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Evaluación in vitro de la interacción de la

glutamina sintetasa extraída de cerebro

de rata con diferentes fragmentos del

péptido beta-amiloide

Sonia Luz Albarracín Cordero

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2012

Evaluación in vitro de la interacción de la

glutamina sintetasa extraída de cerebro

de rata con diferentes fragmentos del

péptido beta-amiloide

Sonia Luz Albarracín Cordero

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de

Doctor en Química

Director

Químico, Ph.D. José Rafael Gerardo Pérez Gómez Q.E.P.D.

Director

Ph.D. Edgar Antonio Reyes Montaño

Línea de Investigación

Bioquímica de Proteínas

Grupo de Investigación en Proteínas

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2012

A Dios por caminar siempre a mi lado sosteniéndome la mano

A mis padres por ser mis más grandes cómplices

A Sofía que llegaste a este mundo para regalarme con tu sonrisa la felicidad

A mi gran amor que ahora me mira desde el cielo.

Los inventores de fábulas que todo lo

creemos nos sentimos con el derecho a profesar

que todavía no es demasiado tarde para

emprender la creación de una nueva

utopía de la vida, donde nadie pueda

decidir por otros hasta la forma de morir,

donde sea cierto el amor

y sea posible la felicidad

Gabriel García Márquez

Evaluación in vitro de la interacción de la glutamina sintetasa con diferentes fragmentos del péptido beta -amiloide

Agradecimientos

Al Dr. Gerardo Pérez Gómez, Ph.D., Q.E.P.D. por su apoyo incondicional, sus orientaciones,

dedicación y su actitud frente a la vida; porque me enseño con su ejemplo y testimonio sintiéndome

privilegiada de crecer al lado de un verdadero Maestro.

Al Dr. Edgar Antonio Reyes Montaño, Ph.D., por acompañarme permanentemente en la realización

de este trabajo y por no dejarme decaer en ningún momento, especialmente cuando tuvimos que

despedir a Leonardo y al Profesor Pérez.

A mi compañera y amiga Nohora Angélica Vega por su capacidad de dar y por su generosa manera

de compartir en la alegría y en las dificultades siempre con una sonrisa.

A mis compañeros de Laboratorio, Andrea Wilches y Camilo Alberto Alvarado por su amistad,

alegría y colaboración.

Al Dr. Alfonso Barreto por su amistad y estímulo permanente, imprescindible en especial en el

trabajo con células y los ensayos con microscopia confocal, fundamentales en el presente trabajo.

A la Vicerrectoría Académica de la Universidad Javeriana por brindarme el apoyo económico para

adelantar este trabajo de grado.

A todas las personas que de una u otra forma, en diferentes circunstancias, con una palabra, un

gesto, una sonrisa, me dieron la energía necesaria para continuar siempre adelante.


Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa de demencia más frecuente en la población anciana,

representando entre un 50 % y 80 % del total de las demencias. Se caracteriza por déficit cognitivo

asociado a la muerte neuronal. A nivel molecular se encuentran agregados del Péptido β-amiloide

(PBA), tanto en sinapsis como intracelularmente. Se ha reportado que PBA puede ser capturado

por los astrocitos e interactuar con la enzima glutamina sintetasa, aunque el detalle de dicha

interacción no se conoce. Este trabajo busco identificar la interacción de la glutamina sintetasa y el

PBA. Para ello, se purifico la enzima proveniente de cerebro de rata y posteriormente se incubó con

diferentes fragmentos del PBA, evaluándose la capacidad de formación de agregados con la enzima.

Adicionalmente se evaluó dicha interacción en cultivo primario de astrocitos de rata. Los

resultados en conjunto muestran que PBA interactúa con la enzima, posiblemente utilizando como

secuencia blanco la correspondiente a PBA 25-35. En las células se identificaron cambios

morfológicos correlacionables con astrogliosis temprana producto del tratamiento con los PBA.

Palabras clave: Amiloide, Glutamina sintetasa, Interacción, Purificación, Astrocitos,

Astrogliosis.


Abstract

Alzheimer's disease (AD) is the most common cause of dementia in the elderly population,

accounting for between 50% and 80% of all dementias. It is characterized by cognitive deficits

associated with neuronal death. At the molecular level are aggregates of β-amyloid peptide (PBA),

both synapses and intracellularly. PBA has been reported that can be captured by astrocytes and

interact with the enzyme glutamine synthetase, although the details of this interaction is not known.

This paper sought to identify the interaction of glutamine synthetase and the PBA. To this end, the

enzyme was purified from rat brain and then incubated with different fragments of the PBA,

evaluating the ability to form aggregates with the enzyme. This interaction was also evaluated in

primary cultures of rat astrocytes. The overall results show that PBA interacts with the enzyme,

possibly used as a target sequence corresponding to PBA 25-35. Cells were identified in the

morphological changes correlated with early astrogliosis proceeds of treatment with PBA.

Keywords: Amyloid, Glutamine synthetase, Interaction, Purification, astrocytes, astrogliosis

Contenido

Contenido

Introducción 1

1. Antecedentes bibliográficos 3

1.1. Sistema nervioso central y neuroglia. 3

1.1.1. Astrocitos. 4

1.2. Funciones de los astrocitos 7

1.2.1. Inducción de la Barrera hemato-encefálica 7

1.2.2. Gliotransmisión 8

1.2.3. Desarrollo embrionario 9

1.2.4. Homeostasis Iónica 10

1.2.5. Activación de los astrocitos 11

1.2.6. Neurotransmisión en Sinapsis excitatorias 12

1.2.6.1. Glutamina Sintetasa 15

1.3. Péptido beta-amiloide (PBA) 18

1.4. Papel de los Astrocitos en la Enfermedad de Alzheimer 23

2. Hipótesis 24

3. Oojetivos 24

3.1. Objetivo General 24

3.2. Objetivos Específicos. 24

4. Materiales 25

4.1. Material Biológico 25

4.2. Reactivos 25

4.2.1. Soportes para cromatografía 25

4.2.2. Péptidos 25


4.2.3. Anticuerpos 25

4.2.3.1. Primarios 25

4.2.3.2. Secundarios 25

4.2.3.3. Fluorescentes 26

4.2.3.4. Cultivo celular 26

4.2.3.5. Otros 26

4.2.3.6. Proteínas 26

5. Métodos 27

5.1. Purificación y evaluación de la actividad de la GS de cerebro de rata 27

5.1.2. Preparación del extracto 27

5.1.3. Precipitación fraccionada con sulfato de amonio 27

5.2. Ensayos identificación de GS 28

5.2.1. Determinación de la actividad enzimática 28

5.2.2. Determinación de la cantidad de proteína 28

5.2.3. Ensayos de ELISA 28

5.2.4. DOT-BLOT 29

5.2.5. Electroforesis 29

5.3. Ensayos Cromatográficos 29

5.3.1. Cromatografía de exclusión molecular 29

5.3.1.2. Curva de calibración de la columna 29

5.3.1.3. Condiciones de corrido 30

5.3.2. Cromatografía de Intercambio Iónico 30

5.3.3. Cromatografía de Afinidad sobre Péptido beta amiloide (PBA 1-40) 30

5.3.3.1. Preparación del soporte 30

5.3.3.2. Cromatografía de Afinidad usando glutamato 31

5.4. Caracterización de la enzima 32

5.4.1. Western Blot 32

5.5. Generación de los complejos GS-PBA 32


5.5.1. Obtención de los Péptidos 32

5.5.2. Ensayos de Agregación o formación de complejos GS-PBA 33

5.5.2.3. Caracterización de los complejos GS-PBA 33

5.6. Interacción in vitro GS-PBA 34

5.6.1. Ensayo de ELISA indirecto GS vs. PBA 34

5.6.2. Cultivo primario de astrocitos de rata 34

5.6.3. Composición y preparación de las disoluciones 34

5.6.3.1. Solución de Earle (EBS) 35

5.6.3.2. Solución de disgregación (Solución A) 35

5.6.3.3. Solución de tripsinización (Solución B) 35

5.6.4. Medio de cultivo 35

5.6.5. Suero 35

5.6.6. Recubrimiento de los frascos Roux de cultivo con poli-L-lisina 36

5.6.7. Preparación del cultivo primario de astrocitos. 36

5.6.8. Incubación de los péptidos 37

5.6.8.1. Ensayo de CELISA 37

5.6.3. Inmuno-precipitación de GS 38

5.7. Inmunocitoquímica directa 38

5.8. Análisis estadístico 39

6. Resultados y Discusión 40

6.1. Purificación y evaluación de la actividad de la GS de cerebro de rata 40

6.1.2. Ensayos de precipitación fraccionada 41

6.1.3. Cromatografía de filtración en gel 43

6.1.3.1. Curva de calibración 43

6.1.3.2. Separación por Filtración en gel (FG) 45

6.1.3.3. Cromatografía de intercambio Iónico (IO) 48

6.1.3.4. Cromatografías de afinidad 51


6.1.3.4.1.PBA-Sepharosa 51

6.1.3.4.2.Glutamato-Sepharosa 54

6.2. Generación de los complejos GS-PBA 58

6.2.1. Obtención de los Péptidos 58

6.2.2. Ensayos de ELISA 59

6.2.3. Ensayos de agregación 62

6.2.4. Caracterización de los complejos GS-PBA 67

6.2.5. Inmunoprecipitación de GS y PBA 68

6.3. Interacción GS-PBA en un modelo celular 70

6.3.1. Características del cultivo primario de astrocitos de rata 70

6.3.2. Ensayo de CELISA 74

6.3.3. Interacción PBA-GS en cultivo primario de astrocitos de rata 78

6.3.3.1. Cambios morfológicos inducidos por PBA 78

6.3.3.2. Inmunocitoquímica 83

6.4. Discusion final 93

7. Conclusiones 98

8. Recomendaciones 99

9. Perspectivas 100

10. Referencias 101


Lista de figuras Pág.

Figura 1. Tipos de astrocitos 5

Figura 2. Mecanismos de señalización entre neuronas y astrocitos 9

Figura 3. Principales reacciones del ciclo de la glutamina 14

Figura 4. Integración de las rutas metabólicas de las neuronas y los astrocitos 18

Figura 5. Electroforesis para los ensayos de precipitación con (NH4)2SO4 44

Figura 6. ELISA para los ensayos de precipitación con (NH4)2SO4 45

Figura 7. Determinación del volumen muerto de columna de Sephacryl S-300 45

Figura 8. Curva de calibración para Sephacryl S-300 46

Figura 9. Cromatografía de filtración en gel (FG) sobre Sephacryl S300 48

Figura 11. Determinación de la presencia de GS por el método de ELISA 49

Figura 12. Cromatografía de intercambio iónico (IO) 50

Figura 13. Electroforesis para los ensayos de Intercambio Iónico 51

Figura 14. Secuencia del Péptido beta Amiloide PBA 1-40 52

Figura 15. Cromatografía de afinidad PBA-Sepharosa 53

Figura 16. Detección de la GS 54

Figura 17. Dot-Blot para los ensayos de cromatografía PBA-Sepharosa 54

Figura 18. Cromatografía de afinidad Glutamato-Sepharosa 55

Figura 19. Electroforesis para la cromatografía de afinidad Glutamato-Sepharosa 56

Figura 20. Dot-Blot de fracciones obtenidas en cromatografía de afinidad 57

Figura 21. Control de calidad de los péptidos PBA 25-35 y PBA 12-28 60

Figura 22. Interacción PBA 1-40-GS 61



Figura 25. Resumen de la Interacción PBAs-GS 64


Figura 26. Modelo estructural de protofilamentos de PBA 1-40 66

Figura 27. Representación de la estructura de ThT 67

Figura 28. Determinación de la capacidad de agregación de los péptidos 69

Figura 29. Determinación de la capacidad de agregación de los péptidos 70

Figura 30. Transferencia de los complejos PBA-GS 72

Figura 31. Inmunoprecipitación de PBA-GS 73

Figura 32. Evaluación de la viabilidad del cultivo de astrocitos 75

Figura 33. Localización de GFAP en cultivo primario de astrocitos de rata 76

Figura 34. Localización de GS en cultivo primario de astrocitos de rata 77

Figura 35. Interacción PBA 1-40 con proteínas del cultivo primario de astrocitos 78



Figura 38. Resumen de la Interacción de PBAs con proteínas del cultivo 80

Figura 39. Cambios morfológicos de las células en respuesta a PBA 1-40 83



Figura 42. Doble marcaje para PBA 1- 40 1 M 87



Figura 40. Doble marcaje para PBA 25-35 1 M 89







Lista de tablas Pág.

Tabla 1. Diferentes fracciones precipitadas con (NH4)2SO4 42

Tabla 2. Cuadro resumen del protocolo de purificación de la GS. 58

Tabla 3. Secuencias analogas del Péptido -amiloide (PBA). 60


17

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la más común de las demencias en la edad adulta, se

manifiesta con un deterioro cognoscitivo y trastornos conductuales. Estos fenómenos se evidencian

con una pérdida progresiva de la memoria y de otras capacidades mentales a medida que neuronas

especialmente, en la corteza cerebral y el hipocampo se atrofian y mueren. El principal factor de

riesgo para la EA es la edad y su incidencia se duplica cada 5 años después de los 65. Se calcula

que se diagnostican al año 1.300 casos nuevos por cada 100.000 personas que superan esta edad

(Hirtz, D. et al., 2007). Aunque algunos estudios muestran que la patología no es necesariamente

resultado del envejecimiento, a medida que aumenta la expectativa de vida de la población, se

espera que la prevalencia aumentará, los datos muestran que sólo en los Estados Unidos de 13,2 a

16,0 millones de casos a mediados del siglo XXI (Den Dunnen, W.F. et al., 2008).

Muchas lesiones moleculares se han detectado en la enfermedad de Alzheimer, principalmente

caracterizadas por una acumulación de proteínas mal plegadas en las neuronas y en el espacio

extracelular que dan como resultado el daño oxidativo y la inflamación, lo que conduce a fallas

metabólicas que implican baja producción de ATP y la disfunción sináptica (Querfurth, H.W. &

LaFerla, F.M., 2010). En las lesiones celulares se observa la existencia de agregados proteicos de

péptido amiloide (PBA). Un desequilibrio entre la formación y degradación del PBA, parece ser

la causa más importante en su acumulación y este exceso puede ser el factor desencadenante de la

EA. Esta idea es conocida como "hipótesis del amiloide", se basa en estudios de las formas

genéticas de la enfermedad de Alzheimer, incluyendo el síndrome de Down y diferentes tipos de

pruebas a cerca de toxicidad del PBA 1-42 en las células neuronales (Tanzi, R.E. & Bertram, L.,

2005).

Se sabe que diversos tipos de proteínas extracelulares como apolipoproteína E (Apo E) y

apolipoproteína J (Apo J) pueden interactuar con PBA. Sin embargo la interacción de PBA con

proteínas intracelulares de astrocitos no ha sido bien estudiada (Ray, W. Ashall, F. y Goate, A.M.,

1998). Se ha demostrado que PBA puede interactuar con la enzima glutamina sintetasa (GS) de

cerebro (Hensley, K., et al., 1995; Butterfield, D.A., 2002). Esta enzima astrocítica juega un papel

fundamental en el metabolismo del glutamato y en la detoxificación de amonio (NH4+) de las

neuronas a través de la síntesis de glutamina (Seiler, N. 2002). La expresión de esta proteína ha


18

sido encontrada significativamente elevada en cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer

(EA) en comparación con pacientes normales (Burbaeva, G. et al., 2005). La interacción de la GS-

PBA puede inducir la reducción de la actividad de la GS (Hensley, K. et al., 1995). Se propone que

la interacción de estas dos especies moleculares (GS-PBA) es uno de los primeros procesos

bioquímicos que se presentan en la patofisiología de la EA (Albarracín, S. L. & y Lareo, L. R.

2002), ya que al alterarse la actividad de la enzima, se trastorna el equilibrio del ciclo glutamato-

glutamina y se generan cambios en el balance de neurotransmisores y amonio (NH4+) (Robinson, S.

R., 2000; Albarracín, S. L. & Lareo, L. R., 2004; Boksha, I. 2004). Estos cambios facilitarían el

entorno celular que podría conducir a generar la presentación típica de los procesos de

neurodegeneración.

En este trabajo se hace una propuesta para explicar el mecanismo de interacción entre la

glutamina sintetasa (GS) y diferentes fragmentos del péptido beta-amiloide (PBA): PBA 1-40, PBA

12-28 y PBA 25-35; lo que permitirá avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares

que favorecen la formación de agregados proteicos en los astrocitos y como estas células juegan un

papel fundamental en la patofisiología de la Enfermedad de Alzheimer.


19

1. Antecedentes bibliográficos

1.1. Sistema nervioso central y neuroglía

El número de células nerviosas contenidas en el sistema nervioso central (SNC), aunque

enorme, es superado, quizá cinco veces, por el número de células no nerviosas o neuroglía

(Sofroniew, M. & Vinters, H. 2010). Aunque el término “glía” se refiere a “pegamento” y de allí

derivó su nombre y en parte la función clásicamente atribuida a éstas células fue la de soporte

mecánico. Hoy sabemos que la neuroglía está constituida por células altamente especializadas y en

condiciones fisiológicas cumplen funciones esenciales tales como el mantenimiento de la

homeostasis iónica especialmente de potasio, dan soporte nutricional y trófico a las neuronas,

permiten la compartimentación metabólica, favorecen el mantenimiento de las sinapsis y de la

capacidad de señalización neuronal (Allen, N.J. & Barres, B.A., 2005). Además ejercen una

actividad moduladora sobre la comunicación neuronal al eliminar neurotransmisores, proveer sus

precursores y mantener concentraciones en el medio extracelular permitiendo la protección de las

neuronas contra la neurotoxicidad por exceso de glutamato y NH4+ (Albrecht, J. et al., 2007).

Adicionalmente, durante el desarrollo embrionario facilitan la migración de las neuronas y dirigen

su destino final (Volterra, A & Meldolesi, J. 2005).

La corteza cerebral de los mamíferos se origina a partir de una sola capa de células

neuroepiteliales. Estas células progenitoras neuronales (CPN) o madre neurales, las cuales

proliferan y secuencialmente dar lugar a tres tipos principales de células del cerebro: las neuronas,

astrocitos y oligodendrocitos (Sauvageot, C.M. & Stiles, 2002; Sun, Y.E. et al., 2003). La

microglía, a diferencia de los astrocitos y los oligodendrocitos, se deriva de los macrófagos fuera

del sistema nervioso, por tanto fisiológicamente y embriológicamente no están relacionadas con las

otras células gliales del sistema nervioso.

El sistema nervioso central de los mamíferos contiene dos clases principales de neuroglía,

que se han clasificado teniendo en cuenta su tamaño y morfología celular. Así, se distinguen las

células macroglíales, es decir; los astrocitos, los oligodendrocitos que se originan del ectodermo y

las células microglíales de origen mesodermal. Se han descrito otros tipos de neuroglía tales como

las glías radiales y las glías del sistema periférico, es decir; las células de Schwann (Varon, 1979;

Bunde, 1968), las células telioglíales, las células glíales satélites, las células ependimarias y la glía


20

entérica (Bradford, 1988).

Los astrocitos son las células gliales más abundantes con cuerpos celulares en forma de

estrella y procesos astrocíticos que interactúan con las neuronas y les proporcionan soporte

estructural y metabólico. Los oligodendrocitos tienen relativamente pequeñas cantidades de

citoplasma alrededor del núcleo, pero tienen varios procesos que se envuelven alrededor de los

axones para formar vainas de mielina. Las células microglíales son las más pequeñas y actúan como

fagocitos o células del sistema inmune en el SNC (Fei, H. y Yi, E. Sun, 2007).

1.1.1. Astrocitos

Los astrocitos son una población celular muy heterogénea. Los estudios clásicos a finales del

siglo XIX y durante el siglo XX los clasificaron en dos subtipos principales: protoplásmicos y

fibrosos, sobre la base de las diferencias en su morfología celular y la localización anatómica

(Cajal, S. 1909). Estas dos categorías principales conservan su validez y utilidad en la actualidad.

Los astrocitos protoplasmáticos se encuentran en la sustancia gris y como se demostró por primera

vez mediante técnicas clásicas de impregnación con plata, presentan una morfología de varias ramas

madre que dan lugar a muchos procesos de finas ramificaciones y con poco contenido en filamentos

intermedios (Fig. 1.). Los astrocitos fibrosos se encuentran a en la sustancia blanca (Cajal, S. 1909)

su cuerpo celular es pequeño y presentan prolongaciones cilíndricas que albergan en su interior una

alta densidad de filamentos intermedios (Privat, A. et al., 1995). Los estudios neuroanatómicos

clásicos y modernos también indican que ambos subtipos de astrocitos hacen extensivos contactos

con los vasos sanguíneos. Los análisis de microscopía electrónica revelan que los procesos de los

astrocitos protoplasmáticos envuelven las sinapsis y los procesos de los astrocitos fibrosos hacen

contacto con nodos de Ranvier (Peters, A. et al.,1991).


