HIPERTENSIÓN

Y Y SISTEMA ENDOTELINA

Bioquímica Especialista Gladys DottoReválida 2011

LA HTA CONSTITUYE UNO DE LOS PROBLEMASMÉDICOS SANITARIOS MÁS IMPORTANTES EN LAACTUALIDAD, LA TEORÍA DE LA DISFUNCIÓNACTUALIDAD, LA TEORÍA DE LA DISFUNCIÓN

ENDOTELIAL Y EL ROL DEL SISTEMAENDOTELINA PROMETEN DAR UNAEXPLICACIÓN CERTERA SOBRE LOS MECANISMOSPATOGÉNICOS.

EL ENDOTELIO ES LA CAPA CELULAR QUE ESTÁSITUADA ESTRATÉGICAMENTE EN LOS VASOSSANGUÍNEOS Y EL CORAZÓN, ENTRE LA SANGRE YEL RESTO DE LOS TEJIDOS.

NO ES SOLO UNA SIMPLE BARRERA, SINO UNAVERDADERA GLÁNDULA ENDÓCRINA.VERDADERA GLÁNDULA ENDÓCRINA.

ACTÚA COMO TRANSDUCTOR ENTRE LA SANGRE YLOS TEJIDOS, RESPONDIENDO AL ESTÍMULO DESUSTANCIAS QUÍMICAS, ESTÍMULOS MECÁNICOS.CONTROLA EL PASO DE SOLUTOS Y ALGUNASCÉLULAS SANGUÍNEAS.

EL TONO VASCULAR

CRECIMIENTO VASCULAR

EL ENDOTELIOEL ENDOTELIOREGULA

INFLAMACIÓN

TROMBOSIS / TROMBOLISIS

FACTORES LIBERADOS POR EL ENDOTELIO

MODULADORES DEL TONO VASOMOTOR

VASODILATADORES VASOCONSTRICTORESÓXIDO NÍTRICO ENDOTELINASEDHF ANGIOTENSINA IIPROSTACICLINAS TROMBOXANO A 2PÉPTIDO NATRIURÉTICO TIPO C PROSTAGLANDINA H2

MODULADORES DEL CRECIMIENTOFACILITADORES INHIBIDORESENDOTELINA ÓXIDO NÍTRICOANGIOTENSINA II PROSTACICLINAANGIOTENSINA II PROSTACICLINARADICALES SUPERÓXIDO PÉPTIDO NATRIURÉTICO TIPO C

MODULADORES INFLAMATORIOSFACILITADORES INHIBIDORESRADICALES SUPERÓXIDO ÓXIDO NÍTRICOFACTOR DE NECROSIS TUMORAL

MODULADORES DE TROMBOSIS/TROMBOLISISPROTROMBÓTICOS ANTITROMBÓTICOSPAI 1 t-PAFACTOR DE VON WILLEGRAND TROMBOMODULINA

DISFUNCIÓN ENDOTELIAL

FACTORES DE RIESGO Y ENFERMEDADES A FUNCIÓN ENDOTELIAL

ATEROSCLEROSISINSUFICIENCIA CARDÍACAHIPERTENSIÓN ARTERIALTABAQUISMOTABAQUISMORESISTENCIA A LA INSULINA Y DIABETESNEFROPATÍASHIPERHOMOCISTINURIA FAMILIAR

ENDOTELINAS

TOMADA DE : ENDOCRINOLOGY. AN INTEGRATED APPROACH. CHAPTER 8 CARDIOVASCULAR AND RENAL ENDOCRINOLOGY COPYRIGHT © 2001 TAYLOR &F RANCIS

EL GEN DE ET-1 ocupa 5,5 kb en el cromosoma humano 6, tiene 5 exones y 4 intrones. La secuencia codificante del péptido maduro está ubicada en el

exón 2. El exón 1 contiene la región 5’ sin traducir (UTR) y el exón 5 la porción de la región 3’ sin traducir.

