Producción de Ácido Cítrico.La fermentación del ácido cítrico fue la primera fermentación industrial aerobia. El ácido cítrico es un ácido tricarboxílico con 6 átomos de carbono que fue aislado inicialmente a partir del jugo de limón. Es una sustancia orgánica producto del metabolismo de la mayoría de los seres vivos, producido en el ciclo de Krebs.

Ácido oxalacético + Acetil-CoA = Ácido cítrico

En 1860 comenzó a obtenerse a partir de frutas mediante el uso de sales de calcio, pero eran necesarias enormes cantidades de limones para obtener una cantidad significativa de ácido cítrico. Hoy en día, la obtención a partir de frutos carece de significado. Actualmente se obtiene mediante fermentación con Aspergillus niger partiendo de diversas materias primas. Principalmente se utiliza la melaza de caña, dado que por su composición permite un perfecto desarrollo de los microorganismos, aunque también se utiliza azúcar, hidrolizado de almidón, melaza de remolacha y caldo de caña.

El ácido cítrico es un saborizante muy utilizado por la industria alimentaria. También se utiliza en la manufactura de bebidas alcohólicas como acidulante, como auxiliar en la fabricación de mermeladas y como aditivo general en las industrias de repostería. Para la producción industrial de ácido cítrico se utiliza el hongo Aspergillus.

Aunque las frutas cítricas (como los limones) cuando son verdes pueden contener hasta un 9 % de ácido cítrico, el 99 % de la producción mundial de ácido cítrico se realiza mediante los hongos miceliares. Por tanto, la mayoría de fermentaciones de ácido cítrico se realizan a través de cepas mutadas de A. niger debido a su alta productividad, adaptabilidad en fermentadores industriales, rendimiento económico y mínima producción de productos no deseados.

Procesos bioquímicos de la fermentación aeróbica del ácido cítrico:

El ácido cítrico es una intermediario estándar del ciclo TCA (ciclo de los ácidos tricarboxílicos o también llamado Ciclo de Krebs).

En la fermentación del ácido cítrico, son importantes dos enzimas clave: la citrato aconitasa (CA) y la isocitrato deshidrogenasa (ICDH).

Durante la etapa de producción de ácido cítrico se expresan todas las enzimas del ciclo de Krebs excepto la α-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDH). La actividad de citrato sintasa (CS) aumenta por un factor de 10, mientras que las actividades de las enzimas que catabolizan el ácido cítrico, aconitasa (CA) e isocitrato deshidrogenasa (ICDH), se reducen drásticamente. Esto da lugar a una acumulación y excreción de ácido cítrico por el microorganismo sobrecargado.

El hierro es un cofactor necesario para la enzima citrato aconitasa (CA). Por ello, se mantiene un déficit del metal que favorece a la acumulación de ácido cítrico. La restricción de la actividad de esta enzima es la clave para tener éxito en la fermentación del ácido cítrico.

Todas estas variaciones en la expresión de las enzimas del ciclo de Krebs suceden una vez el hongo ha crecido, es decir, cuando se encuentra en la fase estacionaria. Los azúcares son catalizados a través de la glucólisis y van al ciclo de Krebs, produciendo ácido cítrico. Aunque éste sea un metabolito básico ligado al metabolismo primario, su producción se puede considerar como la de un típico metabolito secundario, ya que en primer lugar el micelio va creciendo a partir del carbohidrato (como por ejemplo: sacarosa) y cuando se llega a la fase estacionaria, empieza la idiofase con la excreción del cítrico causada por las disminuciones de las enzimas α-cetoglutarato deshidrogenasa, citrato aconitasa e isocitrato deshidrogenasa y la falta de hierro.

Debido a este motivo, como el ciclo de Krebs se encuentra debilitado, los otros compuestos del ciclo necesarios como intermediarios biosintéticos se sintetizan por rutas anapleróticas (PEPC: fosfoenolpiruvato carboxilasa y la PC: piruvato carboxilasa).

En 50 años se ha multiplicado considerablemente la producción de ácido cítrico a nivel mundial. El ácido cítrico se fabrica en más de 20 países. La Unión Europea, Estados Unidos y China reúnen el 88% del mercado total mundial. La Unión Europea incrementó su elaboración debido fundamentalmente a su uso como materia prima para fabricar detergentes biodegradables.