21

Figura 1. Tipos de astrocitos: a) Astrocitos protoplasmáticos de la sustancia gris, b) Astrocitos fibrosos de

la sustancia blanca.

Los filamentos intermedios están constituidos en su gran mayoría por una proteína

denominada proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP) (Bigmani, A. & Dalh, D. 1974). Las

proteínas de los filamentos intermedios constituyen una gran familia de moléculas con una -hélice

central en las que se incluyen keratinas y neurofilamentos. Los gliofilamentos intermedios están

organizados en paquetes, los cuales son usualmente más abundantes en astrocitos fibrosos que en

protoplasmáticos (Privat, A. et al., 1995). La vimentina y la GFAP son los mayores componentes

de los gliofilamentos inmaduros y maduros respectivamente. Durante el desarrollo postnatal, la

vimentina es reemplazada casi totalmente por la GFAP, sin embargo también se encuentra presente

en astrocitos fibrosos en adultos y en astrocitos reactivos (Pekny, M. & Pekna, M. 2004).

Estudios inmunohistoquímicos sugieren que la vimentina puede ser expresada solamente

durante la proliferación astrocítica, mientras que la GFAP es el clásico marcador de astrocitos en el

sistema nervioso maduro (Ridet, J & Privat, A. 2000). El principal papel de los filamentos

intermedios parece ser el de permitir la inducción y la extensión de los procesos astrocíticos, ya que

cuando se realizan ensayos en ratones con el gen GFAP inhibido o eliminado se observa una

notable reducción de los gliofilamentos expresando vimentina y nestina con disminución de

procesos astrocíticos. En los astrocitos el citoesqueleto ejerce un rol importante en la regulación del

volumen celular durante el flujo de iones (Ridet, J. & Privat, A. 2000).

Se han descrito otros tipos de células GFAP-inmunoreactivas difícilmente clasificables como

astrocitos. Por ejemplo, las células radiales de la glía, presentes en el córtex cerebral durante el


22

desarrollo, las células de Bergmann del cerebelo y las células de Müller de la retina. En cualquier

caso, la característica común a todos los astrocitos, en todo momento de su desarrollo, es la

presencia y expresión de la GFAP por ello, puede utilizarse para caracterizar indistintamente

cualquier tipo de astrocito (Sofroniew, M. & Vinters, H. 2010).

GFAP presenta diferentes isoformas y variantes generadas por empalme incluyendo

y , que se pueden expresar de manera heterogénea, tanto en condiciones fisiológicas como

patológicas; pero esta distribución diferencial y el papel de las isoformas de GFAP hasta ahora está

comenzando a ser estudiado (Andreiuolo, F. et al., 2009, Blechingberg, J. et al.,2007).

En cuanto a la diferenciación de los astrocitos se sabe que el factor inhibidor de leucemia

(LIF) cuya cascada de señalización esta mediada por la vía JAK-STAT juega un papel fundamental.

Estudios realizados con ratones knock-out han demostrado que la deficiencia genética de los

principales componentes de esta vía, incluida LIF, sus receptores LIFRβ, gp130 o STAT3 conducen

a la diferenciación astroglial alterada (He, F. et al., 2005). La señalización dependiente de Notch

podría promover la diferenciación de astrocitos a partir de células madre y parece esta mediada por

una pre-activación de la vía JAK-STAT (Ge, W. et al., 2002). Otros factores, como la proteína

morfogenética ósea (BMP), puede actuar en sinergia con LIF a través de la interacción entre las

proteínas Smad / STATs, junto con la transcripción CBP/p300 co-activador para inducir la

expresión de GFAP (Sauvageot, C.M. & Stiles, C.D. 2002; Sun, Y.E. et al., 2003).

Los componentes estructurales de los astrocitos fibrosos y protoplasmáticos son idénticos; las

diferencias son más bien cuantitativas; ambos tipos de células presentan gránulos de glucógeno,

lisosomas muy activos, un pequeño aparato de Golgi opuesto a un polo del núcleo

característicamente ovoide y con nucleocromatina homogénea. Los desmosomas y las uniones

comunicantes (gap juntion) son muy comunes en las regiones entre los procesos astrocíticos

(Siegel, G. et al., 1999; Halassa, M.M. et al., 2007; Ogata, K. & Kosaka, T. 2002; Nedergaard, M.,

et al., 2003).

En cuanto a los antígenos citoplasmáticos utilizados como marcadores astrocíticos se

encuentra una familia de pequeñas proteínas, las S-100 son moléculas que unen calcio en el

citoplasma y están involucradas en múltiples funciones celulares como la progresión del ciclo

celular y la diferenciación. La S-100 , es una proteína de 20 KDa que se encuentra presente en


23

astrocitos en el sistema nervioso central y en células de Schwann en el sistema nervioso periférico.

Dicha proteína puede ser liberada y detectarse en fluido cerebro-espinal. Algunos autores le

atribuyen propiedades neurotróficas en la actividad neurítica; también parece estar implicada en las

actividades calcio dependientes relacionadas con la regulación, en el ensamble de los microtúbulos

y la fosforilación de la proteína tau y otras proteínas de filamentos intermedios como la vimentina y

la GFAP, lo cual sugiere que está involucrada en la reorganización del citoesqueleto (Ridet, J. &

Privat, A. 2000; Goncalves, C.A., et al., 2008).

Desde el punto de vista del perfil enzimático la Glutamina sintetasa (EC 6.3.1.2) fue el

primer marcador específico de astrocitos, pero estudios posteriores revelaron que también se

encuentra en oligodendrocitos (Wiesinger, H. 1995). Otros trabajos reportan la presencia de

diferentes antígenos astrogliales como la isoforma de Enolasa (EC 4.1.2.11), -2-glicoproteína,

glicoproteína gp190 y el antigéno 7B11 (Ridet, J y Privat, A. 2000).

1.2. Funciones de los astrocitos

1.2.1. Inducción de la Barrera hematoencefálica

La barrera hematoencefálica (BHE) es un sistema de difusión que impide la entrada en el

parénquima cerebral de ciertas moléculas sobre la base de la polaridad y el tamaño. Los principales

componentes celulares de la BHE son las células endoteliales de los capilares que forman uniones

estrechas (tight junctions) y están rodeados por una lámina basal, pericitos perivasculares y

terminaciones de los astrocitos (Abbott, N.J. et al., 2006; Ballabh, P. et al., 2004; Gordon, G.R. et

al., 2007). Los pies terminales de las fibras astrocíticas rodean casi en su integridad a los capilares

cerebrales e inducen a las células endoteliales a formar las uniones estrechas características de la

BHE y a sintetizar las enzimas características como Colinesterasa, GABA Transaminasa, amino

peptidasas y endopeptidasas (Janzer, R. & Raff, M. 1987). En la BHE se da la expresión de

diferentes sistemas de transportadores que selectivamente proveen nutrientes de la sangre al cerebro

y son particularmente importantes en el desarrollo del mismo permitiendo la captura de diversos


24

sustratos como glucosa, –hidroxibutirato, triptofano, adenina y colina que se encuentran en más

altas concentraciones en el periodo neonatal que en cerebro adulto. (Siegel, G. et al., 1999).

1.2.2. Gliotransmisión

Las células gliales durante mucho tiempo han sido consideradas como células no excitables

y por tanto descritas como secundarias en los procesos de neurotransmisión, solo hasta hoy se

reconoce su papel protagónico y se han acuñado entonces nuevos conceptos como

“gliotransmisión”, en el sentido en que cuando por señales intra o extracelulares, se generan

mensajes a las células vecinas. También se habla de “gliotransmisores” para las moléculas

involucradas. Sin embargo, los astrocitos no pueden generar potenciales de acción, el mecanismo

excitatorio esta dado químicamente y es evidenciado por cambios en las concentraciones

intracelulares de Ca+2

que se conocen como “oscilaciones de Ca+2

” (Fig. 2). El ión se propaga de

célula a célula modulando así la neurotransmisión (Bezzi, P. & Volterra, A. 2001; Volterra, A. &

Meldolesi, J. 2005). Se ha encontrado que en diferentes sinapsis tanto en el SNC como en el

sistema nervioso periférico (SNP) neurotransmisores como glutamato, GABA, noradrenalina,

acetilcolina, dopamina y adenosina están implicados en la activación sináptica glíal durante la

neurotransmisión (Newman, E.A. 2001, Innocenti, B. et al., 2000; Wang, Z. et al., 2000). Así, por

ejemplo, los astrocitos hipocampales que expresan receptores específicos para glutamato, por

mecanismos de señalización mediados por hidrólisis de fosfolípidos de membrana, generan inositol

1,4,5-trisfosfato (Ins1,4,5P3), favorecen la elevación intracelular de la concentración de Ca+2

provocando “oscilaciones de Ca+2

” que se dispersan de una célula a otra a través de uniones

estrechas. La propagación de estas “ondas de Ca+2”

pone de manifiesto un mecanismo de

señalización astrocitico (Bezzi, P. & Volterra, A. 2001; Perea, G & Araque, A. 2006; Perea, G. &

Araque, A. 2007). Adicionalmente producto de otros tipos de señal, la glía puede producir

“gliotransmisores” como NO, ATP, glutamato, prostaglandinas entre otros o puede ejercer

funciones de neuromodulación con la liberación de moléculas como D-serina (Volterra, A. &

Meldolesi, J. 2005).


25

Figura 2. Representación de los principales mecanismos de señalización mediada por ondas de calcio

entre neuronas y astrocitos. Las células en oscuro indican un aumento de la concentración intracelular de

calcio, en respuesta a la actividad neuronal en las vecindades; la flecha negra indica la activación sináptica de

la glía; las flechas suaves indican la propagación de las ondas de calcio y la flecha doble muestra la liberación

de neuromoduladores por los astrocitos. Adaptado de Bezzi y Volterra 2001.

1.2.3. Desarrollo embrionario

El desarrollo de los astrocitos tiende a ocurrir después de la generación de neuronas en

muchas regiones el SNC. Sin embargo, los astrocitos ejercen una serie de funciones importantes

durante el desarrollo tanto de la sustancia gris, como de la sustancia blanca. Los astrocitos

participan en la orientación de la migración de los axones y neuroblastos (Powell, E.M. & Geller,

H.M. 1999). Algunas de las moléculas implicadas en este mecanismo son las moléculas de adhesión

celular nerviosa (NCAM) y las N-cadherinas (TakeichI, 1988; Edelman, 1983; Benson, et al.,

2000). Otras moléculas como trombospondina 1 y 2 (TSP-1 y TSP-2) una familia de glicoproteínas

extracelulares promueven la sinaptogénesis in vitro e in vivo y su deficiencia durante el desarrollo

resulta en una disminución de la densidad sináptica (Christopherson, K.S. et al., 2005). Se sabe

también que TSP-1 y TSP-2 contribuyen a la plasticidad sináptica y axonal que subyacen a la


26

recuperación de la función motora después de una lesión isquémica. Por lo tanto, las observaciones

que TSP está involucrado en las interacciones célula-célula y la sinaptogénesis plantean la

posibilidad de que un aumento en la expresión de TSP después de la lesión isquémica puede

favorecer la remodelación neuroanatómica posterior (Liauw, J. et al., 2008). GFAP es fundamental

en el mantenimiento y plasticidad de las sinapsis exitatorias, ya que en modelos murinos con genes

GFAP-

la expresión de otras proteínas importantes para el funcionamiento sináptico se ven

afectadas, tanto en neuronas como en astrocitos especialmente transportadores de glutamato

(Hughes, E.G. et al., 2004).

1.2.4. Homeostasis Iónica

Dado que un aspecto crucial en el SNC es la regulación de diferentes tipos de iones y del pH

del fluido extracelular; la concentración de iones como Na+ y K

+ debe estar controladas muy

estrictamente en el espacio sináptico de manera que puedan llevarse a cabo los potenciales de

acción. En este sentido es conocido el mecanismo de la amortiguación espacial de potasio que

como hipótesis propone que los astrocitos retiran K+

del espacio extracelular procedente de la

actividad neuronal y lo transfieren a zonas con baja concentración, de unos astrocitos a otros a

través de las llamadas uniones comunicantes o gap junctions (Sáez, J. et al., 1993; Gardner-

Medwin, A. 1986). Adicionalmente, las células glíales pueden responder metabólicamente a la

liberación de K+, durante la activación neuronal, aumentando la absorción de

3

H-2-deoxiglucosa y

la síntesis de glucógeno (Brown, A.M. & Ransom, B.R. 2007; Dringen, R. et al., 1992). Entonces

las células glíales son selectivamente permeables a los iones potasio y regulan el metabolismo del

glucógeno como mecanismo para ayudar a mantener el suplemento de energía como consecuencia

de una intensa actividad neuronal o si los niveles locales de glucosa en la sangre caen o son

inadecuados (Brown, A.M. & Ransom, B.R. 2007). Adicionalmente, los astrocitos expresan en la

membrana diferentes tipos de moléculas que incluyen intercambiadores Na+/H

+, transportadores de

bicarbonato, transportadores de ácidos monocarboxílicos, transportadores para K+, canales voltaje

dependiente de Ca+2

, Na+ y Cl

- que se pueden detectar en cultivo y en cortes de cerebro (Obara, M.

et al.,2008) y diferentes tipos de acuaporinas, especialmente la acuaporina 4 (AQ-4) (Zador, Z. et

al.,2009; Simard, M & Nedergaard, M. 2004).


27

1.2.5. Activación de los astrocitos

La astrogliosis o activación de los astrocitos comprende un espectro de cambios celulares

que se producen en respuesta a lesiones o a enfermedades en el SNC. Los cambios experimentados

por los astrocitos reactivos varían de acuerdo con la naturaleza y la gravedad de la lesión y se

manifiestan con una serie de alteraciones progresivas en la expresión molecular, hipertrofia celular

progresiva y en los procesos más difíciles, proliferación y la gliosis total con formación de una

cicatriz glíal (Sofroniew, M.V. 2009). Este fenómeno es típico en isquemia, eventos oxidativos y en

enfermedades neurodegenerativas como la EA (Pekny, M. & Nilsson, M. 2005; Maragakis, N.J. &

Rothstein, J.D. 2006). Aunque la astrocitosis claramente es benéfica, ya que puede lograr

encapsular procesos infecciosos y ayudar mantener la integralidad de la BHE en procesos

patológicos (Silver, J. & Miller, J.H. 2004). Ya que induce la expresión de proteínas como

trombospondinas que promueven la sinaptogénesis por lo que tiene gran potencial para favorecer

los procesos de reparación de estructuras cerebrales (Liauw, J. et al., 2008). Sin embargo, existen

muchas evidencias de que en condiciones no reguladas es también letal para el cerebro (Silver, J. &

Miller, J.H., 2004), ya que puede inducir la formación de sinapsis indeseadas que favorecen

procesos epilépticos o potencian el dolor neuropático (Boroujerdi, et al., 2008).

En la astrocitosis difusa a severa se evidencia una pronunciada sobreexpresión de GFAP y

otras proteínas relacionadas con la regulación de los procesos de hipertrofia del soma y de los

procesos, así como la proliferación astrocítica resultando en la extensión de procesos sobre los

dominios individuales de las células. Como resultado se superponen los procesos de astrocitos

cercanos con ruptura de los dominios individuales. Estos cambios pueden generar una

reorganización de la arquitectura del tejido que forma zonas densas, con barreras compactas

características de las cicatrices glíales a lo largo de las zonas de tejido necrótico (Sofroniew, M.

2009; Vinters, H. 2010).

Los astrocitos reactivos de la cicatriz glíal pueden interactuar con otras células gliales de las

vecindades y con las células fibromeningeas favoreciendo el depósito de una densa matriz de

colágeno que impide el crecimiento axonal y la migración celular. La glía madura tiende a persistir

por grandes periodos de tiempo lo que ayuda para que pueda actuar de barrera para las células

inflamatorias, agentes infecciosos y células no nerviosas como una manera de proteger el tejido de


28

los efectos de la inflamación (Silver, J. y Miller, J.H., 2004). Diferentes tipos de moléculas señal

regulan la astrogliosis entre las que se cuentan diferentes factores de crecimiento y citoquinas como

IL6, LIF, CNTF, TNF , INFc, Il1, Il10, TGF , FGF2, etc., mediadores de la respuesta inmune

innata como lipopolisacaridos (LPS) y receptores como Toll-like receptor y neurotransmisores

como glutamato y noradrenalina, purinas como ATP, especies reactivas de oxigeno (ROS)

incluyendo oxido nitrico (NO), condiciones como la hipoxia y la deprivación de glucosa, productos

asociados con neurodegeneración como PBA, moléculas asociadas con toxicidad metabólica como

NH4+ y reguladores de la proliferación celular como endotelina-1. Estas señales tienen el potencial

de alterar las actividades celulares a través de la ganancia o la pérdida de funciones y por tanto

pueden tener un impacto beneficioso o negativo en el entorno neuronal y no neuronal (Sofroniew,

M.V. 2009).

1.2.6. Neurotransmisión en Sinapsis excitatorias

La neurotransmisión en el SNC está mediada por una estrecha interacción entre las

neuronas y la glía, que se pone de manifiesto especialmente en las sinapsis excitatorias en las que el

L-glutamato es el neurotransmisor predominante (Volterra, A & Meldolesi, J. 2005). El glutamato

para la neurotransmisión es acumulado en vesículas que contienen altas concentraciones (100 mM)

y es liberado en la sinapsis por exocitosis Ca+2

dependiente. En las sinapsis el glutamato reconoce

al menos cuatro tipos de receptores que reciben su denominación de acuerdo al tipo de agonista al

que responden: los receptores ionotrópicos, AMPA, NMDA (N-metil-D-Aspartato), Kainato y los

metabotrópicos (Oliet, S.H. et al., 2001) (Fig. 3). El glutamato está involucrado en los aspectos

funcionales más importantes del cerebro como los procesos cognoscitivos del aprendizaje y la

consolidación de la memoria. También ha sido relacionado en el desarrollo de la plasticidad

sináptica y en desordenes patológicos como depresión, esquizofrenia y enfermedades

neurodegenerativas como Parkinson, Alzheimer y Huntington (Danbolt, N.C. 2001; Javitt, D.C.

2004; Daikhin, Y. & Yudkoff, M. 2000).

El glutamato como neurotransmisor proviene metabólicamente de los esqueletos

carbonados de la glucosa y de la glutamina que atraviesan la BHE y que involucran por tanto un

importante suministro glíal. Así, tanto neuronas como astrocitos y oligodendrocitos en del SNC


29

manifiestan una “dependencia” de sustratos que se sintetizan, capturan o liberan de forma que

favorecen la funcionalidad de todos los procesos de comunicación sináptica. Un ejemplo de ello lo

constituye la glutamina que está presente en plasma (500-750 M) y también puede encontrarse en

líquido cefalorraquídeo (LCR) (Stanley, B. & Prusiner, M. 1981). El glutamato es menos

abundante extracelularmente, por lo que la relación glutamato:glutamina en plasma de es 1/50.

Esta disparidad pone de manifiesto la dinámica relación entre la producción de glutamato y de

glutamina como un proceso fundamental para la fisiología celular que se conoce como el ciclo

glutamato/glutamina (Fig. 3) y en el cerebro constituye un paradigma clave para entender el

mecanismo de compartimentación entre las neuronas y la glía (Welbourne, T. et al., 2001).

En el metabolismo del glutamato a nivel del cerebro se deben tener en cuenta dos aspectos

fundamentales, el primero hace relación al control de la concentración extracelular del

neurotransmisor en el espacio sináptico, debido a que la sobre estimulación de los receptores

ionotrópicos, especialmente de tipo NMDA, llevan eventualmente al daño neuronal, fenómeno

conocido como excitotoxicidad y el segundo tiene que ver con el delicado balance en la producción

de iones amonio, cuyos excesos, también resultan en efectos deletéreos en el SNC. Para mantener

este fino mecanismo en condiciones óptimas existen principalmente dos estrategias que le permiten

al cerebro reducir estos riesgos y prevenir el daño neuronal. La primera tiene que ver con la

función de la BHE para limitar el transporte de glutamato de la sangre al cerebro y la segunda es

una estrategia de compartimentalización metabólica entre las neuronas y la glía.

La concentración de glutamato en la sinapsis es del orden de 2–5 mol/L y puede elevarse

después de la despolarización en un rango de 50-100 mol/L; este glutamato debe ser removido

rápidamente de la sinapsis empleando tres sistemas: a) tomado por neuronas postsinápticas, b)

tomado por neuronas presinápticas y c) removido por astrocitos (Daikhin, &, Yudkoff, M. 2000).

