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EVALUACION TRANSITORIA DEL PROMOTOR DEL GEN DE LA PROTEINA DE LA CAPSIDE DEL Virus del
mosaico amarillo de la papa (PYMV) - COLOMBIA EN PLANTAS DE TABACO
Presentado por: ANDREA JIMENA PULIDO RENDÓN
Universidad Nacional de Colombia
Facultad De Ciencias Agropecuarias, Coordinación General De Postgrados Sede Palmira
2014
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EVALUACION TRANSITORIA DEL PROMOTOR DEL GEN
DE LA PROTEINA DE LA CAPSIDE DEL Virus del
mosaico amarillo de la papa (PYMV) - COLOMBIA EN
PLANTAS DE TABACO
ANDREA JIMENA PULIDO RENDÓN
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de
Magíster en Ciencias Biológicas
Director JUAN CARLOS VACA VACA MSc., Ph.D.
Co- director
KARINA LÓPEZ LÓPEZ Ph.D
Línea de Investigación Biotecnología Vegetal
Universidad Nacional De Colombia Facultad de Ciencias Agropecuarias, Coordinación General de Postgrados
Palmira, Colombia 2014
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(Dedicatoria)
A Dios Todopoderoso, en quien confío infinitamente, por derramar tantas bendiciones en mi vida, por ser mi guía y fortaleza espiritual, por poner en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía en momentos de alegría y adversidad. A mi madre Elvira Rendón, quien es mi gran motivación para alcanzar mis metas y mi ejemplo incuestionable a seguir, por su inmenso amor, dedicación y sacrificio.
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AGRADECIMIENTOS
A mi familia por sus oraciones, buenos deseos y constante motivación para culminar exitosamente mis metas.
Al grupo de investigación Interacción Planta Microorganismo Ambiente (IPMA).
A mis directores de tesis: Dra Karina López López y Dr. Juan Carlos Vaca Vaca, por la gran confianza depositada en mí, por sus enseñanzas, consejos y valiosa orientación en el desarrollo de esta investigación. A los docentes de la Facultad de Ciencias Agropecuarias por su trabajo, compromiso y la formación suministrada durante mis estudios de posgrado. Al Dr. Hernando Ramírez por su tiempo, apoyo y disposición constante. Al Dr. Paul Chavarriaga del CIAT por donar gentilmente el vector pCAMBIA 1305,2
de gran utilidad en los ensayos realizados.
A Cristian Olaya MSc y Roosevelt Escobar MSc del CIAT quienes facilitaron el
equipo donde se tomaron las fotografías del presente trabajo.
A mis compañeros de laboratorio Miguel Ángel Useche, Claudia Salazar, Hover Beltrán, Emerson Carrasco por compartir el proceso y por su gran ayuda. A Nubia Rodríguez, Alexandra García y María Helena Guevara de los laboratorios de Microbiología Vegetal, Fitopatología y Cultivo de tejidos Vegetales por su apoyo y colaboración para llevar a cabo los procesos de evaluación y ensayos de laboratorio correspondientes a este trabajo. A Alexandra García por su amabilidad, paciencia y disponibilidad para colaborar. A mis amigos Fabián Salazar, Yamileth Gómez, Magaly Castillón, Miguel Useche Efrén Muñoz, Milton Valencia y Cristian Carreño por su amistad sincera y por los excelentes momentos compartidos en el transcurso de estos años. A doña Ruby Del Valle por su afecto y por tener siempre una frase de aliento y motivarme a salir adelante.
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A la Universidad Nacional de Colombia, por facilitar las instalaciones, equipos necesarios para realizar los ensayos requeridos para la elaboración de este trabajo.
A la Dirección de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira (DIPAL), por la financiación del trabajo de tesis dentro del proyecto titulado "EVALUACION TRANSITORIA DE PROMOTORES VIRALES EN PLANTAS DE TABACO” Código HERMES 18846, que resultó ganador de la CONVOCATORIA Y MODALIDAD CONVOCATORIA DEL PROGRAMA NACIONAL DE PROYECTOS PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN, LA CREACIÓN Y LA INNOVACIÓN EN POSGRADOS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 2013-2015. Modalidad 3. Proyectos de investigación, creación o innovación en desarrollo.
Y a todas aquellas personas que directa e indirectamente contribuyeron en el desarrollo y culminación de este trabajo.
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Resumen
Los promotores derivados de virus son herramientas biotecnológicas muy útiles
que permiten regular la expresión de genes de interés en plantas transgénicas. Sin
embargo algunos promotores no promueven eficientemente la transcripción de
genes en diferentes plantas, siendo necesario evaluar nuevos promotores que
permitan obtener mejores resultados en cuanto a expresión y estabilidad génica.
Con base en lo anterior, el presente estudio tuvo como objetivo general: Evaluar
la expresión transitoria del promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus
del mosaico amarrillo de la papa Colombia (PYMV-Col) en plantas de Nicotiana
tabacum var Xanthi cultivadas in vitro. Para cumplir este objetivo, se optimizaron
las condiciones de biobalística, utilizando el promotor 35S de CaMV fusionado al
gen uidA, clonado en el vector pBI121. Las condiciones evaluadas fueron: presión
de disparo, número de disparos, distancia de disparo y reactivo para eliminar
pigmentos en fragmentos de hojas u hojas completas de tabaco. Las condiciones
optimizadas fueron validadas utilizando el vector pCAMBIA 1305,2.
Posteriormente se generó un vector de expresión heteróloga (PYMV-CPGUS)
constituido por el promotor del gen de CP de PYMV-Col, fusionado al gen uidA y
mediante ensayos transitorios se evaluó la expresión del gen uidA bajo la acción
del promotor CP-PYMV de acuerdo al número de puntos azules obtenidos y el
tejido donde fueron encontrados con base a la expresión génica obtenida con el
promotor 35S de CaMV. Las condiciones óptimas de biobalística fueron: una
presión de 160psi, 4 disparos, 0 cm de distancia y etanol 70% sobre hojas
completas de tabaco. Estas condiciones fueron validadas con pCAMBIA 1305,2
con el cual se obtuvo un alto número de puntos azules en los tejidos vegetales
evaluados. El promedio del número de puntos azules obtenidos con el promotor
CP-PYMV-Col fusionado al gen uidA (GUS) fue 23.2 en una hoja de N. tabacum y
el promedio del número de puntos obtenidos con el promotor 35S de CaMV fue
26.6. Respecto a la expresión del promotor CP-PYMV-Col fue observada
específicamente en células del mesófilo.
Palabras clave: Geminivirus, promotor CP-PYMV-Col, expresión transitoria, gen uidA, Helios® Gene Gun, promotor 35S de CaMV.
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Abstract
The promoters derivates of virus are very useful biotechnological tools to regulate the expression of genes of interest in transgenic plants. However, some promoters do not promote transcription efficiently of genes in different plants, being necessary to evaluate new promoters to obtain better results in terms of gene expression and stability. Based on the above, the present study aims: to evaluate the transient expression of the coat protein promoter of the Potato yellow mosaic virus- Colombia (PYMV-Col) in Nicotiana tabacum var Xanthi plants in vitro cultivated. To carry out this objective, the biolistic conditions were optimized using the 35S CaMV promoter fused to the uidA gene. The evaluated conditions were: pressure shot, number of shots, shooting distance and reagent to remove pigments in fragments of leaves or whole leaves tobacco. The optimizated conditions were validated using pCAMBIA 1305.2 vector. Subsequently, a heterologous expression vector (PYMV-CPGUS) was generated, constituted by the CP promoter of PYMV-Col, fused to the uidA gene and through transient assays was evaluated uidA gene under the action of CP-PYMV promoter according to the number of blue points obtained and the tissue where they were found based on gene expression obtained with the 35S CaMV promoter. Optimum conditions for biolistic were pressure 160psi, 4 shots, 0 cm of distance and ethanol 70% on whole leaves of tobacco. These conditions were validated with pCAMBIA 1305.2 and were obtained a high number of blue spots in plant tissues evaluated. The average number of blue spots obtained with the CP-PYMV-Col promoter fused to the uidA (GUS) gene was 23.2 on a leaf of N. tabacum and the average number of points obtained with the 35S CaMV promoter was 26.6 and expression of CP-PYMV-Col promoter was specifically observed in mesophyll cells. Keywords: Geminiviruses, CP-PYMV-Col promoter, transient expression, uidA gene, Helios® Gene Gun, 35S CaMV promoter.
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Contenido
Pág.
INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 16
1. CAPITULO 1. OBJETIVOS ............................................................................ 20
1.1. Objetivo General ............................................................................................ 20
1.2. Objetivos Específicos ..................................................................................... 20
2. CAPITULO 2. MARCO CONCEPTUAL ..................................................... 2121
2.1. Generalidades Geminivirus ........................................................................... 21
2.2. Clasificación de los Geminivirus .................................................................. 222
2.3. Organización Genómica de Begomovirus .................................................... 222
2.3.1. Componente genómico A.......................................................................... 233
2.3.2. Componente genómico B……………………………………………………….26
2.4. Mecanismo de replicación............................................................................ 288
2.5. Mecanismo de transcripción ........................................................................ 299
2.6. Ciclo infectivo de Begomovirus. .................................................................... 30
2.7. Circulación del Begomovirus en el insecto vector .......................................... 31
2.8. Virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV) ............................................. 31
2.9. Expresión tejido especifica de marcos de lectura abierto de Geminivirus en
plantas. ............................................................................................................... 322
2.10. Promotor 35S de CaMV ............................................................................. 344
2.11. Biobalística ................................................................................................ 355
2.11.1. Equipo biobalística portátil (Helios Gene Gun System- BioRad ®) .......... 366
2.11.1.1. Ventajas uso Helios Gene Gun System ............................................... 377
3. CAPITULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................. 388
3.1. Optimización de las condiciones de biobalística para realizar ensayos de
expresión transitoria de genes heterólogos en plantas de tabaco utilizando una
pistola de genes de baja presión Helios® Gene Gun (BioRad®)......................... 388
3.1.1. Multiplicación y preparación de material vegetal de tabaco Nicotiana
tabacum var. xanthi ..................................................................................... …….388
3.1.2.Plásmidos .................................................................................................. 399
3.1.3. Optimizacion de parámetros de inoculación de biobalistica ....................... 41
10
3.1.4. Tinción histoquímica para evaluar actividad de la β-glucuronidasa. ....... 433
3.1.5. Cuantificación de Expresión del gen reportero uidA (Gus) ....................... 434
3.2. Construcción del vector de expresión heteróloga constituido por el promotor del
gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarrillo de la papa-
Colombia fusionado al gen reportero uidA. ......................................................... 434
3.3. Determinación de la expresión especifica de tejido del promotor del gen de la
proteína de la cápside de Virus del mosaico amarrillo de la papa- Colombia
fusionado al gen reportero uidA mediante ensayos transitorios realizados en
plantas de tabaco. ............................................................................................... 466
4. CAPITULO 4. RESULTADOS Y DISCUSION ............................................. 488
4.1 Optimización de las condiciones de biobalística para realizar ensayos de
expresión transitoria de genes heterólogos en plantas de tabaco utilizando una
pistola de genes de baja presión Helios® Gene Gun System (BioRad®) ............ 489
4.2. Construcción del vector de expresión heteróloga constituido por el promotor del
gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarillo de la papa-
Colombia fusionado al gen reportero uidA. ......................................................... 588
4.3. Determinación de la expresión especifica de tejido del promotor del gen de la
proteína de la cápside de Virus del mosaico amarrillo de la papa- Colombia
fusionado al gen reportero uidA mediante ensayos transitorios realizados en
plantas de tabaco. ............................................................................................... 599
5. CAPITULO 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ................................. 677
5.1. Conclusiones ................................................................................................ 677
5.2. Perspectivas ................................................................................................. 688
6. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................ 699
11
Lista De Figuras
Pág.
Figura 1. Morfología de Geminivirus 21
Figura 2. Organización genómica del género Begomovirus 23
Figura 3. Representación del movimiento intra e intercelular de Geminivirus pertenecientes al género Begomovirus 27 Figura 4. Esquema ciclo de replicación de DNA en Geminivirus 29 Figura 5. Construcciones que contienen el dominio A y B de la región río arriba del promotor 35 CaMV 35 Figura 6. Preparación del material vegetal de tabaco Nicotiana tabacum var. xanthi previo a realizar ensayos de biobalística en fragmentos de hojas y hojas completas cultivadas in vitro. 39 Figura 7. Construcción del vector pBI121 a partir del vector pBI101 39 Figura 8. Mapa del vector pCAMBIA 1305.2 40 Figura 9. Equipo Helios ® Gene Gun System de BioRad ® 42 Figura 10. Optimización de parámetros de inoculación en Fragmentos de hoja y hojas completas de Nicotiana tabacum 42 Figura 11. Construcción CP-PYMV-pUC19 44 Figura 12. Esquema Construcción conformada por el promotor del gen de la
proteína de la cápside del Virus del mosaico amarillo de la papa Colombia
fusionado al gen uidA (PYMV-CPGUS) en los sitios de restricción PstI – EcoRI 45
Figura 13. Construcción conformada por el promotor del gen de la proteína de
cápside fusionado al gen uidA (PYMV-CPGUS) 46
Figura 14. Número de puntos azules obtenidos en ensayos de expresión
transitoria en hojas completas de N. tabacum 50
Figura 15. Evaluación del número de disparos en hojas de N. tabacum 51
12
Figura 16. Evaluación del reactivo para eliminar clorofila: metanol: acetona (3:1),
Etanol 70% en ensayos de expresión transitoria del promotor 35S de CaMV
fusionado al gen uidA (pBI121) en hojas completas de N. tabacum, utilizando la
pistola génica Helios® Gene Gun de BioRad® 52
Figura 17. Evaluación de la presión (psi) de bombardeo en hojas de N. tabacum.
Promedio del número de puntos azules obtenidos en ensayos de expresión
transitoria en hojas completas de N. tabacum cultidas in vitro utilizando el
promotor 35S de CaMV fusionado al gen uidA (pBI121) al evaluar tres presiones
de disparo con la pistola génica Helios® Gene Gun de BioRad® 54
Figura 18. Evaluación de la presión (psi) de bombardeo en hojas de N. tabacum
en ensayos de expresión transitoria empleando el promotor 35S de CaMV
fusionado al gen uidA (pBI121), utilizando la pistola génica Helios® Gene Gun de
BioRad® 55
Figura 19. Promedio del número de puntos obtenidos en ensayos de expresión
transitoria en hojas completas de N. tabacum utilizando el vector pCAMBIA 1305.2
56
Figura 20. Expresión transitoria en hojas completas de N. tabacum, bajo la acción
del promotor 35S fusionado al gen GUSPlus (pCAMBIA 1305), utilizando la pistola
génica Helios® Gene Gun de BioRad® 57
Figura 21. Estructura de vectores de expresión. Construcción 35S CaMV- GUS en pBI121 y Construcción PYMV-CPGUS en pUC 19 59
Figura 22. Promedio del número de puntos obtenidos al evaluar el promotor del
gen de CP-PYMV-Col (PYMV-CPGUS) y el promotor 35S de CaMV (pBI121)en
ensayos de expresión transitoria en hojas completas de N. tabacum utilizando la
pistola génica Helios® Gene Gun de BioRad® 60
Figura 23. Resultados de expresión tejido específica de promotores virales
fusionados al gen uidA en tejido foliar de Nicotiana tabacum 62
Figura 24. Expresión en mesófilo del promotor del gen de la proteína de la
cápside de PYMV-Col mediante ensayos transitorios realizados en plantas de
tabaco (Nicotiana tabacum var Xanthi). 63
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Lista De Abreviaturas
Abreviatura
Término
AC1 Gen que codifica para la proteína asociada a la replicación. AC2 Gen que codifica para el transactivador de la transcripción AC3 Gen que codifica para el intensificador de la replicación. Act1 Promotor actina del arroz. AS Secuencia de activación. AV1 Gen que codifica para la proteína de la cápside.
