facultad de ciencias de la ingenierÍa e industrias …
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UNIVERSIDAD UTE
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA E INDUSTRIAS
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
ESTUDIO ESPECTROSCÓPICO VIBRACIONAL DE LECHE CRUDA ORIGINAL Y ADULTERADA
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
NAVARRETE PALACIOS VIRGINIA ELIZABETH
DIRECTORA: ING. PATRICIA GARRIDO HARO
Quito, Julio 2021
© Universidad UTE. 2021
Reservados todos los derechos de reproducción
FORMULARIO DE REGISTRO BIBLIOGRÁFICO
TRABAJO DE TITULACIÓN
DATOS DE CONTACTO
CÉDULA DE IDENTIDAD: 1313354837
APELLIDO Y NOMBRES: Navarrete Palacios Virginia Elizabeth
DIRECCIÓN: Bartolomé de las Casas Oe8-232 y Gualberto
Arcos
EMAIL: [email protected]
TELÉFONO FIJO:
TELÉFONO MOVIL: 0987614682
DATOS DE LA OBRA
TÍTULO:
ESTUDIO ESPECTROSCÓPICO
VIBRACIONAL DE LECHE CRUDA ORIGINAL
Y ADULTERADA
AUTORA Virginia Elizabeth Navarrete Palacios
FECHA DE ENTREGA DEL
PROYECTO DE
TITULACIÓN:
Julio, 2021
DIRECTORA DEL
PROYECTO DE
TITULACIÓN:
Ing. Patricia Garrido,MSc.
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TÍTULO POR EL QUE OPTA: Ingeniera de Alimentos
RESUMEN:
La leche es un producto alimenticio de primera
necesidad y representa un eje valioso para la
economía del Ecuador. La industria láctea busca
satisfacer las necesidades de los consumidores
con la provisión de alimentos que sean inocuos y
nutritivos y para lo que se requieren diversos
métodos analíticos que garantice el monitoreo de
su calidad. Desafortunadamente, la leche es un
producto susceptible de ser adulterado, por lo
que, los entes de control como AGROCALIDAD
y el ARCSA en Ecuador deben contar con
técnicas cada vez más robustas y rápidas que
permitan realizar evaluaciones in situ. En este
sentido, esta investigación plantea el uso de
técnicas basadas en espectroscopía vibracional
(Raman) y quimiometría, como una alternativa de
análisis físico-químico que permitiría de manera
rápida y precisa evaluar la calidad de leche
X
cruda. Para esto, primero se realizaron diversos
ensayos para elaborar leches adulteradas
estables cuya apariencia sea muy cercana a la
de una leche original. Luego, se realizaron
análisis convencionales de calidad de proteína
en muestras de las leches adulteradas
intencionalmente y análisis de grasa en muestras
originales y de suero. Paralelamente, estas
mismas muestras se evaluaron
espectroscópicamente y sus espectros se
evaluaron manualmente y también con análisis
multivariados (PCA y OPLS-DA). Los espectros
Raman de las muestras originales y adulteradas
mostraron ciertas diferencias debido a la
presencia de los diferentes adulterantes
utilizados como sustitutos de grasa y proteína
principalmente (aceite vegetal, urea y sulfato de
amonio). Estas diferencias espectrales
permitieron una buena discriminación entre
grupos de muestras en el análisis quimiométrico
(OPLS-DA) y así determinar tendencias
promisorias para ser usado como un método
predictivo de análisis para determinar si una
leche es original o adulterada.
PALABRAS CLAVES: Leche cruda, autenticidad, espectroscopía
vibracional, Espectroscopía Raman
ABSTRACT:
Milk is a first need food product, and
represents a valuable stock for the
Ecuadorian economy. The dairy industry
seeks to satisfy the needs of consumers with
the provision of food that is safe, and
nutritious. Which means they require a
variety of analytical methods that are
required to guarantee the monitoring of its
quality. Unfortunately, milk is a product
susceptible to being adulterated. Therefore,
control entities such as AGROCALIDAD and
ARCSA in Ecuador must have increasingly
robust, and rapid techniques that allow “on
site” evaluations. In addition, this research
proposes that the use of techniques based
on vibrational spectroscopy (Raman) and
chemometry, as an alternative of physical-
chemical analysis that would allow to quickly,
and accurately evaluate the quality of raw
milk. Furthermore, various tests were
executed to produce stable adulterated milk
with a very close appearance of a regular
milk. Likewise, conventional protein quality
analyzes were performed on samples of the
intentionally adulterated milk, and fat
analyzes were performed on original, and
whey samples. In addition, side by side these
same samples were evaluated
spectroscopically, and their spectra were
evaluated manually and also with
multivariate analysis (PCA and OPLS-DA).
The Raman spectra of the original and
adulterated samples showed certain
differences due to the presence of the
different adulterants used mainly as fat and
protein substitutes (vegetable oil, urea and
ammonium sulfate). These spectral
differences allowed a good discrimination
between groups of samples in the
chemometric analysis (OPLS-DA), and thus
determine promising trends to be used as a
predictive method of analysis to determine if
a milk is original or adulterated.
KEYWORDS Raw milk, authenticity, vibrational spectroscopy,
Raman spectroscopy.
Se autoriza la publicación de este Proyecto de Titulación en el Repositorio Digital de la Institución.
f:__________________________________________
NAVARRETE PALACIOS VIRGINIA ELIZABETH
1313354837
DECLARACIÓN Y AUTORIZACIÓN
Yo, NAVARRETE PALACIOS VIRGINIA ELIZABETH, CI 1313354837 autora
del trabajo de titulación: Estudio espectroscópico vibracional de leche
cruda original y adulterada previo a la obtención del título de INGENIERA
DE ALIMENTOS en la Universidad UTE.
1. Declaro tener pleno conocimiento de la obligación que tienen las
Instituciones de Educación Superior, de conformidad con el Artículo
144 de la Ley Orgánica de Educación Superior, de entregar a la
SENESCYT en formato digital una copia del referido trabajo de
titulación de grado para que sea integrado al Sistema Nacional de
información de la Educación Superior del Ecuador para su difusión
pública respetando los derechos de autor.
2. Autorizo a la BIBLIOTECA de la Universidad UTE a tener una copia del
referido trabajo de titulación de grado con el propósito de generar un
Repositorio que democratice la información, respetando las políticas de
propiedad intelectual vigentes.
Quito, 15 julio de 2021
f:__________________________________________
NAVARRETE PALACIOS VIRGINIA ELIZABETH
1313354837
CERTIFICACIÓN DEL TUTOR
En mi calidad de tutor de tesis de grado, certifico que el presente trabajo que
lleva por título Estudio espectroscópico vibracional de leche cruda
original y adulterada para aspirar al título de INGENIERA DE ALIMENTOS
fue desarrollado por VIRGINIA ELIZABETH NAVARRETE PALACIOS bajo
mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería e
Industrias; y que dicho trabajo cumple con las condiciones requeridas para ser
sometido a la presentación pública y evaluación por parte del Jurado
examinador que se designe.
___________________
Patricia Garrido
DIRECTOR DEL TRABAJO
C.I. 1719410803
DECLARACIÓN JURAMENTADA DEL AUTOR
Yo, Virginia Elizabeth Navarrete Palacios, portadora de la cédula de
identidad Nº 1313354837, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi
autoría, que no ha sido previamente presentado para ningún grado o
calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que
se incluyen en ese documento.
La Universidad UTE puede hacer uso de los derechos correspondientes a este
trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su
Reglamento y por la normativa institucional vigente.
f:__________________________________________
NAVARRETE PALACIOS VIRGINIA ELIZABETH
1313354837
DEDICATORIA
Una tarea debe siempre hacerse lo mejor que pueda, cuando esta se realiza
con entusiasmo eso es felicidad, y esa felicidad es mayor cuando se la
comparte con seres extraordinarios, por esto y más dedico a:
Mi mamá Fátima, mi ángel, mi ejemplo a seguir, quien con sus palabras de
aliento y su arduo trabajo me ha brindado la confianza para seguir adelante;
a mi papá Tayron por su apoyo incondicional para cumplir mis sueños. Gran
equipo, que me formaron con valores e hicieron de mí una persona mejor con
ideales claros y pasos firmes.
Mis hermanos Ricardo y Carlos por estar presentes a lo largo de este trayecto
que hoy culmina.
A mi Princess Ivannita, mi hermosa primita, de quien muchas veces tuve que
alejarme, pero siempre entendió que era lo mejor para mí, porque me
incentivaba a estudiar a diario, y me llenaba el alma saber que en cada viaje
a Calceta ella estaría esperándome.
Principalmente dedico este trabajo a mis dos ángeles que hoy no están
físicamente, pero sé que están celebrando, porque esto era lo que ellas más
querían, pues siempre mencionaron lo capaz que yo era. Con mucho amor a
mis abuelitas: Lilia y Virginia.
Virginia Navarrete
AGRADECIMIENTOS
A Dios por el regalo de la vida y permitirme vivirla con ímpetu y entusiasmo,
además por darme la fuerza que necesité para forjar mi camino durante los
momentos de debilidad en el transcurso de mi vida universitaria.
A la prestigiosa Universidad UTE, linda y noble institución que me abrió las
puertas para que yo llegara a mi meta.
Agradezco de manera muy especial a AGROCALIDAD, por haberme abierto
las puertas para que yo desarrollara con éxito las actividades planteadas. Su
lindo equipo de trabajo fue un pilar fundamental.