Estos tres sistemas involucran mecanismos de compartimentalización metabólica para el glutamato

que ponen de manifiesto la participación activa de una gran familia de transportadores de alta

afinidad para neurotransmisores excitatorios (EAAT). EAAT-1 y EAAT-2 en astrocitos expresados

en grandes áreas del cerebro como lóbulo frontal, corteza e hipocampo; es decir que estas zonas

particularmente activas en sinapsis glutamatérgicas cuentan con un efectivo sistema de remoción de

glutamato. EAAT-3 se expresa en terminales nerviosos, pero no es considerado un mecanismo de


30

transporte de glutamato tan importante. EAAT-4 es un transportador neuronal limitado a células de

purkinje y EAAT-5 se expresa en retina (Chan, H. & Butterworth, R.F. 1999; Zagami, C. et al.,

2005; Rose, C. 2006).

Figura 3. Representación de las principales reacciones que participan en la compartimentación del ciclo

de la glutamina. Se han reportado transportadores de alta afinidad para glutamato en astrocitos y neuronas.

Adicionalmente se encuentran transportadores de glutamina en ambos tipos de células. En el gráfico se

resaltan las principales enzimas que participan en el ciclo GS y PAG al igual que los principales receptores

para glutamato: NMDA, AMPA, Kainato y mGluR.

El glutamato contenido en el cerebro se puede encontrar en cuatro compartimentos

diferentes a) en los terminales glutamatérgicos (40-50%), b) en los terminales GABAérgicos (10%),

donde se requiere como precursor de GABA c) en los astrocitos para la síntesis de glutamina (30%)


31

y d) un compartimento multi celular en el que es usado para el metabolismo energético (20%). Una

reducción del glutamato disponible para mantener la función de las sinápsis glutamatérgicas o

GABAérgicas podría resultar en un daño en el acople excitación/inhibición, es decir; en el balance

glutamato/GABA. Una pérdida de la función astrocítica que impida la capacidad para metabolizar

el reservorio de glutamato extracelular puede disminuir la capacidad de detoxificar de iones NH4+

(Felipo, V. & Butterworth, R.F. 2000). Estos dos escenarios demuestran que debe existir un

delicado balance en la dinámica actividad metabólica en cada uno de estos compartimentos que

garantice la funcionalidad de cada sistema y que si se trastorna puede disparar un sin número de

alteraciones y estados patológicos.

En el cerebro el tráfico de glutamato y glutamina es crítico para el mantenimiento

metabólico y el reservorio de neurotransmisores. El glutamato es liberado por las neuronas en un

proceso Ca+2

dependiente que involucra la fusión de vesículas y su exceso puede ser tomado por los

astrocitos en un proceso Na+ dependiente y convertido en glutamina o en –cetoglutarato. La

conversión del glutamato hasta glutamina ocurre en presencia de ATP y NH4+

proveniente de la

sangre o del metabolismo cerebral, esta reacción es catalizada por glutamina sintetasa (GS):

Glutamato + NH4+ + ATP → Glutamina + ADP + Pi

1.2.6. 1. Glutamina Sintetasa

GS (E.C. 6.3.1.2), es una enzima presente en todas las especies y en casi todos los tejidos y

cataliza la conversión del glutamato a glutamina en presencia de ATP (Meister, A. 1985; Eisenberg,

D. et al., 2000). Diferentes estudios desde el punto de vista estructural han permitido establecer que

existen tres tipos de GS. Las enzimas bacterianas (GSI) son moléculas con 12 subunidades

idénticas y ~469 residuos organizados en dos disposiciones hexagonales enfrentadas con un sitio

activo en cada monómero y con residuos conservados en todos los tipos de GSI. La estructura del

dodecámero es mantenida principalmente por interacciones hidrofóbicas (Eisenberg, D. et al.,

2000). En el grupo de GS II, se encuentran enzimas eucariotas y de algunas bacterias. Las GS II de

mamífero son octámeros organizados con subunidades micro heterogéneas y pesos moleculares


32

entre 45 y 50 kDa y ~370 residuos (Kumada, Y. et al., 1993; Llorca, O. et al., 2006). GS Homo

sapiens (hsGS) fue purificada y está constituida por un octámero con subunidades de 44 kDa que

presenta micro heterogeneidad al presentarse diferencias pequeñas en el punto isoeléctrico (Boksha,

I. S., et al.,1995; Boksha, I. S., et al., 2000; Boksha, I. S., et al., 2002). Se han descrito GS III

típicas en cianobacterias y bacterias anaeróbicas caracterizadas como enzimas hexaméricas

compuestas por subunidades de 75 kDa (Reyes, J.C. et al., 1994).

En el cerebro GS está involucrada en el balance metabólico y el reciclaje de amino ácidos

para el normal funcionamiento del cerebro. Clásicamente esta enzima ha sido reportada

exclusivamente en los astrocitos (Albrecht, J., et al 2007; Martínez-Hernández, A. et al., 1977,

Norenberg, M. & Martínez-Hernández, A. 1979, Svenneby, G. & Torgner, I. 1987) y la actividad

de la GS está relacionada con la maduración de los mismos (Caldani, M. et al., 1982). En el adulto

la inmunoreactividad de GS está asociada con procesos astrocíticos alrededor de las sinapsis

excitatorias (Derouiche, A. & Frotscher, M. 1991, Miyake, T. & Kitamura, T. 1992). Se ha

sugerido que los niveles extracelulares de glutamato pueden regular la distribución de GS. Lo

anterior evidencia la gran importancia de estos mecanismos de compartimentalización metabólica

(Eid, T. et al., 2008: Fernandes, S.P. et al., 2010). La vida media de la enzima es relativamente

corta (13-22 horas) y los niveles de GS son altamente regulados. La expresión de GS y la actividad

son modulados por hormonas como insulina, hormona tiroidea, hormonas corticoesteroides (Kumar,

S. et al., 1986; Suárez, I. et al., 2002).

La formación de glutamina en astrocitos a partir del glutamato liberado en las sinapsis es la

base para el ciclo de la glutamato/glutamina (Fig 3.). La compartimentalización de GS en astrocitos

es consistente con la misión de reciclar glutamato, manteniendo el tráfico funcional y la ausencia de

GS en neuronas es consistente con la neurotransmisión excitatoria en condiciones normales

(Maciejewski, P.K. & Rothman, D.L. 2008); sin embargo, en condiciones patológicas como en la

enfermedad de Alzheimer (EA), se ha encontrado en neuronas piramidales de las capas 5 y 6

(Walton, H.S. & Dodd, P.R. 2007). Esta expresión alterada en condiciones patológicas muestra que

el reciclaje de neurotransmisores en la sinapsis es crítico para mantener la baja concentración del

mismo y por tanto podría funcionar como mecanismo de protección contra la sobre estimulación de

receptores, que genera excitotoxicidad en estas condiciones. La expresión neuronal de GS podría


33

resultar de un nuevo proceso de compartimentalización que se favorece en condiciones patológicas,

lo que pone de manifiesto la relevancia de GS en el mantenimiento del sistema.

La captación de glutamato en los astrocitos proveniente de la actividad sináptica es un

proceso energéticamente costoso, ya que cada molécula de glutamato es cotransportada con 3 iones

de sodio. Estos iones tienen que ser bombeados de los astrocitos en un intercambio con el potasio

extracelular, a través de la acción de la Na+/K+ ATPasa. Además, la amidación de glutamato para la

producción de glutamina es ATP dependiente, por lo cada vuelta del ciclo glutamato-glutamina se

gastan 4 ATP del metabolismo de los astrocitos; por lo tanto se requiere el acople de la utilización

de glucosa en los astrocitos a la actividad neuronal (Fig. 4) (Steele, M.L. & Robinson, S.R. 2010;

Hertz, L. et al., 1999; Pellerin, L. et al., 1998; Hertz, L. et al., 2007; Pellerin, L. & Magistretti, P.J.

2009).

En condiciones normales como el envejecimiento hay incremento de las concentraciones de

NH4+, ya que al parecer la actividad de GS decrece con la edad (Aksenova, M. et al., 1998). Este

contexto es importante para los pacientes con EA, ya que ellos muestran niveles aun más bajos de

actividad de la enzima especialmente, en las vecindades de las placas seniles y los depósitos

amiloides (Suarez, I. et al., 2002), adicionalmente se ha observado expresión neuronal de la enzima

en condiciones patológicas (Fernandes, S.P. et al., 2010; Robinson, S. R. 2000, Le Prince, G. et al.,

1995). Todos estos cambios intracelulares muy tempranos podrían ser un indicativo de daño tisular.

Adicionalmente la GS se ha encontrado reportada presente en fluido cerebro espinal (FCE) de

pacientes con diagnóstico de la EA, lo que sugiere cambios en la compartimentalización y la

expresión de la GS y metabolismo alterado o disfuncional del glutamato en EA (Tumani, H. et al.,

1999). Se ha reportado que la perdida de actividad de la GS puede estar relacionada con la

formación de radicales libres (Gunnersen, D. & Haley, B. 1992) o por susceptibilidad de la enzima

a la presencia de los mismos, sugiriéndose un daño estructural que sería responsable de la pérdida

de actividad de la GS (Suarez, I. et al., 2002). La sensibilidad de la GS a la in activación por

agentes oxidantes, que modifican su actividad generalmente se ha usado como una medida del daño

del tejido cerebral (Aksenov, M. et al., 1997; Aksenov, M. et al., 1995).


34

Figura 4. Integración de las rutas metabólicas de las neuronas y los astrocitos. Se presentan las

principales rutas de oxidación de sustratos: glucolisis, actividad del complejo piruvato deshidrogenasa (PDH),

ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) y ciclo glutamato/glutamina con algunas de las enzimas implicadas,

al igual que las reacciones oxidativas más importantes y las reacciones anapleróticas relacionadas.

La glutamina sintetasa es fundamental para el metabolismo del glutamato y la

deficiencia de esta enzima en el hipocampo se ha postulado como la causa de acumulación

extracelular del neurotransmisor, lo que en modelos murinos provoca, convulsiones recurrentes y

los cambios neuropatológicos típicos en la epilepsia del lóbulo temporal mesial (ELTM) (Eid, et al.,

2004; Wang, et al., 2006).

1.3. Péptido beta-amiloide (PBA)

La EA es la causa de demencia más frecuente en la población anciana, representando entre

un 50 % y 80 % del total de las demencias. Su forma de presentación se caracteriza por la aparición

de trastornos mentales tales como ideas de persecución, alteración de la memoria, desorientación

temporo - espacial, problemas de comprensión del lenguaje, falta de memoria y conversación

inconexa. Suele aparecer después de los 50 años y no se suele acompañar de síntomas cerebrales

tales como alteración en la marcha, coordinación de movimientos o alteraciones en los reflejos


35

(Murphy, R.M. 2007). El péptido beta-amiloide (PBA) es el principal constituyente de las placas

seniles (PS) o amiloides y los ovillos neurofibrilares (ON) lesiones encontradas en estudios

patológicos en cerebros con diagnóstico de la EA. Por tanto las alteraciones en su procesamiento

metabólico son las características más reconocidas en todas las formas de EA. El mecanismo de

auto agregación del péptido, la cinética y la formación de complejos moleculares insolubles se

conoce como la “Hipótesis amiloide” (Tanzi, R.E. & Bertram, L. 2005; Murphy, R.M. 2007). Los

ON en su mayoría compuestas por la proteína tau hiper fosforilada se encuentran intracelularmente

(Kang, J. et al., 1987) y las PS se componen de los depósitos del PBA extracelular (Roher, A. E. et

al., 1993).

El PBA se deriva de una gran glicoproteína transmembranal precursora amiloide (PPA) que

por clivajes sucesivos forma el péptido beta-amiloide que tiene 42 aminoácidos (PBA 1-42) y tiene

la siguiente secuencia H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly- Tyr- Glu- Val-His-His-Gln-

Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly- Ala-Ile-Ile- Gly-Leu-Met-Val-Gly-

Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH (Murphy, R.M. 2007). PBA 1-42 es secretado por las células neuronales y

por tanto es un producto metabólico normal presente en fluido cerebro espinal (FCE) y plasma de

individuos sanos y con EA, pero bajo ciertas condiciones, aún no bien entendidas; se origina un in

balance entre la producción y la eliminación del péptido y por tanto se genera la formación de

agregados insolubles dados por la interacción con otras proteínas (Busciglio, J. et al., 2002;

Kamenetz, F. et al., 2003). PBA 1-42 proveniente de PPA es procesado por una proteasa aspártica

BACE1 ( secretasa) que libera la fracción NH2 terminal del péptido y secretasa en un complejo

proteico con prenisilina 1 (PS1) una aspartil proteasa como núcleo catalítico, nicastrina, APH-1 y

Pen-2. Este complejo libera el COO- terminal del PBA (Haass, C. & Selkoe, D.J. 2007; Kimberly,

W.T. et al., 2003).

Los PBA autoagregados y por tanto tóxicos coexisten con las formas fisiológicas ya que

diferentes proteasas actúan sobre PBA y por tanto controlan la producción y la degradación del

mismo; neprilisina una endopeptidasa zinc dependiente degrada monómeros y pequeños péptidos

amiloides y la enzima degradadora de insulina una tiol metaloproteasa degrada monómeros. Una

sobreexpresión de ésta previene la formación de placas amiloides, mientras que una reducción de

neprisilina causa acumulación de PBA (Iwata, N. et al., 2002). En modelos murinos la deleción de


36

la enzima degradadora de insulina reduce la degradación de PBA por más de un 50% (Qiu, W.Q. et

al., 1998).

PBA 1-40 con 40 aminoácidos y secuencia: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-

Tyr-Glu-Val- His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe- Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-

Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH, se ha utilizado para diversos estudios in vivo e in vitro

de los efectos neurotóxicos y neurotróficos. Los pequeños fragmentos como PBA 12-28 y PBA 25-

35 no han sido identificados como productos del procesamiento del péptido, pero son usados para

estudiar los mecanismos de neurotoxicidad y para localizar los dominios funcionales del PBA

nativo. Es así como se han identificado los posibles sitios de interacción de PBA en las secuencias

hidrofóbicas PBA 12-28 y las secuencias anfipáticas PBA 25-35 del fragmento PBA 1-40 (Ray, W.

et al., 1998).

PBA 12-28 con la secuencia Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-

Gly-Ser-Asn-Lys, se ha demostrado que afecta la memoria de entrenamiento en ratones (Walsh, D.

et al., 2005). El fragmento C- terminal de la molécula constituido por 10 aminoácidos PBA 25-35

con la secuencia Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met, constituye el dominio funcional

responsable de efectos neurotóxicos y neurotróficos (Yang, Z. et al., 2007), así como de la

activación de astrocitos y microglía (Flood, J. et al 2004), alteración en los procesos de aprendizaje

y memoria en modelos animales (Stepanichev, M. et al., 2006).

Algunas diferencias en secuencia han sido reportadas para los péptidos de rata y humano las

cuales consisten en sustituciones en tres aminoácidos hacia la región N-terminal del PBA Arg5 →

Gly5, Tyr

10 → Phe

10, His

13 → Arg

13. Sin embargo los péptidos análogos de rata y humano han

mostrado propiedades similares como solubilidad, capacidad de agregación y formación de fibrillas

(Ray, W. et al., 1998). En la EA de la formación de placas amiloides por la acumulación

extracelular de PBAs, especialmente del PBA 1-42, juega un papel fundamental en la

neurodegeneración asociada con la enfermedad (Bartolini, M. et al., 2007; Sobow, T. et al., 2007).

En cerebros sanos PBA 1-42 es producido en concentraciones en el rango nanomolar con efectos

neurotróficos, mientras que en rangos del orden micromolar se ven favorecidos los procesos de

agregación proteica y formación de complejos insolubles de alto peso molecular presentándose los

eventos tempranos de neurodegeneración (Yang, Z. et al., 2007; Ray, I. et al., 1998).


37

Se ha reportado que los PBA 1-42, PBA 1-40, PBA 25-35 inhiben la actividad de la ATPasa

Na+, K

+ neuronal en cerebro de rata, afectando la recaptura de neurotransmisores en las sinapsis

(Gu, Q. et al., 2004; Yagyu, K. et al., 2001). Elevados niveles de glutamato, por ejemplo, causan

eventos neurotóxicos que llevan al proceso de neurodegeneración, ya que la prolongada exposición

de las neuronas al glutamato causa cambios complejos en la homeostasis celular (Cooper, A.J. &

Plum, F. 1987, Felipo, V. & Butterworth, R. 2002). El incremento en la concentración intracelular

de Ca+2

también ha sido sugerido como un posible factor neurotóxico inducido por PBA (Butterfield

D.A. 2002; Bartolini, M., et al., 2007). Otros estudios indican que la neurotoxicidad por PBAs

puede ocurrir independientemente de la excitotoxicidad por aminoácidos y parece estar

correlacionada con el estado de agregación del péptido (Murphy, R.M. 2007). Aunque la

acumulación de los PBA se observa frecuentemente en neuronas, el PBA 1-42 se ha detectado en

los astrocitos que rodean las placas amiloides y que por las condiciones en respuesta a los cambios

neuropatológicos inician la astrogliosis (Felipo, V. & Butterworth, R. 2002; Wyss-Coray, T. &

Mucke, L. 2002; Thal, R. et al., 2000).

Usando modelos in vitro se ha demostrado la interacción de GS con el fragmento PBA 1-40

y el fragmento PBA 25-35, resultando en la inactivación oxidativa de la GS y en el incremento de la

formación de radicales con el aumento de la neurotoxicidad del péptido (Butterfield, D.A. et al.,

1997). Estas observaciones sugieren que existe una relación entre la interacción de la enzima con

PBA y la formación de la placa amiloide, que podrían evidenciarse con el compromiso en la

toxicidad por NH4+ (Butterfield, D.A. et al., 1997). Se ha reportado también que los PBA facilitan

la formación de radicales libres reactivos (Atamna, H. & Frey, W. 2007). Se ha demostrado que

los PBA forman diferentes especies de radicales libres y se ha propuesto que estos son derivados

por la acción de PBA y pueden dañar las proteínas celulares causando modificaciones por

oxidación. Una explicación a este efecto neurotóxico de los PBA es que potencian el stress

oxidativo, produciendo alteraciones en la actividad de enzimas del metabolismo intermediario y

disfunción mitocondrial (Canevari, L. et al., 2004). Como se ha reportado en estudios in vitro en

los que se ha puesto en evidencia que los PBA 1-40 sintéticos interactúan con la GS y la inactivan

induciendo oxidación en la enzima pura (Canevari, L. et al., 2004, Butterfield, D.A. et al., 1997).


38

1.4. Papel de los Astrocitos en la Enfermedad de Alzheimer

La astrogliosis reactiva es un fenómeno bien conocido en EA, pero las funciones en la

enfermedad aún no son bien entendidas. Sin embargo, parece ser que está íntimamente asociada

con las vecindades de las PS en donde se deposita PBA, quizás para actuar como una barrera

neuroprotectora. Los astrocitos reactivos contienen diferentes formas de PBA, incluyendo PBA 1-

42 y se reporta que estas células pueden degradar formas extracelulares del péptido (Wyss-Coray,

T, et al., 2003; Koistinaho, M. et al., 2004), lo que sugiere un papel importante de estas células en

la acumulación y limpieza de PBA en EA y por tanto son fundamentales en la progresión de la

enfermedad. Por otra parte, PBA activa a las células glíales para producir moléculas

potencialmente neurotóxicas, tales como las especies reactivas del oxígeno (ROS) y las citoquinas

pro-inflamatorias que pueden aumentar el proceso neurodegenerativo (Akiyama, H. et al., 2000;

Agostinho, P. & Oliveira, C.R 2007).

La intensidad de la respuesta glíal está determinada por los niveles de GFAP, observándose

un reflejo de la progresión de EA, mientras que los niveles de transportadores de glutamato bajan

favoreciendo la vulnerabilidad de las neuronas a la excitotoxicidad (Simpson JE, et al., 2008).

También se encuentra incrementada la expresión de Presenilina, pero las consecuencias apenas

empiezan a ser estudiadas. Estudios realizados haciendo infusiones del PBA 1-40 en corteza

frontal e hipocampo de ratas, muestran una co-localización de la inmunoreactividad para PBA 1-40

y proteína fibrilar ácida de la glía (GFPA) marcador específico de astrocitos, que sugiere que el

péptido exógeno fue absorbido por éstas células (Matsunaga, W., et al., 2003). Adicionalmente en

cerebros de pacientes envejecidos y en pacientes con EA se encuentra inmunoreactividad asociada a

PBA en astrocitos y por la microglía cercana a las placas seniles (Burbaeva, G. et al., 2005; Wyss-

Coray, T. et al., 2003; Funato, H. et al., 1998). Se sabe que la microglía puede fagocitar PBA para

degradarlo, se plantea que los astrocitos también podrían tener una función importante en un

procesamiento del PBA para lograr su degradación (Nagele, R. et al., 2003). Otros estudios

muestran que los astrocitos parecen ser el blanco primario del PBA, mientras que los efectos

reflejados en la neurotoxicidad dependen del soporte oxidativo de los astrocitos (Reyes, A.E. et al.,

2004).