ET-A RECEPTOR TIPO A: El gen del ET-A ocupa 40 kb en el cromosoma humano 4, y contiene 8 exones (11).

Función de receptores a endotelina-1 en diferentes tiposde células del sistema cardiovascular.

Tipo celular Receptores ETA Receptores ETB

Células endoteliales Vasodilatador a través de la producción deóxido nítrico y prostaciclina.Incremento de la expresiónIncremento de la expresióndel gen ET-1

Células de músculo liso Vasoconstricción y proliferación Vasoconstricción

Fibroblastos cardíacos Proliferación y fibrosis Proliferación y fibrosis

Cardiomiocitos Hipertrofia, inotropia positiva. Cronotropia positiva, hipertrofia

ENDOTELINA: ¿UNA FRONTERA EN LA H.T.A?

Dr. ROBERTO COLOCCINIDr. ROBERTO COLOCCINI

NUESTRA EXPERIENCIA

Departamento del Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas, UNC.Unidad de Medicina Interna Nº 3 y Servicio de Clínica Médica. Facultad de Ciencias Médicas,UNC y Hospital Córdoba.Servicio de Bioquímica, Hospital Córdoba.

POLIMORFISMO GENÉTICO SE DEFINE COMO LA EXISTENCIASIMULTÁNEA EN UNA POBLACIÓN DE GENOMAS CON DISTINTOSALELOS PARA UN LOCUS DETERMINADO, SEA CODIFICANTE O NO.

ESTUDIOS DE ASOCIACIONES Y POBLACIONES DE GENES,MEDIANTE EL ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DE UN SOLONUCLEÓTIDO (SNP), CONSTITUYEN UNA APROXIMACIÓNPODEROSA PARA IDENTIFICAR GENES QUE PARTICIPAN

INTRODUCCIÓN

PODEROSA PARA IDENTIFICAR GENES QUE PARTICIPANAGRAVANDO LAS MANIFESTACIONES CLÍNICAS DEENFERMEDADES POLIGÉNICAS.

EN LA ACTUALIDAS HA TOMADO INTERÉS LA PARTICIPACIÓN DEGENES MODIFICADORES DE PATOLOGÍAS, GENES QUE NOESTÁN INVOLUCRADOS EN LA GÉNESIS DE LA ENFERMEDAD,PERO MODIFICAN LA SEVERIDAD DE LA EXPRESIÓN FENOTÍPICADE LOS SÍNTOMAS. POR EJEMPLO EN LAS CARDIOMIOPATÍAS

�RECIENTES TRABAJOS HAN INFORMADO SOBRE LASVARIACIONES EN LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS ENREGIONES CODIFICANTES Y NO CODIFICANTES DE LOSGENES QUE INTEGRAN EL EJE ET.

INTRODUCCIÓN

�LAS VARIACIONES GENÉTICAS EN ESTE EJE AFECTARÍA UNAMPLIO RANGO DE FENOTIPOS CLÍNICOS Y PODRÍAN ESTARINVOLUCRADOS EN LA FISIOPATOLOGÍA DE LA HTA.

“NOS PROPUSIMOS EVALUAR SI LAS VARIACIONESDE UN SOLO NUCLEÓTIDO (SNPs) EN LOS GENES

DE ET-1 Y ET1-RA ESTÁN INVOLUCRADOS DE ET-1 Y ET1-RA ESTÁN INVOLUCRADOS EN LA PREDISPOSICIÓN AL AGRAVAMIENTO DE

LOS SIGNOS CLÍNICOS EN HIPERTENSOS”

MATERIALES Y MÉTODOS

SE RECLUTARON PACIENTES DE AMBOS SEXOS, ENTRE 30 - 83 AÑOS;A TODOS SE LES REALIZÓ EXÁMEN FÍSICO, ECG, ECOCARDIOGRAMA DOPPLER,Rx DE TÓRAX.