A mi tutora la Ing. Patricia Garrido, por toda su guía, paciencia y linda amistad,
alguien a quien siempre le estaré agradecida por todo lo que he aprendido de
ella y recordaré con mucho cariño; a cada uno de mis profesores que fueron
parte de mi formación profesional, pero sobre todo al Dr. Luis Ramos, quién
con su sabiduría me orientó a lo largo de mi camino universitario y por su
apoyo durante mi trabajo de investigación, porque con su vocación como
maestro me inspiró a investigar y a ser mejor, le agradezco infinitamente
porque ha hecho de este trabajo algo del cual me siento orgullosa.
A todos mis compañeros, pero sobre todo a Sebas y Cris, mis amigos y
compañeros de clases, gracias por cada una de sus palabras, gracias por todo
su apoyo, se convirtieron en mis hermanos. Gracias por todo lo vivido, hicieron
de la universidad un trayecto de experiencias que jamás olvidaré.
A mi mejor amiga Belén, que ha estado conmigo en las buenas, en las malas
y en las peores, demostrando que ni la distancia ha podido con lo hermosa
que es nuestra amistad.
A Fernanda, Nurita y Madelaine, mis primas, mis hermanas, que con todo su
amor incondicional y su paciencia me han enseñado a ser mejor persona y a
trabajar cada día por mis sueños.
A Eduardo mi excelente compañero de tesis, quien cada día me motivó a la
culminación de este trabajo.
Finalmente agradecerle a mi tía Nury, quién siempre me apoyó en cada paso
y decisión que tomé, quién ha creído en mí y me ha incentivado a ser la mejor
en cualquier escenario. Gracias tía.
Virginia Navarrete
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. INTRODUCCIÓN 3
2. METODOLOGÍA 10
2.1 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS DE LECHE
ORIGINAL Y ADULTERADA
11
2.2 ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO EN MILKOSCAN 11
2.3 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO 11
2.3.1 GERBER 11
2.3.2 KJELDAHL 12
2.4 MEDICIÓN DE LOS ESPECTROS RAMAN 12
2.5 ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS VIBRACIONALES 12
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 14
3.1 EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LA LECHE CRUDA
ORIGINAL Y ADULTERADA POR LOS MÉTODOS
CONVENCIONALES
14
3.2 ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LECHE
CRUDA ORIGINAL Y ADULTERADA
15
3.3 ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LAS
SUSTANCIAS ADULTERANTES
19
3.4 ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LECHE
ADULTERADA
22
3.4.1 ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LA
LECHE MODIFICADA CON FUENTES DE GRASA
22
3.4.1 ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LA
LECHE MODIFICADA CON FUENTES DE
PROTEÍNA
24
ii
3.5 QUIMIOMETRÍA 25
3.5.1 OPLS-DA DE LOS ESPECTROS DE LAS MUESTRAS
DE LECHE CRUDA ORIGINAL Y ADULTERADA
25
4. CONCLUSIONES Y REMOMENDACIONES 28
4.1 CONCLUSIONES 28
4.2 RECOMENDACIONES 29
BIBLIOGRAFÍA 30
ANEXOS 35
iii
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Combinación de muestras para la formulación 11
Tabla 2. Resultados de grasa y proteína por (Milkoscan y métodos
referenciales)
14
Tabla 3. Principales frecuencias vibracionales Raman de leche cruda
original y suero
17
Tabla 4. Modos de vibración obtenidos en el estudio y datos teóricos
de asignaciones del aceite comercial
19
Tabla 5. Comparación de modos vibracionales y asignaciones del
aceite comercial y la leche
23
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Figura 1. Espectro Raman de leche cruda y suero 16
Figura 2. Espectros Raman de los adulterantes grasa vegetal
(arriba), urea (medio) y sulfato de Amonio (abajo)
20
Figura 3. Espectros Raman de muestras adulteradas con suero y
grasa
22
Figura 4. Espectros Raman de leche cruda (verde), suero (gris) y
leche adulterada con aceite vegetal/urea (morado) y
sulfato de amonio (azul)
24
Figura 5. OPLS-DA de Espectros Raman de muestras de leche cruda
original y modificada LC (Leche cruda); S (Suero); LC+S
(Leche cruda + suero); LC+S+G (Leche curda + suero +
grasa); LC+ S + G + SA (Leche cruda + suero + grasa +
sulfato de amonio); LC + S + G + U (Leche cruda + suero +
grasa + urea)
26
Figura 6. Muestras de leche modificada Leche; Suero; L+S (Leche
cruda + suero); L+S+G (Leche curda + suero + grasa); L+
S + G + SA (Leche cruda + suero + grasa + sulfato de
amonio); L + S + G + U (Leche cruda + suero + grasa +
urea)
35
v
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Anexo 1. Formulación y preparación de muestras de leche cruda y
adulterada
35
Anexo 2. Procedimiento para analizar contenido de proteína y grasa
en Milkoscan
36
1
RESUMEN
La leche es un producto alimenticio de primera necesidad y representa un eje
valioso para la economía del Ecuador. La industria láctea busca satisfacer las
necesidades de los consumidores con la provisión de alimentos que sean
inocuos y nutritivos y para lo que se requieren diversos métodos analíticos
que garantice el monitoreo de su calidad. Desafortunadamente, la leche es un
producto susceptible de ser adulterado, por lo que, los entes de control como
AGROCALIDAD y el ARCSA en Ecuador deben contar con técnicas cada vez
más robustas y rápidas que permitan realizar evaluaciones in situ. En este
sentido, esta investigación plantea el uso de técnicas basadas en
espectroscopía vibracional (Raman) y quimiometría, como una alternativa de
análisis físico-químico que permitiría de manera rápida y precisa evaluar la
calidad de leche cruda. Para esto, primero se realizaron diversos ensayos
para elaborar leches adulteradas estables cuya apariencia sea muy cercana
a la de una leche original. Luego, se realizaron análisis convencionales de
calidad de proteína en muestras de las leches adulteradas intencionalmente y
análisis de grasa en muestras originales y de suero. Paralelamente, estas
mismas muestras se evaluaron espectroscópicamente y sus espectros se
evaluaron manualmente y también con análisis multivariados (PCA y OPLS-
DA). Los espectros Raman de las muestras originales y adulteradas
mostraron ciertas diferencias debido a la presencia de los diferentes
adulterantes utilizados como sustitutos de grasa y proteína principalmente
(aceite vegetal, urea y sulfato de amonio). Estas diferencias espectrales
permitieron una buena discriminación entre grupos de muestras en el análisis
quimiométrico (OPLS-DA) y así determinar tendencias promisorias para ser
usado como un método predictivo de análisis para determinar si una leche es
original o adulterada.
Palabras claves: Leche cruda, autenticidad, espectroscopía vibracional,
Espectroscopía Raman
2
ABSTRACT
Milk is a first need food product, and represents a valuable stock for the
Ecuadorian economy. The dairy industry seeks to satisfy the needs of
consumers with the provision of food that is safe, and nutritious. Which means
they require a variety of analytical methods that are required to guarantee the
monitoring of its quality. Unfortunately, milk is a product susceptible to being
adulterated. Therefore, control entities such as AGROCALIDAD and ARCSA
in Ecuador must have increasingly robust, and rapid techniques that allow “on
site” evaluations. In addition, this research proposes that the use of techniques
based on vibrational spectroscopy (Raman) and chemometry, as an
alternative of physical-chemical analysis that would allow to quickly, and
accurately evaluate the quality of raw milk. Furthermore, various tests were
executed to produce stable adulterated milk with a very close appearance of a
regular milk. Likewise, conventional protein quality analyzes were performed
on samples of the intentionally adulterated milk, and fat analyzes were
performed on original, and whey samples. In addition, side by side these same
samples were evaluated spectroscopically, and their spectra were evaluated
manually and also with multivariate analysis (PCA and OPLS-DA). The Raman
spectra of the original and adulterated samples showed certain differences due
to the presence of the different adulterants used mainly as fat and protein
substitutes (vegetable oil, urea and ammonium sulfate). These spectral
differences allowed a good discrimination between groups of samples in the
chemometric analysis (OPLS-DA), and thus determine promising trends to be
used as a predictive method of analysis to determine if a milk is original or
adulterated.
Keywords: Raw milk, authenticity, vibrational spectroscopy, Raman
spectroscopy.
1. INTRODUCCIÓN
3
1. INTRODUCCIÓN
La FAO - OMS (2013), afirma que: “Se conoce como leche a la secreción
mamaria normal de animales lecheros obtenidas mediante uno o más ordeños
sin ningún tipo de adición o extracción, que se destina al consumo en forma
de leche líquida”. Por su fácil obtención pasa a ser uno de los productos de
mayor importancia a nivel industrial. La leche es un alimento que antes de ser
sometido a algún proceso previo a su comercialización es rica en una variedad
de componentes tales como: proteínas, carbohidratos, grasas, vitaminas y
minerales (Poonia et al., 2017), es decir, es una matriz compleja, que cuenta
con una cantidad y calidad de macro y micro nutrientes convirtiéndolo en un
alimento de primera necesidad, por lo tanto, es importante cada vez producir
más leche con buenos atributos físico químicos.