39

La función de los astrocitos en los procesos inflamatorios asociados con EA es más difícil

de dilucidar. Las placas seniles (PS) en EA son conocidas por ser asociadas con astrocitos reactivos

y forman agrupaciones en los depósitos de PBA. Los astrocitos tienen la capacidad de secretar

muchas moléculas pro-inflamatorias, como interleukinas, prostaglandinas, leucotrienos,

tromboxanos, factores de coagulación, factores de complemento, proteasas, e inhibidores de

proteasa, de forma similar a como lo hace la microglía (Reyes, A.E. et al., 2004; Akiyama, H.

2006). En estudios de microscopia electrónica en cerebros con diagnóstico de EA se revela PBA en

los procesos astrocíticos (Mitrasinovic, O.M. & Murphy G.M. 2002; Akiyama, H. 2006). Esto

sugiere que los astrocitos están involucrados con la síntesis o la fagocitosis de PBA. Otros estudios

detectan un nuevo tipo de placas difusas asociadas con astrocitos, consistentes en gránulos de PBA.

Los autores proponen que la densidad de la placa se encuentra en un balance entre la formación y

degradación. La degradación de PBA se lleva a cabo principalmente por los astrocitos y se

demostró in vitro e in situ (Yamaguchi, H. et al., 1998). Esto sugiere que el aumento en la

densidad de los astrocitos alrededor de los depósitos amiloides puede ser indicativo de una activa

fagocitosis de PBA por parte de estas células y el posible déficit en este proceso de depuración

hace parte de la patogénesis en EA. Otros estudios muestran que los astrocitos acumulan PBA

originado en las neuronas y que esto puede causar una sobrecarga de PBA en los astrocitos que

puede lisar las células y resultar en la formación de placas amiloides (Funato, H. et al., 1998).

El papel de los astrocitos en la cascada inflamatoria en la EA ha sido bien descrita

(Akiyama, et al., 2000; Tuppo, & Arias, 2005). Cuando los astrocitos son estimulados por

citoquinas como IL-1 e IL-6, que promueven el proceso inflamatorio a través de la secreción de una

variedad gama de citocinas, quimiocinas y las proteínas del complemento, así como el óxido nítrico

(Rodríguez, J.J. 2009; Dong, & Benveniste, 2001). Otros cambios fenotípicos asociados con los

astrocitos en la EA incluyen la regulación al alza de la GFAP (Beach, & McGeer, 1988), aumento

de expresión del factor neurotrófico y de S100 (Azmitia, E.C. 1992) y aumento de la expresión

de la hemo oxigenasa-1, importante marcador de estrés oxidativo (Schipper et al., 2006).


40


41

2. Hipótesis

Ho: El péptido beta amiloide interactúa con la glutamina sintetasa de cerebro de rata.

Ha: El péptido beta amiloide no interactúa con la glutamina sintetasa de cerebro de rata.

3. Objetivos

3.1. Objetivo general

Demostrar in vitro la interacción entre la glutamina sintetasa, aislada y purificada de cerebro de

rata, con diferentes fragmentos del péptido -amiloide.

3.2. Objetivos específicos

3.2.1. Extraer, purificar y evaluar la actividad enzimática de la GS aislada de cerebro de rata.

3.2.2. Establecer si existe o no la interacción de la GS con los fragmentos PBA 1-40, PBA 25-35 y

PBA 12-28, del péptido amiloide.

3. 2.3. Identificar si la interacción GS- PBA ocurre en cultivo primario de astrocitos de Rata.


42

4. Materiales

4.1. Material biológico

Se utilizaron ratas Wistar machos de seis meses de edad, suministradas por el bioterio

producción de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia. Los

animales fueron mantenidos a una temperatura entre 20º y 25º C, en cajas individuales de

policarbonato, con un ciclo luz/oscuridad 12/12 horas durante el tiempo del estudio. Se alimentaron

ad libitum con una dieta sólida estándar (10% de proteínas, 6.5% de lípidos, 8% fibra, 10% de

cenizas y 10% de humedad). Asimismo, en todo momento tuvieron acceso libre al agua. Al final se

las sacrificó por decapitación y se extrajeron rápidamente los cerebros intactos que se conservaron

en baño de hielo a 4oC hasta la preparación del extracto.

4.2. Reactivos

4.2.1. Soportes para cromatografía

Sephacryl (Sigma, S300HR), NHS-Sepharosa (Sigma, H8280), DEAE-Sepharosa (Sigma,

DFF100).

4.2.2. Péptidos

PBA 1-40 (Sigma, A1075), PBA 12-28 () y PBA 25-35 ().

4.2.3. Anticuerpos

4.2.3.1. Primarios

Anti PBA 1-40 con reactividad cruzada con PBA 12-28 (IgG generado en ratón) (Sigma, A8326),

anti PBA 25-35 (IgG generado en ratón) (Sigma A3356), Anti GS (IgG generado en conejo)

(Sigma, G2781) y Anti GFAP (IgG generado en conejo) (Sigma, G4546).

4.2.3.2. Secundarios


43

IgG (anti-conejo peroxidasa) (Sigma, A6154) e IgG (anti-ratón peroxidasa) (Sigma, A9917).

4.2.3.3. Fluorescentes

Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen), Alexa Fluor® 568 goat anti-mouse IgM

(Invitrogen), Alexa Fluor® 568 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen).

4.2.3.4. Cultivo celular

Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma, D5523), gentamicina (Sigma G1272),

anfotericina (ICN), penicilina-streptomicina (Gibco BRL, No. 10704), suero fetal bovino (SFB)

(Gibco, No. 1600-036), poli-L-lisina (Sigma, P8954), azul de tripano (Gibco, No. 15250-061),

tripsina-EDTA (Sigma, T4049) (NH4)2SO4 ().

4.2.3.5. Otros

Leupeptina (Sigma, L8511), Pepstatina (Sigma, P4265), Phenylmethylsulfonylflouride (PMSF)

(Sigma, P7626), Aprotinina (Sigma, A1153), HEPES (Sigma, H3784), γ – glutamilhidroxamato

(Sigma, ), Imidazol HCl (Sigma, 74563), Glutamina (Sigma, G3126), ácido tricloro acético (TCA)

(Sigma, 31525), ácido biccinconinico (Sigma, D8284), ácido 2,2 azino-bis (etilbenzoatizoline)-6-

sulfónico (ABTS) (Sigma, A9941), Diaminobencidina (DAB) (Sigma, D8001), Tween 20 (Sigma,

P7949), Dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma, D8418), Coomassie R (Sigma, B0149), Thioflavina T

(ThT) (Sigma T3516), Tris-HCl (Sigma, T3253), Triton X-100 (Sigma, T8787), Glicina (Sigma,

G8898)

4.2.3.6. Proteínas

Albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma, 85040C), Ovoalbúmina (Sigma, A5503 ), Tripsinógeno

(Sigma, T1143), lisozima (Sigma, L6876), beta lacto globulina (Sigma, L7880), proteína A-

Agarosa (Sigma, P7786).


44


45

5. Métodos

5.1. Purificación y evaluación de la actividad de la GS de cerebro de rata.

5.1.2. Preparación del extracto

La extracción de la enzima se realizó según el protocolo de Oliver y colaboradores (Oliver, C.

et al., 1998). En un experimento típico se procesaron aproximadamente 100 g de cerebro en 500

ml de en buffer HEPES 10 mM pH 7.4 con NaCl 137 mM, KCl 4.6 mM, KH2PO4 1.1 mM, MgSO4

0.6 mM y EDTA 1.1 mM. Al buffer se le adicionaron los siguientes inhibidores de proteasas:

Leupeptina (0.5 µg /ml), Pepstatina (0.7 µg /ml), Phenylmethylsulfonylflouride (PMSF) (40 µg/ml)

y Aprotinina (0.5 µg/ml). Posteriormente se homogenizaron en el mismo buffer y se centrifugaron

a 18.000 rpm (38.700 g) por 1 hora a 4oC. Bajo estas condiciones se obtuvo el sobrenadante que se

utilizó para el proceso de purificación de la enzima y que constituyó el extracto crudo.

5.1.3. Precipitación fraccionada con sulfato de amonio

Se midió el volumen total del extracto crudo obtenido y se precipitó con sulfato de amonio

((NH4)2SO4) en el rango de 0% a 20% de saturación, luego se dejó reposar durante toda la noche y

se centrifugó a 18.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante 20%s se precipitó nuevamente

hasta completar 60%s (rango 20% a 60%s), repitiendo el proceso anterior. Se obtuvieron entonces

al final dos precipitados 20%s y 60%s y un sobrenadante del 60%s que fueron dializados contra

agua desmineralizada y luego contra el buffer HEPES pH 7.4 a 4oC durante toda la noche. Los dos

primeros fueron re suspendidos en buffer HEPES. Posteriormente en una alícuota de cada

dializado, se determinó la concentración de proteína por el método del ácido bicinconinico (Smith

P. K. et al.. 1985) y se determinó la actividad específica (Miller, R. E. et al., 1978).

Al final la fracción de mayor actividad se concentró por ultrafiltración utilizando una celda

de Amicón con una membrana de tamaño de poro (Cut-off) de 100 kDa a fin de separar las

proteínas de menor peso molecular. Para esto se utilizó una presión de nitrógeno de 10 p.s.i, la

solución se mantuvo en agitación constante a 4oC.


46

5.2. Ensayos para la identificación de la enzima en cada paso del proceso

de purificación

5.2.1. Determinación de la actividad enzimática

La actividad de la GS, se evalúo en todos los pasos durante el proceso de extracción como un

indicativo de la eficiencia del proceso y de la pureza de la enzima. La GS cataliza la síntesis de

glutamina a partir de NH4+ y glutamato mediante una reacción biosintética. Pero también puede

catalizar la reacción no fisiológica de transferencia:

1) ADP + L-Gln + NH2OH γ - glutamilhidroxamato + NH4+

+ AMP + Pi

La GS se evaluó por la reacción 1, que determina la actividad transferasa de la enzima (Miller, R.E.

et al., 1978). 1 ml de una solución de Imidazol-HCl 50 mM (pH 6.8), NH2OH 50 mM, glutamina

100 mM, arsenato de potasio 25 mM, ATP 0.2 mM y MnCl2 0.5 mM. A esta solución se le

adicionaron 50 l del extracto de la enzima y se incubó por 15 minutos a 37 oC. Para detener la

reacción se adicionó 1 ml de solución de Fe2Cl3 0.37 mM, TCA 0.3 mM y HCl 0.6 M. Se

centrifugó durante 10 minutos a 5000 r.p.m. a temperatura ambiente y el producto de la reacción se

cuantificó por espectrofotometría a 492 nm usando una curva patrón del producto γ–

glutamilhidroxamato.

5.2.2. Determinación de la cantidad de proteína

A todas las fracciones obtenidas se les determinó la concentración de proteína por el

método del ácido bicinconinico (Smith P. K. et al., 1985).

5.2.3. Ensayos de ELISA

Se sensibilizaron placas de 96 pozos con distintas fracciones, siguiendo el método de Vega

(Vega, N. A. 2004) con las siguientes modificaciones. Para las determinaciones se colocó 1 g de

proteína por pozo en buffer carbonatos 0.1 M pH 9.6 por 3 horas a 37oC y durante toda la noche a

4oC. Se bloqueó con PBS-BSA 1.3%, luego se incubó con 100 l de IgG anti-GS (1:5000)

(generado en conejo) durante 1 hora a 37oC. Se incubó con 100 l de IgG (anti-conejo peroxidasa)

(1: 1000). Posteriormente se reveló con ácido 2,2 azino-bis (etilbenzoatizoline)-6-sulfónico


47

(ABTS). Al final se leyó la absorbancia a 405 nm en un lector de micro placa BioRad Modelo 550

a los 30 minutos. En cada paso se hicieron tres lavados con PBS-Tween 0,1%.

5.2.4. DOT-BLOT

diferentes fracciones, luego se dejó secar una hora a temperatura ambiente. La membrana se

bloqueó con PBS-BSA 1.3% agitando una hora a temperatura ambiente. Posteriormente se incubó

con IgG (anti-GS generado en conejo) (1:5000) en PBS-BSA 1.3% durante 1 hora a 37oC. Luego se

adicionó anticuerpo secundario IgG (anti-conejo peroxidasa) (1: 1000) en PBS-BSA 1.3% y se dejó

en agitación 1 hora a temperatura ambiente. Se reveló con una solución de 50 mg de

Diaminobencidina (DAB) en 100 ml de PBS y 10 l de H2O2 al 30%. La reacción se detuvo con

agua desionizada. En cada paso se hicieron tres lavados con PBS-TWEEN 0,1%.

5.2.5. Electroforesis

Todas las fracciones recogidas en los diferentes ensayos, previamente dializadas contra

NH4HCO3 20 mM se separaron por SDS-PAGE analítica. La preparación de los geles de

electroforesis se realizó según Laemmli (Laemmli, U.K. 1970); se usaron geles T12 C2.5 de

separación y T5 C2.5 para concentración. En cada pozo se sembraron 25 g de proteína disuelta en

5 l de NH4HCO3 20 mM más 5 l de buffer muestra en condiciones no reductoras. Como tampón

de corrida se utilizo Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8.8. La electroforesis se corrió a 150 V

durante hora y media. Luego de la corrida, los geles se fijaron y se colorearon con solución de

Coomassie R 250 0.1% por 3 horas.

5.3. Ensayos Cromatográficos

5.3.1. Cromatografía de exclusión molecular

5.3.1.2. Curva de calibración de la columna

Para determinar el peso molecular aproximado del complejo enzimático durante los ensayos

de exclusión molecular se procedió de la siguiente manera: se midieron los volúmenes de elución de

cuatro proteínas patrón: IgY (170 kDa), BSA (66 kDa), Ovoalbúmina (45 kDa) y Tripsinógeno (24


48

kDa), con los cuales se construyó la curva de calibración y se determinó el volumen muerto con

azul de dextrano.

5.3.1.3. Condiciones de corrido

20 mg de proteína obtenidos de la fracción de ultra filtración se hicieron pasar por una

columna de Sephacryl S-300 (96 cm x 1.5 cm) equilibrada previamente con buffer HEPES pH 7.4 e

inhibidores de proteasa. Se recogieron fracciones de 2 ml que fueron leídas a 280 nm, una vez

obtenido el perfil cromatográfico se separaron las fracciones, y se concentraron por liofilización.

Posteriormente se determinó la concentración de proteína y la actividad específica en una alícuota

de cada fracción. Al final se recuperaron las fracciones de mayor actividad que se dializaron contra

NH4HCO3 20 mM y se congelaron para ser separadas por electroforesis analítica.

5.3.2. Cromatografía de Intercambio Iónico

25 mg de la fracción rica en GS proveniente de filtración en gel se hicieron pasar por una

resina de intercambio aniónico DEAE-Sepharosa (42 cm x 1.5) previamente equilibrada con

HEPES pH. 7.4 e inhibidores de proteasa. Se recogieron las fracciones no retenidas

(aproximadamente 100 ml) con buffer de equilibrio. Luego fueron eluídas las proteínas retenidas

en la columna con buffer HEPES pH 7.4 usando un gradiente discontinuo de NaCl 0.2 M y 0.5 M.

Se evaluó la actividad y se hicieron ensayos de ELISA para identificar la fracción en la que se

encontraba presente GS. Se estableció la fracción retenida en la que estaba presente la enzima y

posteriormente se eluyó siempre con buffer HEPES pH 7.4 NaCl 0.2M donde se identificó la

presencia de GS.

5.3.3. Cromatografía de Afinidad sobre Péptido beta amiloide (PBA 1-40).

Las fracciones de mayor actividad obtenidas de la cromatografía de intercambio se pasaron

por una columna de Sepharosa activada con N-Hidroxisuccinimida (NHS) a la cual previamente se

le acopló el fragmento de 40 aminoácidos del Péptido beta amiloide (PBA 1-40).

5.3.3.1. Preparación del soporte

1 ml de Sepharosa NHS se centrifugó durante 3 minutos a 3000 r.p.m. con el fin de

descartar el isopropanol y se lavó con 10 volúmenes de una solución fría de HCl 1 mM antes de su

uso. Se disolvió el PBA 1-40 (4.5 mg) en 1 ml de Dimetil sulfóxido (DMSO) y se mezcló con 1 ml


49

de soporte. Se dejó en agitación para lograr el acople durante 24 horas a temperatura ambiente.

Después del acople se inactivaron los grupos que no reaccionaron agregando una solución de

etanolamina 0.5M, NaCl 0.5M a pH 8.3. Al final el soporte se equilibró con HEPES pH 7.4 e

inhibidores de proteasa. En cada paso se centrifugó durante 3 minutos a 3000 r.p.m., todos los

sobrenadantes se descartaron excepto el PBA 1-40 no acoplado que se utilizó para determinar la

eficiencia del acople determinando la concentración final del péptido en esta solución. El soporte

PBA1-40- Sepharosa se colocó en una mini columna y se sembraron 10 mg de proteína que se

corrieron con buffer HEPES pH 7.4 e inhibidores de proteasa. Se recogió la fracción no retenida y

posteriormente se eluyeron las proteínas retenidas usando el mismo buffer con una adición de NaCl

2M. De la fracción retenida se recogieron volúmenes de 500 l. Al final se recuperaron las

fracciones de mayor actividad que se dializarán contra NH4HCO3 20 mM y se congelaron para ser

separadas por electroforesis.

5.3.3.2. Cromatografía de Afinidad usando glutamato

Las fracciones activas de la cromatografía de intercambio también se hicieron pasar por un

soporte Sepharosa NHS a la cual se le acopló L-glutamato, de acuerdo con el protocolo de

Hermanson (30) con las siguientes modificaciones en la preparación del soporte: se tomaron 2 ml

de sepharosa NHS que se centrifugaron durante 3 minutos a 3000 r.p.m. a fin de descartar el

isopropanol. Posteriormente se lavó con 10 volúmenes de HCl 1mM. Se preparó la solución de

acople en PBS pH 7.4 que contenía glutamato 2.2 M, luego que se mezcló con el soporte. Se dejó

en agitación por 24 horas a temperatura ambiente para lograr el acople. Posteriormente se

inactivaron los grupos que no reaccionaron con una solución de etanolamina 0.5M, NaCl 0.5M a

pH 8.3. Al final el soporte se lavó con buffer HEPES pH 7.4 e inhibidores de proteasa. En cada

paso se centrifugó durante 3 minutos a 3000 r.p.m., todos los sobrenadantes se descartaron excepto

el glutamato no acoplado que se utilizó para determinar la eficiencia del acople determinando la

concentración final del aminoácido en la solución usando la reacción con ninhidrina. Al final el

soporte activado se empaco en una columna (2 x 1 cm). Al soporte Glutamato-Sepharosa se le

sembraron 10 mg de proteína que se corrieron con buffer HEPES pH 7.4 e inhibidores de proteasa.

Se recogió la fracción no retenida y posteriormente se eluyeron las proteínas retenidas usando

buffer glicina pH 2.5, se recogieron volúmenes de 500 l durante ésta elución y para evitar la

desnaturalización de la proteína se recibieron siempre sobre en un buffer glicina pH 10.8 hasta


50

lograr la neutralización. La fracción retenida se dializó contra NH4HCO3 20 mM. Se determinó

concentración de proteína y actividad específica. Al final se recuperaron las fracciones de mayor

actividad que se dializarán contra NH4HCO3 20 mM y se congelaron para ser separadas por

electroforesis.

5.4. Caracterización de la enzima

5.4.1. Western Blot

Se corrió la electroforesis SDS-PAGE como se mencionó en 5.2.5. Posteriormente se hizo

la transferencia de las proteínas en una membrana de nitrocelulosa por 30 minutos usando una

cámara semi seca en las siguientes condiciones finales 12 voltios, 78 mA. Al terminar la

transferencia la membrana se bloqueó con PBS-BSA 1.3% por una hora a temperatura ambiente y

luego se incubó con IgG (anti-GS generado en conejo) (1:5000) en PBS-BSA 1.3% durante 1 hora a

37oC. Luego se adicionó anticuerpo secundario IgG (anti-conejo peroxidasa) (1: 1000) en PBS-

BSA 1.3% y se dejó en agitación 1 hora a temperatura ambiente. Se reveló con una solución de 50

m 2O2 al 30%. La reacción se detuvo

con agua desionizada. En cada paso se hicieron tres lavados con PBS-TWEEN 0,1%.

