrics tamb shan analitzat les exposicions assolides en

base a diferents algoritmes de dosificaci inicial i alguns autors conclouen la

necessitat de la monitoritzaci PK degut a lelevada variabilitat observada53.

2.2.1. DETERMINACI ANALTICA DE GANCICLOVIR

Tot i que GCV sigui un frmac no incls en la rutina de monitoritzaci PK per

ajust de dosis segons ens nivells plasmtics, existeixen a la literatura diversos

mtodes per a la determinaci analtica de GCV.

Shan publicat diversos mtodes cromatogrfics emprant la cromatografia lquida

dalta resoluci (HPLC) acoblada a diferents detectors per a la detecci de GCV el

plasma, srum i altres fluids biolgics54,55,56,57,58,59,60,61. Alguns dels inconvenients

daquests mtodes es podrien resumir en: temps llargs de preparaci de les

mostres, necessitat dutilitzar tcniques dextracci per aconseguir lmits de

quantificaci ms baixos, requeriment dun volum de mostra de plasma gran

(250-1000 L), procs danlisi de llarga duraci, lmit de quantificaci elevat o

relativa baixa sensibilitat.

Per superar tots aquests els inconvenients calen noves tcniques analtiques

validades per a la quantificaci amb precisi i exactitud de GCV en plasma de

forma rutinria. En la prctica clnica rutinria s fonamental disposar de

tcniques que no suposin un gran consum de temps, que requereixi poc volum

de mostra, que siguin suficientment sensibles i en definitiva que no representin

costos molt elevats.

INTRODUCCI

27

2.2.2. ESTRATGIA DE MOSTREIG LIMITAT AMB GANCICLOVIR

La determinaci de lAUC o de qualsevol altre parmetre PK per un determinat

pacient requereix lextracci intensiva de mostres, s a dir, el nmero suficient

per poder descriure correctament totes les fases de la corba (absorci, disposici

rpida i disposici lenta) i estimar els parmetres amb fiabilitat i robustesa. No

obstant, el mostreig intensiu (8-10 mostres per pacient) no s aplicable en la

rutina clnica habitual ja sigui per motius tics, de temps i econmics i donat que

aix implicaria lhospitalitzaci del pacient.

Una aproximaci molt utilitzada per evitar el mostreig intensiu sn les

estratgies de mostreig limitat basades en predir el valor de lAUC amb la

mxima robustesa possible a partir de poques mostres obtingudes de cada

pacient. No hi ha una norma establerta sobre el nmero de mostres ptim

perqu aix depn fonamentalment de la cintica dels processos dabsorci i de

disposici de cada frmac i de lobjectiu concret de lestudi que es vol dissenyar.

Per garantir la mxima qualitat de vida pel pacient la situaci ideal seria entre

una i tres mostres per pacient. A ms, s convenient que les mostres sextreguin

durant les 8 hores posteriors a ladministraci del frmac per evitar

lhospitalitzaci i reduir costos. Un altre factor que pot condicionar els temps de

mostreig a escollir s la sensibilitat de la metdica analtica de que es disposa,

donat que les concentracions als temps seleccionats han de ser superiors al lmit

inferior de quantificaci de la tcnica analtica.

A la literatura existeixen nombrosos articles referents a mtodes per establir

estratgies de mostreig limitat amb diferents frmacs62,63. Clssicament

sutilitzaven tcniques de regressi lineal combinades amb clcul dAUCs

mitjanant lanlisi no compartimental64. Actualment, el desenvolupament de

laproximaci danlisi PK poblacional mitjanant els models defectes mixtes no

INTRODUCCI

28

lineals, combinat amb la predicci bayesiana ha marcat un canvi en la

metodologia emprada donant molt bons resultats65. En aquest sentit tamb cal

destacar lexistncia dalgoritmes que, a partir dun model poblacional

prviament desenvolupat, permeten estimar els temps ptims dobtenci de

mostra dins dun disseny destratgia limitada per predir el valor dAUC amb la

mxima exactitud respecte al valor calculat a partir dun mostreig intensiu

mitjanant la matriu dinformaci de Fisher (PFIM)66,67,68,69. Linconvenient

daquests mtodes s que, en ocasions, els temps ptims des dun punt de vista

matemtic no sn compatibles amb la prctica clnica.

En el cas de GCV, Wiltshire H i col33,50 ja van emprar una estratgia de mostreig

limitat per a desenvolupar el model PK i PD de GCV utilitzant tres finestres de

mostreig per visita: 1-3 h, 5-12 h i aproximadament 24 h postdosi.

Posteriorment, Perrottet N i col van desenvolupar un model PK poblacional

utilitzant dades de concentraci de GCV extretes a la predosi i a les 3h postdosi48

i els segents estudis PK/PD tamb van utilitzar dos temps de mostreig essent un

dells la predosi70,71. Tot i aix, la selecci dels punts de mostreig no es basen en

una estratgia prviament dissenyada i avaluada.

3. FARMACOMETRIA

Al llarg del temps shan emprat diverses metodologies danlisi de dades en

estudis PK/PD. Actualment i des de fa algun temps sha introdut el terme de

Farmacometria que es defineix com la cincia de desenvolupar i aplicar mtodes

estadstics i matemtics per caracteritzar, comprendre i predir la PK, la PD i el

comportament dels biomarcadors dun determinat frmac72. Les aproximacions

ms utilitzades en lanlisi de dades procedents destudis PK sn laproximaci

no compartimental, laproximaci compartimental clssica i laproximaci

poblacional. La principal utilitat de lanlisi PK en la prctica rutinria s com a

INTRODUCCI

29

eina de suport en la individualitzaci de la dosi durant la monitoritzaci

teraputica.