Hoy en día, gracias a la tecnología y a la diversificación de técnicas de
manipulación, transformación y transporte, se ha llegado a obtener distintos
productos lácteos funcionales para la salud de los consumidores. El constante
crecimiento demográfico es un factor importante que incrementa la demanda
de productos de primera necesidad que sean inocuos, seguros y nutritivos.
Por lo tanto, los mercados deben presentar una gama alta de productos que
cumplan con requisitos y estándares de calidad que el consumidor demande
(Sandra, 2014).
Proyecciones de consumo planteadas por la FAO tras diferentes estudios, han
determinado que la oferta y la demanda de productos agrícolas se basa en el
crecimiento poblacional, solo hasta el año 2007 el consumo per cápita de
leche fue de 107.4 kg/año (Mcmahon, Bennett, & McMahon, 2013) y se prevé
que para el año 2025 la producción de leche aumente 177 millones de
toneladas, por lo que se espera que el consumo de leche per cápita aumente
entre 0.8 % y 1.7 % en países en desarrollo, y en los países subdesarrollados
se tenga un aumento entre 0.5 % y 1.1 %. La población crecerá hasta los 9100
millones de personas en el 2050, por lo que el consumo de alimentos
aumentará y así mismo la leche y sus derivados serán más solicitados
(Benalcázar, 2018).
La OMS recomienda que una persona debe consumir un mínimo de 130 litros
promedio de leche al año, esto equivale a consumir un vaso de leche diario,
sobre todo aquellas personas que se las considera de riesgo, tales como:
niños, adultos mayores y mujeres embarazadas (FAO, 2009). En Ecuador la
AGSO sugiere que una persona debe consumir 160 litros de leche al año, sin
embargo en la actualidad se consumen a penas entre 90 y 100 litros de leche,
por lo que la asociación de ganaderos debe buscar cumplir con este objetivo
(Real, 2013).
4
Ecuador es un país que cuenta con una situación geográfica favorecida con
excelentes condiciones ambientales para la producción de diferentes
productos lácteos, por lo que, se considera a este sector como uno de los más
importantes en el desarrollo económico del país, debido a que genera un
sinnúmero de empleos. Según estudios realizados, en Ecuador se producen
5.5 millones de litros de leche diarios, de los cuales 2.5 millones de litros se
van a fábricas industriales y el resto queda para la informalidad (Maldonado,
2019). En el año 2014, el INEC a través de un sondeo provincial determinó
que se produjeron 5.596.361 litros de leche en el país de los cuales 4.247.849
pertenecen a la sierra, y 81.570 litros provienen de la provincia de Pichincha
(UPA, 2014).
La leche para poder ser procesada y estar apta para el consumo humano debe
ser de calidad, por lo tanto tiene que cumplir varios parámetros ya
establecidos, siendo los siguientes los más importantes: Lactosa, proteína,
grasa y sólidos totales (Toapanta, 2015). Sin embargo estos constituyentes
varían de acuerdo a varios factores como: especie, raza, ordeño, tiempo de
ordeño, ubre, estado nutricional, estaciones del año, iluminación entre
otros…(Munguía, 2010), es decir que la cantidad de estas sustancias varía y
no habrá dos muestras de leche equivalentes; aunque se toma como
referencia lo que dicta la norma NTE – INEN 09:2012.
Las proteínas son un macronutriente formadas por enlaces peptídicos entre
cadenas largas de aminoácidos, siendo su principal componente el nitrógeno
(N); en general estás cumplen un rol biológico muy importante en la vida del
ser humano, puesto que aportan energía necesaria para llevar a cabo las
reacciones metabólicas de la célula (Martínez, Martínez, & Muños, 2006).
La proteína láctea, está conformada en un 80 % por caseínas; las caseínas
se encuentran en suspensión coloidal integrando micelas de 50 a 300 nm de
diámetro, formadas por fosfoproteínas y glicoproteínas. Esta proteína se
encuentra en tres tipos α, β y kapa caseína; por otro lado, las proteínas del
suero aportan con el 20 % del total porcentual, son solubles y están formadas
por albúmina y globulinas. Adicionalmente existen otros compuestos
nitrogenados en menor cantidad (Agudelo & Bedoya, 2005). La cantidad de
proteína que debe contener la leche es de 2.9 % como mínimo según lo dicta
la NTE INEN 9:2012
Por otra parte, la grasa de la leche se encuentra formando una emulsión con
las vitaminas liposolubles (A, D y E), dicha emulsión se encuentra suspendida
en la superficie de la leche en forma de glóbulos microscópicos que miden
entre 0.1-10 um de diámetro (Zela S/ & María, 2005). La cantidad de grasa
tiene una relación con respecto a la cantidad de proteína presente en la leche
que varía entre 1.05-1.18 ggrasa/gproteína, así mismo la normativa
5
correspondiente cita que la cantidad de grasa debe ser como mínimo de 3 %
(García, Montiel, & Borderas, 2014).
La composición lipídica de la leche es del 98 % de TAG (Triacilgliceroles), es
decir que tienen una molécula de glicerol en su estructura molecular; a pesar
de ello, los ácidos grasos predominantes en la leche son los saturados de
cadena larga conformados principalmente por: mirístico (C14:0), palmítico
(C16:0) y esteárico (C18:0), estos representan cerca del 75 % de la
composición porcentual de grasa; por otra parte hay un 21 % que corresponde
los ácidos grasos monoinsaturados, siendo el más importante el oleico
(C18:1) y tan sólo un 4 % a los poliinsaturados, en forma de ácido linoleico
(C18:2) (García et al., 2014). Es necesario destacar que esta cantidad de
grasa va a cambiar de acuerdo a la alimentación del animal, puesto que las
vacas que son alimentadas con más pastos producen mayor ácido linoleico
que aquellas que son alimentadas con piensos comunes (Mendes et al.,
2016).
Lo expuesto, destaca la importancia de la leche en distintos ámbitos, por lo
que es necesario determinar su calidad. Existen varios métodos para
determinar la composición físico química de la leche, dichos métodos están
normados con el fin de proporcionar un análisis detallado a los entes de control
de calidad y a los consumidores (Mazurek et al., 2015). Los métodos
tradicionales más usados son: para proteína Kjeldahl y para grasa Gerber, así
lo mencionan las normas NTE INEN 12 y 14 respectivamente.
AGROCALIDAD, ente de control y regulación del país, tiene la
responsabilidad de controlar la producción primaria del país y por lo tanto la
competencia de evaluar la calidad de la leche cruda. En el Laboratorio de
Calidad de la Leche, acreditado ISO 17025, se realizan tres métodos
diferentes para conocer la cantidad de proteína y grasa de la leche:
Espectroscopía Infrarroja media (FTIR-NIR) con un equipo MILKOSCAN y es
el más usado por la facilidad y veracidad que tiene para el reporte de
resultados; Ultrasonido, principalmente para ensayos en campo; y los
métodos de referencia Kjeldahl (proteína) y Gerber (grasa). Cabe señalar que
la prueba Kjeldahl, a pesar de ser un método oficial, es poco usada porque
tarda alrededor de 5 horas en realizar dicho análisis y el consumo de recursos
por ende es mayor.
No obstante, la autenticidad alimentaria en la actualidad es de mucha
importancia para la investigación, ya que durante de toda la cadena de
producción, tanto insumos, materia prima y el producto terminado debe
cumplir requerimientos legales específicos que garanticen calidad. La leche
es parte de los alimentos que es susceptible de adulteración, así lo mencionan
(Zela S/ & María, 2005) (Azad & Ahmed, 2016) ya que durante las distintas
etapas de producción, desde el ordeño hasta el envasado industrial puede ser
6
modificada por una inadecuada manipulación, lo cual puede deberse a
diversos factores tales como: ambientales o humanos, causantes de la
alteración fisicoquímica de sus componentes, siendo la adición indebida de
sustancias adulterantes un factor de riesgo; esta técnica se la realiza con el
fin de aumentar las ganancias económicas, disminuyendo costes de
producción. Sin embargo, para que la adulteración sea efectiva y no sea
descubierta durante los controles, se agregan sustancias (en su mayoría
tóxicas) debido que los análisis rutinarios no detectan el tipo de componente.
Los elementos mayormente sustituidos son la grasa y la proteína láctea.
Uno de los fraudes alimentarios mayormente conocidos es el que se realizó
en China en el 2008 donde aproximadamente 54000 niños fueron
envenenados por beber leche contaminada deliberadamente con melamina
(Okazaki et al.,2009). El análisis de proteína de los alimentos esta se basa en
función del contenido de nitrógeno (N), la fórmula química de la melamina
tiene un alto contenido de nitrógeno por lo que lo hace una sustancia muy
utilizada en las prácticas de fraude alimentario. Así mismo es el caso de la
urea, otra sustancia muy empleada en la modificación de leche para
reemplazar la proteína, ya que la cantidad de nitrógeno presente en su fórmula
química es elevada (Solís-Oba et al., 2011).
Las metodologías de análisis más comunes mencionadas anteriormente no
realizan análisis exhaustivos del tipo de componente en estudio, y los métodos
para identificar específicamente la melamina y la urea tardan horas, requieren
personal muy especializado e instalaciones y equipos de alta gama. Diversos
avances en el análisis de lácteos están asociados en la determinación de
adulteraciones, entre las técnicas más empleadas se encuentran: las
cromatográficas, inmuno-enzimáticos, electroforesis capilar, PCR (Reacción
en cadena de la polimerasa) y la espectrometría de masas (Hernandez &
Peña, 2016).