5.5. Generación de los complejos GS-PBA

5.5.1. Obtención de los Péptidos

El fragmento PBA 1-40 fue adquirido comercialmente de Sigma-Aldrich (A -1075) y los

fragmentos peptidicos PBA 12-28 y PBA 25-35 fueron sintetizados por el grupo funcional de

química de la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia FIDIC. Los péptidos se sintetizaron

siguiendo protocolos para síntesis controlada de péptidos mediante las estrategias Fmoc/tBu y la

Boc/Bzl, denominadas así según esté protegido el grupo alfa-amino de los aminoácidos; con el

grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o con el grupo ter-butiloxicarbonilo (t-Boc) y sus cadenas

laterales con el grupo t-butilo y/ó con el grupo bencilo, respectivamente (Montalbetti, C. y Falque,

V. 2005). El grupo Fmoc es removido por tratamiento con piperidina al 25%, así se obtiene el

grupo amino libre para el acople del siguiente aminoácido. Las reacciones de acople de los

aminoácidos se realizan por activación del grupo carboxi del aminoácido entrante, el cual se


51

encuentra protegido, con activadores como diciclohexilcarbodiimida (DCC). El producto de la

reacción entre el aminoácido protegido y la carbodiimida, es una primera especie reactiva O-

acilurea; si otra molécula de aminoácido reacciona con la O-acilurea se forma el anhídrido simétrico

correspondiente que es una especie bastante reactiva y permite la rápida formación del enlace

peptídico (Montalbetti, C. y Falque, V. 2005). El control de calidad de los péptidos sintetizados de

esta forma se efectuó por cromatografía RP-HPLC y Espectrometría de Masas MALDI-TOF.

5.5.2. Ensayos de Agregación o formación de complejos GS-PBA

Para estos ensayos se empleó el método descrito por Frangione y colaboradores (Frangione,

B. et al., 1996) con las siguientes modificaciones: se utilizaron soluciones stock de 1.0 mg/ml de

los péptidos PBA 1-40, PBA 12-28 y PBA 25-35 en DMSO. Alícuotas de 50 μg se congelaron a -

20oC y se liofilizaron. Adicionalmente, alícuotas de 50 μg de GS previamente dializadas contra

NH4HCO3 20 mM se congelaron y liofilizaron. Para la incubación se resuspendieron los péptidos y

la enzima en una solución de Tris-HCl 0.1 M pH 7.4.

Las incubaciones se realizaron con 5 μg de cada péptido y 50 μg de GS en cada caso, por 24

horas a temperatura ambiente. Paralelamente se hicieron controles de los péptidos solos para

determinar la auto agregación, la GS sin los péptidos y un control con BSA con y sin los diferentes

fragmentos del péptido PBA.

La detección de los agregados formados se hizo mediante ensayos de fluorescencia con Thioflavina

T (ThT) (Sigma T3516), para lo cual se utilizó el método descrito por Levine (LeVine, H. 1993). A

las muestras incubadas en los experimentos de agregación se les adicionaron una solución de

Glicina 50 mM pH 9.2 y thioflavina T 2 µM en un volumen final de 2 ml. La fluorescencia se midió

con una longitud de onda de excitación de 435 nm y 485 nm para la emisión. Una solución de

thioflavina T 2 µM se uso como control de fluorescencia de fondo. Todos los experimentos se

realizaron por triplicado. (ThT) es una molécula usada para la determinación de fibras amiloides in

vitro. En ausencia de fibras amiloides la fluorescencia es baja: excitación y emisión máxima es 350

nm y 438 nm respectivamente. En presencia de fibras amiloides, la fluorescencia es mayor y la

excitación y emisión máxima es 450 nm y 482 nm respectivamente. El cambio de fluorescencia es

lineal de 0 a 2.0 µg/ml fibras amiloides (Naiki, H. et al., 1990).

5.5.2.3. Caracterización de los complejos GS-PBA


52

Los experimentos de formación de complejos GS-PBA (GS vs PBA 1-40, PBA 12-28 y PBA 25-

35) obtenidos en los ensayos anteriores se separaron por electroforesis en condiciones nativas en un

gel de poliacrilamida T10 y C2.5 y transferidos a una membrana de nitrocelulosa utilizando las

condiciones descritas en 5.4.1. Luego las membranas se bloquearon por 1 hora con PBS-BSA

1.3%, luego se incubaron con el anticuerpo contra el PBA (IgG generada en ratón) por 1 hora a 37

oC y toda la noche a 4

oC. Después se incubó con el anticuerpo secundario (anti-ratón peroxidasa).

Al final se reveló con una solución de 50 mg de DAB en 100 ml de PBS y 10 l de H2O2 al 30%,

para detener la reacción se uso agua desmineralizada (Frangione, B. et al., 1996). En cada paso se

realizaron tres lavados con PBS-TWEEN 0.1%.

5.6. Interacción in vitro GS-PBA

5.6. Ensayo de ELISA indirecto GS vs. PBA

A partir de una solución de 1mg/ml de los péptidos PBA 1-40, PBA 25-35 y PBA 12-28 en

DMSO se fijaron sobre placas para Elisa de 96 pozos Nunc Maxisorp F-16. 1 g, 5 g y 10 g de

cada péptido en buffer carbonatos 0.1 M pH 9.6 hasta completar un volumen de 50 l. Se

incubaron durante 3 horas a 37ºC y toda la noche a 4oC. Se bloquearon PBS-BSA (1.3%) en un

volumen final de 100 l por pozo durante 1 h a 37 oC. Luego se retiró la solución de bloqueo y se

incubaron con 50 g de GS hasta completar un volumen final de 100 l por pozo en PBS durante

toda la noche a 4 oC. Posteriormente se incubó con el anticuerpo primario IgG- generado en conejo

dirigido contra la GS 1:5000 en PBS-BSA (1.3%) 1 h a 37 oC y toda la noche a 4 oC.

Posteriormente se incubó el segundo anticuerpo (anti conejo peroxidasa) 1:1000 en PBS-BSA

(1.3%) 1 h a 37 oC. Para el revelado se adicionaron 100 l por pozo de una solución de azino-bis

2.2 (ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico) (ABTS) 0.3 mg/ml en buffer citrato-fosfato pH 5.0. En

el momento de sembrar se agregaron 5 l de H2O2 al 30% por cada 10 ml de solución, se mantuvo

en la oscuridad y se leyó a los 30 minutos con un filtro de 405 nm. En cada paso se realizaron tres

lavados agregando 100 l por pozo de PBS-TWEEN 0.1%. En todos los experimentos se tuvieron

en cuenta los siguientes controles a) Omitir la incubación con PBAs, b) Omitir la incubación con el

anticuerpo contra GS y c) Omitir la incubación con el anticuerpo secundario.

5.6.1. Cultivo primario de astrocitos de rata


53

Para los cultivos primarios de astrocitos se utilizaron cerebros de neonatos de rata Wistar de

un día de vida. La edad gestacional de la rata se controló limitándose a una noche el tiempo de

cohabitación de ratas vírgenes con machos. A las 9 horas de la mañana del día siguiente se

separaron. El período de gestación es de 21.7 días. Los neonatos de 1 día de vida postnatal se

utilizaron para la preparación del cultivo primario de astrocitos (Kimelberg, 1983; McCarthy & De

Vellis, 1980).

5.6.2. Composición y preparación de las disoluciones.

5.6.2.1. Solución de Earle (EBS).

Esta solución se empleó para sumergir los cerebros extraídos en el proceso de disgregación y

tripsinización y contiene: NaCl 116 mM, KCl 5.4 mM, NaH2PO4.H2O 1.0 mM, MgSO4.7H2O 1.5

mM, NaHCO3 26 mM, Rojo fenol 10 mg/L y D-Glucosa 14 mM. Esta solución concentrada 2

veces se ajustó a pH 7.2 y se guardó a -20°C (Saneto, 1987).

5.6.2.2. Solución de disgregación (Solución A):

Se tomaron 50 ml de la solución de EBS concentrada y se diluyó con 50 ml de agua ultrapura

(314 mOsm/kg H2O), además se le adicionó albúmina (Fracción V) 0.3%, DNasa tipo I 20 µg/ml y

al final se ajustó el pH a 7.6.

5.6.2.3. Solución de tripsinización (Solución B)

En 50 ml de solución A se adicionaron Tripsina 0.025% y DNasa tipo I 60 µg/ml. Estas

soluciones se esterilizaron por filtración con membrana (0.22 µm).


54

5.6.3. Medio de cultivo.

Se empleó un medio sintético producido comercialmente para el mantenimiento de las células

in vitro en monocapas. El medio DMEM (Sigma, D-5523) (316 mOsm/kg H2O ± 5%) se le

adicionó bicarbonato de sodio anhidro (3.7 g/L). Una vez se ajustó el pH a 7.2 (Chesler, 1990), el

medio se esterilizo por filtración (0.22 µm) y se le adicionó una mezcla de antibióticos que

incluyen: gentamicina (4 mL/L), penicilina + estreptomicina (50 l/L), anfotericina (25 l/L) y se

almacenó en el refrigerador.

5.6.4. Suero.

El empleo del suero es importante y en cultivos de astrocitos particularmente es crucial, pues

los espongioblastos pueden generar oligodendrocitos y no astrocitos si no se adiciona suero al

medio (Ishii, 1992; Van Der Pal, 1990; Cole, 1989). Al medio Eagle modificado por Dulbecco

(DMEM) se le adicionó suero fetal de bovino (FBS), a una concentración del 10% (Tabernero,

1993; Kimelberg, 1983).

5.6.5. Recubrimiento de los frascos Roux con poli-L-lisina.

La poli-L-lisina se uso como un adherente entre las placas y las células (Saneto, 1987a)

favoreciendo además, la agregación celular (Vernadakis, 1988). La disolución de poli-L-lisina se

preparo a partir del producto comercial (estéril), en agua ultrapura. Los frascos tipo Roux para

cultivo se recubrieron con poli-L-lisina (1 µg/cm2

) y se dejaron 15 minutos a 37°C en la incubadora

de CO2. Posteriormente, se retiro el exceso de poli-L-lisina y se lavaron dos veces con agua

ultrapura. Finalmente, se adicionó la mitad del volumen final de DMEM + FBS al 10%. Este

proceso se debió realizar 24 horas antes de la siembra de las células.

5.6.6. Preparación del cultivo primario de astrocitos.

Para la realización del cultivo primario de astrocitos se emplearon neonatos de rata de 1 día

de vida postnatal (Cole, 1989; Saneto, 1987; McCarthy & De Vellis, 1980; Schousboe, 1980). Todo

el proceso se realizó en condiciones de esterilidad bajo cabina de flujo laminar y a temperatura

ambiente. Los animales se limpiaron con etanol (70%), se decapitaron y se extrajeron los cerebros

(sin cerebelo ni bulbo), de los cuales se retiraron las meninges y los vasos sanguíneos visibles


55

(Saneto, 1987). Los cerebros de 20 neonatos se colocaron en una placa Petri que contiene solución

de disgregación A. El tejido se fracciono mecánicamente utilizando un bisturí estéril y luego se

centrifugó durante 2 minutos a 1800 rpm. El tejido fraccionado se incubó, durante 15 minutos a

37°C, en un baño con vaivén de 80 ciclos/min, con la solución de tripsinización B. Posteriormente,

para inhibir la tripsinización, la suspensión se colocó a un tubo que contiene DMEM con SFB 10%

y la mezcla de antibióticos.

Finalizada la tripsinización, se centrifugó el tejido durante 5 minutos a 1800 rpm y se extrajo

el medio con vacío. Una vez retirado el sobrenadante, se resuspendió el tejido en 7 ml de la solución

A y se hizo pasar varias veces a través de una pipeta Pasteur. Luego se recogió el sobrenadante y el

tejido se sometó tres veces al mismo tratamiento anterior. Al final se colectaron los sobrenadantes

y se centrifugaron a 1800 rpm durante 5 minutos. Las células obtenidas se resuspendieron en 20 ml

de DMEM, suplementado con SFB 10% y la mezcla de antibióticos. Una pequeña alícuota de esta

suspensión celular se mezcló, en partes iguales, con azul de tripano 0.2% para la determinación de

la viabilidad celular y número de células. La suspensión celular inicial se diluyó con el medio

anterior para conseguir una solución con una concentración de 1x106

células/ml recomendada para

la siembra (Tabernero, 1993).

A continuación se sembraron las células en frascos Roux recubiertos con poli-L-lisina y se

colocaron en la incubadora a 37°C con un 5% de CO2 (McCarthy y De Vellis, 1980). Los cambios

de medio se realizaron 2 veces por semana con medio que contiene SFB al 10% (Hertz, 1982). Los

frascos con cultivos quiescentes de astrocitos después de 9 días de cultivo se destinaron a los

experimentos de incubación con los péptidos y para los ensayos de CELISA. Para lo cual se

desprendieron de la placa y se tripsinizaron se prepararon retirando el medio de cultivo anterior,

lavando dos veces con PBS y luego se adicionaron los medios de incubación DMEN libre de suero

y los péptidos.

5.6.7. Incubación de los péptidos

Los astrocitos que se tripsinizaron se siembraron en placas de 96 pozos recubiertos

previamente recubiertos con poli-L-lisina, con una densidad de 10000 células por pozo. Las células

fueron mantenidas por 24 horas con DMEN suplementado con suero fetal bovino (SFB) a fin de que

se adhirieran a la placa. Posteriormente se les retiró el medio con suero y se dejaron 24 horas más


56

en DMEN libre de suero. Posteriormente, a las células se les adicionaron los péptidos PBA 1-40,

PBA 12-28 y PBA 25-35 a diferentes concentraciones 0.5 M, 1 M y 5 M y se incubaron durante

24 horas a 37°C con un 5% de CO2. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.


57

5.6.7.1. Ensayo de CELISA

Las células se fijaron después de las 24 horas, eliminando el medio y agregando 100 l por

pozo de paraformaldehido al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego se

lavaron con PBS y se protegió la monocapa de células con gelatina al 1% en agua desmineralizada

que se retiró inmediatamente, luego se congelaron a 0°C por 10 minutos. Para permeabilizar las

células se colocaron 100 l de Triton X 100 1% por 30 minutos a temperatura ambiente, para

inactivar la peroxidasa endógena se uso una solución de metanol al 10% y peróxido de hidrógeno al

0.3 % en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se bloqueó con PBS-BSA al

1.3% 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó la incubación con el anticuerpo primario dirigido

contra el PBA (IgG generado en ratón) en PBS-BSA 1.3% en una dilución 1:500. Luego se incubó

el segundo anticuerpo (IgG anti-ratón peroxidasa) 1:1000 en PBS-BSA 1.3%, 1 h a 37oC. En cada

paso se hicieron tres lavados con PBS por 5 minutos. Para el revelado se sembraron 100 l por

pozo de una solución de ABTS 0.3 mg/ml en buffer citrato-fosfato pH 5.0. En el momento de

sembrar se agregaron 5 l de H2O2 al 30% por cada 10 ml de solución, se protegió la placa en todo

momento de la luz y se leyó a los 30 minutos con un filtro de 405 nm.

5.7. Inmuno-precipitación de GS

Los complejos GS-PBA1-40 obtenidos en 4.5.1. fueron utilizados para la inmuno-

precipitación. Una alícuota de 100 µl de cada complejo se mezcló con una solución PBS-BSA

1.3% y anticuerpo contra GS (IGg generado en conejo) 1:5000 y se incubó toda la noche. El

complejo inmune se precipito con 20 µl de la proteína A unida a perlas de agarosa. Para separar los

complejos inmunes formados se centrifugó a 12000 rpm y se descarto el sobrenadante. Estos

complejos se sometieron a múltiples lavados con buffer RIPA con NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM

pH: 7,4; EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, Triton X-100 1%, se centrífugo en cada caso en las mismas

condiciones anteriores. Los sobrenadantes fueron usados para electroforesis y posterior

transferencia a una membrana de nitrocelulosa.

Las membranas se bloquearon con PBS-BSA 1.3% y se dejaron en agitación 1 hora a

temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron con el anticuerpo contra PBA (IgG Anti-ratón)

1:500 en PBS-BSA 1.3% 1 hora a temperatura ambiente. Luego se incubo con el segundo

anticuerpo (IgG Anti-ratón- Peroxidasa) en una dilución 1:1000 en PBS-BSA 1.3% que se dejó en


58

agitación 1 hora a temperatura ambiente. Para el revelado se agregó una solución de 50 mg de

diaminobenzidina (DAB) en 100 ml de PBS y 10 l de H2O2 al 30%, se detuvo la reacción con agua

desmineralizada.

5.8. Inmunocitoquímica directa

Los astrocitos obtenidos como se indico en 5.6.7. Después de 9 días de crecimiento in vitro

se utilizaron para los experimentos de inmunocitoquímica. Para lo cual se tripsinizaron las células

que se sembraron en placas de 12 pozos con una densidad de 2500 células por pozo, sobre una

laminilla cubre objetos previamente esterilizada. 24 horas después una vez las células fueron

adheridas a la placa y en una confluencia del 90% se incubaron con los diferentes fragmentos PBA

1-40, PBA 12-28 y PBA 25- M y se incubaron

durante 24 horas a 37°C con un 5% de CO2.

Para el estudio inmunocitoquímico se fijaron las células retirando el medio y agregando 500

l de paraformaldehído al 4% en PBS por 20 minutos a temperatura ambiente. Luego se protegío la

monocapa celular con gelatina al 1% en agua desmineralizada que se retiró inmediatamente y se

congeló a 0°C por 10 minutos. Para permeabilizar las células se utilizó una solución de Triton X

100 al 1% por pozo por 30 minutos. Posteriormente se inactivó la peroxidasa endógena con una

solución de metanol al 10% y peróxido al 0.3% en PBS, durante 30 minutos. Se bloqueo con PBS

BSA 1.3% al durante 1 hora a 37 oC. Luego se incubaron las láminas con los anticuerpos IgG

generada en conejo (Reconoce fragmento PBA 1-40 y fragmento PBA 25-35) (A8326 Sigma

aldrich) en PBS BSA 1.3% una dilución 1:500 para los tratamientos con los péptidos

correspondientes, IgG generada en ratón (Reconoce fragmento PBA 12-28) (A8978 Sigma aldrich)

en PBS BSA 1.3% una dilución 1:500 para el tratamiento con PBA 12-28. Como control de pureza

del cultivo se utilizó IgG generada en conejo (Reconoce Proteína fibrilar ácida de la glía marcada

GFAP) (G9269 Sigma aldrich) en PBS BSA 1.3% una dilución 1:5000, 1 hora a temperatura

ambiente en todos los casos. Posteriormente se incuban todas las láminas con IgG generada en

conejo (Reconoce GS) en PBS BSA 1.3% una dilución 1:5000.

Entre cada paso se hicieron tres lavados, excepto en los pasos de proteger la monocapa,

permeabilizar y sembrar los péptidos. Se realizaron los siguientes controles: a) Omitir la

incubación con los péptidos, b) Omitir la incubación con el anticuerpo primario correspondiente.


59

Los anticuerpos fluorescentes que se usaron fueron Alexa fluor® 488 goat anti-rabbit IgG

(Invitrogen) en PBS BSA 1.3% 1:1000 en todos los casos en los que se utilizó anticuerpo que

reconoce GS. Alexa Fluor® 568 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen) en PBS BSA 1.3% 1:1000 en

todos los casos en los que se utilizó anticuerpo que reconoce PBA 1-40 y PBA 25-35 y Alexa

Fluor® 568 goat anti-mouse IgM (Invitrogen) en PBS BSA 1.3% 1:1000 en todos los casos en los

que se utilizó anticuerpo que reconoce PBA 12-28. Para el control de GFAP se utilizo Alexa

Fluor® 568 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen) en PBS BSA 1.3% 1:1000. Antes de la incubación

con el segundo anticuerpo y el anticuerpo secundario se hicieron tres lavados con PBS y se bloquo

nuevamente con PBS-BSA 1.3%.

Al final se realizaron los montajes húmedos con glicerol-PBS 1:1 y se visualizaron por microscopia

confocal.

5.9. Análisis estadístico

Todas las pruebas estadísticas correspondieron al empleo de descriptores de medida de

tendencia central y comparaciones entre experimentos se realizaron con el programa Statistica

6.0®.


60


61

6. Resultados y Discusión

6.1. Purificación y evaluación de la actividad de la GS de cerebro de rata.

En un experimento típico (que se repitió varias veces) a partir de 100 g de cerebro

aproximadamente (proveniente de 50 ratas) se prepararon 550 ml de extracto que se centrifugaron a

18000 r.p.m. descartándose 50 ml de precipitado. El sobrenadante con proteínas solubles

constituyó el extracto crudo que se sometió a diferentes procesos de purificación.

6.1.2. Ensayos de precipitación fraccionada

Se tomó el extracto crudo y se precipitó utilizando sulfato de amonio (NH4)2SO4. A 500 ml

de extracto crudo se le adicionaron 56.5 g de (NH4)2SO4 hasta alcanzar una saturación inicial del

20%s. Después de centrifugar y obtener el sobrenadante se agregaron 130 g de (NH4)2SO4 hasta

alcanzar el 60%s. Se obtuvieron dos precipitados, uno en el rango 0-20%s, otro del 20-60%s y un

sobrenadante final del 60%s. Tanto los precipitados como el sobrenadante fueron dializados dos

veces contra agua desmineralizada y dos veces contra buffer HEPES pH 7.4 con inhibidores de

proteasa. Se tomaron alícuotas de estos para realizar las determinaciones de proteína y actividad

obteniéndose los datos de la Tabla No. 1.