BC1 Proteína que permite el movimiento del DNA viral de célula a célula.
BV1 Proteína que transporta el DNA viral del núcleo al citoplasma. BVi Región no codificante localizada rio arriba del marco de lectura
BV1. C Transcripción en sentido complementario al virion.
Cm Centímetro CLE Elemento tardío conservado. CP Proteina de la capside.
CP-PYMV-pUC 19
Construcción constituida por el promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarillo de la papa-col en el vector pUC 19.
PYMV-CPGUS Construcción constituida por el promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarillo de la papa-col fusionada al gen uidA.
DNA Acido desoxiribonucleico. DNAcs Acido desoxirribonucleico de cadena sencilla.
DNAcd Acido desoxirribonucleico de doble cadena. GFP GUS
Proteina verde fluorescente Gen reportero uidA que codifica para la proteína β- Glucuronidasa.
GUSPlus Gen reportero aislado de Staphylococcus sp y que ha sido modificado en la optimización de uso de codones para su expresión en plantas.
hptII Gen de resistencia a higromicina para selección en plantas. IPMA Interacción Planta -Microorganismo–Ambiente (Grupo de
investigación). IVIC Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas.
Kb Kilobase.
Mg Miligramo. mL Mililitro.
Nm Nanómetro. nptII Gen de selección que brinda resistencia al antibiótico
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kanamicina.
Nt Nucleótidos.
Pb Pares de bases. libras Psi Libras por pulgada cuadrada
PTGS Silenciamiento Postranscripcional.
RBR Proteína Retinoblastoma. RDR Replicación dependiente de recombinación.
Ren Enhancer de replicación. Rep Proteína de replicación.
RI Región intergénica RNA Acido Ribonucleico TGS Silenciamiento transcripcional
TrAP Proteína de transactivación transcripcional Ubi-1 Promotor del gen de la Ubiquitina en maiz V Transcripción en sentido del virion X-Gluc Acido 5-bromo-4-cloro-3-indol- β -D-glucurónico 2,4 D Acido 2,4-diclorofenoxiacético °C Grado Centígrado. µg Microgramo.
µm Micrométro.
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Lista De Acronimos
Los nombres (en inglés) y acrónimos de los virus que a continuación se listan y
que son empleados en el documento, se citan de acuerdo a las normas del Comité
Internacional de taxonomía Viral (Fauquet et al., 2008).
Acrónimo Nombre (Ingles) Nombre (Español)
AbVM Abutilon mosaic virus Virus del mosaico del abutilon. ACMV African cassava mosaic virus Virus del mosaico africano de la yuca. BCTV Beet curly top virus Virus del rizado de la remolacha.
BGMV Bean golden mosaic virus Virus del mosaico dorado del frijol.
CaLCuV Cabbage Leaf Curl Virus Virus rizado de la hoja de la col.
CaMV Cauliflower mosaic virus. Virus del mosaico de la coliflor. CLCuV Cotton leaf curl virus Virus rizado de la hoja de algodón.
EuMV Euphorbia mosaic virus Virus del mosaico de la euforbia.
MSV Maize streak virus. Virus del estriado del maíz. PepGMV Pepper golden mosaic virus Virus del mosaico dorado de la
pimienta PHYVV Pepper Huasteco yellow
vein virus Virus huasteco de la vena amarilla del chile.
PYMV Potato Yellow mosaic virus Virus del mosaico amarillo de la papa.
SLCV Squash leaf curl virus Virus del rizado de la hoja de la calabaza
TGMV Tomato golden mosaic virus Virus del mosaico dorado del tomate ToLCJAV Tomato leaf curl Java virus Virus Java enrollamiento de las hojas
del tomate TOMoTV Tomato mottle Taino virus Virus del moteado del tomate. ToVEV Tomato Venezuela Virus Virus del tomate de Venezuela.
ToYMV Tomato yellow mosaic virus Virus del mosaico amarillo del tomate.
TYLCV Tomato yellow leaf curl virus Virus del rizado amarillo del tomate.
TYLCSV Tomato yellow leaf curl Sardinia virus
Virus del rizado amarillo del tomate de sardinia.
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INTRODUCCIÓN Los virus representan uno de los grupos más importantes de patógenos que infectan vegetales, no solo por las grandes pérdidas que ocasionan, si no por el interés que generan como entidades biológicas sencillas, pero con capacidad para coordinar complejos procesos moleculares y bioquímicos. Estos agentes al ser parásitos obligados intracelulares, dependen absolutamente del medio celular, es por esto que en la mayoría de etapas durante la infección viral se establecen interacciones que involucran algunos pocos componentes virales y una multitud de factores aportados por el huésped, lo cual representa un pool de recursos objeto de manipulación para su propio beneficio (Ahlquist et al., 2003). Entre las familias de virus que mayores daños han ocasionado a gran variedad de cultivos de importancia agrícola están los geminivirus, virus emergentes que infectan plantas monocotiledoneas y dicotiledóneas de interés económico a nivel mundial y que por los mecanismos que utilizan en su ciclo infectivo y replicativo en el núcleo, pueden ser usados como vectores de expresión en plantas y regulación de genes, convirtiéndose en excelentes modelos para comprender la expresión genética vegetal (Ascencio et al., 2000; Gutiérrez, 2002). Es por esto que mientras más se profundice en el estudio de estos fitopatogenos más nos acercaremos a elucidar intrincados mecanismos del ciclo celular vegetal que aún no se comprenden en su totalidad y así poder establecer bases sólidas para aplicar esos conocimientos a la búsqueda de resistencia en plantas contra estos agentes devastadores. También se han previsto aplicaciones biotecnológicas para estos virus, sugiriéndose la necesidad de un complejo análisis y un estudio sistemático de los mismos (Gutiérrez, 1999; Lozano-Durán et al., 2011). Actualmente, es frecuente el estudio de promotores en biología molecular, que son fragmentos de DNA que contienen los elementos cis-regulatorios necesarios para reclutar la maquinaria transcripcional eucariota y de esta manera promover la transcripción del gen o genes que se encuentran rio abajo del promotor. Los promotores que con mayor éxito se han empleado en ingeniería genética provienen de virus, porque al ser parásitos intracelulares de células vegetales, comparten con estos eucariotas grandes analogías en cuanto a los mecanismos básicos relacionados con la replicación, transcripción y traducción, siendo esto muy útil para lograr expresión de genes de interés biotecnológico fusionados a ellos (Kiran et al., 2005; Sánchez, 2008). El entender la función de cada componente presente en los promotores y los factores asociados a éstos, puede ayudar a mejorar las estrategias utilizadas para la expresión heteróloga de genes y de esta forma poder utilizar los promotores
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como herramientas biológicas y moleculares en la regulación de la expresión de genes de interés (Cañón, 2004). En los últimos años, promotores con potencial biotecnológico han sido identificados y aislados a partir de un gran número de organismos, sin embargo estos no promueven eficientemente la transcripción de genes específicos tanto en plantas monocotiledoneas como dicotiledóneas, siendo necesario evaluar nuevos promotores que permitan obtener mejores resultados en cuanto a expresión y estabilidad génica en numerosas plantas (Zuñiga y Ramírez, 2002). Entre los promotores aislados, uno de los más utilizados es el 35S del Virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que regula la expresión génica de caracteres de interés biotecnológico en plantas transgénicas, por ejemplo la expresión de genes que confieren resistencia a estrés biótico y abiótico en plantas de soya, algodón, maíz y canola (Lemaux, 2008; Podevin y Du Jardín, 2012). Sin embargo, el promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor esta patentado biotecnológicamente y la utilización del mismo con fines comerciales a nivel biotecnológico implica pagar los derechos de propiedad intelectual derivados del uso del mismo. Por tanto, se hace necesario buscar y caracterizar nuevos promotores virales que no hayan sido aun patentados con el fin de generar nuevas alternativas que permitan promover la transcripción eficiente de genes de importancia biotecnológica en cultivos agrícolas de valor comercial para los productores de los países del tercer mundo sin la necesidad de incurrir en costos extras por la utilización de los mismos (Bandopadhyay et al., 2010). Adicionalmente, estrategias que impliquen la utilización de promotores constitutivos como es el caso del promotor 35S de CaMV que permiten que los genes bajo su control estén activos en todos los tejidos y en todo momento, puede conducir a efectos pleiotrópicos indeseables en las plantas, debido a que el gen se estaría expresando en tejidos o en etapas de desarrollo que normalmente no lo hace, pudiendo provocar aberraciones del fenotipo, reflejado en interferencia del crecimiento y procesos de desarrollo de las plantas (Cañón, 2004; Ju Lim et al., 2012). Por este motivo la búsqueda de promotores que se activen en forma precisa, en el tejido adecuado y en el tiempo correcto, ha despertado el interés de los investigadores, motivando principalmente a la identificación y caracterización de promotores que sean tejido-específicos en plantas. Este tipo de promotores estan siendo muy utilizados al dirigir la expresión de un gen a una sola parte de la planta, en un tejido en particular y / o en ciertas etapas del desarrollo (Mazithulela et al., 2000; Sarah et al., 2005). El conocer la especificidad de un virus por un tejido del huésped en particular permite generar estrategias de control dirigido que limite la incidencia devastadora
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de estos fitopatogenos en cultivos de interés agronómico. Esto si se tiene en cuenta que la capacidad de invadir los tejidos de un organismo huésped es un requisito fundamental para el éxito de un fitopatógeno (Tyler y Fields, 1996; Hidalgo et al., 1999). La aplicación de estos logros al sector agrícola, representa una gran ventaja, pues actualmente se diseñan todo tipo de estrategias para mitigar el impacto que están teniendo las enfermedades geminivirales en los cultivos de valor agrícola a nivel mundial. Para esto se busca obtener resistencia derivada del patógeno, en donde la mayoría de estudios han sido basados en los genes de la proteína de la cápside (Sivakumar et al., 2012; Pratap et al., 2012), objeto del presente trabajo de investigación. De igual forma se han utilizado genes mutados, involucrados en el movimiento geminiviral, encontrándose un abatimiento total de la infectividad del virus en cultivos de chile y tabaco, por lo cual se prevee que plantas que contengan esos genes mutados puedan controlar la infección (Bonilla, 1997). Por otro lado, el estudio de patrones de expresión de promotores abren la puerta a investigaciones que conducen a aplicaciones biotecnológicas de los mismos tales como la expresión localizada y específica de proteínas heterólogas, anticuerpos, factores de restricción, genómica funcional, silenciamiento génico, sobreexpresión de genes involucrados en síntesis de metabolitos secundarios de valor biofarmaceutico u otro carácter de interés agronómico o biológico (Atencio, 2005). Generalmente, la funcionalidad de un promotor es medida a través de ensayos de expresión transitoria con genes reporteros, en donde el DNA recombinante no se inserta en el genoma de la planta, si no que se produce grandes cantidades de RNA mensajero, que se traduce a proteínas en el citoplasma (Basu et al., 2003). Una vez el RNA mensajero es traducido a proteínas, la planta lo degrada, de modo que no se transmite a la descendencia. Este tipo de ensayos representan una gran ventaja en cuanto a tiempo, costos y es utilizada como un paso que antecede la transformación estable, razón por la cual los ensayos de expresión transitoria constituyen una herramienta valiosa para la biotecnología vegetal (Voinnet et al., 2003). De igual forma, con el fin de facilitar y hacer eficiente la transferencia de DNA hacia células o tejidos vegetales, se han desarrollado diferentes métodos dependiendo del mecanismo utilizado para la transferencia de DNA; uno de estos se basa en la utilización de vectores biológicos, como Agrobacterium tumefaciens. Sin embargo el rango natural de hospedantes de esta bacteria constituye un factor limitante, pues no toda especie vegetal es susceptible de ser infectada por esta. En consecuencia se desarrollaron métodos de transferencia directa de DNA como la biobalística que permite transferir DNA desnudo sin mediación de vectores biológicos tanto a especies monocotiledóneas como dicotiledóneas (Hodson, 2005).
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Recientemente, el grupo de investigación Interacción Planta -Microorganismo–Ambiente (IPMA) aisló el Virus del mosaico amarillo de la papa, un Begomovirus endémico de Colombia que está limitando sensiblemente la producción de los cultivos de tomate en Colombia (Vaca-Vaca et al. 2011, 2012). PYMV-Col se empleo en esta investigación como modelo para evaluar el potencial biotecnológico de sus promotores divergentes mediante ensayos transitorios. Para esto, el promotor del gen de la proteína de la cápside de PYMV- Col fue fusionado traduccionalmente a un gen reportero (uidA) y se evaluó su expresión tejido específica en tabaco.
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1. CAPITULO 1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo General Evaluar la expresión transitoria del promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarrillo de la papa- Colombia en plantas de Nicotiana tabacum var. xanthi.
1.2. Objetivos Específicos
Poner a punto la técnica de biobalística para realizar ensayos transitorios de expresión génica en tejido foliar de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var. xanthi), utilizando la pistola génica Helios Gene Gun System.
Construir un vector de expresión heteróloga constituido por el promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarrillo de la papa - Colombia (PYMV-Col) fusionado traduccionalmente al gen reportero uidA (GUS).
Determinar la expresión especifica de tejido del promotor del gen de la proteína de la cápside de PYMV-Col mediante ensayos transitorios realizados en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var. xanthi).
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2. CAPITULO 2. MARCO CONCEPTUAL
2.1. Generalidades Geminivirus Los geminivirus forman parte de un grupo muy diverso de virus de DNA de cadena sencilla (DNAcs) que infectan gran variedad de plantas, tanto monocotiledoneas como dicotiledóneas. El nombre de geminivirus se debe a su morfología geminada vista al microscopio electrónico, en donde la cápside se observa como dos icosaedros fusionados por una de sus caras. Las partículas virales tienen un tamaño aproximado de 22nm de diámetro y 38nm de largo (Figura 1) (Zhang et al., 2001; Juárez-Reyes, 2007). Figura 1. Morfología de geminivirus A. Fotografía electrónica de geminivirus B. Geometría de geminivirus.
Fuente: http://www.flickr.com (A) http://rybicki.wordpress.com/2012/01 (B).