Figura 3. Eines danlisi PK per la individualitzaci de la dosis.

Tal com indica la figura 3, la individualitzaci de la dosi requereix, en una primera

etapa, la caracteritzaci des dun punt de vista PK del frmac en la poblaci diana

a la que va destinat. Aix es pot dur a terme amb mtodes de dos etapes o b

amb mtodes duna sola etapa. En els mtodes en dos etapes primer sestimen

els valors individuals dels parmetres per mtodes no compartimentals o

compartimentals i en una segona etapa es fa una estadstica descriptiva que

proporciona els valors de tendncia central o poblacionals dels parmetres i la

variabilitat associada (desviaci estndard). A ms, mitjanant tcniques

destadstica multivariant es busquen possibles correlacions entre covariables i

els parmetres PK. Aquests mtodes presenten els segents inconvenients i)

requereixen molta informaci o punts experimentals per pacient, ii) sobtenen

Aproximacin en dos etapas Anlisi en dos etapes Aproximacin en dos etapas Anlisi en una etapa

Aproximaci estndard clssic RNL:WinNonlin

EMVndar

IT2S NONMEM,

SAEM II

Mtodes paramtrics, Non-linear-mixed-effects-

models: NONMEM, Monolix, S-PLUS, R, Phoenix, S-ADAPT

Mtodes no paramtrics:

P-metrics, NONMEM

Modelo

Estimacin Bayesian

Model Farmacocintic poblacional

Estimaci Bayesiana de mxima probabilitat a posteriori

Validaci Estudi prospectiu

Mo

del

itza

ci

po

bla

cio

nal

INTRODUCCI

30

valors sobreestimats de la variabilitat associada als parmetres PK estimats i iii)

els valors dels parmetres estimats shan dimplementar en un programa de

predicci Bayesiana a posteriori per poder utilitzar aquesta informaci en lajust

de dosi. Malgrat aquests mtodes es van utilitzar en el passat ara han quedat

obsolets.

Per contra, els mtodes duna sola etapa sn prpiament els que es consideren

poblacionals dacord amb el que es descriu en el segent apartat.

3.1 FARMACOCINTICA POBLACIONAL

La PK poblacional es defineix com lestudi de les fonts de variabilitat en les

concentracions de frmac entre individus que reben un rgim de dosificaci

estndard. Aquesta aproximaci permet analitzar simultniament la informaci

de tots els subjectes en la poblaci destudi, i a) estimar el valor promig dels

parmetres PK, b) quantificar tant la magnitud de la variabilitat associada als

parmetres PK dins de la poblaci destudi com la contribuci de determinades

caracterstiques individuals (pes corporal, edat, sexe), fisiopatolgiques

(parmetres relacionats amb la funcionalitat renal o heptica) o teraputiques (la

presncia de tractaments concomitants) a aquesta variabilitat c) estimar la

variabilitat o error associat a les concentracions experimentals73,74.

Ofereix la possibilitat defectuar anlisis simultanis integrant tota la informaci

PK dun frmac, no noms a partir de dades procedents de dissenys de mostreig

relativament dispersos ("sparse data") sin tamb a partir de dades procedents

de dissenys intensius ("dense/rich data") o a partir de la combinaci dambds,

dissenys balancejats amb el mateix nmero de mostres per individus vs dissenys

no balancejats, aix com destudis que estan normalment exclosos degut a que el

seu disseny no permet lanlisi PK clssic.

INTRODUCCI

31

Tal com es resumeix en la Figura 3, dins dels mtodes poblacionals nhi ha que

utilitzen laproximaci paramtrica que assumeix distribuci normal o logo-

normals dels parmetres PK i laproximaci no paramtrica que no fa

assumpcions de normalitat i permet la identificaci de subpoblacions, que no es

podria fer amb laproximaci paramtrica. Malgrat tot, laproximaci

paramtrica s la ms emprada tal i com ho demostra el gran nombre destudis i

de publicacions que lhan utilitzat durant els ltims anys75.

El programa ms emprat s el NONMEM (Universitat de California, San Francisco,

Beal i Sheiner76) que t implementats els models no lineals defectes mixtes. No

lineal es refereix al fet que la variable depenent (concentracions) est

relacionada de manera no lineal amb els parmetres del model i a les variables

independents. Efectes mixtes es refereix a la parametritzaci: els parmetres

que no varien entre els individus sn denominats efectes fixes i els parmetres

que varien entre els individus sn denominats efectes aleatoris77. Aix els efectes

fixes corresponen als parmetres PK i coeficients de regressi de les covariables

que descriuen part de la variabilitat interindividual deguda a caracterstiques

individuals conegudes i els efectes aleatoris corresponen a la variabilitat

associada als parmetres i residual associada a les concentracions. Aquesta

aproximaci, permet lanlisi simultani de totes les dades per estimar els valors

dels parmetres PK (efectes fixes) i de la variana associada a les distribucions

dels efectes aleatoris interindividuals () i residuals ().

Mtodes destimaci Bayesiana a posteriori

Una vegada caracteritzat el comportament PK poblacional s possible estimar els

valors individuals dels parmetres PK en cada un dels pacients que pertanyen a la

poblaci destudi, mitjanant mtodes de predicci bayesiana a posteriori78.

