Examen Departamental

28 de marzo de 2014, 14:00 a 16:00 horas. SICA 1, 2, 3 y SI 1, 2 Comprenderá las Unidades 1, 2 completas y la Unidad 3 solo Medios de Cultivo y Grupos Nutricionales (clasificación) http://amyd.quimica.unam.mx/course/view.php?id=30

Pruebas BioquímicasDeterminan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificación y clasificación

de bacterias y hongos.

Pruebas Bioquímicas

Se pueden resumir en los siguientes puntos:

•Sustrato (contenido en el medio de cultivo)

•Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del microorganismo)

•Producto

•Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)

E + S ↔ ES ↔ E + PE + S E + S ↔↔ ES ES ↔↔ E + PE + P

Los fundamentos completos de estas pruebas y demás información pueden encontrarlos en el libro: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica de Jean F. MacFaddin, Editorial Médica Panamericana.

Hidrólisis del Almidón

Agar Almidón Sustrato: Almidón (polímero de glucosa).Enzima: Amilasa (exoenzima).Producto: Glucosa.Revelador: Lugol. El lugol con el almidón forman un complejo color azul o café-púrpura que desaparece cuando el almidón ha sido degradado.

El almidón es producido principalmente por plantas superiores, estácompuesto de amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amilolíticas hidrolizan almidón y sus productos.Prueba negativa Prueba positiva

Degradación de la caseína

Prueba negativa Prueba positiva

Agar Leche DescremadaSustrato: Caseína (proteína).Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima).Producto: Aminoácidos.Revelador: No requiere.

Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento microbiano.

Hidrólisis de la lecitina y reducción del telurito

Algunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la lecitina (fosfolípido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor.

El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y cuantificación de estafilococos coagulasa positivos, al que se adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias típicas de S. aureus son oscuras por la reducción del telurito, además presentan el halo de hidrólisis de la lecitina.

Agar yema de huevo/Agar Baird ParkerSustrato: Lecitina.Enzima: Lecitinasa.Producto: Fosforilcolina.Revelador: No requiere.

Licuefacción de la gelatina

Gelatina NutritivaSustrato: Gelatina (proteína).Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima).Producto: Aminoácidos.Revelador: No requiere o puede emplearse el carbón activado en polvo.

La gelatina es una proteína que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminoácidos que la componen pierde su característica de gelificar. Se pueden emplear varios medios que permiten la visualización macroscópica como la gelatina adherida a carbón activado.

Prueba negativa Prueba positiva

Agar GelatinaOBJ. Determinar si el microorganismo es capaz de degradar la gelatina.

Inocular el medio mediante estría recta

incubar a 37°C durante 24 h

Agregar HgCl2 para revelar

Prueba +: no pp alrededor de la siembra

Prueba -: pp alrededor de la siembra

HIDRÓLISIS DE GELATINA

*La siembra se realiza por picadura

•Se incuba 24-48 h a 37 °C

•Refrigerar 30 min y registrar resultado

Gelatina + H2O polipéptidos + H2O aa. individualesGelatinasas y proteasas

Gelatinasas y proteasas

(-) Medio sólido (+) Licuefacción del medio

Fermentación de carbohidratos

Medio base rojo de fenol más carbohidrato o polialcohol, con campana de fermentación (Durham).Sustrato: Carbohidrato o polialcohol.Vía: Fermentativa.Producto: Ácidos orgánicos.Indicador: Cualquier indicador de pH.

Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados en monómeros y transportados a la célula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la vía fermentativa. La fermentación (degradación) de un compuesto orgánico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formación de gas capturado en la campana de fermentación.

Negativo/Positivo(A)/Positivo(AG)

Oxidación/Fermentación

Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la necesidad de oxígeno atmosférico y una fosforilación inicial. Por prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno.

La fermentación requiere de una fosforilación inicial, utiliza principalmente la vía de la Glucólisis (Embden-Meyerhof-ParnasEMP), aunque también puede utilizar las vías de las Pentosas fosfato o Entner-Doudoroff en combinación con EMP.

Hugh and LeifsonSustrato: Carbohidratos.Vías: Fermentativa y/u Oxidativa.Producto: Acido pirúvico.Indicador: Azul de bromotimol u otro indicador ácido/base.

Oxidación/Fermentación

La oxidación de la glucosa produce ácido pirúvico por la vía de Entner-Doudoroff (ED) o por una derivación. Ambas se han encontrado en procariotes.

La vía de ED ocurre en condiciones aerobias.

La vía de derivación no requiere de fosforilación inicial.

GlucosaGlucosaDeshidrogenasa

Ácido glucónicoGluconato dehidratasa

Ácido2-ceto-glucónicoCinasa

Ácido 2-ceto-6-fosfoglucónico (KDPG)

Reacciones ED

2 Moles de ácido pirúvico

En la derivación se forma el intermediario KDPG que se incorpora a la vía de ED para formar piruvato.

Oxidación/Fermentación

Reacción Tubo con reacción positiva Tubo abierto Tubo selladoOxidación Abierto Amarillo (+) Verde (-)

Fermentación Sellado Amarillo (+) Amarillo

Ni fermentación, ni oxidación

Ninguno Azul o verde Verde

Fermentación y oxidación

Ambos Amarillo Amarillo

La producción de ácido se observa por el vire del indicador al amarillo. En los tubos positivos puede haber generación de gas.

Rojo de Metilo/Voges ProskauerCaldo RM/VPSustrato: Glucosa.Vías: Fermentación ácida o neutra.Producto: Acido orgánicos o acetoína.Reveladores: Solución de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%.

Fermentación ácido mixta: Los productos finales son ácidos orgánicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo (pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido láctico y dos las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del fórmico a CO2 y H2 en cantidades iguales.