Los geminivirus son reconocidos por ocasionar numerosas pérdidas en cultivos de interés agrícola (Gutiérrez, 1999; Lugo-Melchor et al., 2011); es por eso que en su gran mayoría el conocimiento obtenido a partir del estudio de estos fitopatogenos es aplicado a la búsqueda de estrategias que permitan a partir de la resistencia derivada del patógeno mitigar el impacto que generan en los cultivos agrícolas el accionar de esta familia de virus (Juárez-Reyes, 2007). De igual forma, los geminivirus son considerados como un modelo ideal para estudiar la regulación de expresión de los genes vegetales, así mismo han servido para obtener nuevos conocimientos que permiten dilucidar mecanismos que determinan la interacción hospedero-patógeno, planta- virus. Además, que el ciclo replicativo de los geminivirus ocurra en el núcleo de la célula infectada permite comprender muchos de los aspectos claves que dirigen la replicación del DNA
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vegetal, el ciclo celular y los procesos asociados a la muerte celular programada (Gutiérrez, 1999; Hanley- Bowdoin et al., 2013).
2.2. Clasificación de los Geminivirus La familia Geminiviridae se clasifica actualmente en cuatro géneros, basándose en tres criterios: insecto vector, rango de hospederos y tipo de genoma que poseen (Tabla 1). Tabla 1. Clasificación de la familia Geminiviridae.
Género Organización Genómica
Rango de Hospederos
Insecto Vector
Mastrevirus Monopartita Monocotiledoneas Chicharritas
Curtovirus Monopartita Dicotiledóneas Chicharritas
Topocovirus Monopartita Dicotiledóneas Membrácidos
Begomovirus Monopartita o Bipartita Dicotiledóneas Mosca blanca Fuente: Van Rengenmortel et al., 2000; Fauquet et al., 2008.
2.3. Organización Genómica de Begomovirus
El genoma de la gran mayoría de los begomovirus es bipartita y está constituido por dos componentes de DNA circular de cadena sencilla de 2.5-30 Kb, conocidos como DNA A y DNA B (Gutiérrez, 2002; Fiallo-Olivé et al., 2012). Cada componente A y B, contiene unidades de transcripción divergentes, separadas por una región intergénica (RI) de aproximadamente 300 bases de longitud, donde se encuentran las regiones reguladoras que permiten la expresión coordinada temporal y espacial de los genes virales. En la región intergénica se encuentra un elemento de secuencia denominado región común (RC), idéntica para ambos componentes de un mismo geminivirus pero diferente entre distintos geminivirus. Esta región común contienen un elemento palindrómico de secuencia, aproximadamente de 30 nt con el potencial de formar una estructura de tallo y asa (horquilla) rica en G- C en el tallo y una secuencia conservada de 9 nucleótidos (TAATATTAC), rica en A – T en el asa, la cual contiene el sitio de inicio de la replicación (Argüello- Astorga et al., 1994) (Figura 2).
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La nomenclatura de los genes de los Begomovirus es alfanumérica: la primera letra (A y B) hace referencia al componente viral y la segunda letra (V o C) indica el sentido en el cual se transcriben los genes. La letra V significa que se transcribe en sentido del virion (en dirección del movimiento de las manecillas del reloj) y la letra C significa en sentido complementario al virion (en contra de las manecillas del reloj) (Figura 2). Figura 2. Organización genómica del genero Begomovirus. CR, Región común, contiene el sitio de inicio de la replicación de DNA por círculo rodante; BC1 Y BV1, Proteínas de movimiento; CP, Proteína de la cápside; Rep, Proteína de replicación; TrAP, transactivador transcripcional; REn, enhancer de replicación.
Fuente: Gutiérrez, 1999.
2.3.1. Componente genómico A: Contiene cuatro marcos de lectura
abiertos (MLA): AV1 (CP) que codifica para la proteína de la cápside, AC1 (Rep) que codifican para la proteína asociada a la replicación, AC2 (TrAP) transactivador de la transcripción y AC3 (REn) intensificador de la replicación (Rojas et al., 2005). Proteína CP: Es codificada por un marco de lectura abierto que va en el sentido del virión. Es la más abundante de las proteínas virales durante una infección, protege al virión durante su paso a través del vector y está relacionada con la especificidad del mismo (Ascencio-Ibáñez et al., 2000). Sin embargo en begomovirus bipartitas se ha demostrado que CP no es indispensable para una infección sistémica en especies que están bien adaptadas al huésped, las cuales pueden moverse libremente dentro de la planta. Adicionalmente, CP puede participar en la formación de un estable complejo de nucleoproteína, para una infección eficiente o para mediar la supresión de los mecanismos de defensa del huésped tales como el silenciamiento génico (Rojas, et al., 2005).
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En geminivirus transmitidos por mosca blanca, la proteína de la cápside se encuentra bastante conservada y estudios reportan que CP está directamente involucrada en la transmisión por vectores e incluso en la especificidad de los mismos. Esto se demuestra al intercambiar la proteína CP de un virus transmitido por mosca blanca por el CP de un curtovirus, lo cual resulta en perdida de transmisión por el insecto vector (Czosnek et al., 2002). De igual forma la especificidad de la proteína de la cápside ha sido anotada mediante el uso de mutaciones (delecciones e inserciones) en el gen AV1 del Virus del rizado amarillo del tomate (TYLCSV), en donde se observó perdida de transmisión por su insecto vector (Czosnek et al., 2002). Adicionalmente estudios realizados por Hohnle et al., 2001 demostraron que el intercambio de 3 aminoácidos (Glutamina por Lisina, Histidina por Glutamina y Leucina por Metionina) en la proteína de la cápside resulta en una eficiente transmisión por mosca blanca del no transmisible Virus del mosaico del abutilon (AbVM).
Investigaciones realizadas con el promotor del gen de la proteína de la
cápside
Mutaciones del gen AV1 tienen incidencia sobre la acumulación del DNAcs de geminivirus. Es posible que esto se deba a que la proteína CP secuestra gran parte del DNAcs para la formación de los viriones o simplemente a la interacción de esta proteína con el DNAcs antes de llegar a la formación de los viriones (Qin et al., 1998; Ramos, 2004). Estas alteraciones pueden afectar la formación de un estable complejo de nucleoproteína, para una infección eficiente incidiendo en la diseminación del virus a través de toda la planta (Ascencio-Ibáñez et al., 2000; Rojas, et al., 2005). Estudios realizados con el gen AL2 demostraron que este induce la expresion de CP del Virus del mosaico dorado del tomate (TGMV) por diferentes mecanismos: activacion del promotor CP en celulas del mesofilo y desrepresion del promotor en tejido vascular (Sunter y Bisaro, 1997). La minima secuencia requerida para la activacion del promotor CP de TGMV en mesofilo esta localizado entre los sitios -125pb a -60pb rio arriba del sitio de inicio de la trancripcion (Sunter y Bisaro, 2003). En contraste AL2 estimula el promotor CP en el floema por desrepresion, mediado por secuencias localizadas entre 1.2 y 1.5Kb rio arriba del sitio de inicio de transcripcion de CP. A si mismo, se ha manifestado que la función del transactivador viral TrAp no es especifica, ya que la proteina de un Begomovirus es capaz de transactivar promotores CP de otros virus del mismo género. Por ejemplo se ha comprobado que los genes TrAP del Virus del mosaico africano de la yuca (ACMV), Virus del mosaico dorado de la pimienta (PepGMV), Virus del rizado de la hoja de la calabaza (SLCV) y TGMV son funcionalmente intercambiables entre ellos. La ausencia de especificidad funcional sugiere que los promotores tardíos de la mayoria de los begomovirus contienen una o mas secuencias conservadas que son reconocidas, directa o
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indirectamente por el transactivador viral TrAp (Sunter et al., 1994; Saunders y Stanley, 1995; Sung y Coutls, 1995). Investigaciones realizados por Ruiz y colaboradores, 1999 para identificar
elementos conservados de secuencia sugieren que un elemento conservado
(GTGGTCCC) (CLE) encontrado en los promotores tardíos de algunos
begomovirus es requerido para la activacion del promotor CP del Virus huasteco
de la vena amarilla del chile (PHYVV). En este trabajo se estudió la region
promotora de los genes CP y BV1 del virus PYHVV para definir los elementos de
secuencia involucrados en la transactivacion por TrAp. Resultados de expresion
transitoria y ensayos en plantas transgenicas mostraron que un segmento de 115
nt contiene tres elementos similares a una secuencia motif (CLE), considerada
como un excelente blanco para TrAp. Para confirmar estos resultados, un
oligonucleotido con dos motif CLE fue sintetizado y caracterizado en experimentos
de ganancia de funcion y a traves de ensayos de expresión transitoria se encontró
que esta secuencia de 29nt confiere a TrAp capacidad de respuesta a promotores
heterólogos. Además se comprobó que un pequeño oligonucleotido (16 nt) con un
solo CLE es suficiente para transactivar promotores heterólogos. Adicionalmente
cuando el motif CLE fué mutado (Segmento 115nt) el promotor perdió la
capacidad de ser transactivado, lo cual demuestra la participacion de secuencias
CLE en la transactivacion de promotores tardíos de PYHVV.
En contraste estudios demostraron que la deleccion de secuencias CLE no tienen
efecto significativo en la transactivacion del promotor CP mediada por TrAp
(Sunter y Bisaro 2003). Esto se complementa con ensayos realizados por Hung y
Petty, 2001 quienes evaluaron la expresión del promotor CP de Bean golden
mosaic virus (BGMV), un begomovirus que carece de CLE. Ensayos de expresión
transitoria mostraron que el promotor del gen tardío de BGMV fue transactivado en
protoplastos de Nicotiana Benthamiana, tanto por la proteína homologa TrAp,
como por la proteína heteróloga TrAp de TGMV. La proteína TrAp de BGMV,
también transactiva promotores de genes tardíos de TGMV. Además se encontró
que virus híbridos con promotores de genes tardíos intercambiados entre BGMV y
TGMV fueron viables en plantas
En el 2008, Lacatus y Sunter demostraron que el producto del gen AL2 (TrAp) de Virus del enrollamiento de la hoja de la col, (CaLCuV), transactiva el promotor CP en mesófilo y actúa desreprimiendo el promotor en tejido vascular, similar a lo observado en el Virus del mosaico dorado del tomate (TGMV). Esto se explica en que TrAp interactúa con diferentes componentes de la maquinaria de transcripción celular para inducir la expresión de los genes CP en diferentes tipos de células.
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En el 2009, Lacatus y Sunter identificaron en Arabidopsis un factor de transcripción PEAPOD2 (PPD2) que interactúa con la proteína TrAp y el promotor CP de geminivirus. PPD2 es una proteína de unión específica al DNA que media la activación del promotor CP de TGMV y CaLCuV. Por su parte TrAp de TGMV interactúa con el complejo del promotor CP/ PPD2. PPD2 es asociado al núcleo, pero no es capaz de activar la transcripción directamente, así TrAp de los geminivirus activa la expresión del promotor CP a través de la interacción con PPD2. Proteína Rep: Única proteína viral esencial para la replicación de los geminivirus, posee una secuencia específica de unión al DNA y un sitio especifico de actividad endonucleasa. En el proceso de replicación la proteína Rep se une al sitio de inicio de la replicación viral, realizando un corte en la cadena de DNA para después dar inicio al mecanismo de replicación por círculo rodante (Raghavan et al., 2004). Durante este proceso Rep recluta el replisoma celular necesario para la progresión a la fase S mediante su interacción con la proteína retinoblastoma (RBR), la cual es un regulador maestro del ciclo celular (Moreno-Cárdenas, 2013). Posterior a la replicación del DNA viral, Rep tiene la capacidad de autorregularse al reprimir su expresión a nivel de transcripción, de igual forma puede incrementar la transcripción de genes tardíos en algunos geminivirus (Ascencio-Ibañez et al., 2000; Gutiérrez, 2002). Proteína TrAP: Conocida como un transactivador transcripcional de genes virales tardíos. El marco de lectura TrAP codifica para una proteína que actúa en trans sobre los promotores de los genes que codifican para la proteína de la cápside (AV1) y la proteína de movimiento (BV1) (Hanley et al., 1999). Esta proteína está presente solo en Begomovirus bipartitas y está bastante conservada entre ellos, incluso hay complementación entre diferentes virus. Por otro lado, la proteína TrAp se asocia con actividad supresora del silenciamiento postranscripcional (PTGS) (Yang et al., 2007) e inhibe además el silenciamiento transcripcional (TGS) a partir de la interacción con Kinasas relacionadas con la metilación del DNA y activando la expresión de algunos genes celulares que lo regulan negativamente (Moreno, 2013). Proteína REn: Potenciador de la replicación, acentuando la infección viral y el desarrollo de síntomas, consecuencia de la replicación viral. Aunque no es indispensable para la replicación la potencia significativamente. Se desconoce cómo REn afecta la replicación, pero se cree puede dar estabilidad al DNA de cadena sencilla en la posterior transición a doble cadena o quizás controlar alguna parte del proceso de ensamblaje de la partícula viral (Hormuzdi y Bisaro, 1993; Castillo et al., 2003). 2.3.2. Componente genómico B: Contiene dos marcos de lectura abiertos: BC1 y BV1, que codifican para las proteínas involucradas en el movimiento de célula a
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célula y en el movimiento sistémico de los virus en las plantas (Kumar y Chattopadhyay, 2011). Proteínas involucradas en el movimiento viral: La proteína BV1 permite el transporte del DNA viral del núcleo al citoplasma y viceversa, mientras que BC1 está implicado en el movimiento célula a célula del DNA viral (Martínez et al., 2001). Estudios realizados con el begomovirus bipartita Virus del enrrollamiento de la hoja de la calabaza (SLCV), permitieron conocer que la proteína BV1 se une fuertemente a DNA de cadena sencilla (DNAcs), pero no a DNA de doble cadena (DNAcd), lo cual sugiere que al momento de la replicación en el núcleo del genoma viral, BV1 está involucrado en el transporte de DNAcs dentro y fuera del núcleo, formando un complejo DNAcs: BV1. Además señales de localización nuclear han sido identificadas en el extremo N-terminal del residuo 113 de BV1 (Gafni y Epel, 2002). Por otro lado, la proteína BC1 no se une a DNAcs ni a DNAcd, pero coopera con BV1 para el movimiento de DNAcs viral de su sitio de replicación en el núcleo a células periféricas y a la pared celular de células no infectadas. El complejo BV1-DNAcs se transporta dentro y fuera del núcleo y una vez en el citoplasma interactúa con BC1 a través de un dominio C terminal de BV1 que permite su interacción con BC1, formándose un complejo BC1: BV1: DNAcs, el cual es dirigido al plasmodesmo para ser transferido a las células adyacentes (Gafni y Epel, 2002). En algunos casos, BC1 se asocia con la membrana del retículo endoplasmático, formando una estructura única tubular que funciona en el movimiento célula a célula del complejo BV1: DNAcs (Figura 3). Figura 3. Representación del movimiento intra e intercelular de geminivirus pertenecientes al género Begomovirus.
