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BIOPROCESOSBIOPROCESOS

CONTENIDOCONTENIDO GENERALIDADES• Diseño de un fermentador• Modos de operar los Biorectores y tipos de

fermentación

FERMENTACIÓN FED BATCH• Tipos de bioreactores• Perfiles• Reactores biológicos• ¿Cómo se opera?• ¿Por qué utilizar una fermentación F-Batch?

VENTAJAS

USOS

CLASIFICACION• Incremental• Volumen fijo

BALANCES• Obtencion de ecuaciones para biomasa, Sustrato y producto• Influencia sobre la velocidad específica de crecimiento

TIPOS DE ALIMENTACION

PARAMETROS QUE EMPIEZAN O TERMINAN LA ALIMENTACION Y PARAN LA FERMENTACION

CONOCIMIENTOS PREVIOS

Modos de operar los Bioreactores y tipos de fermentaciones

Los bioreactores (también conocidos como fermentadores) son usados para el crecimiento de las células. El reactor esta diseñado para satisfacer las necesidades de las células, como:

Condiciones nutricionalesCondiciones ambientales

FERMENTACION FED-BATCH

Es un modo de operación donde uno a más (en algunos casos todos) nutrientes son adicionados al reactor durante el cultivo.

La velocidad de adición de la alimentación puede ser función del tiempo, pero el medio que contiene los metabolitos es retirado una vez finalizada cada corrida (no hay salida continua).

Tipos de Bioreactores

♠ En tanda o Lote (batch). ♦ Con agitación. ♦ Sin agitación.

♠ Lote alimentado (Fed-batch).♦ Incremental.

♦ Volumen Fijo.

♠ Continuo. ♦ Semicontinuo.

Reactores Biológicos.

PERFILES

Cultivo Continuo

Cultivo Batch Cultivo Fed-Batch

¿ Cómo se opera ?El proceso de producción comienza como si

fuera un cultivo tipo batch.

En un proceso fed-batch, la fermentación empieza con un volumen, concentración de microorganismos y sustrato determinados y, a medida que transcurre el proceso de fermentación, el substrato se añade poco a poco, hasta que se consigue llenar el bioreactor.

Debido a esto el volumen de caldo aumenta VR = f(t) y todas las variables se ven afectadas enel tiempo x,s,p.

Definición de variable

♦ Cantidad de:X = x*VX = x*VS = s*VS = s*VP = p*VP = p*V

Definición de variable

♦ Cantidad de:X = x*VX = x*VS = s*VS = s*VP = p*VP = p*V

¿ Por qué utilizar una fermentación tipo FED-BATCH ?

El tipo de cultivo fed batch, está entre el cultivo tipo batch y continuo; aquí se busca :

Alargar la fase exponencial de Producción de biomasa paraAumentar la cantidad de la

Misma.

Prevenir o reducir la inhibición por sustrato asociada al

Crecimiento controlando laAdición de nutrientes

Grafica de alargamiento de μ

Ventajas

Poder utilizar sustratos que inhibirían la producción a conc. elevadas.

Mejorar el rendimiento en biomasa.

Producción de metabolitos típicos de fase estacionaria (se prolonga la F.estacionaria y así controlar moo. y sus productos).

Reducir la viscosidad del medio de fermentación (en la producción de polisacáridos extracelulares).

Elegir el momento adecuado para inducir la producción (cambiar el tipo de sustrato que se mete y elegir cuándo).

Evitar problemas de contaminación o estabilidad genética que se dan en cultivo continuo.

Se añaden nutrientes, aditivos o medio fresco para :

Utilidades

Al existir una alta concentración de sustrato se puede producir inhibición del crecimiento. Efecto de la glucosa, metanol, ac. acético, compuestos Aromáticos.

Si se desea una alto concentración de células se necesita una alta concentración de sustrato, se puede producir inhibición por sustrato. Se necesita una forma de alimentación que no genere inhibición.

Alta concentración

Inhibición del crecimiento por sustrato

UtilidadesUtilidades

Los microorganismos tienden a metabolizar las fuentes de carbono más rápido y no generan otras enzimas que se utilizaría para degradar otras fuentes, entonces con este tipo de alimentación se mantiene la tasa de crecimiento pero con la producción de la enzima de interés.

