anexo al informe final del proyecto: sip 20080860 dra....
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ANEXO AL INFORME FINAL DEL PROYECTO: SIP 20080860
Dra. Deifilia Ahuatzi Chacón.
RESUMEN
El ácido cianúrico es un intermediario metabólico de la biodegradación de herbicidas triazínicos
(atrazina, simazina), cuya toxicidad y permanencia en el ambiente, ya demostrados, requieren de
una solución urgente para evitar poner en peligro la biodiversidad. La cianúrico hidrolasa es la
primera enzima en la ruta de degradación de este intermediario.
En este trabajo se aislaron microorganismos con capacidad de degradar el ácido cianúrico y se
evaluó la acumulación de la enzima cianúrico hidrolasa en cultivos en suspensión (por lote, fed-
batch y por lote repetido), de una comunidad bacteriana previamente aislada, formada por
Acinetobacter sp. y por Agrobacterium sp. El medio utilizado contenía 170 ppm de ácido cianúrico
y 50 ppm de glucosa como fuente de carbono adicional.
En el cultivo por lote, la mayor acumulación enzimática se obtuvo al tercer día de incubación con
una actividad de 207.4 U/mg para la comunidad bacteriana, 90.8 U/mg para Acinetobacter sp. y
47.2 U/mg para Agrobacterium sp. En el cultivo fed-batch se obtuvieron mayores niveles de
actividad de la cianúrico hidrolasa que en el cultivo por lote; a un flujo de alimentación de 11.73 se
obtuvo una actividad de 181 U/mg para Acinetobacter sp. y de 190 U/mg para Agrobacterium sp.
Para evaluar la actividad enzimática de la comunidad bacteriana en el sistema fed-batch, se
probaron dos flujos de alimentación, 5.67 mL/h y 11.73 mL/h, la actividad fue de 66.6 U/mg para
el menor flujo y 246.9 U/mg para el mayor. En cuanto al cultivo por lote repetido, se observa que
las productividades, eficiencias de remoción y velocidades de consumo, en general se favorecieron
durante el proceso, así como también se favoreció la acumulación enzimática, ya que las
actividades enzimáticas específicas máximas obtenidas, aumentan durante el cultivo,
obteniéndose una actividad enzimática específica de 317.778 U/mg en el lote 4 para el consorcio
microbiano.
INTRODUCCIÓN.
Hasta mediados del siglo XX el control de las hierbas adventicias de los cultivos se hacía por
medios mecánicos, mediante azada o arado con un elevado costo en mano de obra. Los
herbicidas, o matamalezas químicos, han reemplazado en gran parte los métodos mecánicos de
control de malezas. Junto con los fertilizantes, otros pesticidas, y variedades mejoradas de plantas,
los herbicidas han hecho una importante contribución al incremento de los rendimientos que
actualmente se tienen. Sin embargo, el uso de herbicidas para el control de malezas no sólo ha
generado beneficios, una de las más grandes desventajas de su uso es que, gran parte de los
herbicidas no se degrada en el medio ambiente como tal, y que si bien evita el crecimiento de
malezas que son indeseadas, el tóxico que difícilmente se degrada de manera “natural” en la zona
donde es aplicado, puede ser arrastrado por la lluvia o filtrarse hasta los mantos acuíferos
causando problemas serios de contaminación en el agua.
Desde que se observó la efectividad de los herbicidas, se han desarrollado diferentes grupos de
estos agrotóxicos mediante la selección al azar en el invernadero y la subsiguiente modificación
química. Los herbicidas triazínicos constituyen un grupo ampliamente usado. Las triazinas, están
formadas por anillos heterocíclicos de seis átomos, de los cuales tres son nitrógenos (el prefijo tri-
quiere decir “tres”) y azina (se refiere a un anillo que contiene nitrógeno).