Fuente: Gafni y Epel, 2002.
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2.4. Mecanismo de replicación La replicación de los geminivirus se lleva a cabo en el núcleo de las células vegetales mediante el mecanismo de círculo rodante. La replicación del DNA viral depende del replicón de la célula, puesto que los geminivirus no codifican ninguna DNA polimerasa o factor accesorio, es por esto que la mayoría de proteínas requeridas para la replicación del DNA de geminivirus provienen de células infectadas, exceptuando la proteína Rep que es de origen viral (Gutiérrez, 2000). Los geminivirus al infectar células diferenciadas, deben inducir un estado permisivo para la replicación del DNA viral, puesto que intermediarios de replicación DNAcd son más abundantes en el núcleo de células que están en fase S, que en células que están en otra fase del ciclo celular. Es por eso que para el tránsito de las células de la fase G1 a la fase S, es necesaria la interacción de factores virales con una proteína denominada Retinoblastoma (RBR) encontrada en células vegetales, la cual tiene requerimientos específicos, dependiendo del tipo de geminivirus (Gutiérrez, 2000; Caracuel et al., 2012). El proceso de replicación implica la conversión de DNA viral de cadena sencilla (DNAcs) a DNA de doble cadena (DNAcd), que sirve como plantilla para la replicación y la transcripción (Figura 4) (Gutiérrez, 2002; Johne et al., 2009). El origen de replicación incluye una estructura tallo-asa que contiene una secuencia nonanucleotídica conservada en todos los geminivirus (TAATATTAC), además de iterones, pequeñas secuencias repetidas necesarios para que Rep se una a la zona del origen de replicación, de manera específica (Argüello-Astorga et al., 1994; Ascencio-Ibáñez et al., 2000). La replicación se lleva a cabo mediante dos mecanismos: círculo rodante y la replicación dependiente de recombinación (RDR); el primero, es similar al mecanismo utilizado por los bacteriófagos X174 y M13 (Jeske, 2007; Ascencio-Ibañez et al., 2008). El segundo ocurre vía recombinación homóloga entre un DNAcs y un DNA circular covalentemente cerrado (Jeske et al., 2001). La replicación por círculo rodante se inicia realizando un corte por parte de Rep en el sitio de inicio de replicación de la cadena viral, localizado en el nonanucleótido en la posición séptima u octava (TAATATT*AC), exponiendo el extremo 3´OH que sirve de iniciador para la replicación del DNA viral (Ascencio – Ibañez et al., 2000). Después del corte, la polimerasa de la célula vegetal sintetiza varias unidades del genoma viral denominados concatémeros usando como molde la cadena complementaria, posteriormente Rep que posee actividad endonucleasa/ligasa corta los concatémeros, generando la liberación de las unidades genómicas, posteriormente liga los extremos del ADN viral, generando moléculas circulares lo que corresponde a una unidad del genoma viral (Haible et al., 2006).
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Figura 4. Esquema que representa el ciclo de replicación de DNA en geminivirus.
Fuente: Gutiérrez, 2002
2.5. Mecanismo de transcripción En los geminivirus, la transcripción es bidireccional, dependiente de la maquinaria de la planta, como RNA polimerasas y factores de transcripción (Ascencio- Ibañez et al., 2000). Sin embargo, proteínas virales pueden participar de manera importante en la regulación génica, tal es el caso de TrAp que transactiva la expresión de los promotores de los genes AV1 y BV1. Adicionalmente, la proteína Rep puede reprimir su propia expresión (Ruiz-Medrano y Rivera- Bustamante 1997, Sunitha et al., 2012). El genoma de begomovirus está organizado en unidades de transcripción divergentes separados por una región común que contiene el origen de replicación y dos promotores divergentes con respecto a una estructura de tallo y asa que dirigen la expresión de los genes de manera simultánea y coordinada entre los dos componentes genómicos, es decir las proteínas CP y BV1 en sentido del virion y Rep, TrAp, REn, BC1 en sentido complementario al virion (Shivaprasad et al., 2005 ; Lugo-Melchor et al., 2011). La regulación espacial y temporal de la expresión de los genes virales puede resultar tan compleja como la de los genes de la planta. Esta expresión debe ser bien coordinada, puesto que puede determinar la distribución de partículas o DNA virales en tejidos específicos (Ruiz- Medrano y Rivera- Bustamante, 1997). En geminivirus han sido encontrados diferentes tipos de transcritos primarios: un RNAm similar a los eucariotas, por ejemplo la proteína de la cápside de bipartitas; RNA policistrónico como los marcos de lectura abierto AC2 y AC3; transcritos que
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podrían ser resultado del corte de un transcrito de mayor tamaño, por ejemplo el transcrito dos del componente B de bipartitas y transcritos producto de modificaciones postranscripcionales (Ascencio- Ibañez et al., 2000).
2.6. Ciclo infectivo de Begomovirus.
El ciclo infectivo inicia en la planta desde el momento en que el Begomovirus es inoculado por su insecto vector. Los pasos posteriores son ilustrados a través de la regulación temporal y espacial de los genes virales. El Begomovirus generalmente ingresa a la célula vegetal encapsidado pues la proteína de la cápside lo protege hasta la llegada al núcleo. Sin embargo se cree que en virus bien adaptados a su hospedero no es necesaria la presencia de la proteína de la cápside (Rojas, et al 2005).
Una vez el DNA viral ingresa al núcleo celular, tiene lugar la síntesis de la cadena
complementaria, un proceso dependiente de la maquinaria biosintetica celular. De
este modo, se genera la forma viral que es transcripcionalmente activa y que dará
lugar a la expresión de los genes que son necesarios en las etapas tempranas de
la infección como Rep, TrAP y REn (Lozano-Duran et al., 2011). Al ocurrir la
replicación del DNA viral se alcanzan ciertos niveles de Rep, posteriormente esta
se auto reprimirá permitiendo que TrAP y REn se transcriban a tasas mayores.
Después de la expresión de los genes tempranos por parte de los factores del
huésped, se regula la expresión de los genes tardíos, como la proteína de la
cápside y los genes del movimiento, con intervención de la proteína viral TrAP que
actúa como un transactivador viral (Hanley-Bowdoin et al., 2013). El movimiento
en el interior de la célula vegetal es conocido como movimiento a corta distancia y
a larga distancia, en donde la proteína BV1 se encarga de formar un complejo con
el DNAcs y transportarlo del núcleo al citoplasma y viceversa; posteriormente la
proteína BC1 se encarga del movimiento a larga distancia mediante la interacción
con el complejo DNAcs: BV1, el cual es dirigido al plasmodesmo para ser
transferido a células adyacentes y finalmente continuar con el ensamblado de
nuevas partículas virales y su diseminación en la planta (Gafni y Epel, 2002).
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2.7. Circulación del Begomovirus en el insecto vector
Los Begomovirus son transmitidos por mosca blanca Bemisia tabaci biotipo B (Gennadius) (Hemiptera Aleyrodidae) de manera circulativa pero no propagativa y el único gen que interactúa con factores de mosca blanca es la proteína CP. La especificidad del vector en geminivirus está determinada por CP y no hay evidencia de participación de otra proteína viral en la transmisión. Esto se prueba cuando se intercambian unos pocos aminoácidos de CP de un begomovirus, ocasionando perdida de transmisión por B. tabaci (Gotz et al., 2012). Estudios moleculares han permitido conocer la vía del begomovirus en su insecto vector, desde el momento en que B. tabaci lo adquiere al alimentarse de la savia de los tejidos del floema. El begomovirus transita en el cuerpo del insecto siguiendo una secuencia invariable, inicialmente el virus es adquirido a través del estilete, pasa al esófago y tracto digestivo, luego penetra a la membrana intestinal a través de la hemolinfa, y por ultimo alcanza las glándulas salivares y conducto salival en donde es expulsado con la saliva (Ghanim et al., 2001). El mínimo periodo de acceso y de inoculación de Begomovirus como TYLCV en B. tabaci es de 15 a 30 minutos; valores similares son reportados para otros virus. Por su parte B. tabaci en plantas como Phaseolos lunatus tiene un promedio de 16 minutos desde el inicio de penetración en la hoja hasta la ingestión del floema; en otras especies de 10 a 45 minutos (Czosnek et al., 2002; Gotz et al., 2012). En el proceso de adquisición del virus por el insecto intervienen factores como la edad, puesto que a mayor edad menor adquisición de partículas virales, dado a la probabilidad de que sean menos activos en alimentarse de plantas infectadas; el sexo del insecto, lo cual se demuestra en estudios con TYLCV en donde las hembras transmiten el begomovirus con mayor eficiencia que los machos (Czosnek et al., 2002). B. tabaci posee endosimbiontes (tipo C) que producen chaperonas endosimbióticas como GroEL que parece unirse y proteger al begomovirus de degradación en la hemolinfa (Gottlieb et al., 2010).
2.8. Virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV)
En Venezuela el Virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV) fue descrito como un nuevo geminivirus al ser aislado de plantas de papa que presentaban una
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patología vegetal caracterizada por la presencia dominante de mosaicos amarillos y distorsión en sus hojas (Roberts et al., 1986). En el 2001 Morales y colaboradores demostraron que el PYMV era una sinonimia del Virus del mosaico amarillo del tomate (ToYMV), originalmente descrito sobre plantaciones de tomate (Lastra y De Uzcátegui 1975). Esto basados en el análisis de secuencia de un fragmento de 1698 pb obtenido a partir de muestras de plantas de tomate infectadas por el ToYMV, preservadas en seco y refrigeradas desde principios de la década de 1980 en el Instituto Venezolano de Investigaciones científicas (IVIC) Caracas, Venezuela. Los resultados arrojaron más del 95% de identidad en la secuencia de nucleótidos comparada. Esto se explica en que hasta la década de los ochenta en Venezuela el único Begomovirus reportado era el ToYMV sobre plantas de tomate y eventualmente fue encontrado en plantaciones de papa contiguas a campos de tomate altamente infectados (Debrot y Centeno 1985a). ToYMV fue aislado a partir de una planta de papa señalándolo como nuevo Begomovirus bajo el nombre de Potato yellow mosaic virus (PYMV) y su secuencia completa fue reportada posteriormente por Coutts et al., 1991 quedando como referencia para este virus. Diferentes Begomovirus relacionados con PYMV han sido encontrados en los campos de tomate en Venezuela y otros países de la cuenca del Caribe, incluyendo Panamá. Tal es el caso del Virus del mosaico amarillo del tomate (TYLCV), que infecta también plantas de papa que crecen en la proximidad de plantaciones de tomate (Morales et al., 2001). De igual forma PYMV se ha asociado con el Virus del tomate de venezuela (ToVEV), sin embargo análisis comparativos de secuencia (fragmentos de 1300 pb y 550 pb que coinciden en 200 pb aproximadamente en el extremo 5' del gen AV1) reportan un porcentaje de identidad de nucleótidos inferior al 80%, por lo que se considera un geminivirus diferente a PYMV (Romay et al., 2010). Por otro lado, PYMV ha sido reportado en diferentes lugares como Trinidad y Tobago, Puerto Rico, Guadalupe, Martinica y Panamá (Rampersad y Umaharan, 2003; Garg, 2005). Actualmente en Colombia constituye una serie limitante para la producción de tomate, como lo demuestran estudios realizados recientemente por Vaca-Vaca et al., (2011 y 2012), quienes realizaron el primer muestreo a nivel nacional, encontrando que este geminivirus bipartita, típico del hemisferio occidental es el que prevalece afectando el cultivo de esta hortaliza en Colombia.
2.9. Expresión tejido especifica de marcos de lectura abierto de
Geminivirus en plantas.
Genes virales se expresan de manera específica en ciertas partes de la planta, en un tejido en particular y / o en ciertas etapas del desarrollo (Sarah et al., 2005). Los estudios de regulación de la expresión por medio de genes reporteros
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fusionados al promotor viral de interés han aportado gran conocimiento. Por ejemplo en el caso de PHYVV se ha demostrado que el gen de la proteína de la cápside se expresa preferencialmente en tejido vascular (floema) y en los meristemos; una expresión similar, pero más débil se ha encontrado para el gen Rep. Teniendo en cuenta que el virus PHYVV se restringe al floema se sugiriere una correlación entre la expresión de los genes Rep, CP y la acumulación de las partículas virales. Los genes del componente B por el contrario parecen tener una expresión más diversa que incluiría mesófilo y parénquima (Ruiz-Medrano y Rivera-Bustamante, 1997). Estudios realizados por Zhang et al., 2001 empleando los genes BV1 y BC1 aislados del Virus del mosaico del abutilon (AbMV) en N. tabacum y N. benthamiana reportaron que la expresión del gen la proteína verde fluorescente (GFP) fusionado al gen BC1 se localizó en el citoplasma y en menor medida alrededor del núcleo de células, mientras que la proteína BV1 de AbMV se detecto principalmente en el interior del núcleo. Cuando ambos genes BC1 y BV1 fueron coexpresados las dos proteínas fueron detectadas en células adyacentes, lo cual indica que las dos proteínas cooperan para mediar el movimiento célula a célula y que son transportadas a las células adyacentes. Por otro lado, Morra y Petty (2000) estudiaron determinantes del tropismo de tejido, utilizando dos begomovirus y una planta hospedera en común a los dos N. benthamiana. Análisis de hibridación in situ confirmaron que el Virus del mosaico dorado del tomate invade células del mesófilo en hojas infectadas; mientras que el Virus del mosaico dorado del frijol se limita al floema. Más adelante a través de complementación genética y análisis de virus híbridos recombinantes se demostró que tres elementos genéticos del Virus del mosaico dorado del tomate determinan su tropismo en el mesófilo: una región no codificante (BVi) localizada rio arriba del ORF BV1 es esencial para el fenotipo; pero debe estar acompañado de alguna de estas dos regiones codificantes: AL23 (ORFs AL2, AL3) o de la región BC1/BV1 (ORFS BC1, BV1). Posteriormente, Rojas y colaboradores (2001) realizaron estudios de expresión transitoria utilizando el gen AV1 del Virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV) fusionado al gen GFP que permitieron detectar la proteína CP en el núcleo y nucléolo celular, actuando como un servicio de transporte nuclear, lo que facilita la importación y exportación del DNA. De este modo, la proteína CP actúa como el homólogo funcional BV1 de begomovirus bipartitas. De igual forma Sharma e Ikegami (2009) llevaron a cabo estudios en células de la epidermis de cebolla donde evaluaron la expresión de la proteína CP de Tomato leaf curl Java virus (ToLCJAV) detectando esta proteína en el núcleo y citoplasma de células infectadas.