Tabla No. 1. Diferentes fracciones precipitadas con (NH4)2SO4. Se muestra la concentración de proteína,

la actividad específica y el volumen total de las fracciones obtenidas.


62

Los resultados de la tabla 1 muestran que el extracto crudo presenta una actividad específica

inicial de 2.6 U/mg. En los ensayos de precipitación fraccionada se observó que en la fracción

(NH4)2SO4 0-20%s se obtienen 16.5 mg de proteína pero sin actividad específica para GS. En el

precipitado con (NH4)2SO4 20-60%s se recuperó una mayor cantidad de proteína, 263.2 mg y la

enzima presentó actividad, lo que sugiere que GS precipita en este rango dado que la actividad

específica obtenida es mayor que en el extracto crudo. No se encontró actividad específica para el

sobrenadante del 60%s. La fracción precipitada en el rango 20-60% s se resuspendió en 200 ml de

buffer HEPES pH 7.4 y posteriormente se concentró 5 veces por ultrafiltración en una celda de

Amicón utilizando una membrana con límite de exclusión de 100 kDa.

Estos resultados están de acuerdo con rangos de precipitación reportados en trabajos

anteriores de Tiemeier y Milman (1972) quienes proponen una precipitación en el rango del 30-

55%s. Sin embargo, nuestros datos muestran presencia de la enzima en la fracción del 20%s hasta

el 60%s. Adicionalmente, se evidencia que la actividad específica en la fracción (NH4)2SO4 20-

60%s es mayor que la del extracto crudo, lo que indica la eficacia de este paso en el proceso

preliminar de purificación de la enzima. Nuestros resultados también corresponden con los

reportados para la enzima humana (Boksha, I. S., et al., 1995; Boksha, I. S., et al., 2000; Boksha, I.

S., et al., 2002), rata y hámster (Tate, S. S., et al., 1972; Tiemeier, D. & Milman, G. 1972).

Alícuotas de las diferentes fracciones así como del extracto crudo fueron sometidas a SDS-

PAGE; 25 g de proteína se sembraron en cada carril (Figura 5). Las proteínas del extracto crudo

que se obtuvieron son de un rango muy amplio de peso molecular, encontrándose desde muy

pequeñas (14 kDa), hasta muy grandes (aproximadamente 116 kDa o aún mayores). En este caso en

particular, es importante observar las bandas entre 40 y 50 kDa, indicando allí la posible presencia

de la enzima en el extracto, de acuerdo con lo reportado para la enzima (Eisenberg, D. et al., 2000).

En el carril 4 (precipitado (NH4)2SO4 20-60% s) un bandeo con proteínas predominantes de 55, 45,

30 y 14 kDa, en contraste con los carriles 3 (precipitado (NH4)2SO4 0-20% s) y 5 (sobrenadante

(NH4)2SO4 60% s) en los que se observan un menor número de bandas.


63

Todas las fracciones obtenidas en los experimentos de precipitación fraccionada con sulfato

de amonio fueron sometidas a pruebas de ELISA (Figura 6) para determinar la presencia de GS y se

encontró la enzima en el extracto crudo, en el precipitado (NH4)2SO4 20-60% s antes de la

ultrafiltración y en la fracción concentrada por amicón. Los valores de absorbancia (Abs405 nm 0.4)

indican que la utilización del paso intermedio de ultrafiltración es muy importante no solo para

concentrar un poco más la muestra, sino también para eliminar algunas de las moléculas de peso

molecular de menos de 100 kDa, esto explica el aumento de los valores si se compara con la

fracción (NH4)2SO4 20-60% s. Además permitió mantener las condiciones de asociación entre las

subunidades como se evidenció en las cromatografías realizadas posteriormente.

Figura 5. Electroforesis (SDS-PAGE) de de las fracciones obtenidas por precipitación con (NH4)2SO4.

25 g se sembraron en cada carril. Carril 1. Patrones de peso molecular, 2. Extracto crudo, 3. Precipitado

(NH4)2SO4 0-20% s 4. Precipitado (NH4)2SO4 20-60% s 5. Sobrenadante (NH4)2SO4 0-60% s.


64

6.1.3. Cromatografía de filtración en gel

6.1.3.1. Curva de calibración

2 mg del azul de dextrano se hicieron pasar por la columna de Sephacryl S-300 y se obtuvo

un volumen de elución de 31.7 ml. Este valor corresponde al volumen de la columna en el que se

eluyen moléculas de tamaño superior al fraccionamiento de la misma y por tanto corresponde al

valor de elución esperado para las proteínas de peso molecular mayor a 1500 kDa (Figura 7).

Figura 6. Determinación de la presencia de GS por ELISA para los ensayos de precipitación con

(NH4)2SO4. Se presentan la comparación de los valores de absorbancia de tres fracciones obtenidas por

precipitación, con respecto al extracto crudo y a la fracción concentrada por Amicon.


65

Figura 7. Determinación del volumen muerto de columna de Sephacryl S-300. El volumen del azul de

dextrano se determinó en aproximadamente haciendo la medición del volumen de elución del dextrano desde

el momento de su siembra, hasta que alcanzo el máximo de absorvancia a 595 nm. Este valor fue 31,7 ml.

Utilizando el soporte Sephacryl-S-300 se estimó en forma aproximada el peso molecular

del complejo proteico en estas condiciones experimentales utilizando la curva de calibración a partir

de diferentes patrones de peso molecular. Midiendo los volúmenes de elución de diferentes

proteínas: Inmunoglobulina Y (167 kDa), albúmina sérica bovina fracción V (BSA) (66 kDa),

Ovoalbúmina (44 kDa), Tripsinógeno (24 kDa) y lisozima (14 kDa). Se constituyeron los datos de

referencia de la curva de calibración para determinar el peso molecular aproximado del complejo

enzimático en las condiciones de experimentación. En la figura 8 se observa la gráfica realizada

utilizando el valor del logaritmo de los pesos moleculares de cada una de las proteínas contra el

volumen de elución obtenido experimentalmente.


66

Figura 8. Curva de calibración para Sephacryl S-300. Determinación del peso molecular del complejo

proteico utilizando diferentes proteínas de peso molecular conocido.

6.1.3.2. Separación por Filtración en gel (FG)

En la Figura 5 se observa el perfil cromatográfico de filtración en gel (FG). 53 mg de proteína se

sembraron en el Sephacryl-S300 y se colectaron tres fracciones. Se determinó la actividad

específica en el primer pico (FGF1) en cada punto cada 2 ml y se encontró que el volumen de

elución de la glutamina sintetasa (correspondiente al tubo de mayor actividad específica) fue de

29.5 ml. Lo que quiere decir que la proteína fue excluida totalmente en este soporte. A partir de

este volumen se calculó el peso molecular del complejo en estas condiciones experimentales en 137

kDa aproximadamente.

La rápida elución de la proteína en la cromatografía de filtración por gel, ratifica que el

complejo tiene un peso molecular alto si se consideran los límites de exclusión del soporte. La

determinación del peso molecular del complejo enzimático en el rango 137 kDa permite sugerir que

en estas condiciones experimentales la proteína predomina en formas asociadas como trímeros.

Estos datos están de acuerdo a lo reportado por Llorca y colaboradores, quienes identifican


67

fracciones proteicas correspondientes a GS-II de P. vulgaris con formas oligoméricas de peso

molecular aparente en un rango de 80 kDa a 140 kDa (Llorca, O. et al., 2006).

En todos los ensayos se obtuvo el mismo patrón cromatográfico (Figura 9), en el que se

observan tres fracciones, la primera FGFI es un pico de absorbancia alta que no se resuelve muy

bien y es seguido por un segundo pico (FGFII) de absorbancia alta que cae lentamente hasta lograr

un pico final (FGFIII). En la primera fracción (FGF1) se detectó la actividad enzimática, con una

importante recuperación de proteína (3.8 mg/ml y volumen final de 8 ml) y con un aumento de la

actividad específica con relación al ultrafiltrado, lo que permite concluir que es en esta fracción en

donde predomina la enzima con una pureza 8 veces mayor a la obtenida en el extracto crudo (Tabla

2). No se detectó actividad específica en las fracciones FGFII y FGFIII. Estos resultados

corroboran lo reportado en el trabajo de Llorca y colaboradores para la purificación de la GS-II de

P. Vulgaris (Llorca, O. et al., 2006).

En la Figura 10 se muestra el perfil electroforético de las fracciones obtenidas en filtración

por gel, se observó como era de esperarse que en FGF1 y FGF2 predominaban bandas de alto y

mediano peso molecular (carriles 1 y 2), adicionalmente el bandeo que se observa es muy similar,

mientras que en FGF3 predominaban las bandas de peso molecular menor. En FGF1 y FGFII se

observan bandas entre 40 KDa y 50 KDa, muy impotantes porque es en este rango en donde se

reporta el peso molecular de los monómeros de la enzima eucariótica (McParland, R.H. et al., 1975;

Boksha, I.S. et al., 2002; Eisenberg, D. et al., 2000).


68

Figura 9. Cromatografía de filtración en gel (FG) sobre Sephacryl S300. Se presenta el perfil

característico obtenido en este proceso, se distinguen tres fracciones obtenidas: FGF1 o primer pico de

elusión, FGF2 o segundo pico de elusión y FGF3 o tercer pico de elución.

Figura 10. Electroforesis (SDS-PAGE) 12% para los ensayos de filtración en gel (FG). En la imagen se

observan cuatro carriles de muestras correspondientes a las tres fracciones obtenidas en filtración en gel: 1.

FGF1; 2. FGF2; 3. FGF3 y 4. Patrones de peso molecular. 25µg de proteína se sembraron en cada uno.


69

Dada la similaridad del bandeo en FGF1 y FGF2 se decidió corroborar los resultados

obtenidos en los ensayos de actividad. Así las mismas fracciones se sometieron a ensayos de

ELISA utilizando el anticuerpo específico contra la glutamina sintetasa. Los resultados para tres

ensayos cromatográficos y promedios de tres repeticiones por fracción se muestran en la Figura

11. En estos se observa que FGF1 presentó absorbancias altas (Abs 405 nm 0.6) a las observadas

para FGF2 y FGF3, lo que indica la presencia de GS en la FGF1, ratificándose así las pruebas de

actividad donde siempre se encontró la actividad de la enzima esta fracción. En las FGF2 y FGF3

los valores obtenidos en las pruebas de ELISA fueron inferiores a 0.1, lo cual corrobora la ausencia

de la enzima en estas fracciones.

Figura 11. Determinación de la presencia de GS por el método de ELISA para los ensayos

cromatográficos de Filtración en gel (FG) y de Intercambio Iónico (IO). Una alícuota de 1

proteína obtenida en las diferentes fracciones en los ensayos cromatográficos se fijo a la placa y luego se

determino la presencia de GS utilizando el anticuerpo específico para la enzima.

6.1.3.3. Cromatografía de intercambio Iónico (IO)

25 mg de FGF1 se hicieron pasar sobre una columna de intercambio aniónico DEAE-

Sepharosa obteniéndose tres fracciones, una no retenida (IO1) y dos eluídas con un gradiente

discontinuo de HEPES pH 7.4 NaCl 0.2 M (IO2) y 0.5 M (IO3). El perfil cromatográfico típico se


70

muestra en la Figura 12. Los picos fueron bien resueltos, se pudieron recuperar cantidades

significativas de proteína (Tabla 2) y las actividades específicas más altas se encontraron en la

fracción IO2, la cual corresponde a 32 U/mg, 12.3 veces mayor que la obtenida para el extracto

crudo. Es por esto que a partir de este momento siempre se eluyó utilizando HEPES pH 7.4 NaCl

0.2 M. Las fracciones IO1 y IO3 no presentaron actividad.

Los resultados anteriores indican que al someter los extractos sucesivamente a

cromatografía de filtración en gel e intercambio iónico sobre DEAE Sepharosa aumenta la

eficiencia del proceso de purificación de la enzima. Esto se corrobora al observar el perfil

electroforético de las fracciones obtenidas en las cromatografías de intercambio (Figura 13), ya que

en el carril 3 correspondiente a IO2 se observa un menor número de bandas predominantes de peso

molecular 30, 40, 55 y 60 kDa que podrían ser responsables de la actividad enzimática. Sin

embargo la presencia de varias bandas en el perfil electroforético en esta fracción hizo necesario

utilizar métodos de purificación adicionales.

Figura 12. Cromatografía de intercambio iónico (IO). Se observa el perfil típico obtenido en IO,

mostrando una fracción no retenida (I) y dos fracciones eluídas (II y III) en un gradiente discontinuo de NaCl.

71

Figura 13. Electroforesis (SDS-PAGE) T 12% C 2.5% para los ensayos de Intercambio Iónico. 25µg de

proteína de las diferentes fracciones de la cromatografía de intercambio fueron utilizadas. Carril 1. Patrones

de peso molecular; 2. IOF1; 3. IOF2; 4. IOF3

La determinación de la presencia de GS se realizó también por la técnica de ELISA, en la

figura 8 se presentan resultados de las fracciones provenientes de la cromatografía de intercambio

iónico, en los que se observó presencia de la enzima en las fracciones IOF2, en todos los casos y

ausencia en IO1 y IO3, corroborando los resultados de los ensayos de actividad. La retención de la

enzima en el soporte de DEAE-Sepharosa indica que la proteína está cargada negativamente a pH

7.4. Adicionalmente el incremento en la actividad específica en IO2 respecto al extracto crudo, al

precipitado del 60% y a la primera fracción de filtración en gel indica mayor abundancia de la

enzima.

6.1.3.4. Cromatografías de afinidad

6.1.3.4.1. PBA-Sepharosa

Para la cromatografía de afinidad se ensayó el acople del péptido beta amiloide 1-40 (PBA 1-40) y

NHS-Sepharosa para lo cual se tomo como referencia el protocolo de Oyama y colaboradores

(Oyama, R. et al., 2000) con las siguientes modificaciones: Se utilizaron condiciones no acuosas

para lo cual se tomaron 4.5 mg de PBA disueltos en 3 ml de DMSO (1.5 mg/ml) y se acoplaron a 1

ml de soporte. El porcentaje de acople del péptido sobre la Sepharosa-NHS fue determinado

cuantificando el péptido no ligado y calculando la diferencia. Este porcentaje fue de 77%, es decir

72

-40 / l de soporte. En estas condiciones se efectuó el acople por aminación

reductiva cuyo intermediario es una base de shiff que forma aminas secundarias estables entre los

grupos carbonilo del soporte y los grupos amino del péptido PBA 1-40. En la Figura 14 se presenta

la secuencia del péptido con los residuos (en rojo) que favorecen la reacción.

Figura 14. Secuencia del Péptido beta Amiloide PBA 1-40. Se resaltan los residuos que podrían ser

responsables de las reacciones de amidación reductiva que favorecerían la interacción de PBA 1-40 al

soporte.

10mg de IO2 se aplicaron a la columna obteniéndose el perfil de elución de la figura 15,

donde se observa una fracción no retenida y una fracción retenida eluída utilizando alta fuerza

iónica (HEPES pH 7.4, NaCl 2 M). Esta estrategia de elución indica que las interacciones

electrostáticas son las que imperan en la formación del complejo PBA-GS en la columna. El perfil

electroforético (Figura 16. B.) mostró en los carriles 1 y 2 diferentes fracciones retenidas eluídas

con NaCl 2 M, donde se observa una única banda de proteína retenida, lo que evidencia que esta

proteína interactúa con PBA 1-40. Esta banda de peso molecular 45 kDa en la fracción retenida,

es responsable de la actividad específica obtenida y muestra la pureza de la enzima. Para

corroborar la presencia de la GS en las fracciones eluídas con NaCl 2M se hizo transferencia a una

membrana de nitrocelulosa que se reveló con DAB (Figura 16. A.), en esta se observa una única

banda inmunoreactiva. En pruebas de Dot-Blot, (Figura 17), también se observa la presencia de la

enzima en todas las fracciones retenidas correspondientes a las muestras 2 – 6 para cinco ensayos

diferentes, lo que ratifica que la enzima interactúa específicamente con el péptido acoplado al

soporte.

73

Figura 15. Cromatografía de afinidad PBA-Sepharosa. Se presenta el cromatograma típico obtenido, se

observa una fracción no retenida (I) y otra retenida eluida con alta fuerza iónica (II).

Figura 16. Detección de la GS. (a) Membrana de nitrocelulosa revelada con DAB, donde se visualiza una

única banda inmunoreactiva. (b) Electroforesis (SDS-PAGE) T12% C 2.5% para la cromatografía de afinidad

PBA-Sepharosa. 1. y 2. Fracciones retenidas PBA-Sepharosa mostrando una banda 44 kDa; 3. Patrones de

peso molecular.

En la fracción retenida que se obtuvo en los ensayos con PBA-Sepharosa, se observó un

aumento significativo de la actividad específica; mientras que en la fracción no retenida no se

74

observó actividad. Los resultados de Dot-Blot para las fracciones retenidas, ratifican los ensayos de

actividad y evidencian que existe interacción de GS con PBA 1-40 acoplado al soporte. Utilizando

PBA-Sepharosa se purifica la GS logrando una actividad específica de 105 U/mg, muy cercana a las

reportadas para la enzima de cerebro humano (Boksha, I.S., et al., 1995; Boksha, I.S., et al., 2000;

Boksha, I. S., et al., 2002), cerebro de oveja (Rowe, W.B., et al., 1970) y de maíz (Unno, H., et al.,

2006), adicionalmente se encuentra una banda cercana a 45 kDa como se reporta para las

subunidades de GS eucarióticas (Krajewski, W.W. et al 2008). Estos resultados en conjunto indican

que existe interacción entre el PBA 1-40 ligado al soporte y la enzima presente en la IOF2 que fue

sometida a esta cromatografía.

Figura 17. Dot-Blot de algunas fracciones retenidas obtenidas en las cromatografías PBA-Sepharosa. 1

g de proteína se sembraron en cada punto. 1. Fracción no retenida empleada como blanco; 2-6. Diferentes

Fracciones Retenidas.

6.1.3.4.2. Glutamato-Sepharosa

En un experimento paralelo se hizo el acople del Glutamato a la Sepharosa usando como

referencia un protocolo de amidación reductiva (Hermanson, G. 1996) con las siguientes

modificaciones: Se tomaron 2 ml de soporte y se acopló el glutamato, a partir de una solución de

PBS 2.2 M. Al final, se logró una eficiencia de 70% en el acople. Para determinar este porcentaje

se cuantificó el aminoácido no acoplado utilizando la reacción de la Ninhidrina y se calculó la

diferencia que corresponde al glutamato ligado al soporte. Las condiciones de este acople fueron

acuosas y se generó una amidación reductiva de los grupos aldehído del soporte con el grupo

75

Usando este soporte se cromatografiaron 10mg de IO2 obteniéndose el perfil de elución de

la figura 18. En éste se observa una fracción no retenida y una fracción retenida eluída utilizando

Gly-HCl 50 mM pH 2.5. Esta elución indica que las interacciones del ligando con la enzima son de

tipo puentes de Hidrogeno que se rompen en condiciones ácidas, en las que se aumenta la

concentración de Hidrógeno.

Figura 18. Cromatografía de afinidad Glutamato-Sepharosa. Se presenta el cromatograma típico

obtenido en estos experimentos, en el que se observan dos fracciones una no retenida (I) y otra eluída

utilizando Glicina-HCl pH 2.5 (II).

76

Figura 19. Electroforesis (PAGE-SDS) T 12% C 2.5% para la cromatografía de afinidad Glutamato-

Sepharosa. Se presentan en 1. Patrones de peso molecular; 2 y 4. IO2; 3 y 4. Fracción retenida.

En los perfiles electroforéticos (Figura 19) se evidencia que en la fracción retenida se

observan dos proteínas minoritarias de 18 y 50 kDa, adicionalmente, es visible banda predominante

de 45 kDa. Los ensayos de Dot-blot (Figura 20) se utilizan para determinar la presencia de la

enzima GS en esta fracción. Así, se evidencia que la enzima interactúa con el glutamato y esto

permite usar este mecanismo como herramienta de purificación; ya que solo se facilita la

interacción de la enzima con el glutamato, como ligando natural; pero no la actividad catalítica.

Esto es debido a que las condiciones del buffer HEPES pH 7.4 no favorecen la actividad enzimática

dada la ausencia de los sustratos necesarios (ATP, Hidroxilamina, Mg++). Sin embargo, dado que

en esta fracción se observan dos bandas adicionales de proteína, la pureza de la enzima es menor

que en la fracción retenida con PBA-Sepharosa, debido a que en el soporte interactúan proteínas

diferentes de GS.

77

Figura 20. Dot-Blot de fracciones retenidas obtenidas en las cromatografías Glutamato-Sepharosa. 1

g de proteína se sembraron en cada punto. 1-4. Fracciones Retenidas; 5. Fracción no Retenida, empleada

como blanco.