La aplicación indiscriminada de herbicidas en las tierras de cultivo, particularmente de aquellos del
grupo de las triazinas, ha ocasionado problemas de contaminación ambiental con los
consecuentes daños a las especies animales, incluido el hombre. La gran acumulación de
herbicidas no logra eliminarse en forma natural (adsorción y degradación) y suele infiltrarse a las
aguas subterráneas, lo que constituye un problema de contaminación de los recursos hídricos, por
tal razón es necesario desarrollar procesos destinados a su depuración. A pesar de que existen
métodos fisicoquímicos, la degradación biológica presenta la principal ventaja de que logra la
mineralización de estos compuestos y con ello su completa remoción del medio ambiente, siendo
necesario aislar microorganismos capaces de degradar a las triazinas, así como a los productos de
degradación de éstas. El ácido cianúrico es el principal intermediario en la mayoría de las rutas de
degradación de los triazínicos, y debe eliminarse para lograr una completa depuración de las aguas
contaminadas. La ruptura del anillo triazínico del ácido cianúrico es un paso importante en la
mineralización de estos herbicidas (atrazina, cyanazina, simazina), en varios trabajos se han
mostrado cepas y consorcios bacterianos que son capaces de metabolizar el ácido cianúrico
abriendo hidrolíticamente el anillo triazínico para producir bióxido de carbono y biuret, reacción
catalizada por la cianúrico hidrolasa. En este proyecto logramos aislar microorganismos con
capacidad de degradar el ácido cianúrico, además detectamos la presencia de la enzima cianúrico
hidrolasa midiendo la actividad de la enzima en cepas previamente aisladas, seleccionadas e
identificadas en el laboratorio. Por otro lado también es importante proponer bioprocesos, en los
que participen los microorganismos aislados, para agregar un paso más en el tratamiento de aguas
residuales que se encuentren contaminadas con este compuesto, para que de esta manera la
depuración de dichas aguas sea completa y ya no represente un peligro para el ambiente ni para el
hombre. En este proyecto evaluamos la acumulación de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa
de un consorcio microbiano, y de sus integrantes aisladas, en diferentes sistemas fermentativos.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Acido cianúrico utilizado.
Se utilizó el ácido cianúrico proveniente de Sigma-Aldrich Inc. Steinheim, Germany, con un grado
de pureza del 98%.
Microorganismos
Para el aislamiento de microorganismos con capacidad de degradar el ácido cianúrico, se partió de
muestras de suelo agrícola de diferentes sitios contaminados con herbicidas triazínicos. Mediante
la técnica de transferencias sucesivas se logró el enriquecimiento de comunidades microbianas
capaces de utilizar el ácido cianúrico, posteriormente se separaron por morfología colonial. Para
la evaluación de la acumulación de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa en diferentes
sistemas fermentativos se utilizó una comunidad microbiana previamente aislada de suelo de
cultivo de maíz de Teotihuacán, Edo. De México, conformada por Agrobacterium sp. y
Acinetobacter sp.
Conservación de las cepas
Las cepas se conservaron en placas de agar con medio mínimo y ácido cianúrico (50 mgL-1) a
temperatura de refrigeración.
Medios de cultivo
Se utilizó medio mínimo mineral con una concentración definida de ácido cianúrico y adicionado
de una fuente de carbono adicional (glucosa).
Composición química del medio mínimo mineral
Componente Concentración (g/L)
K2HPO4 1.6
KH2PO4 0.4
MgSO4 0.1
NaCl 0.1
CaCl2 0.02
Este medio mínimo se complementa con 5 mL/L de una solución de oligoelementos.
Composición química de la solución de oligoelementos
Componente Concentración (g/L)
FeSO4 7H2O 0.55
ZnSO4 7H2O 0.23
MnSO4 7H2O 0.34
CoCl2 6H2O 0.065
Na2MoO42H2O 0.034
El medio se esterilizó en una autoclave a 121°C durante 15 minutos y una vez que estuvo a
temperatura ambiente se adicionó el ácido cianúrico esterilizado por filtración.
Cultivo por lote
Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 250 mL con 50mL de medio mínimo mineral adicionado con
50 ppm de glucosa. Para realizar los cultivos por lote del consorcio microbiano y cada una de las
cepas integrantes, se inocularon 8 matraces al mismo tiempo con la biomasa crecida en una placa
con el mismo medio, estos se mantuvieron en agitación a 60 rpm a 37°C, retirando un matraz
completo para usarlo como muestra por día durante 7 días.
Cultivo fed-batch
Para el cultivo Fed-Batch se utilizó un reactor de 1000 mL, y una bomba peristáltica. Cada cultivo
se inoculó con la biomasa crecida en una placa con el mismo medio; una vez inoculados los
cultivos y después de la toma de muestra inicial se comenzó a alimentar inmediatamente. Los
cultivos se mantuvieron a temperatura ambiente con agitación mediante un agitador magnético.