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2.10. Promotor 35S de CaMV
Promotor del gen que codifica la subunidad ribosómica 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Actúa como un promotor constitutivo fuerte en la mayoría de órganos de plantas transgénicas (Podevin y Du Jardín, 2012). En este promotor se han identificado dos dominios (A y B) de gran importancia, que son capaces de conferir especificidad de tejido y regular la expresión del desarrollo en plantas transgénicas. El dominio A (-90 a +8), contiene la caja TATA y un elemento cis regulador, denominado secuencia de activación (AS), el cual se asocia con la expresión principalmente en raíz. La expresión conferida por el dominio A no es solamente en raíz, se ha demostrado que este dominio puede interactuar sinergísticamente con subdominios B activando la expresión en otros tejidos como la hoja (Benfi et al., 1989, 1990). En el dominio B (-343 a -90) se encuentran elementos cis, similares a los encontrados en promotores inducibles por efecto de la luz (GATA), los cuales interactúan con factores de trascripción de las hojas (ASF-2) por lo que su expresión es detectada principalmente en tejidos vasculares de hojas y tallos. De igual forma en el dominio B se han identificado 5 subdominios (B1, B2, B3, B4 y B5) que confieren diferentes modelos de expresión. Cuando los subdominios son unidos a la región rio arriba del dominio A, se obtienen 5 modelos de expresión diferentes a los encontrados cuando el dominio A esta solo. B1+A: Expresión en cotiledones; B2+A: Expresión en raíz; B3+A: Expresión en la mayoría de células del cotiledón y de hipocotilo; B4 +A: Expresión en tejido vascular de hipocotilo y cotiledón; B5+A: Expresión en mesófilo de cotiledón y en hojas de plántulas maduras. Esto resultados son evidencia de interacciones sinergísticas entre elementos cis encontrados en el promotor 35S (Benfey et al., 1989). Benfi y colaboradores (1990) realizaron estudios histoquímicos con el gen uidA para definir modelos de expresión de los dominios A y B a lo largo de las etapas de desarrollo de las plantas, empleando diferentes tipos de construcciones (Figura 5). Los resultados de expresión permitieron conocer que los dos dominios confieren diferentes modelos de expresión en semillas y plántulas de N. tabacum de acuerdo al estadio de desarrollo, adicionalmente que la expresión de los dominios A y B en conjunto es mayor que cuando los dominios están solos, lo cual confirma la importancia de interacciones sinergísticas entre estos dos dominios. En el 2004, Samac y colaboradores realizaron estudios para evaluar la actividad de algunos promotores constitutivos como el promotor 35S de CaMV, encontrando que este promotor se expresa en hojas, raíz y tallo de plantas de alfalfa. No obstante, la fuerte expresión de este promotor se asocia a plantas dicotiledóneas, puesto que en monocotiledoneas se reporta un bajo desempeño, así como poca
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actividad cuando la planta sufre ataque por nematodos (Goddijn et al., 1993; Urwin et al., 1997). De acuerdo a esto se busca aislar nuevos promotores de otros virus alternativos con propiedades similares o mejores al promotor 35S (Peremarti et al., 2010; Bandopadhyay et al., 2010). Figura 5. Construcciones que contienen el dominio A y B del promotor 35S de CaMV. Los fragmentos del promotor fueron ligadas al gen uidA a través de fusiones transcripcionales.
Fuente: Benfi et al., 1990
2.11. Biobalística El término biobalística deriva de la conjunción de “biología y balística” o “balística biológica”. Este método fue ideado y refinado en la década de 1980 por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir DNA a cualquier tipo de célula blanco (Sanford, 1988). En este procedimiento el DNA es transferido a las células por medio de partículas microscópicas aceleradas a gran velocidad por aplicación de presión, lo cual permite que éstas atraviesen la pared y la membrana celular. Las partículas son aproximadamente esféricas con un diámetro de 0.4 a 2.0 micrómetros y están constituidas de materiales de naturaleza metálica como oro o tungsteno que son recubiertos con el DNA que se desea transferir a las plantas. Para que las micropartículas puedan atravesar las membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, son impulsadas a gran velocidad por liberación de gas comprimido a alta presión (helio, nitrógeno), o por descargas eléctricas (Hansen y Wright, 1999). El bombardeo de micropartículas es considerado un mecanismo universal, pues permite introducir DNA, sin necesidad de vectores biológicos en cualquier tipo de
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tejido o célula. Esta técnica ha sido utilizada para introducir y expresar material genético no sólo en plantas sino también en bacterias, protozoarios, algas, hongos, células y tejidos animales (insectos, peces, aves y mamíferos) (Sanford, 1988). Al elegir un tejido blanco para la transformación por biobalística debe tenerse en cuenta la capacidad de la especie de interés para regenerar in vitro. Entre los explantes vegetales utilizados con mayor éxito, se encuentran las hojas, suspensiones celulares, meristemos, embriones, primordios foliares, cotiledones y callos (Lapidot et al., 2007). Además en la actualidad, constituye el único medio que permite transformar organelos celulares, tales como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible (Shark et al., 1991). La eficiencia en métodos físicos como la biobalística, dependen en parte de parámetros biológicos como la especie vegetal tratada, el tejido especifico y su estado fisiológico. Por otra lado, influye notablemente la optimización de la técnica empleada, particularmente en lo que concierne a la presión, distancia de disparo, así como el tamaño ideal de los micropartículas y la cantidad de DNA a utilizar (Quintana, 2009). Los logros más destacados en la transferencia de DNA por medio de este método, incluyen especies de gran importancia económica como son la soya, el maíz, el arroz, el sorgo, la papaya, la caña de azúcar, el trigo y el espárrago (Quintana, 2009). Esta técnica permite también el análisis de la expresión transitoria de genes fusionados a un gen reportero con el fin de conocer el lugar exacto en el cual los productos génicos son transcritos y expresados.
2.11.1. Equipo biobalística portátil (Helios Gene Gun System-
BioRad ®)
La pistola de genes Helios Gen Gun System es el segundo instrumento acelerador de partículas de la línea Bio-Rad ®. El primer instrumento diseñado por la línea BioRad® fue el PDS-1000/He de alta presión (600-1000psi), donde el tamaño global del individuo blanco a ser transformado está limitado por el tamaño de la cámara y el tejido diana se somete a un vacío durante el bombardeo. Por su parte la pistola de genes de baja presión (Helios Gen Gun System) no requiere cámara de vacío y cualquier blanco es accesible al cañón para ser transformado, siendo totalmente portátil es decir se puede utilizar tanto en campo como en el laboratorio. En consecuencia, la pistola de genes Helios Gen Gun System puede ser utilizada con amplia variedad de aplicaciones en transferencia de genes y sirve tanto para transformaciones in vitro como in vivo (Biorad®)
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2.11.1.1. Ventajas uso Helios Gene Gun System
• Fácil de usar, rápido y versátil sistema de suministro de genes • Independiente del tipo o destino celular • Es útil para la expresión tanto transitoria y estable • Requiere sólo pequeñas cantidades de DNA • Requiere sólo un pequeño número de células • Puede obtener altos niveles de co-transformación • Largos fragmentos de DNA pueden ser transferidos. • Aplicable tanto para transformación in vitro como in vivo de plantas, bacterias,
protozoarios, algas, hongos, células y tejidos animales (insectos, peces, aves y mamíferos).
• Util para analizar la función y regulación génica, transferir RNA viral y estudiar vías metabólicas (http://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9541.pdf).
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3. CAPITULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente trabajo de investigación se desarrolló en los Laboratorios de Cultivo de Tejidos Vegetales, Microbiología Vegetal y Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia sede- Palmira.
3.1. Optimización de las condiciones de biobalística para realizar ensayos de expresión transitoria de genes heterólogos en plantas de tabaco utilizando una pistola de genes de baja presión Helios® Gene Gun (BioRad®).
3.1.1. Multiplicación y preparación de material vegetal de tabaco
Nicotiana tabacum var. xanthi
Multiplicación del material vegetal: Los ensayos fueron realizados en tejido
foliar de tabaco Nicotiana tabacum variedad xhanti, especie modelo de
transformación genética. Las semillas de tabaco fueron germinadas in vitro en
medio MS (Murashige & Skoog, 1962) en ausencia de reguladores de crecimiento,
siguiendo el protocolo descrito por Badillo y col. (2009). Las condiciones de
incubación en el cuarto de crecimiento fueron: una temperatura de 24°C, una
humedad relativa de 70% y un fotoperiodo de 16 horas luz / 8 horas oscuridad. Se
realizaron subcultivos periódicos cada mes para garantizar la disponibilidad de
nutrientes y condiciones necesarias para el crecimiento y desarrollo de las
plántulas.
Preparación de material vegetal: Plántulas de tabaco de 45 días posteriores a su germinación fueron seleccionadas para realizar los ensayos de biobalística. Se utilizaron dos tipos de material vegetal: 1. Fragmentos de hojas: se cortaron fragmentos de tejido foliar con un área aproximada de 1cm2 y se colocaron formando un círculo de 5 cm de diámetro en una caja de Petri que contenía medio sólido MS con manitol 0.4 M y sorbitol 0.4 M. Estos fragmentos de hoja fueron incubados de 18-20 horas en el cuarto de crecimiento a 25°C antes de ser bombardeados (Figura 6A) (Ruiz- Medrano et al., 1999); 2. Hojas completas: se tomaron hojas jóvenes (2- 3 hojas cercanas al ápice caulinar) de plantas de tabaco con condiciones fisiológicas y morfológicas similares (Figura 6B).
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Figura 6. Preparación del material vegetal de Nicotiana tabacum var. xanthi previo a realizar ensayos de biobalística en A. Fragmentos de hojas. B. Hojas completas cultivadas in vitro.
Fuente: La Autora
3.1.2. Plásmidos Plásmido pBI121: Este plásmido fue utilizado para realizar los ensayos de optimización de la técnica de biobalística utilizando la pistola génica Helios® Gene Gun (BioRad®). pBI121 fue adquirido comercialmente del proveedor Invitrogen S.A. El vector binario pBI121 porta el gen uidA que codifica para la proteína β- Glucuronidasa (GUS) bajo el control del promotor 35S de CaMV; contiene dos copias del gen de selección nptII que brinda resistencia al antibiótico kanamicina dirigidas por dos diferentes promotores: un promotor procariota para expresión en bacterias y el promotor 35S de CaMV para su expresión en plantas. pBI121 fue construido a partir del vector pBI101 (Jefferson et al., 1987) (Figura 7). Figura 7. Construcción del vector pBI121 a partir del vector pBI101. Un fragmento de 800 pb correspondiente al promotor 35S de CaMV fue ligado al vector pBI101 en los sitios Hind III - BamH I.
Fuente: Jefferson et al., 1987.
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Plásmido pCAMBIA 1305,2: Este plásmido fue utilizado para validar las
condiciones de optimización del protocolo de biobalística previamente establecidas
con el plásmido pBI121. Este plásmido es derivado del vector pCAMBIA 1301, en
el cuál el gen gusA de E. coli fue reemplazado por GUSPlus. GUSPlus es un
nuevo gen reportero aislado de Staphylococcus sp y que ha sido modificado en la
optimización de uso de codones para su expresión en plantas (Broothaerts et al.,
2005). GUSPlus presenta al inicio del gen una secuencia señal peptídica rica en
glicina proveniente de arroz insertada en los sitios NcoI y BglII. GUSPlus también
contiene un intrón del gen de la catalasa de “castor bean” para prevenir la
expresión por bacterias y asegurar la detección de expresión de la actividad de la
enzima glucuronidasa en plantas. Este plásmido contiene el gen de resistencia a
higromicina (hptII) para selección en plantas y el gen de resistencia a kanamicina
para selección en bacterias. (Figura 8). Este plásmido fue donado gentilmente por
el Dr. Paul Chavarriaga de CIAT.
Figura 8. Mapa del vector pCAMBIA 1305.2.
Fuente: http://www.cambia.org.
La multiplicación de los plásmidos pBI121 y pCAMBIA 1305.2 se realizó en la
bacteria Escherichia coli, para lo cual se realizó una transformación por choque
térmico siguiendo el protocolo reportado por Ausubel et al., (1999). Las cepas
bacterianas transformadas con los plásmidos pBI121 y pCAMBIA1305.2 fueron
almacenas a -20°C en glicerol al 50% hasta su utilización. Para la purificación de
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ambos plásmidos en altas concentraciones se utilizó el Plasmid Midi Kit (Qiagen
®) siguiendo las instrucciones del fabricante
3.1.3. Optimizacion de parámetros de inoculación de biobalistica
Parámetros de inoculacion: La optimización del protocolo de inoculación en fragmentos de hoja y en hojas completas de tabaco Nicotiana tabacum se realizó para los parámetros: presión de disparo, distancia de disparo, número de disparos, presencia y ausencia de difusor. Los valores evaluados para cada parámetro fueron:
Presión de Helio: 100, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 250, 300, 400 y 500 libras por pulgada cuadrada (psi). Distancia de disparo: 0, 10 y 15 cm. Numero de disparos: 2, 3 y 4. Presencia/ ausencia de difusor. Los parámetros que permanecieron constantes durante los ensayos fueron la concentración de DNA plasmidico (1ug/cartucho), concentración de PVP (0.05 mg/ml), cantidad de oro (0.125 mg/ por cartucho) y diámetro de la partícula de oro (0.6µm), los cuales se seleccionaron de ensayos previos realizados por López-López et al.,(2013) y recomendaciones del fabricante de la pistola génica (BioRad ®). Preparación de micropartículas y cartuchos con DNA plasmidico: El
bombardeo se efectuó con cartuchos que portan el plásmido pBI121 ó
pCAMBIA1305.2 unido a partículas de oro. La preparación de las micropartículas y
cartuchos se realizó siguiendo las instrucciones del equipo Helios® Gene Gun
System (BioRad®, Hercules, CA, USA) con algunas modificaciones previamente
reportadas por López-López et al., (2013) y empleando la estación de trabajo de
preparación de cartuchos (Figura 9B).
Ensayos de Biobalística: Se empleo un equipo de biobalística de baja presión,
pistola de genes Helios® Gene Gun (BioRad, 1996) (Figura 9A) que utiliza helio
como gas inerte para dispersar las partículas de oro. La transferencia del plásmido
que portan los cartuchos se llevó a cabo sobre fragmentos de hojas (Figura 10A) u
hojas completas de plantas de tabaco (Figura 10B). Posteriormente, los
fragmentos de hoja y hojas completas de plantas de tabaco fueron incubados a
25°C durante 18 – 24 horas (Ruiz-Medrano et al., 1999) antes de evaluar la
actividad de la enzima β-glucuronidasa.
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Figura 9. Equipo Helios ® Gene Gun System de BioRad ® A. Pistola de genes de
baja presión B. Estación de preparación de cartuchos C. Porta cartuchos.
Fuente: La Autora
Figura 10. Optimización de parámetros de inoculación en A. Fragmentos de hoja. B. Hojas completas de Nicotiana tabacum.
Fuente: López López, K. 2013
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3.1.4. Tinción histoquímica para evaluar la actividad de la enzima
β-glucuronidasa.