En el laboratorio de AGROCALIDAD no cuentan con otros métodos más
rápidos, portátiles o portables, de menor costo y confiables para la detección
de leche cruda adulterada, por lo tanto, esta investigación pretender evaluar
el uso de la Espectroscopía Raman, un tipo de espectroscopía vibracional,
como herramienta alternativa en la identificación de adulteraciones, que toma
como guía las sustancias de proteína y grasa láctea, estos constituyentes
forman una base que permite comparar similitudes o diferencias entre datos
de muestras auténticas y muestras modificadas. Esta técnica resulta bastante
útil ya que permite realizar análisis en muestras sólidas y líquidas y
proporciona datos cualitativos y cuantitativos de la composición de las
muestras evaluadas y otorga una inspección de los alimentos mucho más
rápida, precisa y efectiva (Mazurek et al., 2015).
7
La espectroscopía vibracional se basa en la interacción de la luz con la materia
para obtener información específica de la muestra, por medio de un proceso
de emisión o dispersión de luz, lo que proporciona información sobre las
vibraciones intramoleculares y así conocer la composición química de la
muestra en estudio, debido a que las vibraciones específicas de la molécula
son como una huella molecular y es muy valiosa para identificar la naturaleza
o los componentes de una sustancia o producto (Orozco & Dávila Álvarez,
2018).
Entre las características a destacar de la Espectroscopía Raman se
reconocen las siguientes: presenta un alto rendimiento, no necesariamente
requiere etapas de preparación de muestras, tiene una detección específica y
la medición no es destructiva. Esto resulta ventajoso para obtener resultados
rápidos, principalmente en la industria alimentaria y en productos perecederos
como la leche (Mendes et al., 2016). Otra de las ventajas muy importante de
la Espectroscopía Raman es que las señales generadas por el agua y CO2
son bajas y las bandas son generalmente discretas, esto mejora la
sensibilidad de los análisis de muestras biológicas. Otra ventaja es la
disponibilidad de equipos más robustos en sistemas Raman, incluso mini
portátiles los cuales ya son comercialmente competitivos, por lo tanto, esto
extiende la posibilidad de aplicaciones para realizar análisis in situ de la leche
(Nieuwoudt et al.,2016).
No obstante una de las desventajas de la Espectroscopía Raman, es que en
muestras de leche líquida generalmente los espectros se caracterizan por
tener una pobre relación de señal/ruido debido a la dispersión difusa de la
matriz de la leche o procesos de fluorescencia (Mazurek et al., 2015). No
permite leer elementos que se encuentran en trazas es decir que se necesitan
muestras representativas; y que durante la lectura de la muestra suele
generarse ruido, lo cual dificulta posteriormente la lectura espectroscópica
(Samaniego, 2015).
El principio de la Espectroscopía Raman establece que, cuando la luz
interactúa con las moléculas de la materia, los fotones se dispersan con la
energía de los fotones incidentes, a esto se lo denomina como dispersión
elástica (Qin et al., 2017). En mecánica cuántica cuando los fotones
interactúan con una molécula, dicha molécula puede pasar de un estado de
menor energía a otro de mayor energía, el resultado de este fenómeno, es
que la molécula se relaja a un nivel vibratorio diferente de su estado inicial, es
decir a una longitud de onda distinta, y la energía entre el fotón incidente y la
energía del fotón disperso de lo denomina cambio Raman (Qin et al., 2017).
La quimiometría es una técnica que utiliza herramientas computacionales,
matemáticas y estadísticas para obtener información de los datos
experimentales de variables múltiples (Callao & Ruisánchez, 2018). Dicha
8
respuesta es de carácter cualitativo, y las herramientas quimiométricas
utilizadas se las conoce como técnicas de clasificación; el término clasificación
establece que se debe construir un modelo donde se asigne una muestra a
una categoría en función de los datos recolectados para describirlo. Bajo este
criterio un grupo de muestras van a compartir ciertas similitudes y por lo tanto
tendrán una tendencia a que permite conocer su naturaleza (Stanimirova &
Komsta, 2014).
En el área de los alimentos, la quimiometría es muy eficaz en la determinación
de adulteraciones, pues el uso de distintas técnicas tales como: el Análisis de
Componentes Principales (PCA) y las Proyecciones Ortogonales para el
análisis Discriminante de Estructuras Latentes (OPLS-DA) representan
modelos estadísticos donde se obtiene una separación entre los grupos
experimentales, tomándose como las multivariables a las medidas espectrales
(Rodrigues Júnior et al., 2016).
El PCA es un método de análisis multivariado que tiene como objetivo la
reducción de datos. Cada espectro tiene variables limitadas que se las
denomina componentes principales, por lo tanto, diferencia y proporciona la
clasificación de estas componentes obtenidas de las mediciones espectrales.
(Yazgan Karacaglar et al., 2019), de esta manera da una visión general de los
datos y se detectan anomalías y valores atípicos (Stanimirova & Komsta,
2014).
El OPLSA–DA es un método alternativo que facilita la separación e
interpretación de los distintos tipos de variaciones en los datos; procedimiento
versátil y muy ilustrativo en el modelado de predicciones para detectar las
fuentes de variación y así obtener una mejor visibilidad de lo estudiado
(Stenlund et al., 2008).
Por lo tanto, el uso de los métodos PCA y el OPLSA-DA son favorables para
la aplicación de la Espectroscopía Raman, puesto que son técnicas que
determinan cualitativamente los adulterantes den la leche, lo que permite
discriminar productos, controlar la calidad y realizar ensayos in situ, ahorrando
un sinnúmero de recursos.
En este sentido, los entes responsables de evaluar la calidad y autenticidad
de la leche están interesados en nuevas metodologías que permitan conocer
su composición, por lo que, se busca desarrollar un método robusto, simple y
confiable utilizando la Espectroscopía Raman combinada con el análisis
multivariado OPLSA – DA para identificar posibles adulterantes en leche, sin
la necesidad de una preparación previa de la muestra, porque ha demostrado
ser sensible, de bajo costo y eficaz para el cumplimiento de los objetivos
planteados.
9
El objetivo general de este trabajo fue realizar un estudio exploratorio de la
calidad de leche bovina cruda y adulterada mediante espectroscopía
vibracional.
Como objetivos específicos se planteó:
- Preparar muestras de leche adulterada con suero de leche y fuentes
de proteína y grasa.
- Medir e interpretar los espectros vibracionales Raman de muestras de
leche, suero y adulterantes.
- Evaluar los espectros Raman de muestras de leche cruda y adulterada
mediante el análisis visual y multivariado de leche cruda y adulterada,
para identificar la presencia de sustancias extrañas.
- Realizar un análisis quimiométrico a partir de los espectros Raman para
conocer la variabilidad producida por los adulterantes en la leche cruda
original.
2. METODOLOGÍA
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2. METODOLOGÍA
Los ensayos preliminares para modificar leche cruda se los realizó en el
Laboratorio de Calidad de la Leche de AGROCALIDAD, ubicado en Tumbaco,
Pichincha, Ecuador, sector la Granja.
Por otro lado, el estudio espectroscópico vibracional se realizó con el apoyo
de la Escuela Politécnica Nacional (EPN), quién facilitó el uso del laboratorio
DECAB. Se utilizó el equipo portátil Raman de la marca 𝐹𝑖𝑟𝑠𝑡𝐺𝑢𝑎𝑟𝑑𝑇𝑀 (Rigaku
Raman Technologies, Wilmingtong, MA, EEUU) para conocer los espectros
Raman de las muestras de leche cruda y adulterada intencionalmente, así
como de los adulterantes puros.
2.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS DE LECHE ORIGINAL Y ADULTERADA
Las muestras de leche cruda fueron provistas por la empresa Lácteos “La
Holandesa” ubicada en E28C Puembo. Se trasladaron en envases de
aproximadamente 500 ml sin ningún tipo de conservante. Posteriormente se
transportó en un cooler a una temperatura de 4 °C.
Este estudio se lo realizó con una cantidad representativa de leche cruda. A
una parte de la muestra se le hizo lectura de proteína y grasa por medio del
equipo MILKOSCAN de marca Foss y modelo MilkoScan™ FT1 y por medio
de las pruebas de referencia Kjeldalh y Gerber en muestras de leche original
y en el suero, el resto de la muestra se la utilizó para preparar leche adulterarla
con compensadores de proteína como el sulfato de amonio y urea, y aceite
comercial para corregir la composición de grasa.
Para la preparación de la leche adulterada se realizaron los cálculos
estequiométricos para determinar las cantidades requeridas de las sustancias
adulterantes y se ensayaron varios métodos para que la incorporación de los
componentes resultase en una mezcla homogénea. Este procedimiento no se
describirá detalladamente en la metodología con la finalidad de prevenir un
mal uso del mismo pero se explica en términos generales en el Anexo 1.
De esta manera, se obtuvieron un total de 3 combinaciones con los
adulterantes empleados. Las muestras cuentan con una codificación
específica que se asignó para identificar los espectros de la mezclas de leche
original y modificada y se detallan en la Tabla 1:
11
Tabla 1. Combinación de muestras para la formulación
Muestras Combinación
L Leche cruda
S Suero de leche
L+S Leche + Suero
L+S+G Leche + Suero + Grasa
L+S+G+SA Leche + Suero + Grasa + Sulfato de Amonio
L+S+G+U Leche + Suero + Grasa + Urea
Para cada muestra de leche tanto cruda como modificada se planteó realizar
análisis por triplicado. En la modificación de leche se utilizó como
adulterantes: Urea, sulfato de amonio, grasa vegetal y diversos surfactantes
para facilitar la emulsión completa de la muestra.