Para este cultivo se utilizaron dos velocidades de alimentación, para la comunidad microbiana
(5.67 mL/h y 11.73 mL/h) y la velocidad de 11.73 mL/h para cada una de las integrantes. El
volumen inicial en todos los casos fue de 200 mL.
Cultivo por lote repetido
Para el cultivo por lote repetido se utilizó un reactor de 4000 mL. Para la inoculación se tomaron
600 mL de la suspensión obtenida del cultivo fed-batch realizado para la comunidad bacteriana
con una velocidad de alimentación de 11.73 mL/h. El cultivo se mantuvo a temperatura ambiente
y en agitación con un agitador magnético. Una vez finalizado el primer lote, el reactor se drenó
hasta un volumen de 500 mL para llevarlo a un volumen final de 3500 mL con medio nuevo; una
vez finalizado el segundo lote, el reactor se drenó hasta un volumen de 500 mL para llevarlo a un
volumen final de 3500 mL con medio nuevo; una vez finalizado el tercer lote, este se drenó hasta
un volumen de 1500 mL para llevarlo a un volumen final de 3.5 mL con medio nuevo.
Toma de muestra en cultivo por lote repetido
Las muestras se tomaron por la salida del reactor, drenado un volumen adecuado cada vez para
obtener muestras representativas del seno de la suspensión celular. El muestreo se realizó cada 24
horas y el volumen de las muestras siempre fue 200 mL.
Monitoreo de la comunidad bacteriana en cultivo por lote repetido
Al finalizar cada lote se tomó una muestra de la suspensión celular del reactor, cada muestra se
centrifugó para obtener una pastilla de biomasa que se destinó para el monitoreo de la
comunidad bacteriana por biología molecular.
Métodos analíticos
Evaluación de la actividad de la enzima ácido cianúrico hidrolasa
Para el ensayo enzimático de la enzima ácido cianúrico hidrolasa, las células de cada muestra,
fueron recuperadas por centrifugación (5 min, 11340 x g); estas células fueron lavadas con agua
destilada y resuspendidas en 3 mL de regulador de fosfatos a pH de 8 (Cook y col., 1985). La
suspensión celular obtenida fue sometida a una ruptura mecánica con perlas de vidrio (Glass
beads 150-212 microns, acid-washed), durante 10 min. Las células lisadas fueron separadas por
centrifugación (5 min, 11000 x g) y el sobrenadante fue utilizado para el ensayo enzimático (Cook y
col., 1985).
Para la determinación de actividad de la enzima ácido cianúrico hidrolasa, se colocó en una celda 1
mL de regulador de fosfatos a pH de 8, 15.5 L de una solución de ácido cianúrico de 1500 mg/L,
50 mL de extracto crudo de células y se llevó a un volumen final de 3 mL con agua destilada
(Furchey y col., 2003). La velocidad de la degradación enzimática fue medida como la disminución
en absorbencia a 220 nm, referido a una curva tipo de unidades de absorbencia a 220 nm en
función de la concentración de ácido cianúrico (mM). La actividad enzimática específica se reportó
como los mmoles de ácido cianúrico degradado en un periodo de 1 min (U), por mg de proteína
cuantificada en mg/mL por el método de Lowry (Karns, 1999; Cheng y col., 2006).
Determinación de unidades formadores de colonias
El método consiste en hacer una serie de diluciones decimales, de las cuales se tomaron alícuotas
que se sembraron en placas de agar nutritivo. Se contó el número de colonias formadas en las
placas y se calculó el número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) contenidas en un mL.
Determinación de proteínas por el método de Lowry
Cada muestra se trató con una solución al 20% de NaOH en baño maría a ebullición, en una
proporción 4:1.5, con el fin de solubilizar toda la proteína presente. Se agrega 0.5 mL de muestra
y 5 mL del reactivo C, se mezcla y se deja reposar durante 10 min a temperatura ambiente,
transcurrido el tiempo se agrega 0.5 mL del reactivo D agitando inmediatamente después de la
adición del reactivo. Se deja desarrollar el color durante 30 min a temperatura ambiente. Se mide
la absorbencia a 590 nm. El color permanece estable por 2 horas. Se preparó una curva de
calibración con una solución tipo de proteína a 1 g/mL de albúmina bovina.