Para identificar la expresión del gen reportero uidA (GUS) en los fragmentos de
hoja de tabaco bombardeados se realizó un ensayo histoquímico que evalúa la
actividad de la enzima β-glucuronidasa, siguiendo las instrucciones del protocolo
reportado por Jefferson et al., (1987). Los fragmentos de hojas de tabaco fueron
incubados en un buffer que contiene X-glu (Acido 5-bromo-4-cloro-3-indol- β -D-
glucurónico) como sustrato, en cajas BD falcón a una temperatura de 37°C
durante 22 – 24 horas en ausencia de luz. Para eliminar los pigmentos de clorofila
de los fragmentos de hoja y visualizar los puntos azules se evaluaron dos tipos de
soluciones de lavado: una mezcla de metanol: acetona (3:1) y una solución de
etanol 70%. La eliminación de los pigmentos de clorofila se realizó enjuagando
varias veces los fragmentos de hojas con la solución de lavado hasta eliminar el
color verde de los tejidos. Finalmente, los fragmentos de hojas fueron
almacenados en una solución glicerol: agua (1:1) a 4°C hasta su observación en
un estero microscopio (Carl Zeiss), donde se realizó el conteo de los puntos
azules observados en los tejidos foliares bombardeados.
3.1.5. Cuantificación de Expresión del gen reportero uidA (Gus) La expresión del gen reportero uidA se estimó mediante la actividad de la enzima β- Glucuronidasa de acuerdo al número de puntos azules presentes en los sitios donde el tejido fue bombardeado. Se promedio el número de puntos azules obtenidos de acuerdo al número de repeticiones realizadas en cada ensayo y para conocer la desviación que presentan los datos en su distribución respecto de la media aritmética se realizó una desviación estándar.
3.2. Construcción del vector de expresión heteróloga constituido
por el promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del
mosaico amarrillo de la papa- Colombia fusionado al gen
reportero uidA.
La construcción del vector de expresión heteróloga fue realizada en dos etapas. Primera etapa: Un fragmento de 420nt que porta la región promotora del gen de la proteína de cápside del Virus del mosaico amarillo de la papa - Colombia (Vaca-
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Vaca et al. 2012) fue obtenido al digerir el genoma begomoviral con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. Este fragmento fue purificado del gel de agarosa empleando el Silica Bead DNA Gel extraction kit (Fermentas, Thermo Scientific ®) y clonado en el sitio EcoRI y HindIII del plásmido pUC19. La construcción obtenida después de la ligación fue denominada CP-PYMV-pUC 19 (Figura 11). Esta construcción fue introducida en la cepa de E. coli mediante una transformación por choque térmico siguiendo el protocolo reportado por Ausubel et al., (1999). Se seleccionaron cinco colonias de E. coli resistentes a ampicilina, se purifico el DNA plasmidico utilizando el protocolo de Birnboim and Dolly (1979) y se verifico la presencia del inserto utilizando las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. Las cepas bacterianas transformadas con la construcción CP-PYMV-pUC 19 fueron almacenas a -20°C en glicerol al 50% hasta su utilización. Para la purificación del plásmido en altas concentraciones se utilizó el Plasmid Midi Kit (Qiagen®) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Figura 11. Construcción CP-PYMV-pUC19. Un fragmento de 420nt que porta el
promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarillo de
la papa Colombia fue clonado en el plásmido pUC 19 (CP-PYMV-pUC 19).
Fuente: Lopez-Lopez, K. 2013.
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Segunda etapa: Un fragmento de 2162 nt que porta al gen reportero uidA (GUS) fue obtenido al digerir el plásmido pBI101.2 con las enzimas de restricción EcoRI y PstI (Figura 12). Este fragmento fue purificado del gel de agarosa empleando el Silica Bead DNA Gel extraction kit (Fermentas, Thermo Scientific ®) y clonado en los sitios EcoRI y PstI de la construcción CP-PYMV-pUC19.
Figura 12. Esquema que representa la construcción conformada por el promotor
del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarillo de la papa
Colombia fusionado al gen uidA (PYMV-CPGUS) en los sitios de restricción *PstI
– *EcoRI.
Fuente: La Autora
La construcción obtenida después de la ligación fue denominada PYMV-CPGUS,
la cual porta la región promotora del gen de la proteína de la cápside del Virus de
mosaico amarillo de la papa- Colombia fusionado al gen uidA (Figura 13). Esta
construcción fue introducida a la cepa de E. coli mediante una transformación por
choque térmico siguiendo el protocolo reportado por Ausubel et al., (1999). Se
seleccionaron cinco colonias de E. coli resistentes a ampicilina, se purificó el DNA
plasmidico utilizando el protocolo de Birnboin and Dolly (1979) y se verificó la
presencia del inserto utilizando las enzimas de restricción EcoRI y PstI. Se
seleccionaron tres colonias de E. coli que portaban la construcción PYMV-
CPGUS, se purificó el DNA plasmidico utilizando el Plasmid Mini Kit (Qiagen ®)
siguiendo las instrucciones del fabricante y se enviaron a secuenciar al proveedor
Macrogen (Korea). La secuenciación de la construcción PYMV-CPGUS se realizó
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con el fin de verificar que la secuencia del promotor del gen de la proteína de la
cápside del begomovirus estuviera clonada en sentido con respecto al gen uidA.
Las reacciones de secuenciación fueron analizadas en el software CLC Main –
Workbench 7.0. Las cepas bacterianas transformadas con la construcción PYMV-
CPGUS fueron almacenas a -20°C en glicerol al 50% hasta su utilización. Para la
purificación del plásmido en altas concentraciones se utilizó el Plasmid Midi Kit
(Qiagen ®) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Figura 13. Construcción conformada por el promotor del gen de la proteína de la
cápside fusionado al gen uidA (PYMV-CPGUS).
Fuente: Lopez-Lopez, K. 2013.
3.3. Determinación de la expresión especifica de tejido del promotor del gen de la proteína de la cápside de Virus del mosaico amarrillo de la papa-Colombia fusionado al gen reportero uidA mediante ensayos transitorios realizados en plantas de tabaco.
El desarrollo de esta fase se realizó con la construcción PYMV-CPGUS (ver metodología sección 3.2.) y utilizando las condiciones previamente optimizadas en los ensayos de biobalística (ver metodología sección 3.1).
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Para determinar la actividad del promotor CP del Virus del mosaico amarrillo de la
papa- Colombia fusionado al gen reportero uidA (GUS) se realizó la tinción
histoquímica del tejido foliar bombardeado siguiendo el protocolo reportado por
Jefferson et al., (1987) y la cuantificación de la expresión génica se hizo teniendo
en cuenta el promedio de puntos azules y la región del tejido donde fueron
encontrados (ver metodología sección 3.1.4. y 3.1.5).
Para identificar la expresión constitutiva o de tejido específico de los promotores
evaluados se observó y determinó la ubicación de los puntos azules.
Adicionalmente, el análisis del número de puntos nos permitió determinar la
eficiencia del promotor CP de PYMV- Colombia con respecto a los resultados
obtenidos con el promotor 35S derivado de CaMV.
El número de repeticiones realizadas por ensayo fueron cinco, donde cada repetición estaba representada por una hoja completa. Se calculó el promedio de puntos azules por ensayo y su desviación estándar. Finalmente, como control positivo del ensayo de biobalística se utilizó el plásmido pCAMBIA1305.2 y como control negativo tejido sin bombardear.
48
4. CAPITULO 4. RESULTADOS Y DISCUSION
4.1 Optimización de las condiciones de biobalística para realizar ensayos de expresión transitoria de genes heterólogos en plantas de tabaco utilizando una pistola de genes de baja presión Helios® Gene Gun System (BioRad®).
Existen pocos reportes donde se utilize la pistola de genes de baja presión
(Helios® Gene Gun, System BioRad®) para realizar ensayos de expresion
transitoria de genes heterologos, por lo que contar con las condiciones óptimas de
inoculación en plantas de tabaco es un paso clave en ensayos de este tipo
(Boletín 2453 BioRad ®; Kuriakose et al., 2011). Para la optimización de las
condiciones de inoculación se tuvieron en cuenta los siguientes parametros
presión (psi), número de disparos y distancia de disparo, dado que se ha
reportado que tienen una gran influencia e importancia en el éxito de transferencia
de DNA mediante la técnica de biobalística (Chaves et al., 2002). Los ensayos se
realizaron con micropartículas de oro, porque presentan características especiales
como inercia química, ausencia de reactividad con el DNA y otros componentes de
la mezcla de reacción, textura lisa y baja toxicidad para las células vegetales
(Valerio y García, 2008). Cada partícula de oro llevaba adherida por cohesión el
plásmido pBI121 que porta al promotor 35S de CaMV fusionado al gen reportero
uidA (GUS), plásmido que se utilizó para optimizar las condiciones de biobalística
(ver metodología).
El análisis de la información se hizo teniendo en cuenta la localización y el número
de puntos azules observados en las hojas después del bombardeo y tinción
histoquímica. La localización de los puntos azules mostró las regiones del tejido
foliar donde hubo expresión del gen reportero bajo la acción de los promotores
evaluados. El número de puntos permitió determinar la tasa de transcripción del
gen, resultado de la interacción de secuencias regulatorias presentes en el
promotor con proteínas llamadas factores de transcripción (Ruiz-Medrano et al.,
1999).
Evaluación de presión, número de disparo y distancia de disparo en fragmentos de hoja de tabaco: Los parámetros presión y distancia de disparo se evaluaron inicialmente sobre fragmentos de hojas de tabaco, dado que este tipo de material vegetal es generalmente el reportado en ensayos de expresión transitoria (Bansal et al., 1992; Denchev et al., 1997; Ruiz-Medrano et al., 1999;
49
Vaca-Vaca, 2003; Kim et al., 2007; Gao et al., 2013). Se encontró que a presiones altas (250 -500 psi), el impacto de las micropartículas de oro era muy fuerte en el tejido vegetal, ocasionando daño mecánico y deterioro de las hojas, además de que hubo dispersión de los fragmentos de hoja fuera de la caja de petri donde fueron inoculados, impidiendo su evaluación por presentar posible fuente de contaminación. Además, este último evento podría afectar la confiabilidad de los resultados obtenidos con el gen reportero uidA. Con base en los resultados obtenidos se evaluaron presiones inferiores (200 y
220psi) a una distancia de 10 y 15 cm y se utilizaron dos, tres o cuatro disparos.
Los resultados obtenidos fueron de cero puntos azules en todos los ensayos
realizados, independientemente de los valores de presión, distancia de disparo y
número de disparos utilizados (datos no mostrados). Este resultado estaría
indicando que los fragmentos de hoja de tabaco no son el material vegetal óptimo
para análisis de expresión transitoria utilizando la pistola de genes de baja presión
(Helios® Gene Gun System, BioRad®). En contraste, en la literatura se reportan
resultados de expresión transitoria en fragmentos de tejido vegetal pero utilizando
la pistola de genes de alta presión. A continuación se citan algunos ejemplos:
Bansal y colaboradores en 1992, evaluaron secuencias promotoras de los genes
cab-ml y rbcS-m3 mediante expresion transitoria del gen uidA en segmentos de
hoja de plantulas de maíz bombardeadas con la pistola Particle Delivery System-
1000(DuPont®) encontrando que la expresion es diferente en celulas del mesofilo
y de la vaina. En 1993, Gallo-Meagher e Irvine obtuvieron mayores niveles de
expresion transitoria del gen uidA bajo la accion del promotor del gen de la
Ubiquitina en maiz (Ubi-1) en comparacion con los promotres actina del arroz
(Act1) y 35S de CaMV evaluados en segmentos de hoja de Saccharum spp. De
igual forma estudios realizados en tejido foliar de coliflor bombardeado con el
plasmido pBI221 que porta el promotor 35S de CaMV permitió obtener expresion
transitoria evidenciada a traves de la presencia de puntos azules en el tejido
evaluado (Boletín 1688 BioRad®). Estudios de expresion transitoria realizados en
tejido foliar de N. tabacum por Ruiz- Medrano y colaboradores (1999) permitieron
identificar que un elemento tardío conservado (CLE) está involucrado en la
transactivación del promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus
huasteco de la vena amarilla del chile (PHYVV).
Evaluación preliminar de presión, número de disparo y método de
decoloración en hojas completas de N. tabacum: En la figura 14 se reportan
los resultados obtenidos en un ensayo preliminar en una sola hoja donde se
evaluaron presión de disparo (140, 160, 180 y 200 psi), número de disparo (dos,
tres o cuatro) y método de decoloración (mezcla metanol-acetona y etanol 70%).
50
A una presión de 140psi, combinada con dos, tres y cuatro disparos, el número de
puntos azules encontrados por hoja fue 2, 4 y 19 respectivamente cuando se
utilizó etanol al 70% y al utilizar la mezcla metanol-acetona el número de puntos
disminuyó a 1, 2 y 9 (Figura 14 A). Cuando se aplico una presión de 160psi se
obtuvieron 3, 5 y 34 puntos azules con dos, tres y cuatro disparos
respectivamente, empleando etanol al 70%; y con metanol- acetona solo se
observaron 2 puntos, independientemente del número de disparos realizados
(Figura 14 B). Respecto a presiones como 180 y 200 psi solo fue posible evaluar
dos y tres disparos porque durante el ensayo el tejido se deterioró, impidiendo
realizar un nuevo disparo. A una presión de180 psi se hallaron 2 puntos en cada
hoja con dos y tres disparos al emplear etanol y al utilizar metanol-acetona
solamente se obtuvo un punto al realizar dos disparos y 2 puntos con tres
disparos (Figura 14C). Por último a una presión de 200psi, dos disparos y
empleando etanol 70% se obtuvo solo 1 punto y al evaluar la mezcla metanol-
acetona no se obtuvo ningún punto (Figura14 D).
Figura 14. Número de puntos azules obtenidos en ensayos de expresión transitoria
en hojas completas de N. tabacum. A.140 psi, B.160 psi, C.180psi y D.200psi. Se
evaluaron los parámetros número de disparos (dos, tres y cuatro) y reactivo para
eliminar clorofila (etanol 70% o metanol-acetona), empleando la pistola génica
Helios® Gene Gun System de BioRad®. Se utilizó el promotor 35S de CaMV
fusionado al gen uidA (pBI121).