Represión Catabólica

Mutantes auxotróficas

Los microorganismos que requieren de un nutriente que no son capaces de sintetizar, si tienen exceso de este nutriente se tiene un abundante crecimiento sin acumulación del metabolito deseado, luego se requiere alimentar este nutriente a bajas tasas.

UtilidadesUtilidades

Los moos. rápidamente utilizan F. de carbono para su crecimiento y luego sintetizan otros metabolitos, generalmente en la etapa declinatoria o estacionaria, esta etapas son muy cortas, para prolongarlas y mantener una alta actividad de síntesis y a los moos. “semi-hambrientos”, la F. de carbono y/o precursores son alimentados a velocidades. controladas.

Productos No-Asociados al crecimiento

Cuando un promotor de un gen foráneo es encadenado en un plásmido regulable su expresión puede ser controlada por la adición de algún compuesto (gen inducido) o puede reprimirse. Se pueden adicionar algún compuesto como cloramfenicol en pequeñas dosis o mantener el nivel de nutrientes muy bajo.

Control On-Off de expresión de algún gen:

FERMENTACIONFED-BATCH

Incremental

Volumen Fijo

Clasificación

Cultivo Fed-Batch

El sustrato limitante es alimentado sin diluir al cultivo.

El volumen del cultivo puede ser mantenido practicamente constante, por alimentar al S-L en forma <indiluible>.

Volumen Fijo

Fed-Batch Volumen Fijo

Cultivo F-Batch Cíclico para sistemas de volumen fijo

Salida periódica de una porción de cultivo, y uso de cultivo residual como un punto de comienzo.

Una vez que la fermentación alcanze condiciones que no puedan ya ser mantenidas, el cultivo es removido y la biomasa es diluída al volumen original con agua estéril o medio conteniendo S-L.

Cultivo Fed-Batch

El volumen cambia con a lo largo del tiempo de la fermentación, debido al sustrato alimentado.

Las concentraciones del sustrato de la alimentación es igual o mayor a la concentración que había en el fermentador al comienzo del proceso.

El modo de cambio de este volumen, es dependiente de los requerimentos, limitaciones y objetivos del operador.

Tambien puede ser llamado: proceso de F-Batch Repetido, cultivo F-Batch ciclico, proceso F-Batch simple.

Incremental

Fed-Batch incremental

Un Cultivo Fed-Batch cíclico tiene una ventaja adicional:

• La fase productiva de una proceso puede ser extendida bajo condiciones controladas.

• El control periódico en la µ suministra una oportunidad de optimizar la síntesis de producto, particularmente si el P de interes es secundario (produc. en fase de desaceleración).

Fed-Batch incremental

La alimentación puede ser sumunistrada de acuerdo a una de las siguientes opciones:

1) El mismo medio usado en el modo Batch es añadido

2) Una solución del sustrato limitante a la misma concentración tal que en el inicio del medio es añadido

3) Una solución muy concentrada del S-L es añadidad a una velocidad más lenta que en 1), 2), 3)

Incremental

Existen 2 Etapas:

1a ETAPA: Finaliza con V = V0 y X = X0

2a ETAPA: Donde se comienza una alimentación F(t) hasta V = Vf

Forma de operación

Balance Global

d(VCi) (F1Cil) (F1Ci) (Vrfi) (Vrci) dt

dV El caudal de salida F2 es nulo, por lo que V aumentará en el

dt tiempo, en función del caudal de entrada

Velocidadde

acumulación

Velocidadde

entrada

Velocidadde

salida

Velocidadde

formación

Velocidadde

consumo= - -+

= - -+

= F

Balance para biomasa

y

1 . .s f

dXFX F X V rx V x V

dt

.dX

V rx Vdt

rx X

Balance para sustrato

Pero como la velocidad de crecimiento está controlada por la alimentación, entonces en todo momento S = 0, y por lo tanto

0 .f

dSV FS FS V rs

dt

0 .dSV FS V rs

dt

0dSV

dt

Y si sustituimos rs por / /

1.