ANÁLISIS DE LABORATORIO:FUNCIÓN HEPÁTICAFUNCIÓN RENALFUNCIÓN RENALGLUCOSAÁCIDO ÚRICOHB A1-cLDHCPKSEROLOGÍA PARA CHAGAS

SE EXCLUYERON: EMBARAZADAS, HIPERTENSIÓN SECUNDARIA Y CHAGÁSICOS

LA MUESTRA SE CLASIFICÓ SEGÚN CRITERIOS DE JOINT NATIONAL COMMITTEE VII

GRUPO A: HIPERTENSOS CON VARIACIONES EN SU GRADODE CARDIOMIOPATÍA. T:55 PACIENTES

MATERIALES Y MÉTODOS

DE CARDIOMIOPATÍA. T:55 PACIENTES

GRUPO B: NORMOTENSOS SIN SÍNTOMAS DE DISFUNCIÓN MIOCÁRDICA. T:25 PACIENTES

EL ADN GENÓMICO: SE EXTRAJO A PARTIR DE G.B. PERIFÉRICOSMEDIANTE TÉCNICAS CONVENCIONALES CON FENOL – CLOROFORMO -ALCOHOL ISOAMÍLICO Y LUEGO SE PRECIPITÓ CON ETANOL.FINALMENTE SE RESUSPENDIÓ EN H2O ESTÉRIL LIBRE DE NUCLEASAS.

MATERIALES Y MÉTODOS

POLIMORFISMOS EN LOS GENES ET-1 Y ET-RA

Localización Posición Cambio de

Nucleótidos

Cambio de

aminoácidos

Abreviatura

ETA receptor

Exón 6

+69┼ C/T His/His(H323 H323H(C/T)

ET-1

Exón 1

+138┼ A/- ----------- +138ex1ins/delA

POLIMORFISMOS EN LOS GENES ET-1 Y ET-RA

EL ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO +138 EX1 ins/del A PRESENTE EN ELGEN ET-1 SE DETERMINÓ MEDIANTE AMPLIFICACIÓN CON PRIMERSESPECÍFICOS DE UN FRAGMENTO DE 127 PARES DE BASES.

EL FRAGMENTO OBTENIDO POR P.C.R SE TRATA CON EZ Bsl 1 QUEDETECTA DOS POSIBLES GENOTIPOS DEPENDIENDO DE LA PRESENCIA ONO DE A138. LA AUSENCIA DE ESTA A GENERA UN SITIO DE CORTE PARALA EZ (FRAGMENTOS DE 29+98 pb).

LA EZ. Bsl I reconoce el siguiente sitio de restricción5`CCNNNNN▼NNGG 3`3`GGNN▲NNNNNCC 5`

EL POLIMORFISMO H323H(C/T) DEL ET-RA SE DETERMINÓAMPLIFICANDO UN FRAGMENTO DE 172 pb. PARA DETECTAR ELPOSIBLE CAMBIO DE NUCLEÓTIDOS EL PRODUCTO DE PCR SEENFRENTÓ A LA EZ Afl II QUE RECONOCE AL SIGUIENTE SITIO DERESTRICCIÓN:

5` C▼TTAAG 3`3` GAAT T▲C 5`

LA PRESENCIA DE CT PRODUJO FRAGMENTOS DE 83 Y 89 pb EN

LOS FRAGMENTOS FUERON SEPARADOS MEDIANTEELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA AL 4% YVISUALIZADOS CON LUZ UV EN PRESENCIA DE BROMURO DEETIDIO.

LA PRESENCIA DE CT PRODUJO FRAGMENTOS DE 83 Y 89 pb ENCAMBIO, LA PRESENCIA DE TT NO DETERMINA UN SITIO DERESTRICCIÓN Y EL FRAGMENTO NO SE DIGIERE.

1 2

1100 pb

500 pb

1 2 3 4 5 6 7

Gel de Agarosa Nusieve (SIGMA) al 3%. Electroforesis mostrando RFLP.