Fuente: La Autora
51
Al evaluar el número de disparos se observó que a medida que se incremento el número disparos a presiones como 140 y 160 psi, el número de puntos azules obtenidos fue mayor (Figura 15), debido a que se inoculó más cantidad de DNA plasmidico en el tejido foliar de N. tabacum (López-López et al., 2013). Respecto al reactivo utilizado para eliminar la clorofila se seleccionó etanol al 70% porque cuando se utilizó se observó mejor expresión del gen reportero representado a través del número e intensidad de puntos azules sobre el tejido en comparación de los resultados obtenidos con la mezcla metanol- acetona (Figura 16), lo cual coincide con estudios llevados a cabo en sorgo (Able et al. 2001), en explantes de Solanum phureja (Barrero- Farfán y Chaparro- Giraldo 2008); en segmentos de hoja de plátano (Valerio y García, 2008) y estudios de expresión transitoria realizados en abedul (Boletín 2453 de BioRad®), donde este pigmento fotosintético fue removido con etanol. En contraste estudios de expresión génica realizados por Ruiz- Medrano et al., 1999; Onofre et al., 2003 en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana y Juárez-Reyes, 2007 en brotes de hojas pequeñas de plantas transgénicas reportan el uso de la mezcla metanol: acetona para eliminar pigmentos fotosintéticos. Según estos reportes, tanto el etanol como la mezcla metanol: acetona son comúnmente empleados para este tipo de ensayos. Sin embargo se reporta que el etanol es ampliamente utilizado para remover pigmentos fáciles de eliminar como la clorofila, pero en el caso de tejidos como el de las semillas se requiere una combinación de reactivos más eficiente como metanol, acetona o acido acético para retirar los pigmentos presentes en estas (Vitha et al., 1995). Figura 15. Evaluación del número de disparos en hojas de N. tabacum. A. Dos
disparos. B. Tres disparos. C. Cuatro disparos. D. Tejido sin bombardear. Ensayo
realizado a una presión de 140psi sobre hojas completas de N. tabacum utilizando
la pistola génica Helios® Gene Gun System de BioRad® donde se analizó la
expresión transitoria del promotor 35S de CaMV fusionado al gen uidA (pBI121).
Observación en Estereoscopio Carl Zeiss a 5X.
52
Fuente: La Autora
Figura 16. Evaluación del reactivo para eliminar clorofila A. metanol: acetona (3:1)
B. Etanol 70% en ensayos de expresión transitoria del promotor 35S de CaMV
fusionado al gen uidA (pBI121) en hojas completas de N. tabacum, utilizando la
pistola génica Helios® Gene Gun System de BioRad®. Ensayo realizado a una
presión de 140psi y 4 disparos. Observación en Estereoscopio Carl Zeiss a 5X.
Fuente: La Autora
53
Evaluación de presión en hojas completas de N. tabacum: En la Figura 17 se
reportan los resultados obtenidos en un ensayo independiente con un tamaño de
muestra de tres repeticiones, donde se utilizaron cuatro disparos, se decoloraron
las hojas con etanol 70% y se evaluaron las presiones de disparo: 100, 140, 160 y
180 psi. Se observó que a una presión de 160 psi se obtuvo un promedio de 16
puntos azules, siendo la presión con la cual se logro mayor expresión del gen
reportero uidA, en comparación a las presiones 100 y 140 psi donde solamente se
obtuvo un promedio de 4.6 y 8.6 puntos, respectivamente. El ensayo realizado a
180 psi no fue posible evaluarlo debido a que bajo esta condición solo se pudieron
realizar 3 disparos que ocasionaron daño mecánico en la hoja (Datos no
mostrados). Este ensayo permitió observar que la expresión es directamente
proporcional a la presión de disparo utilizada, puesto que medida que se
incrementó la presión, se observó un mayor número de puntos azules en los
tejidos bombardeados (Figura 18), lo cual puede estar relacionado con que a
mayor presión, mayor efecto de barrido de las micropartículas de oro que se
encuentran adheridas al cartucho (López-López et al., 2013). Sin embargo esto
solo es aplicable hasta una presión de 160psi, porque como se mencionó
anteriormente presiones superiores ocasionan deterioro y oxidación del tejido.
Esto permite afirmar que la presión del gas Helio utilizada es muy importante
puesto que altas presiones causan daño, mientras bajas presiones pueden
permitir insuficiente penetración de la micropartícula a los tejidos blanco (Helenius
et al., 2000).
Los resultados de optimización de las condiciones de biobalística para realizar
ensayos de expresión transitoria obtenidos en este trabajo difieren de estudios
realizados en Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum, donde utilizaron una
pistola de genes de baja presión y encontraron que el mayor número de puntos
azules se obtenía con presiones de 75 y 200psi, respectivamente (Boletín 2453
BioRad®). Esta diferencia en la presión de disparo optima sobre hojas de Nicotiana
tabacum se podría explicar si tenemos en cuenta el tipo de método utilizado para
el crecimiento de las plantas, mientras este trabajo de investigación utilizó plantas
de tabaco obtenidas de cultivo in vitro, el ensayo reportado en la literatura (Boletín
2453 BioRad®) utilizó plantas cultivadas en invernadero. Esta diferencia en el
sistema de crecimiento ocasiona un espesor y rigidez de las hojas que permite
explicar la diferencia en presión de helio optimizada en cada experimento.
Por otro lado, ensayos realizados por Kuriakose et al (2011) reportan que la
presión de helio optima de bombardeo en tejido foliar de rosa es 220psi; presiones
inferiores a 200psi no reportan expresión génica y presiones superiores a 250 psi
54
ocasionan deterioro del tejido. Estos estudios permiten evidenciar que según el
tipo de especie vegetal evaluada, los tejidos en las plantas difieren en sus
características de espesor y de superficie, por lo que es importante optimizar las
condiciones necesarias para cada especie. De igual forma, factores como la edad
fenológica y el tamaño de la hoja también pueden influir en la presión adecuada,
explicando la diferencia de presiones optimas en cada caso (Kuriakose et al.,
2011).
Figura 17. Promedio del número de puntos azules obtenidos en ensayos de
expresión transitoria en hojas completas de N. tabacum cultivadas in vitro
utilizando el promotor 35S de CaMV fusionado al gen uidA (pBI121) al evaluar
tres presiones de disparo con la pistola génica Helios® Gene Gun System de
BioRad®. Las barras de error representan la desviación estándar.
En el ensayo se realizaron tres repeticiones, y la unidad experimental fue una hoja completa.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
100 140 160
Pro
med
io n
úm
ero
de
pu
nto
s
Presión (Psi)
55
Figura 18. Evaluación de la presión (psi) de bombardeo en hojas de N. tabacum.
A. 100psi B. 140 psi. C. 160psi en ensayos de expresión transitoria en hojas
completas de N. tabacum, empleando el promotor 35S de CaMV fusionado al
gen uidA (pBI121), utilizando la pistola génica Helios® Gene Gun System de
BioRad®. Ensayo realizado con cuatro disparos y empleando etanol 70% para
decolorar. Observación en Estereoscopio Carl Zeiss a 5X.
Fuente: La Autora
Validación de condiciones óptimas de bombardeo en hojas de N. tabacum.
Una vez se determinaron las condiciones óptimas de bombardeo: se procedió a
validar estos parámetros con el vector de expresión pCAMBIA 1305.2. En las
figuras 19 y 20 se presentan los resultados obtenidos, donde se observa un
número alto de puntos azules en las hojas bombardeadas. Un análisis del número
de puntos azules obtenido por ensayo para el vector pCAMBIA 1305.2 muestra
que fue mayor (369.3 puntos; Figura 19) en comparación a lo observado con el
vector pBI121 (16 puntos; Figura 17). Esta diferencia se puede explicar porque el
vector pCAMBIA 1305.2 contiene un gen GUS mejorado, aislado de
Staphylococcus sp, el cual ha sido modificado para optimizar la expresión en
plantas, mientras que el gen GUS presente en el vector pBI121 es aislado de
Escherichia coli (Vitha et al., 1995). Los beneficios de GUSPlus en comparación
con el gen GUS aislado de E. coli son: una mayor sensibilidad, obteniéndose
coloración en menos tiempo al actuar con el sustrato X-Gluc, este puede ser
secretado, señalando un ensayo no destructivo, mayor estabilidad térmica y
mayor tolerancia a los fijadores (Vitha et al., 1995). La diferencia en los niveles de
expresión obtenidos al utilizar el gen GUS y GUSPlus se evidencian claramente en
estudios realizados en diferentes líneas de arroz donde el porcentaje de expresión
del gen GUS en tejidos vegetativos es menor a comparación de líneas
56
transformadas con construcciones que portan GUSPlus, lo que demuestra que
este gen es más sensible (Connett et al., 2006).
Durante el ensayo de validación se evaluó una característica adicional que fue la
presencia/ausencia de difusor, un accesorio que porta la pistola génica de baja
presión Helios Helios® Gene Gun System de BioRad®, sin embargo no se
observaron diferencias en cuanto al promedio de número de puntos obtenidos con
el uso o no de difusor (Figura 20). Estos resultados coinciden con estudios de
expresión transitoria realizados en tejido foliar de tabaco, abedul y Arabidopsis
thaliana, donde no se incrementó significativamente los niveles de expresión del
gen reportero con el uso de difusor. No obstante, se reportó que el uso del difusor
redujo el daño ocasionado al tejido durante el bombardeo, lo cual permitió el
manejo de mayores presiones durante el proceso de optimización (Boletín 2453
BioRad®). De acuerdo a lo anterior, Sanford et al., 1993 afirman que el uso del
difusor, generalmente es útil en procesos de transformación estable, donde las
condiciones óptimas tienden a ser más suaves en comparación con la expresión
transitoria. Esto porque los mayores niveles de expresión transitoria se han
logrado con condiciones más fuertes que garanticen una mejor penetración de las
partículas, no obstante esto puede ser negativo en la transformación estable
donde se puede afectar la división celular o el crecimiento.
Figura 19. Promedio del número de puntos obtenidos en ensayos de expresión
transitoria en hojas completas de N. tabacum utilizando el vector pCAMBIA 1305.2. En
adición se muestran los valores obtenidos al evaluar la presencia y ausencia de difusor
en la pistola génica Helios® Gene Gun System de BioRad®. Las barras de error
representan la desviación estándar.
Fuente: La Autora
0
100
200
300
400
500
Sin difusor Con difusor
Pro
me
dio
nú
me
ro d
e
pu
nto
s
57
Figura 20. Expresión transitoria en hojas completas de N. tabacum, bajo la acción
del promotor 35S fusionado al gen GUSPlus (pCAMBIA 1305), utilizando la pistola
génica Helios® Gene Gun System de BioRad®. A. Resultados con presencia de
difusor (Observación a simple vista). B. Presencia de difusor C. Ausencia de
difusor (B y C observación en Estereo microscopio Carl Zeiss a 5X).
Fuente: La Autora
El observar resultados de expresión génica evaluada mediante el número de puntos obtenidos en hojas completas de N. tabacum permitió constatar que la preparación de las micropartículas y cartuchos se hizo correctamente y no influyó en la ausencia de expresión en el ensayo realizado con fragmentos de tejido foliar.
Respecto a la distancia de disparo directa (0 cm) utilizada para realizar los ensayos en hojas completas, se seleccionó con base en estudios de optimización de la técnica de biobalística llevados a cabo en Nicotiana tabacum con la pistola génica Helios® Gene Gun System (Boletín 2453 de BioRad®). Por otro la germinación y desarrollo de las plántulas se realizó en ausencia de reguladores de crecimiento, con el fin de que los resultados de expresión génica sean debidos exclusivamente al promotor evaluado fusionado al gen reportero uidA (GUS) y no a fuentes externas que podrían influir en los resultados obtenidos y ser motivo de confusión. Esto teniendo en cuenta estudios realizados por Nikovics et al., 2001 con promotores del Virus del estriado del maíz (MSV) donde se reporta que niveles de expresión obtenidos en la región meristemática de la raíz se incrementaron al utilizar el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4 D). De igual forma la selección de hojas jóvenes, próximas al ápice caulinar se realizó teniendo en cuenta estudios realizados por Sanford y colaboradores (1993) quienes afirman que explantes jóvenes, con activa división celular son considerados ser los más apropiados en ensayos de expresión génica y transformación por biobalística. Esto se complementa con estudios realizados por Wilson y colaboradores (2005) en donde se obtuvo mayor expresión génica principalmente en tejidos jóvenes, debido a la disponibilidad de factores de transcripción necesarios promover la transcripción del gen reportero.
58
4.2. Construcción del vector de expresión heteróloga constituido
por el promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del
mosaico amarillo de la papa- Colombia fusionado al gen reportero
uidA.
El vector de expresión heteróloga PYMV- CPGUS, constituido por el promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarillo de la papa- Colombia fusionado al gen reportero uidA, fue construido en pUC 19, porque es un vector pequeño que puede transportar grandes fragmentos de DNA, está presente en un alto número de copias por célula y presenta un polylinker con secuencias de reconocimiento para numerosas enzimas de restricción, características que lo hacen fácil de manipular y explica porqué es ampliamente utilizado en ingeniería genética (Perron et al., 1985; Klug, 2008). La extracción del promotor del gen de la proteína de la cápside de PYMV-Col
clonado en el vector Topo TA se realizó con las enzimas de restricción HindIII y
EcoRI; y la fusión del gen de la proteína de la cápside de PYMV- Col al gen
reportero uidA se hizo entre los sitios EcoRI y PstI (Figura 21). La fusión del
promotor del gen de la proteína de la cápside al gen uidA es de tipo traduccional,
es decir que el ATG del gen de CP-PYMV fue clonado en fase con respecto al
ATG del gen reportero uidA, el cual se extrajo del plásmido pBI101.2,
seleccionado previamente mediante un análisis bioinformático que permitió
conocer que era el indicado para realizar una fusión donde se conserve el marco
de lectura indicado. Posteriormente, un análisis de secuenciación confirmó la
correcta fusión del promotor del gen de CP-PYMV al gen uidA.
59
Figura 21. Estructura de vectores de expresión utilizados en este trabajo de investigación. A. Construcción 35S CaMV- GUS en pBI121. Un fragmento de 800 pb correspondiente al promotor 35S de CaMV fue ligado en los sitios HindIII-BamHI de pBI101.1 (Jefferson et al., 1987). B. Construcción PYMV-CPGUS en pUC 19. Un fragmento de 481pb correspondiente al promotor CP de PYMV fue ligado en los sitios EcoRI y pstI de pBI101.2.
Fuente: La Autora
4.3. Determinación de la expresión especifica de tejido del
promotor del gen de la proteína de la cápside de Virus del
mosaico amarrillo de la papa- Colombia fusionado al gen
reportero uidA mediante ensayos transitorios realizados en
plantas de tabaco.
En la figura 22 se reportan los resultados obtenidos al evaluar la expresión
transitoria del promotor CP de PYMV-Col fusionado al gen uidA: un promedio de
23.2 puntos fueron encontrados en una hoja de N. tabacum y el promedio del
número de puntos obtenidos con el promotor 35S de CaMV fue 26.6. Estos
resultados permiten observar que el promotor 35S de CaMV supera al promotor
CP solo en un promedio de 3.4 puntos azules, teniendo en cuenta que este es
considerado como un promotor fuerte.
60
Figura 22. Promedio del número de puntos obtenidos al evaluar el promotor del
gen de CP-PYMV-Col (PYMV-CPGUS) y el promotor 35S de CaMV (pBI121) en
ensayos de expresión transitoria en hojas completas de N. tabacum cultivadas in
vitro utilizando la pistola génica Helios® Gene Gun System de BioRad®.
Fuente: La Autora
Respecto a la expresión tejido especifico con el promotor CP de PYMV-Col
fusionado al gen reportero uidA (GUS) fue observada solamente en células del
mesófilo (Figuras 23C, D y 24) y la expresión del promotor 35S de CaMV, como
era de esperase fue observada tanto en tejido vascular como en células del
mesófilo (Figura 23A, B). El haber obtenido una expresión especifica en células
del mesófilo por parte del promotor CP es interesante, ya que los geminivirus son
limitados al floema y recientemente han sido considerados como excelentes
vectores virales con valor biotecnológico (Onofre et al., 2003).