Aquesta metodologia ha estat la ms emprada com a suport durant la

INTRODUCCI

32

monitoritzaci teraputica per la individualitzaci de la dosi en els ltims 40

anys. Laproximaci Bayesiana permet predir els valors individuals dels

parmetres i concentracions desprs dun rgim de dosificaci donat (funci de

distribuci de la probabilitat a posteriori) en base a la informaci PK poblacional

prvia (funci de distribuci de la probabilitat a priori) i dinformaci

experimental del pacient com sn les seves caracterstiques individuals,

particularment aquelles que siguin predictives del comportament PK i dalgunes

dades de concentraci plasmtica vs temps (2-3 valors).

Els mtodes destimaci Bayesiana permeten per tant i) predir les

concentracions individuals desprs dun determinat regim de dosificaci i en

funci daix reajustar la dosi ii) comparar els valors de concentracions predites

amb els observats, la qual cosa representa una validaci del model emprat tal

com es descriu tamb a la figura 3, iii) presenten molta flexibilitat en quan als

temps experimentals de presa de mostra i iv) reutilitzar els valors de

concentraci vs temps registrats durant el procs per afegir a la informaci

poblacional i millorar el model poblacional prviament desenvolupat.

3.2. MODELS FARMACOCINTICS POBLACIONALS DE GANCICLOVIR

Laproximaci dels models defectes mixtes no lineals implementada al programa

NONMEM sha aplicat per lestudi PK poblacional, dut a terme a partir de dades

de concentraci srica de GCV vs temps en diferents poblacions destudi: adults

receptors SOT, adults seropositius pel virus de la immunodeficincia hum (HIV) i

en poblaci peditrica receptors SOT. Concretament existeixen en la literatura

quatre models PK poblacionals de GCV per a la poblaci de pacients adults

receptors SOT. A la taula 6 es mostren les diferncies entre el models descrits i

els valors dels parmetres poblacionals, tant els defectes fixes o valors

INTRODUCCI

33

poblacionals dels parmetres PK com els defectes aleatoris, es a dir,

representatius de la variabilitat interindividual i residual.

El primer de tots es va desenvolupar lany 1995 en pacients amb retinitis per

CMV que eren HIV positius (53 pacients) o receptors SOT (7 pacients)79. El segon

model publicat33 es va incloure en lestudi IMPACT80 i les dades dels pacients es

van extreure dun assaig clnic randomitzat, doble cec, que avaluava leficcia i

seguretat de VGCV oral comparat amb GCV oral per a la prevenci de la malaltia

per CMV en pacient SOT dalt risc immunolgic (D+/R-)81. Els dos ltims models

es van publicar al 2009 i van incloure pacients receptors SOT sota tractament

profilctic o per malaltia per CMV. En el primer publicat per Perrottet N i col48 els

pacients estaven sota tractament profilctic i el disseny de mostreig va ser limitat

(2 mostres per pacient), per amb un nmero de pacients relativament elevat

(N=65), mentre que en el segon publicat per Calds i col52, els pacients estaven

en tractament per infecci o malaltia per CMV, la mostra era ms petita (N=20) i

el mostreig va ser intensiu (12 mostres per pacient).

INTRODUCCI

34

Taula 6. Caracterstiques dels models PK poblacionals en adults receptors SOT publicats.

Model 179 Model 233 Model 348 Model 452

Poblaci Pacients HIV o SOT amb retinitis per CMV

Pacient SOT dalt risc immunolgic (D+/R-)

Pacient SOT Pacient SOT

Tipus de tractament Tractament de la retinitis per CMV Profilaxis de CMV Profilaxis i tractament de la malaltia per CMV

Tractament de la malaltia per CMV.

Frmac administrat GCV iv GCV i VGCV oral GCV iv i VGCV oral GCV iv i VGCV oral. Mostres obtingudes Mostreig intensiu en una ocaci:

0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 15 i 24h post inici de la infusi

Mostreig dispers en dos ocasions: 1-3h, 5-12 i 24h post dosi

Mostreig dispers setmanal si tractament o mensual si profilaxis: predosi i 3 h post administraci.

Mostreig intensiu en 2 ocasions: Predosi, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6 i 12 h post inici de la infusi de GCV iv i post administraci de VGCV oral.

Comportament PK Bicompartimental Eliminaci dordre 1

Bicompartimental

Bicompartimental

Bicompartimental

Valors dels parmetres PK poblacionals Parmetres farmacocintics

CL 0.168; 0.168WT(CLCRC-G/100) (1-T)(1-CMV) + 0.382

SOT: T=0.76, CMV=0 HIV: T=0, CMV=0.41

V2 0.391WT V3 0.511WT

CLC-G 12.4 L/h V2 25 L CLD1 12 L/h V3 49 L KA 0.36 h

-1 LT 0.661 h

CL empeltCLCRMDRD1.21 (empelt: kidney 1.68, heart 0.86, lung and liver 1.17) V2 24(pes/70)0.72 L CLD1 4.1 L/h V3 19.6 L KA 0.65 h-1 F1 0.6

CL 7.49 L/h; 7.49(CLCRC-G/57) V2 31.90 L CLD1 10.20 L/h V3 32.0 L KA 0.895 h

-1 F1 0.825 LT 0.382 H

Variabilitat interindividual

2 V2 0.075

2 CL 0.182 2 V2 0.642

2 CL 0.26 2 V1 0.2

2 CL 0.107 2 V2 0.227 2 KA 0.464 2 F1 1.54

Variabilitat residual Proporcional Proporcional 1 Proporcional 1 Additiu 1 Proporcional 22