Reactivos:
Reactivo A: Solución de Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 N
Reactivo B: Solución de CuSO4 5H2O al 0.5% en tartrato de sodio al 1%
Reactivo C: Mezclar 1 mL del reactivo B con 50 mL del reactivo A
Reactivo D: Reactivo de Folin diluido 1:3 con agua destilada
Determinación de la concentración de ácido cianúrico
Determinación del espectro de absorción UV del ácido cianúrico
La muestra se filtró previamente en membranas de fibra de vidrio de 0.7 m de poro (Whatman,
GF/F), para separar cualquier partícula en suspensión y posteriormente se midió su absorbencia a
213 nm, que es la longitud de onda de máxima absorción del ácido cianúrico.
Determinación de la concentración de ácido cianúrico utilizando el kit de la marca Hach
Se determina mediante el Método 1851-02 de Hach, usando el kit comercial de esta marca
(Cyanuric Acid Test Kit, Model CY-3).
Electroforesis en gel de agarosa
El DNA amplificado generado durante la reacción en cadena de la polimerasa, se observó
mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%, en regulador TBE 1X (GIBCO BRL), donde
también se incluyó un marcador de peso molecular para comparar el tamaño del fragmento de
DNA amplificado. La electroforesis se llevó a cabo aplicando una corriente de 80V durante 1h y se
utilizó bromuro de etidio como revelador.
Composición del regulador TBE
Componente Cantidad Concentración
Tris base 121.1 g 1 M
Ácido bórico anhidro 61.8 g 1 M
Na2EDTA2H2O 7.4 g 20 mM
Agua desionizada 1 Litro -----
La concentración de la solución es 10X y se diluye con agua desionizada para su uso. El pH final
obtenido es de 8.3.
Técnica de aislamiento de DNA de bacterias
Se llevó a cabo utilizando un kit de extracción de DNA de suelo, el cual utiliza una lisis química y
mecánica de las células (Ultra Clean TM Soil DNA Kit, 50 Purifications).
Amplificación del DNA por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificación de una región específica de DNA, se lleva a cabo mediante la reacción en cadena
de la polimerasa; PCR por sus siglas en (Polymerase Chain Reaction). La reacción se realizó en un
termociclador (Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400) con el siguiente programa:
Primeramente se tiene una desnaturalización a 94°C por 5 minutos, después se tienen 35 ciclos
consistentes en 1 minuto a 94°C, un alineamiento a 55°C por un minuto y una extensión a 72°C por
2.5 minutos, seguido por 10 minutos para la extensión final a 72°C. Concluida la amplificación, se
dejan enfriar las muestras durante diez minutos a 4°C.
La mezcla de reacción para la amplificación contenía: 1 L de DNA molde, 2.5 L de regulador 10X,
0.75 L de MgCl2 50 mM, 0.5 L de dNTP 10 mM (desoxirribonucleótidos trifosfato), 0.125 L de
Taq DNA polimerasa, 18 L de agua bidestilada y finalmente 1 L de cada iniciador, dando un
volumen final de 25 L.
Técnica RAPD-PCR (Random Amplification of the Polymorphic DNA).
Esta técnica fue utilizada para comparar las cepas de las bacterias seleccionadas, utilizando
iniciadores al azar para amplificar fragmentos de tamaño variable de DNA a partir de DNA
genómico. Los marcadores utilizados en la Amplificación al azar del DNA polifórmico son
fragmentos de DNA provenientes de la amplificación por PCR de segmentos al azar de DNA
genómico con un iniciador único de secuencias arbitrarias de nucleótidos.
Se utilizaron los iniciadores específicos 1283 (5´-GCGATCCCCA-3´) y 1290 (5´-GTGGATGCGA-3´),
utilizando un volumen de 25 L de una mezcla que contiene 2.5 L de regulador [200 mM Tris-HCl
(pH 8.4), 500 mM KCl], 0.75 L de MgCl2, (50 mM), 0.5 L de desoxinucleótidos (10 mM cada uno),
0.125 L de Taq polimerasa (5 U/ L), 18.925 L de H2O, a la mezcla anterior se le adiciona 2 L de
la solución del DNA extraído y 1 L del iniciador correspondiente. La amplificación se lleva a cabo
mediante un programa que consiste en 5 minutos a 94°C, previo a 35 ciclos consistentes en 1
minuto a 94°C, 1 minuto a 36°C y 2 minutos a 72°C. Finalmente se da un calentamiento a 72°C por
10 minutos más.