Producción de cortisona a partir de progesterona

La utilización de microorganismos en la biotransformación ha tenido especial éxito en la producción de esteroides, como es el caso de la cortisona. Inicialmente los esteroides se producían mediante extracción de tejidos animales o mediante una síntesis química muy compleja, pero los dos procedimientos eran excesivamente caros. Algunos pasos clave de la síntesis química pueden realizarse de forma más eficaz mediante el uso de enzimas. La mayoría de esteroides que se fabrican hoy en día se hacen mediante un proceso mixto de biotransformación microbiana y transformaciones químicas.

La cortisona es la forma oxidada del cortisol, una hormona esteroidea perteneciente al grupo de los glucocorticoides. Los glucocorticoides son sustancias con importantes actividades biológicas que los hacen útiles en medicina. Tienen propiedades antiinflamatorias, por eso se utilizan como fármacos para el tratamiento de alergias, asma, artritis reumatoide, desordenes dermatológicos, etc.

Existen ciertos trastornos relacionados con la alteración de los niveles de cortisol en el organismo. Uno de ellos es la enfermedad de Addison que consiste en la insuficiente producción de cortisol. El tratamiento para esta enfermedad se basa en la administración de dosis hormonales de cortisol a diario a los pacientes.

Fig. Estructura molecular del cortisol

El descubrimiento del efecto antiinflamatorio de la cortisona tuvo un gran impacto en el mundo médico de tal manera que Kendall, Reichstein y Hench ganaron el premio Nobel en

1950. La gran demanda de la cortisona impulsó el desarrollo de la síntesis química de este producto.

En 1952 investigadores de Upjohn descubrieron un hongo, Rhizopus nigricans que podía hidroxilar la progesterona (un intermediario en la síntesis de la cortisona) en el C11, reduciendo así las etapas del proceso. Desde entonces, la producción de cortisona se realiza industrialmente mediante éste hongo que contiene unas enzimas que realizan la hidroxilación específica de la progesterona produciendo 11α-hidroxiprogesterona. El átomo de oxígeno del C11 es esencial para el efecto antiinflamatorio de la cortisona. Esta oxidación altamente específica hizo posible reducir la síntesis industrial de cortisona de 31 a 11 pasos. El resto de pasos desde la progesterona hasta la hormona esteroidea cortisona se realizan químicamente.

Después de este descubrimiento, el precio comercial de 1g de cortisona bajó de 200$ a 6$. La producción de esteroides es actualmente un gran negocio, las cifras de venta de los cuatro esteroides principales: cortisona, hidrocortisona, prednisona y prednisolona es de unas 800 toneladas/año.

Fig, Biotransformación de la progesterona para obtener cortisona, mediante el microorganismo Rhizopus nigricans.

Las materias primas que se utilizan en este proceso son la diosgenina, obtenida a partir del barbasco mejicano o el estigmasterol que se obtiene del aceite de soja. A partir de estos esteroles vegetales, mediante procesos químicos se obtiene la progesterona, que es el

precursor el cual Rhizopus nigricans realiza la 11β-hidroxilación para obtener la 11α- hidroxiprogesterona.

En el proceso de producción de cortisona, mediante el sistema de células en crecimiento, el microorganismo Rhizopus nigricans se cultiva en grandes fermentadores, en condiciones controladas. El microorganismo se deja crecer de manera exponencial para obtener la máxima cantidad de biomasa antes de añadirle el sustrato. Una vez el microorganismo se ha desarrollado, se añade el esteroide precursor de la cortisona, es decir la progesterona. Después de un período de incubación durante el cual el microorganismo actúa sobre el compuesto químico, se extrae el caldo de fermentación y se recupera el esteroide transformado. El ratio de conversión de la progesterona a 11α- hidroxiprogesterona es del 85%. La purificación del producto depende de si el producto de interés es acumulado en las células o es excretado. Los productos finales de las biotransformaciones suelen ser extracelulares y se pueden encontrar disueltos o en suspensión.

Gracias al reemplazamiento de varios pasos químicos por reacciones especificas catalizadas por enzimas, como es el caso de la 11-hidroxilación de los esteroides, ha sido posible abaratar mucho la producción de cortisona; esteroide que por sus cualidades antiinflamatorias ha tenido un gran impacto médico y supone un gran impulso en la industria de los esteroides.