CL = aclariment; V2 i V3 = volum de distribuci central i perifric; WT = weight (Kg); C-G=Cockcrott-Gault

Per al model 4: CLD1 = aclariment intercompartimental entre el compartiment centra i perifric; KA = constant dabsorci de primer order; F = biodisponibilitat; LT = temps de latncia; 2 = variana

de la variabilitat interindividual; 1 = desviaci estndard del component additiu de la variabilitat residual; 22 = variana del component proporcional de la variabilitat residual; CLCR = aclariement

de creatinina en mL/min calculat amb Cockcroft-Gault; 57 = promig.

INTRODUCCI

35

4. ESTIMACI DE LEXPOSICI: INDIVIDUALITZACI DE LA DOSI MITJANANT

LA UTILITZACI DUN PREDICTOR BAYESI.

Els models poblacionals explicats en lapartat 3.2 mostren les covariables que

influencien la PK de GCV en pacients TOS per noms en el de Calds A i col52 es

proposa la utilitzaci del model com a predictor bayesi de forma prospectiva.

Van desenvolupar un model PK poblacional en la poblaci de pacients

trasplantats SOT infectats per CMV i en tractament amb GCV iv seguit de VGCV

via oral a partir de dades concentraci temps (12 punts per pacient i via

dadministraci) i van utilitzar el model per avaluar la dosificaci descrita pel

fabricant. Van simular els valors dexposici assolits desprs de ladministraci de

GCV i VGCV i en base a lexposici diana descrita per Wiltshire H i col33, es va

estimar lassoliment de lobjectiu teraputic.

4.1. CARACTERSTIQUES DEL MODEL APLICAT EN LA TESIS

Degut a que en aquesta tesi es realitza laplicaci del model PK desenvolupat per

Calds A i col52 en la prctica clnica, aquest sexplica ms detalladament a

continuaci.

El comportament PK del GCV desprs dambds administracions iv i oral, es va

descriure dacord amb un model bicompartimental amb una eliminaci de

primer ordre des del compartiment central, parametritzat en termes

daclariment plasmtic (Cl), volum de distribuci del compartiment central (V2),

aclariment intercompartimental (ClD1), volum de distribuci del compartiment

perifric (V3), constant dabsorci (KA), biodisponibilitat (F) i temps de latncia

(TL).

INTRODUCCI

36

Lanlisi de les dades va identificar laclariment de creatinina (CLCR) com a

predictor de laclariment del GCV (Cl) de forma que CLCR va explicar el 52.03% de

la variabilitat interindividual trobada en laclariment del frmac, que es va reduir

dun 68.19% a un 32.71% respecte al model base. No es va trobar cap influncia

del pes en els valors de Cl, com shavia descrit en al literatura anteriorment. Aix

probablement va ser degut a lestret marge de variaci en els valors del pes dins

dels pacients inclosos en lestudi. La taula 6 mostra els valors dels parmetres PK

poblacionals obtinguts en aquest estudi.

4.2. AVALUACI DE LEXPOSICI

A partir del model desenvolupat i utilitzant leina de la simulaci van avaluar el

rgim de dosificaci. Concretament, van determinar el percentatge de pacients,

que segons funci renal (CLCLR), presentaven valors dAUC entre 40-50 gh/mL.

Van realitzar una comparaci de les exposicions assolides seguint la fitxa tcnica i

seguint lestratgia dajustar les dosis en base al model PK poblacional.

Els resultats de lavaluaci van demostrar que desprs de ladministraci iv de

GCV segons fitxa tcnica, els percentatges de pacients amb AUC entre 40 y 50

gh/mL van ser noms del 13,5%; observant que per CLCR < 30 mL/min ms del

75% dels pacients presentaven AUC superiors a 50 gh/mL. Contrriament, per

CLCR > 70 mL/min, ms del 75% presentaven valors dAUC per sota de 40

gh/mL. Una tendncia similar es va observar desprs de ladministraci de

1 V2 V3 KA

Cl

ClD1 F

TLAG

INTRODUCCI

37

VCGV. Els percentatges de pacients amb AUC entre 40 i 50 gh/mL van ser del

15,6%, presentant el 98.6% (CLCR=10mL/min), 89.5% (CLCR=20mL/min) i 68.8%

(CLCR=30mL/min) de pacients un AUC > 50 gh/mL.

Per contra, els valors de les exposicions simulades amb dosis ajustades segons el

model PK poblacional, van estar en diana teraputica en el 50% dels pacients per

a tots els valors daclariment de creatinina. Els resultats daquest estudi de

Calds A i col52 demostra la importncia de lajust de dosi en base al CL individual

de cada pacient, sobretot en la poblaci de pacients SOT en que la funci renal

evoluciona al llarg del perode post-transplantament.