RESULTADOS
Aislamiento de microorganismos con capacidad de degradar ácido cianúrico.
Mediante la técnica de enriquecimiento, se obtuvo un cultivo capaz de utilizar el ácido cianúrico,
del cual se lograron separar por morfología colonial los siguientes microorganismos:
Cepa Morfología colonial
1 Colonias redondas, blancas, transparentes, abultadas y redondas. Buen crecimiento
sobre medio con ácido cianúrico.
2 Colonias redondas, pequeñas, abultadas, de color naranja. Buen crecimiento sobre
medio con ácido cianúrico.
3 Colonias grandes, cremosas, opacas, redondas. Aisladas, necesitan una fuente de
carbono adicional (glucosa) para su crecimiento en ácido cianúrico.
4 Colonias pequeñas, blancas, superficie irregular, dura, queratinosa. Aisladas, necesitan
una fuente de carbono adicional (glucosa) para su crecimiento en ácido cianúrico.
5 Colonias muy pequeñas de color rojo, superficie irregular, dura, crece en forma de
estría. Aisladas, crecen escasamente sobre medio con ácido cianúrico.
6 Colonias pequeñas de color amarillo, redondas, brillantes, cremosas y lisas. Aisladas,
crecen escasamente sobre medio con ácido cianúrico.
7 Colonias pequeñas de color verdoso, redondas, opacas. Aisladas, necesitan una fuente
de carbono adicional (glucosa) para su crecimiento en ácido cianúrico.
Nota: Los microorganismos se encuentran en proceso de identificación por técnicas de biología
molecular, mediante la extracción del DNA de cada cepa aislada, amplificación y secuenciación de
los fragmentos de 16S rDNA bacteriano y comparación con secuencias conocidas del NCBI
GenBank.
Cinética de acumulación de la enzima cianúrico hidrolasa en cultivo por lote.
Para la evaluación de la acumulación de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa en diferentes
sistemas fermentativos se utilizó una comunidad microbiana previamente aislada de suelo de
cultivo de maíz de Teotihuacán, Edo. De México, conformada por Agrobacterium sp. y
Acinetobacter sp.
Además de la estabilidad del anillo N-heterocíclico, la biodegradación del ácido cianúrico es difícil
debido a la baja relación carbono/nitrógeno en la molécula (C/N=0.857). Así que, para mejorar la
eficiencia de remoción y biodegradación de compuestos triazínicos, frecuentemente es necesario
adicionar fuentes de carbono asimilables para compensar el desbalance C/N (Galíndez Nájera,
2008). En este proyecto se llevaron a cabo cultivos por lote a una concentración de 100 ppm de
ácido cianúrico y 50 ppm de glucosa como fuente de carbono adicional. En cada uno de los cultivos
se tomaron muestras cada 24 horas (se inocularon 8 matraces al mismo tiempo manteniéndose en
agitación retirando un matraz completo para usarlo como muestra por día), se determinó la
actividad de la enzima por cuadruplicado y la concentración de proteína por el método de Lowry
pro duplicado. En el siguiente cuadro, se muestran los resultados de actividad enzimática
específica (Ypx), obtenidos en cultivo por lote de Acinetobacter sp., donde se observa que existe
un máximo de actividad a las 48 horas de cultivo.
Actividad enzimática específica (Ypx) en cultivo por lote para Acinetobacter sp.
Tiempo (horas)
mg proteína/mL Ypx (U/mg)
0 0.016 3.29
24 0.021 4.22
48 0.016 13.62
72 0.023 11.54
96 0.016 9.29
120 0.022 7.26
144 0.022 2.58
168 0.026 1.38
En el cuadro 10, se muestran los resultados de actividad enzimática específica (Ypx), obtenidos en
cultivo por lote de Agrobacterium sp., donde se observa que existe un máximo de actividad a las
72 horas.