X S X S

rxrx

Y Y

Entonces la ecuación de balance queda:

0/

10 .

X S

dXFS V

Y dt

y recordemos que dX

rxdt

Resolviendo y haciendo separación de variables:

0/

0

/

0 /

0 /

1.

1

.

X S

X S

X S

X S

dXFS V

Y dt

FS dXVdt

Y

dXFS Y V

dtIntegrando

FS Y dt XV

0 / 0 0.X SFS Y t X V XV

Donde X0 y V0 representan la concentración de biomasa y de Volumen al inicio de kla fermentación.

Obteniendo la ecuación para Sustrato:

Donde: 0 .dSV FS V rs

dt

/X S

Xrs

Y

0/

0 .x s

XFS V

Y

0/

0/

.x s

x s

XFS V

Y

V XFS

Y

Velocidad específica de crecimiento:

1 dXV

XV dt

El valor de μ varia permanentemente en cultivo BATCH. Reemplazando términos ya conocidos anteriormente :

/ 1

0 0 / 1

X S

x s

Y FS

X V Y FS t

Balance de producto.

1tF K e

1tF K e

0F F gt 0F F gt

0F F0F F

Exponencial

Lineal

Pseudo - estacionaria

Alimentación exponencial.maxS

Ks S

No es constante

Balance para Biomasa

1

1

. .

( )

s f

s f

dX dxFX F X V rx V x V

dt dtdXV dx

FX F X XV XVdt dt

Suposiciones:

La alimentación es estéril: 1 0X

0 0. tf gX X e X X

Cantidad de biomasa creció

Cantidad de biomasa inicial

0. 1tgX X e

Por otra parte se supone que todo lo que se alimenta al fermentador es consumido por la producción de biomasa

1. .g X SX V S Y Donde V = volumen adicionado

Si Kv es la constante de Volumnen:

0

0.vX S

XK

S Y 0

0

11

.

t

tv v

X S

X eK K e

S Y

Igualando ecuaciones:

Calculando F: 0

0.t

X S

XdVF e

dt S Y . . t

vF K eFLUJO EXPONENCIAL

Alimentación lineal.

0

0 0

t tdVF V Fdt F gt dt

dt

Del balance global: Si se supone un flujo tipo: 0F F gt

Estado Pseudo o Casi- estacionario.

Se produce cuando se tiene una alta concentración de biomasa y se mantiene el sustrato a un nivel muy bajo.

Esta situación se obtiene cuando se tiene un batch con alta densidad de biomasa, con lo cual se tendrá el sustrato casi completamente agotado, en este momento se comienza a alimentar el medio con un flujo constante.

La concentración de biomasa alta y casi constante.

Parámetros que empiezan o terminan la alimentación y paran la fermentación Fed.Batch

El tiempo al cual la alimentación debe de empezar y terminar, así como el criterio para detener una fermentación Fed-batch es muy dependiente de la cinética específica del cultivo y del interés del operador.

Por ejemplo, en le procesos e sustrato limitante, la alimentación debe de empezar inmediatamente después de que el sustrato es consumido de la fase batch, si las circunstancia fuera distintas, el proceso sería difícil de controlar.

El criterio más común para comenzar la alimentación es el consumo de sustrato, el cual puede ser medido por una múltiples de técnicas, de ensayos de enzimas específicas, HPLC.

Criterio para detener la fermentación:

Producción baja o lenta debido a muerte celular Concentración de metabolitos inadeacuada Por formación de sub-productos a niveles significativos Por incremeno de la viscosidad, que demanda mas O2,

convirtiendose el oxígeno en un factor limitante.

Conocimientos previos antes de comenzar Fed-batch

Antes de empezar el proceso Fed-Batch, una fermentación batch deberá de implementarse, y el operador obtendría el siguiente conocimiento:

Las mejores condiciones tal como temperatura, luz, agitación, pH, medio de crecimiento, etc.

Necesidades específicas de precursores, inducidos o otros factores de mejora

Las diferentes fases de crecimiento y consumo (sustrato) y componentes producidos (productos de interés y sub-productos)

La relación entre la biomasa y formación de productos (asociados o no asociados al crecimiento.