2.2. ANÁLISIS FÍSICO – QUÍMICO EN MILKOSCAN
Una vez las muestras de leche original y adulteradas se ingresaron al
Laboratorio de Calidad de Leche de AGROCALIDAD, se procedió a calentar
las muestras a baño maría, a 40 °C durante 15 minutos, para que la muestra
se homogenice. Luego se procedió a agitar la muestra y se la colocó en
envases del tamaño adecuado para el análisis en el equipo MilkoScan FT+;
posteriormente los frascos se los ubicó en racks de 10 puestos para
nuevamente agitar, de 10 a 15 veces. Después los racks fueron transportados
a través del equipo MilkoScan FT+ para realizar los respectivos análisis.
Finalmente, se procedió a realizar el proceso de análisis tal como se lo indica
en el (Anexo. 2).
2.3. ANÁLISIS BROMATOLÓGICO
2.3.1. GERBER
En un butirómetro evitando mojar las paredes internas del cuello, se midieron
y se introdujeron 10 ml de H2SO4, luego se le añadió cuidadosamente 11 ml
de leche e inmediatamente se procedió a añadir alcohol isoamílico, y se tapó
el butirómetro con ayuda de un tapón, se agitó la mezcla cuidadosamente de
manera lenta utilizando un paño envuelto, ya que la temperatura de la mezcla
incrementó (reacción exotérmica). Una vez que la mezcla se homogenizó se
la llevó a baño María a 65 °C durante 10 minutos, con el tapón hacia abajo.
Transcurrido dicho tiempo se colocó la muestra en la centrífuga por 5 minutos,
seguidamente se llevó a baño María a una temperatura de 40 °C nuevamente
para lograr una columna de grasa limpia, se movió el tapón para que la
12
columna de grasa y la escala coincidieran, se hizo la respectiva lectura y se
registró el resultado.
2.3.2. KJELDAHL
Para este análisis se homogenizaron las muestras de leche y se pesó
aproximadamente 5 g ± 0.1 mg de cada muestra. Luego se colocó cada
muestra en el tubo Kjeldahl, y se les añadió una tableta de digestión y 20 ml
de H2SO4 al 98 %, cada tubo fue etiquetado de acuerdo a una codificación pre
establecida. Se colocaron los tubos en el digestor hasta que alcanzara una
temperatura de 350 °C y el ácido se volatilice, para después continuar
calentando alrededor de 180 minutos. Posteriormente se procedió a enfriar las
muestras a temperatura ambiente.
En un matraz Erlenmeyer de 500 ml se colocó 50 ml de ácido bórico más 4
gotas del indicador de tashiro con el fin de realizar una destilación. Los tubos
Kjeldahl digestado se los acopló al equipo y este se lo programó para que la
destilación se realice en 5 minutos y 100 % de vapor. Adicionalmente a los
tubos se les añadió 100 ml de agua destilada y 75 ml de NaOH 50 %.
Finalmente cada muestra destilada fue recuperada en el matraz
correspondiente y se valoró con una solución de HCl 0.1 M, hasta tonalidad
rosa. Para calcular la cantidad de proteína presente, se usó la Ecuación 1.
% 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝐶𝑟𝑢𝑑𝑎 = % 𝑛𝑖𝑡𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜 × 6.25 [1]
2.4. MEDICIÓN DE LOS ESPECTROS RAMAN
Los espectros Raman de la leche cruda natural y la leche adulterada fueron
medidos por medio del equipo Raman portátil 𝐹𝑖𝑟𝑠𝑡𝐺𝑢𝑎𝑟𝑑𝑇𝑀 (Rigaku Raman
Technologies, Wilmingtong, MA, EEUU). Para el procedimiento de medición
de las muestras de leche cruda y las adulteradas se establecieron condiciones
que permitan tener el mejor espectro; el tiempo de exposición fue de 10
segundos y una potencia del láser de 300 mW, para detectar las dispersiones
Raman entre 100-2500 cm-1. Bajo estos parámetros cada muestra tardó entre
5 y 7 minutos en ser analizada, un total de seis tipo de mezclas fueron
estudiadas desde dos puntos distintos con tres repeticiones cada una.
2.5. ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS VIBRACIONALES
La información de los datos espectrales obtenidos con el equipo Raman
conjuntamente con información de la muestra y las condiciones de medida se
obtienen en formato .txt. Para poder utilizar la información únicamente del
espectro es necesario utilizar el programa Origin y con este separar los datos
13
X e Y de los espectros únicamente y realizar su normalización. Sobre estos
espectros se realizó un análisis de caracterización de las bandas de
dispersión y su correspondiente asignación, en base a un análisis de las
posiciones de las bandas, su forma, los constituyentes del sistema estudiado
y la información espectral reportada en la literatura.
Para el análisis quimiométrico, una vez normalizada la información espectral,
se procedió a analizar a través del software SIMCA, desde un enfoque
estadístico multivariante. Para esto las muestras de leche cruda originales y
adulteradas se evaluaron mediante el método de análisis de componentes
principales (PCA), este método discriminó las muestras entre sí y ayudó a
conocer la tendencia que estas tenían; y el método de Proyecciones
Ortogonales para el Análisis Discriminante de Estructuras Latentes OPLS-DA.
Finalmente el conjunto de muestras procesadas y normalizadas fueron
analizadas para establecer los modos vibratorios y así describir el
comportamiento de la leche cruda y de los aditivos en muestras adulteradas.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
14
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LA LECHE CRUDA ORIGINAL Y ADULTERADA POR LOS MÉTODOS CONVENCIONALES
Con el fin de determinar la calidad de las muestras de leche se procedió a
analizar las muestras a través del equipo Milkoscan y por los métodos Kjeldahl
para conocer la proteína que estas contenían; adicionalmente se hizo Gerber
en muestras originales y el suero para conocer el contenido de grasa, estos
análisis se los llevó a cabo en el Laboratorio de Calidad de la Leche de
AGROCALIDAD. Cabe mencionar que las muestras presentadas en el
laboratorio fueron enumeradas, sin presentar la etiqueta donde se
especificaba el tipo de adulterante que había sido utilizado en cada ellas, esto
con el fin de evitar sesgos al momento de la lectura. Las muestras de leche
cruda, suero y las adulteradas al ser analizadas por el equipo, dieron los
resultados que se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Resultados de grasa y proteína por (Milkoscan y métodos referenciales)
Muestra Codificación MILKOSCAN
MÉTODOS
REFERENCIALES
Grasa (%) Proteína (%) Gerber (%) Kjeldahl
(%)
1 L 3.79 3.40 3.80 3.008
2 S 0.25 0.97 0.36 0.89
3 L+S - - - 1.993
4 L+S+G - - - 2.047
5 L+S+G+SA 3.65 3.72 - 2.039*
6 L+S+G+U - - - 4.969*
* Valor de proteína en muestras adulteradas con el 4 % de concentración del adulterante.
En la Tabla 2, se observan los datos obtenidos de los métodos referenciales
Gerber, Kjeldahl y con el Milkoscan; Se obtuvieron resultados de la cantidad
de grasa y proteína de las muestras 1, 2 y 5, mientras que por la complejidad
de la matriz no se pudieron obtener resultados para las muestras 3, 4 y 6. La
norma NTE-INEN 9:2012 establece que la cantidad de grasa y proteína para
leche cruda debe ser de 3 y 2.9 % respectivamente. Por lo tanto, las muestras
1 y 5 se encuentran dentro de los límites de control aceptados, pues muestran
15
una cantidad admisible en la composición de forma clara, y estas pasarían a
un posterior tratamiento para su posible comercialización. En cuanto a la
muestra 2 que corresponde al suero, cuenta con una menor concentración
tanto en la grasa como en la proteína, porque el suero posee una mayor
cantidad de agua y da como resultado una disminución en la cantidad de sus
componentes.
Las muestras 3, 4 y 6 no fueron analizadas por medio del equipo
MILKOSCAN, puesto que presentaron un precipitado, que se debió a la
acidificación del medio y generó una descomposición residual de la matriz de
la leche. Esto se dio a causa de la inestabilidad de la emulsión respecto a uno
de los adulterantes utilizados.
El método de referencia para conocer la cantidad de proteína de la leche es
Kjeldahl; las muestras adulteradas fueron modificadas con el 4 % de
concentración del adulterante con respecto a volumen total de la solución,
este porcentaje fue escogido porque durante la preparación de las muestras,
a esta concentración la cantidad de proteína se muestra aceptable al ser
comparada con el dato del Milkoscan y con la información que se encuentra
en la literatura, por lo tanto, estas muestras podrían ser utilizadas para
cualquier tipo de práctica.
En cuanto al método Gerber se tiene una lectura de la cantidad de grasa en
muestras de leche y suero, donde su contenido es apto para que una leche
sea aceptada.
Por lo tanto, una vez realizados los análisis correspondientes usando los
métodos de referencia, se observan que ambos métodos pueden ser
fácilmente engañados, pues las muestras adulteradas con sulfato de amonio
y urea, al ser comparadas con la muestra de leche cruda pueden pasar
desapercibidas por lo que cumplirían con los requisitos necesarios en ambos
métodos. De manera similar se obtiene valores dentro del rango permitido
para el análisis de grasa de muestra adulterada realizado en el equipo
Milkoscan. Los resultados obtenidos, muestran que se pueden tener similares
resultados en soluciones adulteradas y de leche cruda, abriendo la posibilidad
de que las muestras adulteradas puedan pasar los controles de calidad de
rutina aplicados como norma oficial.