La eficiencia en el proceso de purificación al utilizar las cromatografías de afinidad

aumenta, como se ve en la Tabla 2, usando Sepharosa-Glu- se obtienen 2.1 mg de proteína total y

una actividad específica de 116 U/mg, el perfil electroforético muestra tres bandas de proteína de

18, 45 y 50 kDa (Figura 19). Usando PBA- Sepharosa se obtienen 0.84 mg, una actividad específica

de 105 U/mg y un factor de purificación de 40.3 veces mayor que el extracto crudo, adicionalmente

se evidencia en la electroforesis es una sola banda de proteína de 45 kDa. Entonces se puede decir

que el factor de purificación en esta columna es diferente al de PBA-sepharosa y por tanto es menos

selectivo.

El resumen del protocolo de purificación de la glutamina sintetasa de cerebro de rata se

presenta en la tabla 2.

78

Tabla 2. Cuadro resumen del protocolo de purificación de la GS. Se presentan todos los pasos del

proceso de purificación, indicando los valores de actividad específica y la cantidad de proteína.

79

6.2. Generación de los complejos GS-PBA

6.2.1. Obtención de los Péptidos

Los péptidos utilizados en estos ensayos corresponden a tres secuencias análogas del

Péptido amiloide (PBA). PBA tiene de 39 a 42 aminoácidos y desde el punto de vista molecular,

es la especie que se encuentra en los pacientes que padecen la enfermedad. PBA 1-40 se ha

identificado en agregados moleculares insolubles en cerebro de pacientes con EA (Hartley, D. et al.,

1999; Selkoe, D. 2008) y en fluido cerebro espinal (Walsh, D.M. et al., 2000). PBA 12-28 y PBA

25-35 corresponden a péptidos que no se encuentran en condiciones fisiológicas o patológicas, pero

que contienen las secuencias del péptido anterior y que se han identificado como responsables de

los principales efectos de neurotoxicidad (LaFerla, F.M. et al., 2007; Bayer, T.A. & Wirths, O.

2010) y de las características que le confieren agregación o potencial amiloidogénico; es decir la

capacidad de producir agregados proteicos, especialmente en la secuencia 17 a 21 considerada un

núcleo hidrofóbico importante para esta función (Tycko, R. 2003). De hecho, el término beta ( )

asignado al péptido resalta la capacidad de formación de hojas plegadas , que son las que facilitan

el proceso de agregación (Di Carlo, 2009). En la tabla 3, se muestran las secuencias de cada

péptido y los pesos moleculares de los mismos, en rojo los aminoácidos 17-21.

PBA 1-40 fue obtenido comercialmente (Sigma-Aldrich) y se purificó por RP HPLC, el

laboratorio reporta una pureza del 90%. Los péptidos PBA 12-28 y PBA 25-35 fueron sintetizados

utilizando la técnica de síntesis química en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia

(FIDIC). El reporte de control de los péptidos muestra tiempos de retención de 23.34 y 24.39

minutos, lo que indica masas moleculares altas para los analitos, como era de esperarse para

pequeños péptidos. El análisis de espectrometría de masas muestra 1058 Da para PBA 25-35 y

1954 Da para PBA 12-28. Estos valores están muy cercanos a los datos teóricos reportados en la

tabla 3, por tanto se puede afirmar que estas masas corresponden a lo esperado dada la secuencia de

los péptidos (Figuras 21 A y 21 B).

80

PEPTIDOS SECUENCIA PM

Da

PBA 1-40 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV 4328.4

PBA 12-28 VHHQKLVFFAEDVGSNK 1955.3

PBA 25-35 GSNKGAIIGLM 1060.6

Tabla 3. Secuencias analogas del Péptido -amiloide (PBA). Se observan los fragmentos específicos que

se utilizaron en este trabajo con el peso molecular correspondiente a cada uno. Los residuos en rojo

identifican la región a la que se le confiere la propiedad de autoagregación y por tanto responsable de la

ameloidogenesis.

Figura 21. Control de calidad de los péptidos PBA 25-35 y PBA 12-28. Análisis de espectrometría de

masas de los péptidos sintetizados en el FIDIC. (a) PBA 25-35 y (b) PBA 12-28.

6.2.2. Ensayos de ELISA

Los ensayos de ELISA se propusieron inicialmente para identificar la interacción de los

diferentes fragmentos de PBA con la enzima GS previamente purificada. Para estos, se fijaron por

81

separado sobre placas para ELISA 1 M, 5 M y 10 M de PBA 1-40, PBA 25-35 y PBA 12-28.

Posteriormente se dejaron interactuar con 50 g de GS purificada de cerebro de rata.

Los resultados de la figura 22 muestran que PBA 1-40 presenta interacción con la enzima

purificada y que esta interacción es dependiente de la concentración del péptido. No se observan

diferencias estadísticamente significativas P ≥ 0.05 en los tratamientos PBA 1-40 1 M, 5 M y 10

M.

Figura 22. Interacción PBA 1-40-GS. Datos de ELISA PBA 1-40 en tres concentraciones diferentes: 1 M,

5 M y 10 M que se dejaron interactuar con 50 g de GS purificada de cerebro de rata.

Los resultados de la figura 23 muestran la interacción PBA 25-35-GS; en ellos los valores

de absorbancia son cercanos a 1.0 y dado que la dispersión de los datos fue mayor que en los

resultados con PBA 1-40, no se puede observar una respuesta que refleje la tendencia de aumento

82

de concentración del péptido con relación al aumento de la interacción entre las dos especies

moleculares. No hay diferencias significativas entre las tres concentraciones del péptido.

Figura 23. Interacción PBA 25-35-GS. Datos de ELISA PBA 25-35 en tres concentraciones diferentes: 1

M, 5 M y 10 M que se dejaron interactuar con 50 g de GS purificada de cerebro de rata.

En los resultados para PBA 12-28-GS (Figura 24) se evidencia la tendencia de interacción

entre las dos moléculas. Se encontraron diferencias significativas P ≤ 0.001 para los datos

obtenidos con 5 M y 10 M. Sin embargo, los valores de absorbancia son muy bajos y no

sobrepasan 0,45 con relación a los tratamientos con PBA 1-40 y PBA 25-35; por lo que se puede

decir que la interacción de PBA 12-28 es menor con relación a los otros péptidos. Es posible que

dicha interacción sea más débil.

83

Figura 24. Interacción PBA 12-28-GS. Datos de ELISA PBA 12-28 en tres concentraciones diferentes: 1

M, 5 M y 10 M que se dejaron interactuar con 50 g de GS purificada de cerebro de rata.

En la figura 25 se muestra un resumen del comportamiento de los péptidos en estos

ensayos. Las interacciones se ven favorecidas para los PBA 1-40 y PBA 25-35 lo que se ve

reflejado en los mayores valores de absorbancia, mientras que los valores obtenidos para PBA 12-

28 muestran que la interacción es de menor magnitud. Se observan diferencias estadísticamente

significativas P ≤ 0.001 entre los tratamientos con PBA 12-28, comparados con PBA 1-40 en todas

las concentraciones y PBA 25-35 y PBA 12-28 en todas las concentraciones. No se encontraron

diferencias significativas cuando comparan PBA 1-40 y PBA 25-35.

Los resultados anteriores permiten sugerir que el blanco de la interacción de la glutamina

sintetasa y el PBA 1-40 está en los aminoácidos presentes en la secuencia PBA 25-35. La

interacción entre PBA 12-28 y GS es menor, aunque es de esperarse que también contribuyan los

aminoácidos de ésta secuencia en la interacción PBA 1-40 evidenciando un efecto sumatorio tanto

84

de la interacción PBA 25-35-GS y PBA 12-28-GS. Los resultados anteriores fueron obtenidos de 2

experimentos diferentes con 3 repeticiones cada uno.

Figura 25. Resumen de la Interacción PBAs-GS. Datos de ELISA obtenidos para los PBA 1-40, PBA 25-

35 y PBA 12-28 en tres concentraciones diferentes y que se dejaron interactuar con 50 g de GS purificada de

cerebro de rata.

Nuestros resultados muestran una tendencia que favorece la interacción de GS con PBA 1-

40 y PBA 25-35 a mayores concentraciones de los péptidos. Estos resultados podrían estar

reflejando lo sucedido en el proceso de formación de agregados, que presenta una cinética

característica; en la cual se generan inicialmente auto-agregados denominadas centros de

nucleación; a partir de estos se favorece el proceso de co-agregación, a mayor número de núcleos se

aumenta el proceso de co-agregación. Este es el comportamiento típico de una cinética lineal, hasta

que el sistema alcanza la saturación (Murphy, R. 2002). Entonces a mayor concentración de la

especie amiloidogénica mayor capacidad de formación de núcleos y como consecuencia se inicia la

fase lineal de la cinética. Las concentraciones fisiológicas de PBA son del orden de 1-10 nM

(Price, J.M. et al., 2001) a mayores concentraciones se favorecerían las condiciones para la

formación de núcleos y por tanto potenciarían las interacciones que favorecen auto-agregación y co-

85

agregación. En nuestras condiciones experimentales en los órdenes de 1 M hasta 10 M, 1000

veces mayor que en condiciones fisiológicas, se presenta este comportamiento cinético, como era de

esperarse.

6.2.2. Ensayos de agregación

Debido a que PBA se encuentra tanto en cerebro y fluido cerebro espinal de individuos

sanos y de pacientes con EA, la teoría sostiene que coexisten péptidos que generan especies

solubles y péptidos que forman agregados insolubles. Las primeras aproximaciones apuntaban a

que las formas insolubles eran las principales responsables de los efectos neurotóxicos (Selkoe, D.J.

2002), sin embargo, también se ha reportado que las especies solubles potencialmente son

responsables de estos efectos deletéreos en neuronas (Hoshi M, et al., 2003). Diferentes ensayos

empleando oligómeros de PBA de alto peso molecular y fibrillas de bajos pesos moleculares

mostraron efectos neurotóxicos aunque los mecanismos fueron diferentes (Selkoe, D.J. 2002).

Estas evidencias permiten identificar que existe una correlación entre el daño neuronal y la

formación de placas, aunque no es claro todavía el papel de las formas solubles, éstas se pueden

considerar formas intermedias que producen toxicidad y podrían ser los responsables de los eventos

iniciales en la pato- fisiología molecular de la enfermedad.

Así la pregunta que se han hecho muchos investigadores es ¿en qué condiciones estos

fragmentos peptídicos comienzan a auto-agregarse formando fibrillas y al final agregados

macromoleculares? La respuesta que se plantea es que PBA presenta la capacidad de interacción

con otras especies proteicas, lo que le confiere la característica de ser amiloidogénico o con gran

potencial de formación de agregados moleculares insolubles. Posiblemente debido a la presencia de

dos hojas plegadas que pueden organizarse para formar hojas paralelas más estables con otros

PBA (Figura 26), o con otras proteínas formando protofilamentos (Tycko, R. 2003). La

identificación de proteínas que interactúan con PBA es fundamental para entender las características

que pueden favorecer la formación de agregados solubles (tempranos) e insolubles (tardíos) de gran

importancia en la EA.

86

Figura 26. Modelo estructural de protofilamentos de PBA 1-40. Representación de moléculas de PBA

mostrando sus característicos dos pliegues (uno en rojo y otro en azul) que forman un eje de dos pliegues

paralelos que generan el centro de la protofibrilla en formación. Tomado de Tycko, R. 2003.

Una estrategia muy utilizada en la identificación de estructuras amiloides es la molécula

Tioflavina T (ThT), constituida de un anillo de benzotiazol unido a un anillo de di-metil-amino-

benceno (figura 27) (Wolfe, L. et al., 2010). ThT fue reportado por primera vez en 1959 como una

herramienta para la detección de amiloide en muestras de tejido ex vivo, y esta interacción se

propuso por ser altamente específica para las estructuras de amiloides (Vassar, P.S. & Culling, C.F.

1959). En años posteriores, después de conocerse la caracterización biofísica, empezó a emplearse

para la identificación del PBA (LeVine H., 1993). Cambios en las propiedades fluorescentes de ThT

cuando interactúa con PBA se manifiestan en cambios en su espectro de excitación y emisión. ThT

en medio ácido absorbe principalmente a 340 nm con un máximo de emisión en 445 nm. Tras la

interacción con el amiloide, se desplaza el espectro de emisión a 440 nm con un máximo de 480

nm. Estos cambios se conocen como estado "ThT positivo”. A pesar del amplio uso de ThT como

fluoróforo indicador, la base estructural de sus interacciones con los péptidos amiloides no ha sido

aún entendida (Biancalana, M. & Koide, S. 2010; Wolfe, L. et al., 2010). Sin embargo, se acepta

que cuando ThT interactúa con proteínas que expongan en su superficie hojas plegadas o con

estructuras fibrilares de amiloide se presenta fluorescencia correspondiente con la excitación y de

emisión máximos. Por tanto con el uso de ThT se puede hacer la cuantificación de la formación de

estructuras amiloides o agregados proteícos con PBA.

87

Figura 27. Representación de la estructura de ThT. Se observan los anillos de benzotiazol y dimetil-

amino-benceno, se muestra el angulo permite identificar la coplanaridad de los a dos anillos. Tomado

de Wolfe, L. et al., 2010

En la figura 28 (a, b y c) se muestran los resultados para los experimentos en los que se

determinó la capacidad de formación de agregados proteicos entre los diferentes péptidos análogos

de PBA en presencia (líneas rojas) y en ausencia de la glutamina sintetasa purificada de cerebro de

rata (líneas negras). Los resultados muestran que los fragmentos de PBA exhiben la capacidad de

auto-agregarse, como era de esperarse y que este proceso es dependiente de la cantidad de péptido

presente. La magnitud de la fluorescencia permite evidenciar en los tres casos una relación directa

entre la concentración de los PBA y la capacidad de auto-agregación. Dado que los valores son

muy cercanos para los tres fragmentos, se evidencia que las secuencias PBA 12-28 y PBA 25-35

juegan un papel fundamental en la formación de auto-agregados. Adicionalmente, pequeñas

concentraciones de estos fragmentos son suficientes para potenciar el efecto de auto-agregación.

Los resultados muestran que PBA 1-40 se agrega menos a bajas concentraciones y sólo consigue

favorecer la tendencia de agregación a mayores concentraciones (5 M y 10 M). Mientras que

PBA 12-28 y PBA 25-35 a 5 M ya muestran valores altos de agregación. Sin embargo, PBA 25-

35 muestra una mayor capacidad de auto-agregación a 10 M. Se observan diferencias

estadísticamente significativas P ≤0.001 a esta concentración en los grupos PBA 12-28 y PBA 25-

35, lo que ratifica la evidencia anterior. No se muestran diferencias para PBA 12-28 y PBA 1-40.

En la figura 29 (a) se observa el consolidado de los datos para auto-agregación de los PBA en

ausencia de GS. Se observa que el comportamiento de PBA 2-35 y PBA 12-28 es muy similar,

aunque en el primero se observa una tendencia más marcada hacia la formación de agregados a altas

concentraciones. Estos datos reflejan, de nuevo el comportamiento clásico en la cinética de

88

agregación; lo que supone formación de núcleos, y posteriormente el crecimiento de los mismos.

Dada la concentración de los péptidos es de esperarse que sea ésta la fase lineal de la cinética.

(a)

(b)

89

(c)

Figura 28. Determinación de la capacidad de agregación de los péptidos análogos con y sin interacción

con GS. Mediciones fluorométricas utilizando ThT. (a). PBA 1-40, (b) PBA 25-35y (c) PBA 12-28. Líneas

negras indican fluorescencia de los péptidos solos y líneas rojas la fluorescencia de los complejos PBA-GS.

En presencia de GS purificada (figura 28 a, b y c en líneas rojas) se alcanzan mayores

valores de fluorescencia que en los péptidos solos, lo que indica que la presencia de la proteína

favorece la formación de co-agregados con GS. PBA 12-28 muestra mayores valores de co-

agregación a bajas concentraciones, mientras que PBA 25-35 y PBA 1-40 lo hacen a mayores

concentraciones. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas P ≤ 0.001 entre PBA 1-

40 y PBA 25-35 así como también entre PBA 12-28 y PBA 25-35 a 10 M. Los resultados

anteriores fueron obtenidos de 4 experimentos diferentes con 2 repeticiones cada uno.

PBA 25-35 y PBA 1-40 se comportan desde el punto de vista cinético muy similar cuando

se favorece la interacción con GS, aumentando la capacidad de formación de co-agregados a 5 M

y al final se obtienen los valores más altos de fluorescencia para estos péptidos. Estas

observaciones confirman que se favorece de forma temprana la formación de núcleos para la

90

agregación. A mayores concentraciones la cinética de los dos fragmentos es muy similar. PBA 1-

40 muestra una mayor capacidad de formación de agregados con GS, lo que se refleja en los

mayores valores de fluorescencia a 5 M y 10 M.

(a) (b)

Figura 29. Determinación de la capacidad de agregación de los péptidos análogos con y sin interacción

con GS, por medición fluorométrica de ThT. PBAs 1 M, 5 M y 10 M GS fueron incubados con 50 g

de GS de cerebro de rata. (a) Diferentes PBA sin GS y (b) PBA con GS.

La tendencia de auto-agregación PBA 25-35 y el papel de esta secuencia en la interacción

con GS está posiblemente dada por su marcada hidrofobicidad y la estructura pliegue

predominante, lo que también favorece la interacción con ThT favoreciendo el estado ThT positivo

(Murphy, R. 2002). Tal como se ha reportado, una fibrilla de amiloide consiste en un conjunto de

varios protofilamentos o protofibrillas, y estos a su vez son un conjunto de cadenas de polipéptidos

ricos en -pliegues, haciendo que sea la formación protofibrilla un paso crucial en la formación del

amiloide (Abdul, A. et al., 2007). PBA 25-35 podría favorecer las condiciones de formación de

agregados en contraste con PBA 12-28. Sin embargo, se ha reportado que la secuencia de PBA 10-

35 es la que posee mayor actividad amiloidogénica debido a la presencia de los aminoácidos

LVFFAED (Cairo, C. et al., 2002). Nuestros resultados indican que aminoácidos presentes en

PBA 25-35, hacen posible la interacción con GS y esto permite la detección de mayor proporción

de agregados en relación con los otros dos péptidos, especialmente a bajas concentraciones. Este

dato es muy importante dado que en condiciones fisiológicas la concentraciones de los PBA son

muy bajas al inicio de la enfermedad (Price, J.M. et al., 2001).

91

Como se evidencia en nuestros resultados, la formación de agregados GS-PBA 1-40 es

dependiente de la cantidad de péptido presente. Esta observación es muy importante porque puede

ser un reflejo del proceso de nucleación, previo al de crecimiento de los agregados y a la formación

de fibras (Murphy, R. 2002). Esta capacidad de agregación dependiente de la concentración es muy

importante ya que en condiciones fisiológicas se ha reportado toxicidad con oligómeros PBA

solubles, lo que significa que estas formas podrían estar presentes en los estadios tempranos de

patogénesis (Bartolini, M. et al., 2011).

Desde el punto de vista estructural las secuencias PBA 12-28 y PBA 25-35 son las

secuencias más hidrofóbicas y presentan un motivo hélice- -pliegue y contienen toda la secuencia

tradicionalmente reportada con mayor poder amilodeogénico (Cairo, C. et al., 2002). Los anteriores

resultados en conjunto sugieren que GS puede generar pequeños agregados moleculares con el

péptido amiloide en estas condiciones experimentales. Esta interacción puede ser importante en

la patogénesis en la enfermedad de Alzheimer, ya que podría ser uno de los primeros fenómenos

moleculares relacionados con la excitotoxicidad por glutamato, dada la importancia de la enzima en

el sistema nervioso central.

6.2.3. Caracterización de los complejos GS-PBA

La presencia de los agregados formados en los ensayos de agregación entre el PBA y la GS

se evidenció mediante una separación por SDS PAGE T10% C2.5% de los complejos PBA-GS y la

posterior transferencia a una membrana de nitrocelulosa. En la figura 26 se observan dos

membranas en las que se emplearon los anticuerpos específicos para los fragmentos PBA 1-40 y

PBA 12-28 (Sigma, A8326) y el anticuerpo especifico para la detección de PBA 25-35 (Sigma

A3356).

En estos experimentos se identificaron los péptidos no asociados a GS que muestran pesos

moleculares mayores a 6.5 kDa en una banda muy amplia que evidencia la presencia de auto-

agregados, posiblemente formando especies diméricas, triméricas y tetraméricas. También se

observan bandas que exhiben pesos moleculares mayores a los anteriores. Lo que implica que

deben estar agregados o en interacción con la GS. Los agregados tienen pesos moleculares

cercanos a 50 kDa, lo que no corresponde al peso molecular de ninguno de los péptidos (Figura 30).

Lo anterior evidencia la interacción de la enzima con los péptidos y la formación de complejos

PBA-GS.