38

39

40

41

II. HIPTESI

42

HIPTESI

43

II. HIPTESI

s coneguda la relaci entre lexposici sistmica (AUC) a GCV i la prevenci de la

virmia, prevenci de la malaltia per CMV i laparici defectes adversos

hematolgics. Lrea sota la corba de concentracions plasmtiques de GCV est

directament relacionada amb leficcia i seguretat de manera que valors dAUC

de 40-50 gh/mL permetent la supressi de la virmia durant el tractament

profilctic i reduir la incidncia del desenvolupament de la mateixa, un mes

desprs de finalitzar el tractament. Daltra banda, una AUC superior a 50

gh/mL ha demostrat estar relacionada amb un increment tant de la

neutropnia com de la leucopnia. Amb aquests resultats podrem dir que

lassoliment dun valor teraputic dAUC podria ser la clau per aconseguir bona

eficcia en el tractament i evitar efectes adversos aix com laparici de

resistncies.

Daltra banda, s'ha demostrat que la funci renal s la variable predictora ms

important de la variabilitat observada en els nivells srics de GCV. La funci renal

s d'especial importncia en la subpoblaci de transplantats renal que presenta

valors de la funci de l'rgan trasplantat molt baixos (CLCR < 20 mL/min) en el

moment del trasplantament i va millorant al llarg del perode de seguiment. Aix

suposa la necessitat de fer lajust de dosi al llarg de tot el perode post-

transplantament, especialment en la subpoblaci de trasplantats renals i

sobretot quan el tractament sinicia immediatament desprs del

transplantament.

Segons el model poblacional desenvolupat prviament per Calds A i col52,

noms un 16% dels pacients assoleixen lobjectiu teraputic dAUC desprs de

lestratgia de dosificaci del frmac segons fitxa tcnica. Especialment, els

pacients amb valors de funci renal molt disminuda (CLCR < 30 mL/min) o

HIPTESI

44

conservada (CLCR > 70 mL/min) estarien sobredosificats i infradosificats,

respectivament, amb el risc de presentar ms efectes adversos o b fracs

teraputic.

Malgrat que el GCV no sigui un frmac que actualment es monitoritzi de forma

rutinria, la variabilitat PK observada desprs de la seva administraci representa

un problema potencial per leficcia i seguretat. La infecci per CMV juga un

paper important desprs del transplantament en termes de morbi/mortalitat,

essent la incidncia dinfecci per CMV D+/R- en pacients sense tractament del

45%. Per aquest motiu la optimitzaci de la posologia en base a un model

predictiu que permets ajustar la dosi en funci de les caracterstiques

individuals de cada pacient, per assolir lexposici adequada a GCV, seria de gran

utilitat. Com a conseqncia es minimitzarien els efectes adversos, garantint una

major eficcia en la poblaci diana i es reduirien els costs associats. Tanmateix

sevitaria laparici de resistncies secundari a la infradosificaci, com ja shan

descrit en el tractament amb GCV oral.

Per tot aix, s fonamental disposar dun model PK poblacional prviament

desenvolupat aix com del corresponent predictor bayesi. Per tant, la

individualitzaci de la dosi de GCV/VGCV en funci de les caracterstiques de

cada pacient i de les concentracions sriques de GCV, pot contribuir en gran

manera a assolir lexposici ptima al frmac en els pacients transplantats.

45

46

47

III. OBJECTIUS

48

OBJECTIUS

49

III. OBJECTIUS

Objectiu principal

Optimitzar la posologia de GCV i VGCV, assessorada per lexposici al frmac

segons lrea sota la corba de nivells plasmtics (AUC), mitjanant laproximaci

bayesiana en base al model farmacocintic poblacional prviament

desenvolupat. Savaluar lexposici assolida desprs de ladministraci de GCV i

VGCV segons lestratgia doptimitzaci i es comparar amb lAUC assolida

seguint les indicacions del laboratori fabricant.

Objectius secundaris

1. Validaci de la metdica analtica mitjanant UHPLC/UV i UHPL/MSMS

2. Establir un disseny destratgia limitada dextracci de mostres per poder

estimar parmetres farmacocintics, entre ells valors dAUC de GCV,

utilitzant laproximaci dels models defectes mixtes no lineals, amb la

mxima robustesa i fiabilitat possible emprant el menor nmero de

mostres possible.

3. Avaluar limpacte de loptimitzaci de la posologia segons el model

poblacional en leficcia estimada segons la crrega viral i millora clnica i

en els parmetres de tolerncia clnica.

50

51

52

53

IV. RESULTATS

54

RESULTATS

55

Captol 1

Determination of ganciclovir in human plasma by ultra performance liquid

chromatography UV detection.

Padulls A, Colom H, Armendariz Y, Cerezo G, Calds A, Pou L, Torras J, Griny

JM, Lloberas N.

Clinical Biochemistry 2012;45(4-5):309-14.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Padull%C3%A9s%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Colom%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Armendariz%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cerezo%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Caldes%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pou%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Torras%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Griny%C3%B3%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Griny%C3%B3%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lloberas%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22245106

RESULTATS

56

Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Clinical Biochemistry

j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /c l inb iochem

Determination of ganciclovir in human plasma by ultra performance liquidchromatographyUV detection

A. Padulls c, H. Colom b, Y. Armendariz a, G. Cerezo a, A. Caldes a, L. Pou d, J. Torras a,J.M. Griny a, N. Lloberas a,a Nephrology Department, IDIBELL, Hospital Universitari de Bellvitge, L'Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spainb Department of Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, School of Pharmacy, University of Barcelona, Spainc Pharmacy Department, IDIBELL, Hospital Universitari de Bellvitge, L'hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spaind Biochemistry Department, Hospital Valle Hebrn, Barcelona, Spain

Abbreviations: (GCV), Ganciclovir; (VGCV), Valgancacid solution; (UV), Ultraviolet; (HPLC), High-perform(UHPLC), Ultra High-performance liquid chromatogr(AUC), Area under the concentrations time curve; (Lower limit of quantifications; (SD), Standard deviatioCoefficient of variation; (RT), Retention time; (SOT), So Corresponding author at: Nephrology Service, Hos

Lab Exp Nephrology 4122, Pab. Govern, 4a planta, UB, Ftalet de Llobregat, Barcelona, Spain. Fax: +34 93 40358

E-mail address: nlloberas@ub.edu (N. Lloberas).