3.2. ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LECHE
CRUDA ORIGINAL Y ADULTERADA
Los espectros Raman de las muestras de leche cruda sin previa manipulación
y del suero se observan en la Figura 1. En estos espectros se aprecian las
distintas señales que corresponden a las componentes principales que tiene
16
una matriz láctea, y visualmente se percibe la variabilidad de las bandas entre
el suero y la leche. Sin embargo a simple vista las señales más intensas son
las que se encuentran entre 2452-800 cm-1.
2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250
1058
Inte
nsid
ad
Ra
ma
n
Número de Onda cm-1
SUERO
LECHE CRUDA
2452
2419,9
1374,62
1440
16561750
868
921
1126
10851556 1005
Figura 1. Espectro Raman de leche cruda y suero
En la Figura 1, se muestran los resultados característicos obtenidos durante
el análisis, la gráfica muestra los espectros de la leche sin adulterar y del
suero, y se puede apreciar que el espectro de la leche presentó una mayor
intensidad en los picos que en las muestras de suero, lo que concuerda con
lo observado en la Tabla 2, ya que en los datos obtenidos en el Milkoscan, el
suero presenta una menor cantidad de grasa y proteína debido a que este
tiene menos sólidos y una mayor cantidad de agua y por eso sus bajas
señales.
No obstante, la espectroscopía tiene efectos adversos, uno de ellos es que
durante la lectura de compuestos orgánicos se generan ciertas emisiones no
deseadas; la leche contiene el 87.5 % de agua y esta absorbe fuertemente la
luz, este efecto se lo denomina fluorescencia, que se da por la interacción de
la muestra más el efecto Raman; en estos espectros la fluorescencia suele
presentar una curvatura en la línea base con una intensidad que puede cubrir
las bandas en el Raman y dificulta la lectura espectral (Larkin, 2011).
Sin embargo, existen diversos picos que sobresalen y se muestran en las dos
matrices y de los cuales catorce son los predominantes y se le atribuyen a los
17
componentes predominantes de la naturaleza láctea. En la Tabla 3, se
muestran las principales frecuencias de la leche cruda original y del suero y
su asignación tentativa.
Tabla 3. Principales frecuencias vibracionales Raman de leche cruda original y suero
Frecuencia cm-1 Asignaciones
Leche Suero Literatura Modo Vibracional
Lactosa
- 868 869 Estiramiento C-O-C
- 921/1126 940/1015/1121 Estiramiento C-C
- 1085 1085 Estiramiento C-O-C
Proteína
1005 1005 Fenilalanina 1058 1100 Estiramiento O=P-O
(Caseína) 1374 1235/1270 Amida III 1440 1400 Estiramiento C=O 1556 1556/1705 Amida I 1656 1613 Amida II
Grasa
1056.21 1083 Flexión CH3 1374.62 1301 Torsión CH2
1440 1440 Flexión CH2 1656 1654 Estiramiento C=C 1750 1747 Estiramiento C=O
La leche es una sustancia orgánica, por lo tanto es una mezcla de diferentes
compuestos tales como grasas, minerales, vitaminas, proteínas y azúcares,
que a su vez se verán reflejados en los espectros Raman, o al menos los
modos vibracionales que tienen una mayor intensidad.
El ruido pertenece a las demás bandas que no fueron asignadas, sin embargo
no es algo representativo, ya que el ruido es una intensidad indeseada que
interfiere durante la medida espectral y obstaculiza significativamente la
calidad de la información (Bey, 2010).
En la literatura se puede observar que en el espectro de la leche y del suero,
la lactosa tiene cinco picos principales: 869, 940, 1015, 1085 y a 1121 cm-1
(Li et al., 2015), en este estudio los picos de la lactosa se encontraron en 868
cm-1, que corresponde a la vibración del estiramiento O - C - O, en 921/1126
cm-1, se le atribuye al estiramiento de C=C y a 1085 cm-1 a la vibración del
estiramiento del C-O-C (Tabla 3). Cabe mencionar que los espectros de la
lactosa se ven mucho más intensos en el suero que en la leche por la
concentración con la que esta se encuentra; la concentración está relacionada
directamente con la intensidad de las señales.
18
Teóricamente se conoce que la leche contiene compuestos de naturaleza
lipídica como los trialgliceroles (TAG). Esta molécula está formada por una de
glicerol que tiene esterificados sus tres grupos hidroxilo por tres ácidos grasos
que pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados (García et al.,
2014). Los lípidos de la leche son considerados una fuente de ácidos grasos
esenciales; la grasa de la leche tiene más de 400 ácidos grasos distintos, pero
los principales son el linoleico (C18:1), palmítico (C16:0) y el esteárico (C18:0)
cuyas concentraciones son de 29, 26 y 14 % respectivamente. No obstante,
la mayoría de los ácidos grasos de la leche solo se encuentran en trazas de
concentración (El-Abassy et al., 2011).
Por lo mencionado, en la Figura 1, que corresponde a los espectros de la leche
y suero en condiciones normales, se puede observar que los ácidos grasos
de la leche y el suero se encuentran en la zona de (1056.21 - 1750 cm-1), en
dicha zona existen picos relevantes, por lo que, en los espectros las señales
más intensas están a 1056.21 cm-1 y se le atribuye a la flexión de CH3, en
1374.62/1440 cm-1 se le asigna a la flexión dada por CH2. Otras señales para
la grasa de la leche se encuentran en 1656 y en 1750 cm-1 y pueden asignarse
a modos de estiramiento C=C y C=O, respectivamente (Mendes et al., 2016).
Otro componente de la leche que se estudió fue la proteína láctea; se conoce
que las caseínas y las proteínas del suero son los principales componentes
de las proteínas de la leche, sus señales se caracterizan por ser más intensas
y por estar bien definidas, se encuentran ubicadas en la zona de 1005 - 1730
cm-1 y esto se debe a los enlaces peptídicos, amidas y dobles enlaces (Solís-
Oba et al., 2011), que son característicos en la unión de las cadenas de
aminoácidos que componen una proteína.
La señales de la proteína de la leche en este estudio se encontraron
distribuidas de la siguiente manera, a los 1005 cm-1, se ubicó la fenilalanina,
que es un aminoácido presente en las proteínas; existen muchas bandas
pequeñas que son las amida I y amida II, y se encuentran en la región desde
los 1556 y 1656 – 1750 cm-1, estas bandas fueron el resultados de las
combinaciones vibracionales de los enlaces peptídicos, en 1235 y 1270 cm-1
por amida III, lo que es comparable con lo que se menciona en el estudio
realizado por (Etzion et al., 2004), ya que si observa en la Tabla 3, las bandas
de las lecturas espectroscópicas se encuentran en las mismas señales que
las indica la literatura; por otra parte, en 1400 cm-1 se tiene un estiramiento
C=O, así mismo también se encuentra banda de estiramiento O=P-O
característico de la caseína a los 1100 cm-1 (Li-Chan, 2007).
Las señales que se observan en la zona de los 2400 cm-1, corresponden a los
estiramientos de lo OH teniendo 2 señales muy intensas.
19
3.3. ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LAS SUSTANCIAS ADULTERANTES
De acuerdo con lo planteado en la presente investigación para la preparación
de leches adulteradas se utilizó suero de leche para ganar volumen, urea y
sulfato de amonio para compensar la proteína de la leche y aceite comercial
para compensar la composición de la grasa. En la Tabla 4, se puede observar
los principales modos de vibración de los adulterantes utilizados y sus
correspondientes espectros en la Figura 2.
Tabla 4. Modos de vibración obtenidos en el estudio y datos teóricos de asignaciones del aceite comercial
Frecuencia cm-1
Asignaciones Proteína
Urea 1011 Estiramiento simétrico N-C-N
Sulfato de Amonio 975 Vibraciones N-H
Grasa
Literatura Aceite comercial Asignaciones
Soja Palma
1264/1303 1266/1303 1262/1303 Deformación =C-H; Torsión de CH2
(En el plano)
1445 1444 1442 Flexión del CH2
- 1655 1653 Estiramiento C=C
1745 1747 1750 Estiramiento –C-C=O
La Tabla 4, muestra las principales vibraciones que se dan entorno a las
sustancias empleadas para la sustitución de grasa. En la Figura 2, se observa
que las principales señales Raman para estas sustancias se encontraron en
la región espectral 975 a 1750 cm-1.La diferencia entre estos espectros
podrían utilizarse para detectar el comportamiento de estos y así distinguir de
qué tipo de adulterante químico se trata, en el caso de que estos sean los
utilizados, y cómo estos marcarían la diferencia para que finalmente se pueda
discriminar entre la leche original y adulterada.
20
3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Número de Onda cm -1
Sulfato de Amonio
975 cm-1
Inte
nsid
ad
Ra
ma
n
Urea 1011 cm-1
Aceite Comercial
1262 cm-1
1303 cm-1
1442 cm-1
1653 cm-1
1750 cm-1
Figura 2. Espectros Raman de los adulterantes grasa vegetal (arriba), urea (medio) y sulfato de Amonio (abajo)
En el espectro del aceite comercial empleando durante la adulteración se
observan varias bandas de las cuales predominan las de 1262-1303 cm-1,
1442 cm-1, 1653 cm-1 y 1750 cm-1, estas señales se produjeron debido a los
componentes del aceite en este caso fue una mezcla de aceite de soya y de
oleína de palma refinada y blanqueada.