Actividad enzimática específica (Ypx) en cultivo por lote de Acinetobacter sp con
respecto al tiempo
0 2
4
6
8
10
12
14
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tiempo (horas)
Actividad enzimática específica (U/mg)
Actividad enzimática específica (Ypx) en cultivo por lote para Agrobacterium sp
Tiempo (horas)
mg proteína/mL Ypx (U/mg)
0 0.084 0.387
24 0.093 1.785
48 0.083 1.804
72 0.077 7.074
96 0.077 2.337
120 No se determinó No se determinó
144 0.069 3.237
168 0.103 1.033
192 0.069 1.529
En el siguiente cuadro se muestran los resultados de actividad enzimática específica (Ypx),
obtenidos en cultivo por lote para el consorcio microbiano conformado por Acinetobacter sp y
Agrobacterium sp., donde se observa que existe un máximo de actividad a las 72 horas.
Actividad enzimática específica de Agrobacterium sp en cultivo por
lote con respecto al tiempo
0
2
4
6
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (horas)
Actividad específica (U/mg)
140 160 180 200 210 220
Actividad enzimática en cultivo por lote para el consorcio microbiano
(Acinetobacter sp., y Agrobacterium sp.)
Tiempo (horas)
mg proteína/mL Ypx (U/mg)
0 Dato eliminado Dato eliminado
24 0.071 2.147
48 0.025 11.829
72 0.025 31.108
96 0.025 22.701
120 0.02 22.221
144 0.015 13.456
En la siguiente figura se presenta el gráfico de actividad enzimática específica con respecto al
tiempo correspondiente a los tres casos utilizados en cultivo por lote (lote con Acinetobacter sp.,
lote con Agrobacterium sp., lote con el consorcio microbiano), donde se observa que en los tres
casos se presentan máximos de actividad entre 48 y 72 horas después de la inoculación, así mismo
en los tres casos existe una disminución considerable en actividad después de estos máximos de
actividad al transcurrir el tiempo. Comparando los valores máximos de actividad obtenidos en
cada caso, se observa que Acinetobacter sp. presenta mayor actividad que Agrobacterium
tumefaciens, así mismo el consorcio microbiano presenta mayor actividad comparado con los dos
casos anteriores. Se tienen referencias de que cultivos microbianos múltiples ejercen una actividad
sinérgica en la biodegradación de compuestos xenobióticos recalcitrantes (Roberts y col., 1993;
Sorensen, y col., 2005; Satruna, y col., 2006), por lo que el hecho de que el consorcio presente
mayores niveles de acumulación de la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa indica dicha
potencialización en la mineralización del ácido cianúrico.
Actividad específica en cultivo por lote de la cepas Acinetobacter sp. ( ), Agrobacterium
tumefaciens ( ) y de la comunidad bacteriana ( ), con respecto al tiempo.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
5
10
15
20
25
30
Tiempo (horas)
Actividad específica (U/mg)
En el siguiente cuadro se presentan los resultados de productividad de ácido cianúrico
amidohidrolasa y actividad enzimática correspondiente a esa productividad obtenida en cada uno
de los lotes usados en cultivo por lote, donde se observa que la productividad de enzima de
Acinetobacter sp. es mayor que la de Agrobacterium sp., así como la productividad mayor
obtenida fue con el consorcio microbiano.
Productividad de ácido cianúrico amidohidrolasa y actividad enzimática obtenida en los cultivos
por lote
Lote Productividad de ácido cianúrico amidohirolasa
(U/mgh)
Actividad enzimática específica (U/mg)
Acinetobacter sp 0.215 13.623
Agrobacterium sp 0.093 7.074
Consorcio microbiano 0.402 31.108
Cinética de acumulación de la enzima en cultivos Fed-Batch
Durante el desarrollo de los cultivos por lote la actividad máxima obtenida fue 31.108 U/mg para
el consorcio microbiano, menor que la actividad reportada por Karns y Jefrey (1999), por lo que se
decidió utilizar un sistema de cultivo que permitiera obtener mejores condiciones metabólicas
para lograr mayores niveles de acumulación de la enzima. El cultivo por lote alimentado
linealmente (alimentación constante) “Fed-batch lineal”, permite tener estas condiciones al
alargar la fase de crecimiento activo y retardar la fase de decaimiento de actividad.
En el siguiente cuadro se muestran los resultados de actividad enzimática específica (Ypx),
obtenidos en cultivo Fed-batch de Acinetobacter sp. y de Agrobacterium sp. y del consorcio
microbiano a un flujo de alimentación de 5.67 mL/h.