Rojo de Metilo/Voges ProskauerFermentación butilenglicólica: en ésta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol, productos que son neutros.

Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba de Voges-Proskauer): Se agrega un poco de α-naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le añade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violáceo en la parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloración).

Utilización de citrato

Prueba negativa Prueba positiva

Medio de Citrato de SimmonsSustrato: Citrato de sodio.Vía: Varias dependientes del pH del medio.Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Acetoína y CO2 en condiciones ácidas.Indicador: Azul de bromotimol.

Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.

Agar Hierro de Kligler (KIA)

Agar hierro de Kligler Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína. Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa-Productos: Ácidos mixtos y H2S.Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+ .

En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.

Agar Hierro de Kligler (KIA)No fermentadores

Pico de flauta alcalino y fondo alcalino

No fermentadores de lactosa

Péptidos Aminas

O2

Glucosa

Ácidos Mixtos

Reacción inicial: Pico de flauta ácido y fondo ácido

Reacción final: Pico de flauta alcalino y fondo ácido

Péptidos Aminas

O2

Glucosa

Ácidos Mixtos

Fermentadores de lactosa

Péptidos Aminas

O2

Glucosa + Lactosa

Ácidos Mixtos

Pico de flauta ácido y fondo ácido

Péptidos Aminas

O2No fermenta

pH = 7.4

•Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan todo el medio.

•Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan aeróbicamente la glucosa. Debido a la baja concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio.

•Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa del medio.

Agar Hierro de Kligler (KIA)

Tubo C 1 2 3 4 4A 5Fermentación de Glucosa - - + + + + +

Producción de gas de la fermentación

- - - + + + +

Fermentación de Lactosa - - - - + + +

Producción de H2S - - - + - - +

El medio de Kligler estádiseñado para la identificación de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas.

•Interpretación:

Medio SIM (Sulfhídrico Indol Movilidad)

Medio SIM (medio semisólido)Sustratos: Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína y triptófano. Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y tiptofanasa.Producto: H2S e Indol.Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA).

Prueba positiva Prueba negativa

En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.

Medio SIM (Sulfhídrico Indol Movilidad)

El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada.

Prueba positiva Prueba negativa

Prueba negativa Prueba positiva

Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en la superficie del medio.

1.- Medio sin inocular

2.- S -, I -, M +

3.- S -, I +, M -

4.- S +, I -, M +

1 2 3 4

Ureasa

Caldo urea o agar urea de Cristensen.Sustrato: Urea.Enzima: Ureasa.Producto: Amoníaco.Indicador: Rojo de fenol.

La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es color bugambilia.

Prueba negativa Prueba positiva

Reducción de Nitratos

Caldo nitratos Sustrato: Nitrato de sodio.Enzima: Nitrato reductasa.Producto: Nitritos.Revelador: Reactivos de Griess.

N03- → NO2

- → NO → N2O → N2

•Nitrato reductasa (NAR).

•Nitrito reductasa (NIR).

•NO reductasa (NOR).

•N2O reductasa (N2OR).

Reducción de NitratosEl nitrito reacciona con dos reactivos: ácido sulfanílico y dimetil-a-naftilamina (o a-naftilamina). La reacción de color se debe a la formación de un compuesto diazonio, p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina.

NH2

SO3H

Acido sulfanílico (incoloro)

+ HNO2

Acido nitroso

Acido sulfanílico diazotizado (sal de diazonio)

N

SO3H

N

+ H2O +

NH2

α-naftilamina (incolora)

p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina (colorante rojo azo hidrosoluble)

NH2

+ H2O N

SO3H

NAcoplamiento

Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir químicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griess el compuesto colorido.

Descarboxilasas

Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias.

Medio base de descarboxilasas u otros medios como LIA o MIO.Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o arginina) .Enzimas: Lisina descarboxilasa.Producto: AminasIndicador: Púrpura de bromocresol.

Prueba de la coagulasa

Plasma de conejoSustrato: Factores de la coagulación.Enzima: Coagulasa (estafilocoagulasa).Producto: Coágulo.Revelador: No requiere.

La enzima producida por S. aureus es excretada al medio extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el plasma y formar un coagulo visible.

Prueba positiva Prueba negativa

Oxidasa

Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Esta reacción se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones. La prueba positiva se observa por la oxidación del reactivo incoloro en pocos segundos formándose un producto colorido.

Cultivo de medio nutritivoSustrato: Compuesto reducido.Enzima: Oxidasa.Producto: Compuesto oxidado.Revelador: Reactivo de Kovacs, diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) al 1%, solución incolora.

IndolIndol VPVP H2SH2S UreaUrea MovilidadMovilidad ÁÁcido de cido de lactosalactosa

ÁÁcido de cido de glucosaglucosa

E. coliE. coli 9898 00 11 11 9595 100100 9595

Proteus Proteus mirabilismirabilis

22 5050 9898 9898 9595 9696 22

TABLAS DE IDENTIFICACIÓN

% de cepas probadas que dan positiva la prueba

Tiras API

MALDI-Biotyper

Matrix-assisted laser desorption/ionizationMALDIEspectrometría de masas para identificación de proteínas ribosomalesbacterianas.Ventaja: menor tiempo de identificación y muy buena precisión.

http://www.bruker.com/products/mass-spectrometry-and-separations/maldi-biotyper/overview.html

Chips para la detección de microorganismos patógenos. IFC, UNAM.

http://www.dgcs.unam.mx/boletin/bdboletin/2013_764.html

http://ciber-genetica.blogspot.mx/2012/01/microarreglos-de-dna.html

http://www.dgcs.unam.mx/gacetaweb/2014/140127/gaceta.pdf