0009-9120/$ see front matter 2012 The Canadian Sdoi:10.1016/j.clinbiochem.2011.12.014

a b s t r a c t

a r t i c l e i n f o

Article history:

Received 27 September 2011Received in revised form 3 December 2011Accepted 16 December 2011Available online 4 January 2012

Keywords:Therapeutic drug monitoringGanciclovirValganciclovirHPLCUHPLC

Objectives: Implement a sensitive UHPLC method for the assay of ganciclovir in human plasma.Design andmethods:Wedeveloped and validated a chromatographicmethod coupled to ultraviolet detection forquantification of ganciclovir, with a short run time using a small volume of human plasma. Comparison of systemperformance was made with respect to analysis time, efficiency and sensitivity.Results: Correlation coefficients (r) of the calibration curves ranged from 0.999744 to 0.999784. Within-day andbetween-day imprecision and inaccuracy, specificity and recovery were also evaluated for validation. The methodwas precise and accurate and the retention time was 0.7 min. The calibration curves were linear between 0.5 and30 g/mL. There was a good correlation between HPLC and UHPLC techniques.Conclusions:We developed a method that is currently applied in a clinical study assessing GCV plasmaconcentration variability after ganciclovir and valganciclovir administration.

2012 The Canadian Society of Clinical Chemists. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.

Introduction

Cytomegalovirus (CMV) is themost common opportunistic pathogenaffecting solid organ transplant (SOT) [1]. Ganciclovir (GCV) a deoxygua-nosine analog was the initial choice for both prevention and treatment ofthe CMV disease in transplant patients [2]. Intravenous (IV) administra-tion of GCV (5 mg/kg/12 h given during 23 weeks or prolonged admin-istrations according to product information [3]), has been the goldstandard for the treatment of established infection, while oral GCV wasadministered for CMV prophylaxis due to its poor bioavalaibility (F) [4].Valganciclovir (VGCV), the valyl ester of GCV, is characterized by a nearten-fold higher bioavailability than GCV [5,6] and offers the perspectiveof replacing suboptimal oral prophylactic (oral GCV) and intravenous

iclovir; (TCA), Trichloroaceticance liquid chromatography;aphy; (PK), Pharmacokinetic;QC), Quality control; (LLOQ),n; (RE), Relative error; (C.V.),lid organ transplant.pital Universitari de Bellvitge,eixa Llarga s/n, 08907 L'Hospi-06.

ociety of Clinical Chemists. Publishe

57

therapeutic regimens. The approved indications [7] of VGCV are the treat-ment of CMV retinitis in HIV patients and the prophylaxis of CMVinfection in SOT patients.

Pharmacokinetic of GCV after IV GCV and/or oral VGCV has beenstudied in different patient populations. New pharmacokineticsanalyses, as population pharmacokinetics, provide predictive modelsthat allow dose adjustment.

Therapeutic GCV plasma concentrations in solid organ transplantrecipients receiving oral VGCV therapy typically range from 2.0 to20 g/mL [8]. The suppression of CMV viremia and disease is related[9] to exposure to GCV, so it is important to achieve the requiredexposure, avoiding adverse events and development of viralresistances. Only one pharmacokinetic (PK) study [10] comparedexposure to GCV between patients receiving GCV IV and oral VGCV,at steady state, in SOT patients suffering of CMV infection. A previousstudy demonstrated viraemia suppression during prophylaxis withGCV exposure (AUC) of 4050 g h/mL [9], suggesting that doseadjustment to a target exposure value would justify the developmentof a clinically applicable population pharmacokinetic model.

Some high-performance liquid chromatographic (HPLC) methodshave been described for the analysis of GCV in plasma, serum andother biological fluids [1118]. However, these HPLC/Ultraviolet(UV) methods have one or more of the following shortcomings:time-consuming extraction procedures (12, 13, 14), a requirementof large plasma volumes (2501000 L) (12, 13, 15), long run times

d by Elsevier Inc. All rights reserved.

http://dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2011.12.014mailto:nlloberas@ub.eduhttp://dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2011.12.014http://www.sciencedirect.com/science/journal/00099120

310 A. Padulls et al. / Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314

(16, 17), high limit of quantification (LLOQ) (18) or relatively lowsensitivity. Actually, ganciclovir concentrations are currently mea-sured in our reference hospital by a validated HPLC with UV detectionmethod [19]. That method either requires large sample volume or haslong run time. In order to overcome these problems, a new methodfor the analysis of GCV was developed. The aim of this work is thevalidation of the method of GCV analysis with UHPLC using UVdetection. Plasma samples of transplant recipients were determinedby the current applied HPLC method and UHPLC, and both resultswere correlated.

Materials and methods

Chemicals

GCV was a gift from Roche Pharma (Palo Alto, CA, USA). Methanol,acetonitrile, trichloroacetic acid solution (TCA) 50% and potassiummonophosphate were purchased from Merck (Darmstadt, Germany).Ultrapure water was obtained from Milli-Q UF-Plus apparatus(Millipore Corporation, Millford, MA, USA).