Actividad enzimática específica (Ypx) en el cultivo Fed-batch para Acinetobacter sp.,
Agrobacterium sp. y del consorcio microbiano (flujo de alimentación 5.67 mL/h).
Tiempo (horas)
Ypx (U/mg) a un flujo de 5.67 mL/h
Acinetobacter sp Agrobacterium sp Consorcio microbiano
0 57.63 61.79 52.04
24 301.24 290.76 173.06
48 350 236.63 217.17
72 443.93 353.68 221.51
96 603.35 636.22 No se determinó
120 576.98 498.35 204.9
144 567.7 439.33 112.83
En el siguiente cuadro se muestran los resultados de actividad enzimática específica (Ypx),
obtenidos en cultivo Fed-batch para el consorcio microbiano para el flujo de alimentación de 11.73
mL/h, donde se observa que existe un máximo de actividad a las 120 horas.
Actividad enzimática específica (Ypx) en el cultivo Fed-batch para el consorcio microbiano (flujo
de alimentación 11.73 mL/h)
Tiempo
(horas)
mg proteína/mL Ypx
(Y/mg)
0 0.0024 129.16
24 0.0033 101.95
48 0.0033 159.12
72 0.0021 168.58
96 0.0012 742.81
120 0.0009 822.94
144 0.0009 659.67
En la siguiente figura se presenta el gráfico de actividad enzimática específica con respecto del
tiempo correspondiente a los cuatro casos utilizados en el cultivo Fed-batch (Fed-batch con
Acinetobacter sp., con Agrobacterium sp., con el consorcio microbiano con un flujo de
alimentación de 5.6 mL/h y Fed-batch con el consorcio microbiano con un flujo de 11.73 mL/h),
donde se observa que en al menos tres casos se presentan máximos de actividad entre 95 y 100
horas después de la inoculación. Comparando los valores máximos de actividad obtenidos en cada
caso, se observa que los máximos correspondientes a Acinetobacter sp. y Agrobacterium sp., son
similares entre sí, sin embargo el máximo obtenido para el consorcio microbiano con un flujo de
alimentación de 11.73 mL/h es mayor a los dos anteriores, así mismo el valor obtenido para el
consorcio microbiano con un flujo de alimentación de 5.67 mL/h es mucho menor a todos.
En el siguiente cuadro se presentan los resultados de productividad de ácido cianúrico
amidohidrolasa y actividad enzimática específica correspondiente a esa productividad para el
consorcio microbiano con un flujo de alimentación de 5.67 mL/h y 11.73 mL/h, donde se observa
que con el flujo de 11.73 mL/h se obtiene mejor productividad que con el flujo menor, así mismo
las productividades obtenidas son mayores a las obtenidas en cultivo por lote.
Productividad de ácido cianúrico amidohirolasa y actividad enzimática específica obtenida en los
cultivos Fed batch con el consorcio microbiano con un flujo de alimentación de 5.67 mL/h y
11.73 mL/h
Fed-batch Productividad de ácido cianúrcio amidohidrolasa
(U/mgh)
Actividd enzimática específica (U/mg)
Consorcio microbiano (flujo de alimentación 5.67 mL/h)
3.294 221.51
Consorcio microbiano (flujo de alimentación 11.73 mL/h)
9.728 822.94
Actividad enzimática específica vs. Tiempo
0
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (horas)
Actividad enzimática específica (U/mg)
Acinetobacter sp Agrobacterium sp Consorcio (5,67mL/h) Consorcio (11,73mL/h)
700
800
RAPD-PCR
Al aplicar la técnica de RAPD a ambas cepas se obtuvieron sus huellas. La correspondiente a
Agrobacterium sp. despliega 2 bandas claras (1300 a 1400 pb); en cuanto a Acinetobacter sp. el
desplegado es de 6 bandas claras, que van de 600 a 1500 pb. La muestra correspondiente al
efluente del reactor despliega sólo las dos bandas que pertenecen a Agrobacterium sp.
Cinética de acumulación de la enzima en cultivo por lote repetido.