El uso de múltiples elementos cis para conferir expresión constitutiva puede ser
específico para promotores virales los cuales han sido seleccionados por la
habilidad para dar altos niveles de expresión en muchos tipos de células y bajo
diversas condiciones metabólicas. Tal es el caso del promotor 35S de CaMV en el
cual se han definido dos dominios que pueden conferir diferentes patrones de
expresión tejido específico en plantas transgénicas conforme estas se desarrollan.
0
5
10
15
20
25
30
35
CP de PYMV-Col 35S de CaMV
Pro
me
dio
nú
me
ro d
e p
un
tos
Tipo de Promotor
61
El dominio A (-90 a +8) capaz de conferir expresión principalmente en tejido de
raíz (Benfey et al., 1989). Un elemento de secuencia cis-regulatorio denominado
secuencia de activación (as)-1 es el responsable de esta expresión, el cual se une
a un factor denominado secuencia de activación (ASF)-1 en extractos de tabaco
(Lam et al., 1989).
Por su parte, el dominio B confiere expresión en cotiledón, tallo y hojas. El dominio
B se divide en cinco subdominios que confieren diferentes modelos de expresión,
lo cual se explica en que se han identificado elementos cis-regulatorios que
interactúan con diferentes factores en trans, por lo que el dominio B tiene una
organización modular. Sin embargo, los modelos de expresión de los subdominios
aislados no representan la expresión conferida por el domino B intacto, lo cual se
explica en que los elementos cis pueden ser interrumpidos al aislar cada dominio.
Además se ha encontrado interacciones sinergísticas de los elementos cis
presentes en cada subdominio, encontrando que la expresión es la suma de los
modelos de expresión de los elementos aislados (Benfey et al., 1990).
Los modelos de expresión conferido por el promotor 35S fueron: dominio A en
radícula, raíz (plántulas de 6 días), raíz y ápice (Plántulas de 10 y 17 días);
dominio B en cotiledón, tejido vascular de raíz, hipocotilo, cotiledón (Plántulas de
6, 10 y 17 días); dominio A y B en cotiledón y todas las células (Plántulas de 6,
10 y 17 días) (Benfey et al., 1989). Cuando se fusionaron los 5 subdominios con el
dominio A se obtuvo: B1 +A expresión en cotiledones, hipocotilo; B2+A expresión
en raíz; B3+A en la mayoría de células de hipocotilo y cotiledón; B4 + A tejido
vascular de hipocotilo y cotiledón; B5+A en mesófilo de cotiledón (Benfey et al.,
1990).
Con base a lo anterior es importante realizar un análisis bioinformático y ensayos
de delecciones de nuestro promotor CP de PYMV-Col fusionado al gen reportero
uidA (GUS), con el fin de conocer no solamente los elementos responsables del
modelo de expresión conferido en células del mesófilo, si no el tamaño mínimo del
promotor, información de gran valor en un futuro para hacer aplicaciones
biotecnológicas. Adicionalmente, es importante mencionar que los resultados de
expresión génica obtenidos con el promotor del gen de la proteína de la cápside
de PYMV-Col fusionado al gen reportero uidA (GUS) son el resultado de expresión
basal del gen reportero en ausencia de otras proteínas geminivirales que pueden
actuar en trans sobre los elementos cis-regulatorios presentes en este promotor y
que pueden causar tanto la promoción de la transcripción como la represión de la
expresión de cualquier gen fusionado rio abajo de esta región promotora.
62
Figura 23. Resultados de expresión tejido específica de promotores virales
fusionados al gen uidA en tejido foliar de Nicotiana tabacum. A y B. Expresión
del promotor 35S de CaMV (pBI121). C y D. Expresión del promotor CP-PYMV-
Col (PYMV-CPGUS). A y C (zoom 8); B y D (Zoom 25). Estereomicroscopio Wild
Heerbrugg.
Fuente: La Autora
63
Figura 24. Expresión en mesófilo del promotor del gen de la proteína de la
cápside de PYMV-Col mediante ensayos transitorios realizados en plantas de
tabaco (Nicotiana tabacum var. xanthi).
Fuente: La Autora
Los resultados de expresión obtenidos con el promotor CP de PYMV-Col
fusionado al gen reportero uidA (GUS) difieren de estudios realizados por
Mazithulela et al., 2000, quienes trabajaron con una versión extendida del
promotor de CP del Virus estriado del maíz (MSV). La tinción histoquímica mostró
que el promotor CP de MSV confiere expresión en tejido vascular de raíz, tallo,
hojas y órganos florales de plantas de arroz transgénico. No se detectó expresión
en células del mesófilo o esclerénquima.
Luego, Yingqiu et al (2000) reportan estudios con el promotor CP del Virus rizado
de la hoja de algodón (CLCuV) en tabaco y algodón que sugieren que dicho
promotor no se expresa específicamente en el floema. La actividad de expresión
64
del gen CP se encontró no solo en el floema, si no en también en tejido del
mesófilo y meristemo de raíz.
Por otro lado, Sunter y Bisaro, 1997 reportaron que la expresión del promotor CP
del Virus del mosaico dorado del tomate (TGMV) fue especifica en tejido vascular
de plantas transgénicas de Nicotiana bentamiana, a pesar de que TGMV infecta
mesófilo y otros tejidos en este huésped. Sin embargo la expresión en mesófilo
fue activada cuando el producto del gen AL2 geminiviral (TrAp), transactivo el
promotor de este gen. De igual forma, Lacatus y Sunter, 2008 encontraron que el
promotor CP del Virus rizado de la hoja de la col (CaLCuV) es activado en
mesófilo al ser transactivado por el gen AL2 y actúa para desreprimir el promotor
CP en tejido vascular. Las secuencias que median represión y activación del
promotor CP de CaLCuV se unen específicamente a diferentes factores
nucleares comunes a Nicotiana tabacum, espinaca y tomate.
La especificidad de células y tejidos que infecta un virus es conocido como
tropismo de tejido (Morra y Petty, 2000). Los geminivirus tienen un tropismo
particular por las células del floema (Quin y Petty, 2001). Algunos ejemplos de
geminivirus limitados al floema son: el Virus del rizado amarillo del tomate
(TYLCV; Morilla et al, 2004), Virus del mosaico dorado del frijol (BGMV; Carr y Kim
1983), el Virus del mosaico del abutilon (AbMV; Wege et al., 2001), Virus del
rizado de la hoja de la calabaza (SLCV; Hoefert, 1987). Sin embargo, algunos
geminivirus son capaces de moverse fuera del sistema vascular e infectar otro tipo
de células como las del mesófilo (Rothenstein et al., 2007). Como ejemplo de
estos virus tenemos el Virus del mosaico dorado del tomate (TGMV; Lacatus y
Sunter, 2009), el Virus del mosaico dorado del frijol (BGMV; Morra y petty, 2000),
Virus del estriado del maíz (MSV; Kotlizky et al., 2000).
Entre los aspectos determinantes del tropismo de tejido en células del mesófilo
están: factores genéticos (Morra y Petty, 2000), los cuales fueron estudiados en
TGMV y BGMV dos begomovirus que se encuentran estrechamente relacionados
pero que exhiben distinto tropismo de tejido en N. benthamiana un hospedero
común a los dos (Morra y Petty, 2000). Tanto BGMV como TGMV pueden infectar
a N. benthamana pero solo TGMV está bien adaptado a esta (Petty et al., 1995).
BGMV es limitado al floema en hojas infectadas sistémicamente, mientras que
TGMV invade el mesófilo. Los determinantes de esta diferencia en el tropismo de
tejido fueron analizados usando virus híbridos en los cuales fragmentos
homólogos de su genoma fueron intercambiados entre BGMV y TGMV,
encontrándose que virus que permanecían limitados al floema fueron capaces de
65
replicarse en células del mesófilo de hojas directamente inoculadas. Tres regiones
del genoma de TGMV contribuyeron a la invasión al mesófilo: la región no
codificante BVi es esencial, pero esta debe estar presente en combinación con
cualquiera de los siguientes marcos de lectura: AL23 o BC1.
De igual forma, la tasa de replicación viral, que involucra la capacidad de los
geminivirus de modificar el ambiente celular hacia la fase S, puede ser un
determinante del tropismo, así la infección es propicia solo en aquellos tipos de
células donde hay condiciones favorables para la replicación (Fontes et al.,
1994a). Un ejemplo de esto son mutantes del gen AC1 que codifica para la
proteína Rep del virus TGMV que presentan una capacidad reducida de
interacción con reguladores del ciclo celular como son las proteínas homologas a
retinoblastoma, por tanto son incapaces de infectar células del mesófilo y
permanecen confinados al tejido vascular (Kong et al., 2000).
Además, el tropismo de tejido puede estar relacionado con la adaptación del virus
a su hospedero, tal es el caso del Virus del mosaico de la euforbia (EuMV) que es
limitado al floema en su hospedero natural Euphorbia heterophylla L, pero al usar
un hospedero experimental (Datura stramonium L), no se limita al floema,
infectando otro tipo de células como las del mesófilo y células de la epidermis
(Rothenstein et al., 2007). Esto se puede explicar en que el mecanismo de
movimiento célula a célula en los dos hospederos es diferente y a la presencia de
estructuras inducidas por algunos virus conocidas como macrotúbulos que
parecen estar involucrados en el movimiento célula a célula del virus en etapas
tempranas de infección. En este caso los macrotúbulos no se formaron en su
huésped natural, lo cual manifiesta la limitación de este virus al floema (Kiung-
Soo and Key-Woon, 1992). De igual forma, la poca permisividad de la planta al
virus puede limitar su movilidad por causa de factores propios del hospedero como
son el diámetro de exclusión de los plasmodesmos, lo cual podría influir en la
dispersión célula a célula de este geminivirus, limitando su ciclo infectivo tan solo
a unas pocas células vegetales en donde fue inoculado (Lopéz-Lopez et al., 2013).
Adicionalmente, la limitación a un tejido determinado, probablemente refleja
coevolucion con elementos genéticos de dicho tejido, en tanto que las funciones
necesarias como replicación, movimiento y transmisión por insectos ya han sido
optimizadas en ese tipo de células (Rojas et al., 2005). También pueden estar
involucrados factores intrínsecos al propio virus como la ausencia del componente
B, tal es el caso del Virus del rizado de la remolacha (BCTV) cuyo tropismo a
tejidos vasculares se atribuye en parte a la ausencia de este componente o a que
las proteínas involucradas en el movimiento viral son incapaces de interactuar
66
eficientemente con células diferentes a las del tejido vascular (Morra y Petty,
2000). Sin embargo estudios realizados en begomovirus bipartitas como el Virus
del moteado del tomate (TOMoTV) demuestran que la sola presencia del
componente B no es una condición suficiente para garantizar la movilización del
DNA viral o de los viriones fuera del tejido vascular y a pesar de que la proteína
BC1 parece facilitar el escape de algunos begomovirus bipartitas del floema, es
importante resaltar que un numero de factores adicionales están involucrados en
este proceso (Levy y Czosneck, 2003). Además, begomovirus bipartitas que
codifican proteínas de movimiento con alta similitud en la secuencia de
aminoácidos exhiben diferente tropismo de tejido (Morra y Petty, 2000).
Por otro lado, se reporta que virus limitados al floema, pueden escapar de este e
invadir células del mesófilo posterior al proceso de transactivación de promotores
de genes tardíos por parte del producto del gen AL2 (Sunter y Bisaro, 1997). Esto
se sustenta en estudios realizados por Morra y Petty, 2000 en los begomovirus
BGMV y TGMV donde la proteína TrAp de TGMV al transactivar el promotor de
BV1 de BGMV permitió alcanzar un umbral crítico de proteína BV1 necesaria para
la invasión exitosa al mesófilo de N. benthamiana de este begomovirus cuyo
tropismo de tejido natural es en tejido vascular. La transactivación heteróloga de
promotores de genes tardíos nos permite conocer que secuencias requeridas para
este proceso deben ser conservadas entre begomovirus (Hung y Petty, 2001).
Finalmente, se puede concluir que el tropismo de tejido de un virus puede ser el
resultado de un complejo conjunto de factores genéticos y fisiológicos
dependientes tanto de la maquinaria del hospedero como de componentes virales.
67
5. CAPITULO 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
5.1. Conclusiones
Fragmentos de hoja de Nicotiana tabacum var. xanthi no son el material vegetal óptimo al utilizar la pistola de genes de baja presión (Helios® Gene Gun System, BioRad®).
Las condiciones optimas para realizar ensayos transitorios de expresión génica en hojas completas de Nicotiana tabacum var. xanthi cultivadas in vitro, utilizando la pistola de baja presion Helios® Gene Gun System, (BioRad) son: 4 disparos, presión 160psi, distancia aproximada de 0cm y etanol al 70% para eliminar pigmentos presentes en el tejido foliar.
Las condiciones optimas logradas en ensayos de expresión transitoria en hojas completas de N. tabacum cultivadas in vitro se validaron con el vector pCAMBIA 1305.2, lo cual es indicativo de la eficiencia de las condiciones optimizadas en el presente trabajo. Adicionalmente, no se reportaron diferencias en cuanto al promedio del número de puntos azules obtenidos con la presencia o no del difusor en la pistola de genes de baja presión (Helios® Gene Gun System, BioRad®).
El promedio del número de puntos azules obtenidos con el promotor CP-PYMV-Col fusionado al gen uidA (GUS) fue de 23.2 en una hoja completa de N. tabacum, expresión aproximadamente comparable al promedio obtenido con el promotor 35S de CaMV (26.6), teniendo en cuenta que este último es considerado como un promotor fuerte.
La expresión heteróloga regulada por el promotor del gen de la proteína de la cápside de PYMV-Col es especifica en células del mesófilo de tejido foliar de Nicotiana tabacum var. xanthi, lo cual es interesante, ya que los geminivirus son limitados al floema y recientemente han sido considerados como excelentes vectores virales con valor biotecnológico.
68
5.2. Perspectivas
Teniendo en cuenta que se obtuvo un mayor número de puntos azules en ensayos realizados con el vector de expresión pCAMBIA 1305,2 sería interesante fusionar el promotor CP de PYMV-Col al gen GUSPLUS, modificado para optimizar la expresión en plantas. Por otro lado es importante realizar estudios de transactivación homologa y heteróloga del gen de la proteína de la cápside de PYMV-Col, que además de incrementar los niveles de expresión génica, podría acentuar la expresión en células del mesófilo o por el contrario dirigir la expresión a otros tejidos. De igual forma, la construcción obtenida, correspondiente al promotor del gen de la proteína de la cápside del virus PYMV-Col fusionado al gen uidA (PYMV-CPGUS), puede ser de gran utilidad en estudios posteriores. Finalmente, sería significativo generar diferentes versiones del promotor CP-PYMV-Col fusionadas al gen uidA para evaluar si hay variación en la expresión tejido especifica.
69
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