Apparatous and chromatographic conditions

Chormatography was performed using a Waters AcquityTM UHPLCsystem (Waters, Milford, MA, USA) with a ultraviolet (UV) detectorset to 254 nm. The separation was carried out on a UHPLC AcquityHSS T3 column (1.8 m2.150 mm) obtained from Waters (Milford,MA, USA). A Vanguard HSS T3 precolumn (1.8 m2.15 mm) wasused to prevent particles from clogging the column and to prolongcolumn life. It was equipped with cooling autosampler and columnoven enabling temperature control of the analytical column. Thetemperature of the autosampler chamber was held at 40 C. Theinjection mode was partial loop with needle overfill and the volumeinjectedwas 7.5 L. Elutionwas performed at 0.7 mL/minwith amobilephase solution that was potassiummonophosphate water solution (pH4.0; 0.02 M) containing 1% of acetonitril. The strong and weak washsolvent was methanol and water (20:80 v/v). The Acquity UHPLCsystem was equipped with an HP Pavilion (Hewlett Packard, Palo AltoCA, USA) with the EMPOWERTM software (Waters, Milford, MA, USA)to process the data (area integration, calculation and plotting ofchromatograms) throughout the method validation. The GCV areawas direct extrapolated from the daily calibration curve and only infew samples the area was manually adjusted.

Samples collection

According to a study protocol previously approved by the EthicsCommittee of University Hospital, blood samples were taken fromsolid organ transplant patients under prophylaxis or treatment withGCV and VGCV during their hospital stay and for their subsequentroutine follow-up at their scheduled medical visits. Blood samples(5 mL) were withdrawn in vacuettes tubes before and at 30, 60,90 min and 2, 3, 4, 6, 8, and 12 h after the start of GCV administration.Samples were centrifuged at 13000 rpm for 10 min at 4 C (SorvallCentrifuge, Thermo Fisher, MA, USA) and the plasma was separatedand transferred into two aliquots of 1 mL-polypropylene test tubesand stored at 20 C up to the time of analysis.

Stock solution and plasma calibration standards

Stock solution of GCV 1000 g/mL in HCl 0.1 N was further dilutedwith blank plasma for the preparation of the working solution of GCV80 g/mL. To prepare solutions for the construction of standardcurves, a measured amount of each stock solution was transferredinto a test tube and mixed well. Subsequently, serial dilutions wereperformed to create mixed standard solutions at target concentration

58

ranges of 0.5, 1, 5, 10, 16, 20, 25 and 30 g/mL. Blank plasma wasobtained from a pool of plasma of healthy volunteers and was storedmaximum 48 h at 412 C. The calibration standards were stored upto 3 months at 20 C as 200 L aliquots in 1.5 mL-polypropyleneEppendorf tubes, and thawed on the day of analysis.

Quality control (QC) samples were also prepared by spiking thestock solution into blank plasma, as described for the preparation ofthe calibration standards. The concentration levels of QC samples ofGCV (1.5, 8.5 and 15 g/mL) were selected to encompass the clinicallyrelevant range of concentrations expected in plasma samples. The QCsamples were stored up to 3 months at 20 C and analyzed everytime along with patient samples.

Sample preparation

On the day of analysis, standards and patient samples were thawed,allowed to equilibrate to room temperature and vortex-mixed. For theprecipitation of plasma protein, 50% trichloroacetic acid solution (TCA)solution (20 L) was added to 200 L of plasma samples (calibrationand patients). After being vortex-mixed, the suspensions were centri-fuged for 10 min on a bench top centrifuge at 13000 rpm at roomtemperature (Hettich Benchtop Universal 16R centrifuge, Bch, Swit-zerland). The supernatants collected were introduced into conic 1.5 mLautosampler vials (Bonded Pre-slit slilicone/PTFE septum, Waters,Milford, MA, USA) and a volume of 7.5 L was used for UHPLC analysis.

Method validation

All assay validation procedures were carried out according tocurrent guidelines [20], which include specificity, linearity, intra-dayand inter-day precision and accuracy, lower limit of quantification,recovery and stability.

Linearity and limit of quantificationLinearity was assessed by analyzing a set of five calibration curves

for plasma. Calibration curves were prepared as described in theStock solution and plasma calibration standards section above. Thelinearity of the method was determined by plotting peak area (y) ofGCV against theoretical concentration (x) of GCV. Calibration measure-ments were subjected to least square regression analysis by computerprogram, to provide information on the slope, y-intercept, correlationcoefficient (r) and the back calculated concentrations. The coefficientof correlation should be 0.9800 or greater.

The lowest limit of quantification (LLOQ) is defined as the lowest GCVconcentration that could be quantifiedwith precision and accuracy valueslower than 20%.

Precision and accuracyThe intra-assay and inter-assay precision and accuracy were evalu-

ated by analyzing 5 replicates at four different concentrations, LLOQand QC samples at three concentrations (low, medium and high: 1.5,8.5 and 15 g/mL). Mean and standard deviation (SD) were obtainedfrom back-calculated drug concentrations at each level. Accuracy andprecision were evaluated in terms of relative error (RE) and coefficientof variation (C.V.), respectively. Precision and accuracy values higherthan 15%were not accepted except at LLOQ,where it should not deviateby more than 20%.