Durante el desarrollo del cultivo Fed-batch se observó que el cultivo poseía una alta
heterogeneidad, ocasionando problemas al tratar de obtener muestras representativas y forzando
a aumentar el volumen de las mismas, provocando que el volumen de la suspensión dentro del
reactor fuera muy poco; por lo que se propuso utilizar el cultivo por lote repetido con un volumen
de cultivo mayor al de los lotes y mayor al máximo volumen de los cultivos Fed-batch, además de
que este permite contar con mayores concentraciones de biomasa iniciales, ya que el inóculo de
los lotes que siguen del inicial, es proveniente del anterior, permitiendo aumentar la
concentración de biomasa reactiva; por lo tanto se esperaba obtener mayor concentración de
enzima.
En el siguiente cuadro se presentan los resultados de productividad de ácido cianúrico
amidohidrolasa, eficiencia de remoción, velocidad volumétrica de consumo y actividad enzimática
específica máxima, obtenidos en el cultivo por lote repetido, donde se observa que las
productividades, eficiencias de remoción y velocidades de consumo, en general se favorecieron
durante el proceso, así como también se favoreció la acumulación enzimática, ya que las
actividades enzimáticas específicas máximas obtenidas aumentan durante el cultivo. En todos los
PM
Mezcla
Agrobacterium
tumefaciens
Acinetobacter sp
casos se obtuvieron valores da actividad enzimática específica mayores al reportado por (Karns,
1999).
Productividad de ácido cianúrico amidohidrolasa, eficiencia de remoción, velocidad volumétrica
de consumo y actividad enzimática específica máxima obtenida en cada lote del cultivo por lote
repetido
Lote Productividad de ácido cianúrico amidohidrolasa
(U/mgh)
Eficiencia de
remoción (%)
Velocidad volumétrica de consumo
(mg/Lh)
Actividad enzimática específica máxima
obtenida (U/mg)
1 0.297 19.57 0.072 147.223
2 0.4209 23.64 0.107 172.722
3 0.563 22.32 0.099 217.388
4 0.977 34.41 0.174 317.778
Monitoreo de la comunidad bacteriana en cultivo por lote repetido.
Al finalizar cada lote se tomó una muestra de la suspensión celular del reactor; cada muestra se
centrifugó para obtener una pastilla de biomasa que se destinó para el monitoreo de la
comunidad bacteriana por biología molecular.
El monitoreo se llevó a cabo mediante la extracción de DNA de las muestras, amplificación con el
primer 1283 y corrimiento en gel de agarosa para observar las bandas características de cada una
de las cepas. El primer 1283 fue reportado por Galíndez Nájera, 2008, como capaz de generar
amplicones y bandas en gel de agarosa características y diferentes para las cepas integrantes de la
comunidad bacteriana utilizada.
En la siguiente figura se observa el gel de agarosa con las bandas correspondientes a los
amplicones obtenidos en cada uno de los lotes del cultivo por lote repetido. Con respecto a los
amplicones obtenidos de la muestra del primer lote, se puede observar la presencia de las bandas
muy tenues correspondientes a la cepa Agrobacterium sp.; no así en el segundo y tercer lote
donde se observa claramente la presencia de las bandas correspondientes a Agrobacterium sp., y
se logra observar la banda muy tenue característica de Acinetobacter sp. Es importante recalcar
que el inóculo utilizado para llevar a cabo todo el proceso fue tomado del cultivo Fed-Batch,
donde muy probablemente ya existe la predominancia de una de las cepas.
IMPACTO
La principal contribución de este proyecto fue que se lograron aislar microorganismos con
capacidad de degradar el intermediario común y más difícil de remover durante la biodegradación
de los herbicidas triazínicos, el ácido cianúrico. Además se estudió la acumulación de la enzima
cianúrico hidrolasa, en un consorcio microbiano con capacidad de degradar el ácido cianúrico y en
sus integrantes aisladas: Agrobacterium sp y Acinetobacter sp. La enzima ácido cianúrico
amidohirolasa (cianúrico hidrolasa) es la primera enzima en la vía de degradación del ácido
cianúrico y responsable de la ruptura del anillo triazínico, en este trabajo se realizó el estudio de la
acumulación de esta enzima en diversos sistemas fermentativos para su aplicación en procesos
biológicos, sencillos y susceptibles de escalamiento, con los cuales puede llevarse a cabo la
depuración de agua contaminada con estos herbicidas triazínicos tan utilizados en nuestro país.