Como se lo mencionó anteriormente, todos los aceites tienen TAG, que es
una molécula de glicerol unida a tres ácidos grasos, sin embargo los ácidos
grasos pueden variar según cada compuesto. De acuerdo con Gálvez (2017),
21
cita que el aceite de soya dentro de su composición contiene cantidades de
ácidos grasos tales como el oleico, linoleico y linolénico, los picos en el
espectro del aceite se los encuentra en 1264, 1303, 1445 y 1745 cm-1, y esto
se debe a los dobles enlaces de las moléculas de los ácidos grasos (Lee et
al., 2013).
Por otro lado, la oleína de palma contiene una mezcla de ésteres de glicerol
que se encuentran en forma de ácidos grasos insaturados como, ácido oleico
y el linoleico, y también en forma de ácidos grasos saturados tales como el
palmítico y el esteárico; los picos predominantes en la oleína de palma según
Martín-Ramos et al., (2018) y Weng et al., (2003), se encuentran en: 1266
cm-1 por la deformación en el plano =C-H en un doble enlace cis no conjugado,
a 1303 cm-1 por la torsión de CH2 en =C-H flexión en el plano, a 1444 cm-1,
se le atribuye a la deformación de tijera del CH2, en 1655 cm-1, se da por el
estiramiento C=C y en 1747 cm-1 que viene dado por la vibración del
estiramiento del carbonilo del éster del triglicérido (-C-C=O).
El espectro en rojo de la Figura 2, corresponde a la urea, este sustituto
químico se lo empleó, porque en su fórmula molecular CO(NH2)2 cuenta con
dos grupos amino, y su alto nivel de contenido de nitrógeno incrementa el
contenido de proteína medido a través de las pruebas de rutina, ya que éstas
miden el contenido de nitrógeno total como una indicación de los niveles de
proteína; la señal más intensa de la urea en el espectro se encuentra en los
1011 cm-1, esto se debe al estiramiento simétrico que existen alrededor del
enlace N-C-N (Nieuwoudt et al., 2016).
El espectro en azul, corresponde al sulfato de amonio, al igual que la urea se
utiliza porque su fórmula molecular (NH4)2SO4, contiene una alta cantidad de
nitrógeno, y este es un indicador para determinar proteína. Se puede observar
que su señal más intensa se encuentra a los 975 cm-1, que viene dado por el
modo de estiramiento simétrico del SO4 (Larkin, 2011).
Cabe mencionar, que la leche al ser una sustancia compleja poco miscible
con otras, por la polaridad de sus moléculas es una emulsión del tipo grasa
en agua (W/O), es decir es “termodinámicamente inestable”, por lo que para
adulterar leche, existió la necesidad de utilizar diversos surfactantes que
cumplan la función de tensioactivos y de estabilizantes, tal como lo menciona
Aranberri et al., (2006), donde cita que el uso de los agentes tensioactivos son
importantes para la formación de agregados ya que estos se asocian en
soluciones acuosas, porque estas moléculas tienen la peculiaridad de contar
con una parte polar y otra apolar, dicha característica facilita la adsorción en
las interfases, dando como resultado cierto tipo de afinidad y así tener una
sustancia estable. Por lo tanto estas sustancias se las utilizó con la finalidad
de obtener mezclas homogéneas y emulsiones estables en la modificación de
leche con los adulterantes empleados. Estos serían poco perceptibles en los
22
espectros debido a que solo se los uso en pequeñas trazas de concentración,
en porcentajes mínimos cercanos a 0.2 %.
3.4. ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LECHE ADULTERADA
Los espectros de muestras modificadas se muestran en las Figuras 3 y 4. En
las medidas espectrales tanto en muestras de leche cruda como en suero lo
que se esperaría diferenciar de manera visible principalmente serían las
señales correspondientes a las grasas y proteínas, por lo tanto, se los puede
considerar como indicadores vibracionales para la evaluación de la calidad de
leche cruda.
3.4.1. ANÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LA LECHE MODIFICADA CON FUENTES DE GRASA
La Figura 3, muestra el comportamiento de las bandas Raman de la leche, del
suero y de la mezcla leche + suero sobre una leche adulterada con aceite
vegetal.
2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250
Inte
nsid
ad
Ra
ma
n
Número de Onda cm-1
Leche
Suero
Leche+Suero
Leche+Suero+Grasa
12621442
1653
1750
1056,211374,62
Figura 3. Espectros Raman de muestras adulteradas con suero y grasa
En la Figura 3, además de mostrar la tendencia que tienen las bandas de la
leche cruda y del suero, lo que se espera es que las señales del espectro en
la mezcla de leche y suero (línea roja), sean menos intensas que las de la
leche pura ya que para las adulteraciones se hizo con una base del 50 % leche
23
y 50 % suero; por lo tanto, las señales son bajas ya que la cantidad de los
componentes disminuyen y no es equívoco que en el espectro muestre la
misma tendencia pero con una intensidad menor al tratarse de la misma
matriz.
Por otra parte, el espectro de la mezcla de leche, suero y aceite se mostró
aceptable, el cual permite visualizar cómo la leche se comporta en presencia
de otras sustancias; el rango espectral que va desde 1056.21-1750 cm-1
muestra señales de los lípidos de la leche, y se esperaría que también
aparezcan algunas bandas de los lípidos del aceite comercial en el espectro
color morado, sin embargo, a pesar de que tanto la leche como el aceite
comercial utilizado tienen lípidos principalmente TAG, la composición es
distinta, y se espera que esa diferencia también se vea en los espectros.
El perfil lipídico en todos los espectros de la Figura 3, cuentan con
trialgliceroles en su estructura molecular, y estos tienen la singularidad de
generar algunas señales de Raman intensas por su grado de polarización en
algunos enlaces de su estructura química; por lo tanto, lo que se espera es
que los espectros Raman sean sensibles a los cambios estructurales y a la
interacción de las moléculas en la leche original y el adulterante.
En la Tabla 5, se observa una comparación de los modos vibracionales de la
grasa del aceite comercial y de la leche, las bandas que tienen la señal en
1056.21 y en 1374.62 cm-1 (líneas punteadas negras) si se ven en los
espectros de los 4 casos, en cambio las bandas de la leche que van de la
región de1440-1750 cm-1 (líneas punteadas naranjas) no mostraron señales
claras, esto se debe a una superposición de algunas de las bandas, por lo que
sí se podría notar el uso de sustancias adulterantes.
Tabla. 5 Comparación de modos vibracionales y asignaciones del aceite comercial y la leche
Grasa
Frecuencia cm-1 Asignaciones
Ac. Comercial Leche
- 1056.21 Flexión del CH3
1262/1303 1374.62 Deformación =C-H; Torsión de CH2 (En el plano)
1442 1440 Flexión del CH2
1653 1656 Estiramiento C=C
1750 1750 Estiramiento –C-C=O
*Ac = Aceite comercial
24
3.4.2. ÁNÁLISIS DE LOS ESPECTROS RAMAN DE LA LECHE MODIFICADA CON FUENTES DE PROTEÍNA
La superposición de bandas se da porque tanto el sulfato de amonio como la
urea tienen bandas de frecuencia cercanas a la proteína láctea, uno de los
compuestos de la proteína que se verían ocultos es la fenilalanina que se
encuentra en los 1005 cm-1 (línea roja), esta no se encuentra de manera
limpia en el espectro y no podría visualizarse de una forma definida y no
permitiría observar lo que la leche naturalmente contiene. La Figura 4 muestra
cómo las bandas de los compuestos utilizados se superponen sobre la
muestra de leche cruda.
2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250
975
Inte
nsid
ad
Ra
man
Número de Onda cm-1
Leche
Suero
Leche+Suero+Aceite+
Sulfato de Amonio
Leche+Suero+Aceite+Urea
1011
1058
1440
13741556
1656 1005
Figura 4. Espectros Raman de leche cruda (verde), suero (gris) y leche adulterada con
aceite vegetal/urea (morado) y sulfato de amonio (azul).
El espectro de la leche modificado con sulfato de amonio, muestra claramente
la señal del sulfato de amonio en los 975 cm-1 (línea naranja), asimismo el
espectro de la leche modificado con urea, muestra una señal muy clara a los
1011 cm-1 (línea rosada), la señal es débil, se debe a la baja concentración en
la que se encuentran dichos adulterantes utilizados; sin embargo, ambos
estarían afectando a la fenilalanina, pues no se ve clara en ninguna de la dos
muestras.
25
Así también es el caso de la caseína de la leche, cuya señal se encuentra en
los 1058 cm-1 (línea morada), se la ve predominante en la muestra de leche
sin modificar (espectro rojo), pero no sucede lo mismo en las muestras
modificadas, no se limpia en los espectros y se debe la interacción de los
adulterantes en esta zona espectral.
No obstante las otras bandas, que corresponden a las demás componentes
de la proteína láctea, referente a las aminas I, II y III marcadas con líneas
punteadas de color vino, presentaron una misma tendencia para los cuatro
casos, se mostraron definidas, pues los adulterantes utilizados no
intervinieron en la lectura, por lo tanto la identificación de estos adulterantes
proteicos estarían cerca de la caseína y de la fenilalanina ya que estas no se
ven definidas en los espectros.