RecoveryAbsolute recovery of extraction procedure was assessed by

comparing the peak area of the QCs (1.5, 8.5 and 15 g/mL) withthose of the reference standards prepared in HCl and injecteddirectly into the analytic column. It was expressed as percentagearea ratio of the extracted QC relative to the directly injectedreference standard.

Table A.1Comparison of system performance of UHPLC and HPLC.

Chormatograph Column Injection volume Mobile phase RT(min)

Flow(mL/min)

Detector(nm)

LLOQ(g/mL)

UHPLC Aquity WATERS HSS T3 column1.8 m2.150 mm

7.5 L K3PO4+ACN1%(0.02 M pH 4.0)

0.7 0.7 254 0.5

HPLC Kontron Diode Array ANFA-04 Nucleosil 120 C183 m 40.46 cm

40 L K3PO4(0.02 M pH 4.0)

5 1 254 0.5

311A. Padulls et al. / Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314

StabilityFreeze-thaw cycles, autosampler and long-term stability studies

were performed atfive replicates andwere studied on threeQC samples

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

A

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

Mi0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1

Mi0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20

GC

V -

0.7

24

B

Fig. B.1. Representative UHPLC Chromatogram for GCV.Typical chromatogra

59

at three concentrations (1.5, 8.5 and 15 g/mL). To evaluate freeze-thaw stability, samples were subjected to freezing for 24 h at 20 Cand thawed unassisted at room temperature for 3 cycles. Long-term

nutes.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00

nutes1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

ms showing: (A) blank plasma, (B) plasma spiked with GCV 16 g/mL.

312 A. Padulls et al. / Clinical Biochemistry 45 (2012) 309314

stability after three months under storage at 20 C was alsoperformed [19]. Mean area ratios of extracted samples after eachexperimental condition as a function of the mean area ratios of freshlyextracted samples analyzed at time zero were compared and resultswere expressed as percentages of freshly sample concentrationswhich were considered as 100%.

SpecificityTo evaluate potential chromatographic interference by other

drugs commonly co-administered in renal transplant patients, pooledblank plasma samples from different sources containing 10 g/mL ofeach drug were tested. Specificity was determined by checking theabsence of interfering peaks of endogenous or exogenous materialsat the same retention time of the analytes [19].

Chromatographic interference was studied by injecting the mixtureof GCV with conventionally coadministered drugs, including cyclospor-ine, tacrolimus, mycophenolic acid, everolimus, sirolimus, prednisone,sulfamethoxazole and trimethoprim.

Correlation with HPLC methodSamples of all patients were analyzed in duplicated by two

chromatographic techniques (UHPLC and HPLC) to determine GCVconcentrations following the conditions and performance shown inTable A.1. To ensure linear relationship between data, linearity wastested as described by Passing and Bablok [12] using Analyse-itStandard Edition software integrated into Excel '97. If linearity is given,the test of the null hypothesis a=0 and b=1 is carried out.

The analysis of GCV in serum by high-performance liquidchromatographic (HPLC)methodwithUVvis detectionwasperformedas follows. A nucleosil 120C18 3 m 40.46 cm was used. For theprecipitation of plasma protein, 20 L of TCA solution was added to200 L serum sample and vortexed and centrifugated at 10000 rpmfor 4 min. The supernatant was directly injected into HPLC system.Themobile phasewas a phosphate buffer 0.02 M (pH 4.0) and delivereda flow rate of 1 mL/min. Sample volume injectedwas 40 L and the totalruntime was 5 min.

Results

Assay performance was determined in accordance with FDA [13]guidelines for bioanalytical method validation. The method wasvalidated by determination of linearity, precision, accuracy, sensitivity,lower limit of quantification (LLOQ), and stability. In Table A.1., acomparison of the conditions and performances for the two techniquesHPLC/UHPLC is shown. The UHPLC retention time (RT) was 0.7 minmeanwhile in HPLC was 5 min. Although GCV peak was at 0.7 min,the total run time was 2.5 min because after each analysis, the UHPLCcolumn was washed by methanol and acetonitrile at a flow rate of0.7 ml/min for 1.5 min. The total run time was less than half with re-spect to the HPLC measuring more sample patients per day. TypicalUHPLC chromatogram is depicted in Fig. B.1.

Table A.2Summary of the intra and inter assay precision and accuracy data.

Spiked (g/mL) Analyzed PrecisionCV %

AccuracyRE

Intra assay (n=5)LLQ (0.5 g/mL) 0.56 g/mL 8.32 12.70Low (1.5 g/mL) 1.47 g/mL 13.09 2.00Middle (8.5 g/mL) 8.37 g/mL 1.16 1.53High (15 g/mL) 15.50 g/mL 1.02 3.33

Inter assay (n=5)LLQ (0.5 g/mL) 0.54 g/mL 18.03 7.95Low (1.5 g/mL) 1.49 g/mL 11.72 0.67Middle (8.5 g/mL) 8.45 g/mL 2.58 0.59High (15 g/mL) 15.10 g/mL 2.77 0.67

60

Linearity and limit of quantification

The correlation coefficients for all the standards were greater than0.999 and the slopes of the five curves prepared on five different dayshad a mean coefficient of variation (C.V.) of 3.63%. A typical equationfor the calibration curves was Y=2.81e+004X+2.56e+003 wherey and x were the peak-area and the GCV concentration (g/mL).

The validation of LLOQ was conducted in