RESULTADOS

500 pb

127 pb

98 pb

29 pb

89 pb

83 pb

172 pb

100 pb

Productos del polimorfismo del Receptor A (ET(A): carril 1-3;Productos del polimorfismo de Endotelina-1(ET-1): carril5-7.carril 1: homocigota CC; carril 2: homocigota TT; carril 3:heterocigota CT; carril 4: 100 bp marker (Promega); carril5: heterocigota 3A/4A; carril 6: homocigota 3A/3A; carril 7:homocigota 4A/4A .

ET-1 138 ex1 ins/delA polimorfismo

ETA H323H(T/C) polimorfismo

3A/3A 4A/4A 3A/4A CC TT CT

CARACTERÍSTICAS DE PACIENTES H.T. SEGÚN GENOTIPO ET-1 Y ET-RA

Pacientes 13/55 5/55 37/55 16/55 5/55 34/55

Sexo M/F 3/10 3/2 19/18 5/11 3/2 17/17

Edad 61±10 65.5±9 56±10 56±10 58±10 59±10

Valores promedio +DE

�LAS FRECUENCIAS ALÉLICAS Y GENOTÍPICAS DE LOS PACIENTESY CONTROLES SE COMPARARON POR TEST CHI CUADRADO.

� LA ASOCIACIÓN ENTRE VARIABLES CLÍNICAS Y LOS GENOTIPOS DE MARCADORES POLIMORFICOS SE ANALIZARON POR CORRELACIÓNY ANOVA.

�LA SIGNIFICACIÓN ESTIDÍSTICA ENTRE LOS VALORES MEDIOS SE �LA SIGNIFICACIÓN ESTIDÍSTICA ENTRE LOS VALORES MEDIOS SE EVALUARON POR EL TEST T DE STUDENT DE A PARES.

�LA DIFERENCIA SE CONSIDERÓ SIGNIFICATIVA CUANDO EL VALOR DE p< 0,05.

NT HT p

ET-1 138 ex1 ins/delA polimorfismo

3A/3A 16.9 21 ns

3A/4A 54.2 65 ns

4A/4A 28.9 11 <0.0039

Alelo

�La distribución de polimorfismo ET-1

+138 EX1 ins /del A y receptor ETA

H323H (T/C) en hipertensos y

normotensos satisface el equilibrio

Hardy Weimberg.

�El polimorfismo 138 ex1 ins/delA del

FRECUENCIA GENOTIPICAS Y ALELICAS DE LOS POLIMORFISMO DE LOS GENES DE ET-1 138 EX1 INS/DEL A Y ET-RA H323H (T/C) EN

HIPERTENSOS Y NORMOTENSOS

Alelo

3A 44 54 ns

4A 56 44 ns

ET-RA H323H (T/C) polimorfismo

C/C 33,4 31 ns

C/T 53,4 62.2 ns

T/T 13,4 8.2 <0.041

Alelo

C 66 62 ns

T 40 39 ns

�El polimorfismo 138 ex1 ins/delA del

gen ET-1 muestra la baja presencia del

genotipo 4A/4A en hipertensos. Este

genotipo podría estar asociado con

fenotipos normotensos. La frecuencia

de distribución del genotipo 3A/3A y

del 3A/4A es similar en ambos grupos.

�El polimorfismo H323H (T/C) del gen

ETA, el genotipo TT es menos

frecuente en hipertensos, que para el

resto de los genotipos.

FRECUENCIAS GENOTIPICAS y ALELICAS DE LOS POLIMORFISMOS 138 EX1 INS/DEL A DEL GEN DE ET-1 Y H323H (T/C) DEL GEN DE

ET-RA EN PACIENTES HIPERTENSOS Y CONTROLES SANOS

Polimorfismo ET-1 138 ex1/del A

NT HT

Frecuencia Genotipica

3A /3 A 16,9 (10) 23,07 (21)

3 A/4 A 54,23 (32) 59,35 (54)

Polimorfismo ET-A H323H (T/C)

NT HT

Frecuencia Genotipica

C/C 35,7 (10) 35,23 (31)