3.5. QUIMIOMETRÍA
En el análisis espectral de las muestras de leche puras y las adulteradas, se
pudieron observar pequeñas variaciones en los espectros, por lo que, un
análisis de estas diferencias espectrales utilizando Quimiometría fue
necesario. Para esto se planteó utilizar el modelo de Análisis de Componentes
Principales (PCA) y el de Proyecciones Ortogonales para el Análisis
Discriminante de Estructuras Latentes (OPLS-DA). Estas herramientas sirven
para identificar diferencias o tendencias mínimas a través de una separación
de muestras de acuerdo a su la naturaleza química. En este caso las
diferencias entre las muestras de leche original y de leche modificada con los
adulterantes contemplados en este estudio, pues según sea el caso de la
muestra van a tener vibraciones diferentes, por lo tanto estos métodos son
capaces de identificar el tipo de muestra según su comportamiento de manera
individual, a través del programa SIMCA.
El Análisis de Componentes Principales, se lo realiza con el fin de mostrar la
variabilidad que existen entre los datos espectrales de las muestras de leche
cruda y las muestras de leche adulterada. Sin embargo, este método no
mostró buenos resultados, pues no existió una apropiada discriminación entre
las muestras analizadas, y no se observaron diferencias significativas; esto
sucede cuando la variabilidad es mínima y por lo tanto no hay el agrupamiento
ideal buscado (Verde, 2019).
3.5.1. OPLS-DA DE LOS ESPECTROS DE LAS MUESTRAS DE LECHE CRUDA ORIGINAL Y ADULTERADA
Por otro lado, el método OPLS-DA sirve para separar la variación predictiva
de la no predictiva (Y-Ortogonal), que es la variación dentro de la clase. Este
método separa de forma eficaz la dirección discriminatoria desde la dirección
26
ortogonal (Stenlund et al., 2008). La Figura 5 muestra diagramas de
dispersión 3D, que permiten observar un correcto agrupamiento y buena
discriminación de las muestras de cada tipo. Este modelo representó
aproximadamente el 17.28 % de la variación total en X.
Figura 5. OPLS-DA de Espectros Raman de muestras de leche cruda original y modificada LC (Leche cruda); S (Suero); LC+S (Leche cruda + suero); LC+S+G (Leche curda + suero + grasa); LC+ S + G + SA (Leche cruda + suero + grasa + sulfato de amonio); LC + S + G + U (Leche cruda + suero + grasa + urea)
Todas estas variaciones permitieron que los grupos se dispersen entre sí y se
diferencien los unos de los otros. Las muestras que fueron adulteradas
mostraron una mayor separación, esto es comparable con lo que se vio en el
espectro, dichos adulterantes cambiaron de forma más significativa los
espectros al ser comparados con leche original, generando una adición de
nuevas bandas en el espectro y por lo que, se esperaba que en el análisis
quimiométrico la tendencia de discriminación sea mayor con respecto a las
demás muestras.
27
Finalmente, cabe mencionar, que no existieron valores atípicos en las
lecturas, es decir todos se encontraron dentro de la eclipse T2 de Hotelling
con una confianza del 95 %, por lo que, el modelo muestra una buena
perspectiva de discriminación de las muestras. Cabe recalcar que este
análisis Quimiométrico es preliminar y presentó buenas perspectivas para que
se desarrolle un modelo quimiométrico utilizando un grupo de muestras para
el calibrado y otro para la validación y con lo que se podría ya realizar un
estudio de aplicación en campo.
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
28
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. CONCLUSIONES
• Se obtuvieron espectros Raman de muestras de leche original y de
adulterada artificialmente, estos a su vez permitieron conocer la tendencia
y comportamiento espectral de la leche en presencia de sustancias
diferentes de la matriz láctea.
• Se pudo demostrar que, el uso de sustancias adulterantes y el uso de
tensioactivos para corregir las cantidades de grasa y proteína de la leche
cruda adulterada mediante la preparación de emulsiones funciona y que
además permiten “engañar” a las pruebas convencionales existentes, para
el análisis de calidad de leche.
• Por medio de los espectros medidos de la leche y el suero, se observó que
los espectros cuentan con ciertas similitudes, sin embargo, las señales
fueron menos intensas en el suero que en la leche en la zona de las
proteínas ya que el suero no tiene caseína que da su señal más intensa a
los 1058 cm-1, así mismo es el caso de la lactosa cuyas señales fueron
más intensas en el suero.
• En el caso de las muestras adulteradas con aceite comercial, los espectros
presentaron una superposición de bandas en la zona que va de 1440-1750
cm-1, por lo que se puede identificar el uso de aceite vegetal.
• En el caso de la adulteración con fuentes de proteína, el sulfato de amonio
y la urea mostraron sus señales más intensas en 975 y 1011 cm-1
respectivamente; estas señales se encuentran cerca de la fenilalanina en
1005 cm-1 y de la caseína a los 1058 cm-1; por lo tanto las bandas de los
adulterantes utilizados representan un problema por la superposición de
bandas en muestras de leche original.
• El método OPLS-DA resultó una mejor opción que el método PCA, para
conocer la variabilidad espectral de las muestras de leche original y sus
modificaciones, pues permitió observar una mejor separación de las
muestras, por lo tanto, permite la posibilidad de generar un modelo
ampliado para la discriminación de este tipo de muestras.
29
4.2. RECOMENDACIONES
• Es recomendable implementar nuevos métodos para la identificación
de alimentos adulterados. Hoy en día la adulteración de la leche ha ido
en aumento, esto de cierta manera desalentaría a la población en
general al consumo de este alimento tan nutritivo; por lo tanto, se
sugiere implementar diversos métodos nuevos que permita realizar
análisis in situ, para evitar prácticas fraudulentas considerando que
existe una larga lista de posibles adulterantes lo que agrava los
problemas de su detección analítica.
• Se sugiere el uso de la Espectroscopía Vibracional Raman para
evaluar muestras adulteradas, pues es una técnica que demuestra ser
efectiva y eficaz y que además presenta ventajas como permitir el uso
sin una preparación previa de la muestra, rapidez, no es destructiva y
no requiere el uso de consumos de reactivos y materiales.
• Se aconseja el uso de quimiometría conjuntamente con la
espectroscopía vibracional, pues en muchos procesos de análisis se
cuenta con un número de variables asociadas al control de calidad, y
la mayoría están relacionadas entre sí, lo cual resulta complicado
analizar por separado, sin embargo, la quimiometría permite reducir el
número de variables considerablemente y conocer la mayor
variabilidad según los datos obtenidos espectroscópicamente.
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TECNOLÓGICOS DE LA LECHE. Lima.
ANEXOS
35
ANEXOS
ANEXO l
PROCEMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE
MUESTRAS ADULTERADAS
Para la modificación de la leche se utilizó balón aforado de 100 ml,
estableciéndose una relación de 1:1, es decir 50 ml de suero y 50 ml de leche
cruda. Para la compensación de proteína se utilizó urea y del sulfato de
amonio en concentraciones del 2.5 %, 3 % y 4 % con respecto al volumen
total de la solución. Una vez pesadas y medidas las sustancias se siguió el
siguiente proceso para la respectiva adulteración de las muestras:
Mezclar el surfactante y el aceite vegetal con ayuda de un agitador magnético,
seguidamente se añade un estabilizador de emulsión y se agita a una
velocidad de 300 a 500 rpm hasta homogenizar la solución; luego poco a poco
se agrega el suero y se deja agitando por 5 minutos a 500 rpm. Posteriormente
se añade las soluciones de urea y sulfato de amonio según sea el caso; una
vez incorporado los adulterantes, se añade leche cruda a una velocidad de
agitación de 250 rpm, para así tener una distribución uniforme de las
sustancias adulterantes y la leche cruda. Finalmente se afora con leche hasta
100 ml.
Figura 6. Muestras de leche modificada Leche; Suero; L+S (Leche cruda + suero); L+S+G (Leche curda + suero + grasa); L+ S + G + SA (Leche cruda + suero + grasa + sulfato de
amonio); L + S + G + U (Leche cruda + suero + grasa + urea)
36
ANEXO II
PROCEDIMIENTO PARA ANALIZAR CONTENIDO DE
PROTEÍNA Y GRASA EN MILKOSCAN FT +
Una vez colocados los tubos con las muestras en los racks, para elaborar los
análisis de grasa y proteína, se debe realizar la siguiente serie de pasos:
Encender el equipo MilkoScan FT + y en la computadora ingresar al programa
Start Foss Integrator.
Luego se colocan las muestras sobre el conveyor 5000 Basic. Se escoge la
opción de Registro de Muestras y se da clic en la pestaña “Nueva Tarea-
Análisis”, y se añaden los siguientes datos de cada muestra:
Tipo de tarea: Normal
Nombre: Identificación de las muestras, tal como lo describe el Anexo I.
Total: Número de muestras en el análisis
Una vez ubicados los datos se procede a dar clic en la opción Play y el equipo
comienza a realizar los análisis correspondientes. Los resultados finales se
registran automáticamente de forma electrónica. Al terminar el análisis se
debe realizar la limpieza del equipo, comenzado por el lavado de pipeta, la
purga y finalmente la limpieza. Se cierra el software y se procede a apagar el
equipo.