C/T 50 (14) 56,82 (50)

4 A/4 A 28,9 (17) 17,58 (16)

Frecuencia Alelica

3 A 44 (52) 53 (96)

4 A 56 (66) 47(86)

T/T 14,3 (4) 7,95 (7)*

Frecuencia Alelica

C 61 (34) 64 (112)

T 39 (22) 36 (64)

Los números representan el porcentaje en la población,entre paréntesis el número de individuos *test t p= 0.041

Hipertensosn = 91

GOT 65/26 (72%)GPT 63/28 (70%)

CK 87/4 (96%)LDH 69/22 (76%)

Creatinina 82/18 (90%)Fosfatasa Alcalina

60/31 (66%)

Urea 55/36 (60%)

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LOS PACIENTES HIPERTENSOS

Urea 55/36 (60%)Ac. Úrico 42/49 (46%)

Glucemia 55/36 (60%)

Colesterol 44/47 (48%)TG 25/66 (44)

HDL-Col 55/36 (60%)LDL 73/18 (80%)

GR 76/15 (84%)GB 60/31 (66%)

Los números representan cantidad de pacientes con valores patológicos/cantidad de pacientes con valores normales, entre paréntesis porcentaje de pacientes con valores

patológicos para cada variable bioquímica

NIVELES DE COLESTEROL EN PLASMA SEGÚN EL POLIMORFISMO ET-1 Y ET(A)

NT HT

ET-1 138 ex1 ins/delA polimorfismo

3A/3A 179 ±±±± 15 266 ±±±± 10

3A/4A 171 ±±±± 20 245 ±±±± 15

4A/4A 168 ±±±± 15 262 ±±±± 104A/4A 168 ±±±± 15 262 ±±±± 10

ET-RA H323H(T/C) polimorfismo

CC 178 ±±±± 15 252 ±±±± 10

CT 163 ±±±± 10 240 ±±±± 15

TT 181 ±±±± 25 287 ±±±± 10*

Valores promedio ± DE en mg/dL. *p≤0.039

NIVELES DE TRIGLICÉRIDOS EN PLASMA SEGÚN EL POLIMORFISMO ET-1 Y ET(A)

NT HT

ET-1 138 ex1 ins/del A polimorfismo

3A/3A 118 ±±±± 10 185 ±±±± 15

3A/4A 97 ±±±± 12 199 ±±±± 12

4A/4A 110 ±±±± 12 193 ±±±± 15

ET-RA H323H (T/C) polimorfismo

CC 97 ±±±± 10 172 ±±±± 15

CT 106 ±±±± 10 208 ±±±± 12

TT 120 ±±±± 12 179 ±±±± 10

Valores promedio ± DE en mg/dL.

� EL NIVEL DE COLESTEROL ES ESTADÍSTICAMENTESIGNIFICATIVO EN INDIVIDUOS PORTADORES DELGENOTIPO TT

� NO HUBO DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS EN LOSNIVELES DE TRIGLICÉRIDOS CIRCULANTES RESPECTO AGENOTIPOS

FRECUENCIA DE LOS ALELOS POLIMÓRFICOS ET-1 Y ET-RACON Y SIN CARDIOMEGALIA

Alelos Sin Cardiomegalia

Con Cardiomegalia

Gº I Gº II-III

3A 55 (10) 54 (11) 55 (18)3A 55 (10) 54 (11) 55 (18)

4A 45 (9) 46 (10) 45 (16)

C 62 (13) 66 (15) 54 (21)

T 38 (10) 34 (10) 46 (19)*

VALORES EN % Y (n)

Alelos ECG normalECG alterado

HVI HVI+otro

FRECUENCIA DE ALELOS POLIMÓRFICOS ET-1 Y ET-RA EN HTCON O SIN ANORMALIDAD DEL ECG

3A 50 (10) 71 (7) 56 (32)

4A 50(10) 28 (4) 44 (27)

C 73 (11) 57 (7) 60 (30)

T 27 (11) 43 (6)* 40 (28)*

VALORES EN % Y (n)

� HUBO DEFERENCIAS ENTRE DISTRIBUCIÓN ALÉLICA

EN PACIENTES CON CARDIOMEGALIA GRADO II Y III

CONCLUSIONES

EN PACIENTES CON CARDIOMEGALIA GRADO II Y III

Y CON ANORMALIDADES SEVERAS DEL ECG.

ESTOS PACIENTES FUERON HOMOCIGOTOS TT DE ET1-RA

�OBSERVAMOS DIFERENCIAS EN LA DISTRIBUCIÓN ALÉLICA DELPOLIMORFISMOS H323H(C/T) DEL ET-RA EN PACIENTES CONCARDIOMEGALIA HIPERTENSIVA DE GRADO II Y III Y CONDIFERENTES ANOMALÍAS EN EL ECG. ESTOS PACIENTES FUERONHOMOCIGOTAS TT

�LA VARIANTE GENÉTICA 138/DEL EX1 DEL POLIMORFISMO DELGEN DE ET-1 SE CONOCE QUE LA INSERCIÓN UNA ADENINA EN ELEXÓN 1,QUE REPRESENTA EL EXTREMO 3’ DE RNA MENSAJERO,

CONCLUSIONES

EXÓN 1,QUE REPRESENTA EL EXTREMO 3’ DE RNA MENSAJERO,AUMENTA LA ESTABILIDAD DEL MISMO, POR LO QUE PODRÍAMOSESPECULAR QUE ESTA MOLECULA PERMANECE + TIEMPO EN ELCITOSOL.

�PODEMOS ESPECULAR QUE, SER PORTADOR DEL ALELO T DELPOLIMORFISMO H323H(C/T) DEL GEN DE ET-RA O DE LAVARIANTE 138/DEL EX1 DEL POLIMORFISMOS DEL GEN DE ET 1PODRIA CONSTITUIR UN FACTOR DE RIESGO PARA ELDESARROLLO DE SINTOMATOLOGIA MAS SEVERA DE HTA.

ESTUDIOS QUE RELACIONAN SNPs CON LOS EFECTOS FUNCIONALESSON LIMITADOS Y NO SE HAN REPETIDO INDEPENDIENTEMENTE.

LA MAYORÍA DE LOS ESTUDIOS QUE ASOCIAN POLIMORFISMOS CONFENOTIPO Y/O ENFERMEDAD SON TRANSVERSALES O LIMITADOS PORPOCOS PACIENTES Y, POR LO TANTO, RESULTAN PROCLIVE A LAPOSIBILIDAD DE SESGOS EN LA SELECCIÓN DE LA MUESTRA.

ES NECESARIO TENER PRECAUCIÓN ANTES DE SER CONCLUYENTES. APESAR DE QUE LAS OBSERVACIONES SON ESTADÍSTICAMENTE

REFLEXION FINAL

PESAR DE QUE LAS OBSERVACIONES SON ESTADÍSTICAMENTESIGNIFICATIVAS POR EL NÚMERO DE PACIENTES QUE INTEGRAN ELESTUDIO, NO HAY EVIDENCIAS CONVINCENTES EN ESTE TRABAJO QUEMUESTREN EL ROL DE LOS POLIMORFISMOS DE LOS GENES DE ET-1 YDEL RECEPTOR A ASOCIADO A UNA SINTOMATOLOGÍA.

AUNQUE NUESTROS RESULTADOS NO MUESTRAN UN EFECTO DIRECTODE LOS POLIMORFISMOS DE LOS GENES DEL RECEPTOR A Y DEENDOTELINA-1 SOBRE EL RIESGO DE CONTRIBUIR EN LA PATOGÉNESISY LAS COMPLICACIONES DE ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES, NOSIGNIFICA QUE EL SISTEMA ENDOTELINA NO PARTICIPE TANTO EN LAHTA COMO EN OTRAS CARDIOMIOPATÍAS.

GRACIASGRACIAS