92

(a) (b)

Figura 30. Transferencia de los complejos PBA-GS. (a) Electroforesis SDS PAGE T10% C2.5% de los

complejos PBAs-GS, gel espejo utilizado como control de la transferencia. (b) Inmunodetección utilizando

Anticuerpo anti PBA. 1. Auto-agregados PBA12-28, 2. Complejos PBA1-40-GS y 3. Auto-agregados

PBA25-35.

6.2.4. Inmunoprecipitación de GS y PBA

Una forma inequívoca de identificar la interacción entre dos especies proteícas consiste en

utilizar la técnica de inmunoprecipitación. En nuestro caso, los complejos obtenidos en los ensayos

de agregación correspondientes a PBA 1-40-GS se hicieron interactuar primero con anticuerpo

contra GS y se precipitaron con proteína A unida a perlas de agarosa. Posteriormente se separaron

por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Al final se revelaron con un

anticuerpo contra PBA 1-40. En la figura 31 se observa la membrana en la que se distingue un

barrido de peso molecular entre 45 kDa y 55 kDa. Por lo cual se identifican entonces los complejos

GS-PBA-140, aparentemente cada subunidad puede interactuar con uno o dos fragmentos de PBA

1-40, es decir; formas monoméricas o diméricas del péptido. Como consecuencia se muestra ese

barrido en el rango de peso molecular mencionado. No se observan monoméros o diméros de PBA

1-40, debido a que previamente se inmunoprecipitó con el anticuerpo específico para la enzima.

93

Figura 31. Inmunoprecipitación de PBA-GS. Inmunodetección utilizando Anticuerpo anti PBA. 1.

Marcadores de peso molecular, 2. Complejos PBA1-40-GS.

6.3. Interacción GS-PBA en un modelo celular

Debido a que se identificó la interacción de los diferentes fragmentos del péptido PBA 1-

40, PBA 12-28 y PBA 25-35 con la glutamina sintetasa purificada de cerebro de rata, el paso

siguiente fue identificar si esta interacción era posible en cultivo primario de astrocitos de rata para

lo cual se estableció el protocolo de cultivo primario de estas células.

6.3.1. Características del cultivo primario de astrocitos de rata

Se utilizaron neonatos de rata Wistar de 1 día postnatal ya que, en este momento del

desarrollo, las neuronas están diferenciadas y son menos resistentes al proceso de disgregación

mecánica y enzimática a que van a ser sometidas. Sin embargo, el número de astroblastos es

importante en esta etapa del desarrollo del cerebro, lo que permite que se obtenga una importante

cantidad de células en suspensión que luego se cuentan y se siembran en frascos Roux con una

densidad de 9*105 células por frasco.

94

Los astrocitos son células que se adhieren a la placa y proliferan formando una monocapa.

Durante los tres primeros días de cultivo, los astroblastos se anclan a la superficie del frasco y las

células muertas y restos de otras células son removidos durante el primer cambio de medio; de esta

forma se favorece la proliferación y por lo tanto el aumento en el número de células. Los astrocitos

deben este nombre por presentar cuerpos celulares de formas irregulares similares a “estrellas” y

con numerosos procesos cortos y ramificados. Esta descripción corresponde a los astrocitos tipo 1

que proliferan hasta lograr la confluencia, más o menos hacia el día ocho de cultivo in vitro.

Posteriormente aparecen unas células mucho más pequeñas que se agrupan como racimos sobre la

mono capa antes descrita, éstas células corresponden a los astrocitos tipo 2 (Sánchez-Abarca,

1998). Pasados los 12 días de cultivo se observan entonces dos tipos de células: la monocapa de

astrocitos tipo 1 bien establecida con unas células más pequeñas sobre éstas; es decir, los astrocitos

tipo 2 creciendo sobre su superficie.

Con el objeto de confirmar las características de proliferación de los cultivos primarios se

determinó el número de células a distintos días de cultivo. Los resultados para el cultivo de

astrocitos aparecen en la figura 32. El número de células viables se utilizó como indicador de la

proliferación a lo largo del cultivo y los resultados muestran que a los 3, 5, 7, 9 y 11 éste es lineal,

e indica claramente un aumento en la proliferación entre los 5-9 días y al finalizar el cultivo en el

día 12 la proliferación sufre una pequeña caída, lo que señala que las células han alcanzando la

quiescencia. Estos resultados corroboran trabajos hechos en este tipo de cultivos donde se observa

que en este tipo de células (Tovar, J. 1995). De acuerdo a estos resultados se trabajaron astrocitos

quiescentes de 12 días de cultivo que se emplearon para los experimentos de incubación con los

fragmentos del péptido. Para esto las células fueron tripsinizadas y transferidas a placas de 24

pozos con una densidad de 10000 células por pozo.

Las características morfológicas de los astrocitos coinciden con las descritas en cultivo

primario por diferentes autores (Sánchez-Abarca, 1998; Tovar, J. 1995). Adicionalmente, se realizó

la caracterización inmuno-citoquímica de estos cultivos, siguiendo el protocolo establecido en el

numeral 5.8.

95

Figura 32. Número de células vivas a lo largo del tiempo de cultivo de astrocitos. Las células crecidas en

cultivo se recogieron durante los días señalados y se determinó el número de células viables, haciendo conteo

con azul tripano. Cada punto representa el valor promedio de 3 determinaciones procedentes de 3 cultivos.

Se determinó la presencia de la Proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP) y la glutamina

sintetasa (GS) como marcadores específicos de este tipo de células. GFAP es una proteína de

filamentos intermedios implicada en el mantenimiento de la resistencia mecánica, en la mitosis y el

movimiento celular. GFAP tiene una función crítica en la morfogénesis y en las interacciones

neurona-astrocito (Chen, W.J. & Liem, R.K., 1994). Así como también en condiciones patológicas

como en la EA, cuando se presenta activación astroglial porque ocurre una sobre expresión de

GFAP, (Rodríguez, J.J. et al., 2009).

La relación del número de células GFAP positivas (Figura 33) sobre el número total de

células en un campo generó el porcentaje de pureza del cultivo que en este caso fue del 95%.

Adicionalmente se realizó una segunda marcación específica también para astrocitos y por ello se

hizo inmuno-citoquímica para la enzima glutamina sintetasa, esto nos permitió identificar la

expresión de la GS en el cultivo importante para los ensayos de incubación los péptidos y la

localización citosólica de la enzima (Figura 34). Las observaciones anteriores nos permiten afirmar

que en las condiciones experimentales utilizadas se pudo generar un cultivo primario de astrocitos

de rata con mínimas contaminaciones de otros tipos celulares.

0 2 4 6 8 10 12

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000N

o. C

élul

as v

ivas

Días de cultivo in vitro

96

(a)

(b)

Figura 33. Localización de GFAP en cultivo primario de astrocitos de rata. Microscopia confocal

utilizando anticuerpo primario contra la GFAP y un anticuerpo secundario Alexa fluor 568 (Rojo). (a).

Astrocitos GFAP* 60x, (b). Astrocitos GFAP* Barra 5 m.

97

(a)

(b)

Figura 34. Localización de GS en cultivo primario de astrocitos de rata. Microscopia confocal utilizando

anticuerpo primario contra la GS y un anticuerpo secundario Alexa fluor 488 (Verde). (a). Astrocitos GS*

60x, (b). Astrocitos GS*. Barra 5 m.

98

6.3.2. Ensayo de CELISA

El ensayo se CELISA se direccionó para identificar: 1) que los fragmentos de PBA son

internalizados por los astrocitos de rata en cultivo primario y 2) que PBA puede interactuar con

proteínas que se expresan en este tipo de células. Para lo cual se sembraron astrocitos 12 días de

cultivo in vitro en placas de 96 pozos con una densidad de 10000 células por pozo y se incubaron

los péptidos PBA 1-40, PBA 12-28 y PBA 25-35 a diferentes concentraciones 0.5 M, 1 M y

5 M durante 24 horas a 37°C con un 5% de CO2.

Los resultados muestran que los diferentes fragmentos de PBA son internalizados por las

células en cultivo. Por lo cual se observan datos de absorbancia altos en todos los casos. En la

figura 35 se muestran los resultados de las interacciones de PBA 1-40 con proteínas expresadas en

los astrocitos en cultivo. Los valores de absorbancia son superiores a 1.0 en todos los casos y los

análisis estadísticos no evidencian diferencias significativas P ≤ 0.05. Estos resultados provienen

de 4 experimentos diferentes con 2 repeticiones cada uno.

Figura 35. Interacción PBA 1-40 con proteínas expresadas en cultivo primario de astrocitos. Datos de

CELISA utilizando PBA 1-40 en tres concentraciones diferentes: 1 M, 5 M y 10 M que se dejaron

interactuar 24 horas con las células en cultivo.

Similares resultados se presentan para PBA 12-28 (figura 36) y PBA 25-35 (figura 37), lo

que confirma que todos los péptidos interactúan con proteínas expresadas en este tipo de células.

99

Sin embargo, no se puede afirmar que ésta se presente con GS de forma específica. Dado que todos

los PBA interactúan con GS purificada como se demostró en los ensayos de ELISA, es posible que

se genere también este fenómeno en las células en cultivo. En la figura 38, se observa un resumen

de los resultados de interacción de todos los péptidos en el cultivo primario de astrocitos, no se

observan diferencias significativas cuando se hacen comparaciones entre los grupos. Por lo que se

puede concluir que la magnitud de la interacción es equivalente en todos los tratamientos.

Los ensayos de ELISA (figuras 22 y 23) mostraron que la glutamina sintetasa purificada de

cerebro de rata interactúa con PBA 1-40 y PBA 25-35. Los CELISA muestran que todos los

fragmentos de los péptidos interactúan con proteínas expresadas en el cultivo primario de astrocitos

de rata y que GS podría ser blanco de esta interacción a nivel celular.




100




Figura 38. Resumen de la Interacción de PBAs con proteínas expresadas en cultivo primario de

astrocitos. Datos de CELISA utilizando PBAs en tres concentraciones diferentes: 1 M, 5 M y 10 M que

se dejaron interactuar 24 horas con las células en cultivo.

101

Los resultados anteriores permiten apreciar que PBA es capaz de ser internalizado por las

células e interactuar con proteínas expresadas en el mismo. PBA ha mostrado capacidad para

formar poros en membranas artificiales y se sugiere que también pueden actuar formando poros en

membranas celulares (Pollard, H.B. et al., 1993; Shafrir, Y. et al., 2010). Esto podría explicar el

proceso de transporte del péptido del espacio extracelular al interior del astrocito. Estas

observaciones son importantes en el contexto en que se ha reportado la presencia de astrocitos y

microglía activada cerca de depósitos de PBA, lo que sugiere que estas células juegan un papel en la

patología de la EA (Itagaki, S. et al., 1989; Haga, S. et al., 1989; Kato, S, et al., 1998). Debido a

que los astrocitos son el tipo celular más abundante en el SNC, se sabe que los astrocitos activados

pueden internalizar y degradar PBA (Pihlaja, R. et al., 2008), posiblemente en un intento por

reducir la disponibilidad del péptido para las neuronas. Sin embargo, la exposición de los astrocitos

a PBA puede traer consecuencias perjudiciales. PBA ocasiona el aumento en la producción de

citoquinas pro-inflamatorias y aumenta la liberación de óxido nítrico en los astrocitos cultivados

(Hu, J. et al., 1998). Por otra parte, PBA induce no sólo la muerte celular de astrocitos (Nagele,

R.G. et al., 2003) sino también indirectamente a la muerte neuronal (Allaman, I. et al., 2010).

La acumulación del péptido en las zonas con alta deposición se ha demostrado en los

astrocitos y la microglia (Akiyama, H. et al., 2010) o en astrocitos, pero no microglía o en neuronas

(Funato, H. et al., 1998; Kurt, M.A. et al., 1999). Estudios empleando infusiones intra-cerebrales

continuas de PBA en cerebro de rata mostraron la acumulación del PBA en los astrocitos, pero no

en la microglía (Matsunaga, W. et al., 2003). No obstante, la ausencia de PBA intracelular en la

microglía podría reflejar que estas células son altamente eficientes en la degradación del péptido

(Matsunaga, W. et al., 2003). Una teoría que se opone a este concepto establece que en lugar de

acumular PBA intracelularmente, la microglía produce la liberación de fibrillas de PBA, lo que

estaría contribuyendo al crecimiento de las placas amiloides (Wegiel, J. et al., 2000; Wegiel, J. et

al., 2001).

Es claro que en el caso de las neuronas, se presenta una mayor producción endógena de

PBA, así el papel de los astrocitos podrían derivarse de una mayor internalización de PBA. Debido

también a que se ha establecido que la producción de PBA en macro y microglia es muy baja

debido a la reducida expresión de la proteína precursora amiloide (PPA) en la microglía y la

reducción de la actividad -secretasa en los astrocitos en comparación con las neuronas (Zhao, J. et

al., 1996; Bigl, M. et al., 2000; Scott, S.A. et al., 1993). Sin embargo, algunos estímulos inducen la

expresión de PPA, la -secretasa, γ-secretasa y la producción de PBA en los astrocitos y microglía

(Lesné, S. et al., 2003; Hong, H.S. et al., 2003; Nadler, Y. et al., 2008).

102

6.3.3. Interacción PBA-GS en cultivo primario de astrocitos de rata

6.3.3.1. Cambios morfológicos inducidos por PBA

Los astrocitos cumplen funciones importantes en el sistema nervioso central tanto en

condiciones normales como patológicas. Una característica común en la EA es la presencia de glía

activada asociada a las placas amiloides. Diferentes estudios han mostrado que PBA induce

cambios funcionales en los astrocitos, lo que es consistente con la respuesta, posiblemente muy

temprana, de la acumulación del PBA que potencia el desarrollo de astrogliosis en cerebros de

pacientes con EA. Nuestros resultados confirman estas observaciones y además ponen de

manifiesto un aumento de la respuesta de estas células a la incubación con los PBA. En la figura

39B en el panel marcado como “B” (células sin tratamiento), se observan las células típicas

formando una monocapa distribuida de forma homogénea sobre la placa. Se hacen visibles los

cuerpos celulares y abundantes prolongaciones que se muestran con las flechas. En contraste los

paneles 1 M, 5 M y 10 M de PBA 1-40 se observa que la continuidad de la monocapa se ha

perdido y son visibles en el campo zonas en las que hay ausencia de células y zonas en las cuales

éstas se agrupan exhibiendo “aparentemente” prolongaciones más largas.

En la figura 40 y en la figura 41 se muestran los resultados del tratamiento de los astrocitos

en cultivo primario con PBA 12-28 y PBA 25-35 a diferentes concentraciones (1 M, 5 M y 10

M). Los hallazgos son consistentes con los observados para el PBA 1-40. Es decir, se evidencian

cambios morfológicos en todos los tratamientos inducidos por los péptidos y estos son consistentes

con la activación de las células frente a un estimulo nocivo para ellas. En este caso producido por

del tratamiento con el PBA 12-28 y PBA 25-35 iniciando el proceso de astrogliosis.

Cambios morfológicos asociados a cambios fisiológicos en los astrocitos por la influencia

de PBA han sido previamente reportados (Maragakis, N.J. & Rothstein, J.D. 2006; Wyss-Coray, T.

2003). En este trabajo los resultados obtenidos corroboran que el proceso de astrogliosis se puede

estar iniciando y por esta razón se observan cambios en las células que pueden evidenciarse por el

aumento de prolongaciones astrociticas en longitud y posiblemente en número. En las imágenes de

microscopía se observa mayor densidad celular en ciertas regiones de la superficie y apilameniento

en otras. Así, se identifica in vitro que producto de los tratamientos con los diferentes fragmentos

del péptido (PBA 1-40, PBA 12-28 y PBA 25-35) se llevan a cabo cambios morfológicos en los

astrocitos en todos los casos, induciéndose la activación glíal por efecto de los péptidos. Como

sucede en condiciones patológicas, los astrocitos pueden ser activados por las placas amiloides que

los rodean (Ryu, J.K. et al., 2004; Mohri, I. et al., 2007), por tanto PBA ha mostrado jugar un papel

importante en la activation de los astrocitos (Nagele, R.G. et al., 2003). Adicionalmente se ha

103

demostrado que algunas áreas de astrogliosis se colocalizan con placas amiloides, soportando la

vision de que los astrocitos responden a la deposición del péptido (Simpson, J. et al., 2008).

Figura 39. Cambios morfológicos de las células en cultivo primario en respuesta a la incubación con

PBA 1-40. En el panel B, se observan las células control y los paneles 1 M, 5 M y 10 M corresponden a

células tratadas con PBA 1-40 en estas concentraciones. Las imágenes son de microscopia óptica en 40X.

104




Los astrocitos corticales y del hipocampo se organizan en dominios constituidos por la

relación espacial de los procesos no superpuestos con interdigitación limitada de los procesos en las

células adyacentes en condiciones normales (Wilhelmsson, U. et al, 2006; Bushong, E.A. et al.,

2004; Halassa, M.M. et al., 2007). A este tipo de organización se le conoce como "mosaico". Así,

las prolongaciones astrocíticas crecen dentro de territorios exclusivos durante el desarrollo, cuando

los territorios neuronales y vasculares también se están estableciendo. Se estima que un dominio

abarca ~ 140.000 sinapsis en el cerebro de los roedores y 2.000.000 de sinapsis en el cerebro

humano (Bushong, E.A. et al., 2002; Oberheim, N.A. et al., 2008.). Cada dominio representa un

área que está bajo control de un único astrocito (Volterra, A. & Meldolesi, J. 2005). Estudios

estructurales han mostrado que un único astrocito envuelve un promedio de cuatro cuerpos celulares

neuronales con un límite máximo de ocho y que puede realizar de 300 a 600 contactos con dendritas

105

neuronales con un potencial de contacto con 36 espinas por dendrita (Halassa, M. M. et al., 2007).

Esta nueva visión estructural permite que se hable de “islas funcionales” en las cuales las

interacciones que un solo astrocito establece con diferentes neuronas vecinas, tienen la capacidad de

actuar como nodos de coordinación y modulación sináptica, mediada por la producción de

gliotransmisores. Nuestros resultados muestran que los astrocitos pierden sus “dominios

individuales” como consecuencia del tratamiento con el PBA, disipando sus dominios o redes

astrociticas, esto favorece la presencia de territorios "Mixtos" que potencian cambios en la

organización en la red de astroglial generando diferentes cambios funcionales asociados. Así, una

marcada pérdida de los dominios de organización astrocíticos, refleja que el proceso de astrogliosis

reactiva se puede estar emulando en el cultivo primario de astrocitos de rata. El hallazgo más

evidente fue el alto grado de superposición de estos dominios en todos los tratamientos con los PBA

1-40, PBA 25-35 y PBA 12-28, ninguno comparable con el control.

Otras hipótesis que ayudan a soportar estos resultados tienen que ver con alteraciones en

las membranas celulares, lo que favorece el proceso de internalización de PBA. Adicionalmente, la

activación de los astrocitos puede ser relacionada con el incremento de los niveles de expresión de

GFAP y S100B. GFAP está involucrado en el control de la forma y el movimiento de los astrocitos

(Pekny, M. 2006). También se sugiere que GFAP juega un papel importante en las interacciones

astrocito-neurona, como la modulación sináptica y el mantenimiento de la arquitectura de la barrera

hematoencefálica (Liedtke, W. et al., 1998, Brahmachari, S. et al., 2006). Cambios en morfología

de los astrocitos pueden inducir cambios funcionales que reduzcan la capacidad neuroprotectora de

estas células.

106




Por otra parte, los astrocitos son las células más numerosas en el cerebro y constituyen un

soporte fundamental en casi todas las actividades neuronales. La interacción neurona-glía-

endotelio, por ejemplo, es crítica en la fisiología de la barrera hematoencefálica, también es

fundamental en la regulación del micro-ambiente en el parénquima cerebral tanto en condiciones

fisiológicas como patológicas (solo para mencionar una función). En este sentido, el potencial

patológico de la glía es evidente en diferentes enfermedades. Esta hipótesis se pone de manifiesto

cuando se encuentran procesos tanto de atrofia glíal, como de astrogliosis reactiva hipertrófica

observados en neurodegeneración resultando en la demencia. Los astrocitos reactivos e

hipertróficos rodean las placas neuríticas, mientras que en todo el parénquima cerebral células

glíales pueden sufrir atrofia. Estos cambios pueden generar efectos deletéreos en la

107

plasticidad sináptica y alteraciones cognitivas, que se desarrollan antes de las alteraciones

neurodegenerativas (Rodriguez, J. et al., 2009).

6.3.3.2. Inmunocitoquímica

Estos experimentos se realizaron para demostrar si la interacción GS-PBA previamente

identificada por cromatografía de afinidad, ensayo de ELISA e inmunoprecipitación, efectivamente

se evidenciaba también en un modelo celular de cultivo primario de astrocitos de rata. Para lo cual

en placas de 12 pozos se sembraron 5000 células por cada pozo previamente cubiertos con una

placa para microscopia. En la figura 42A se observa el marcaje específico de GS, con localización

citosólica y en (42B) se identifica el marcaje para el fragmento PBA 1-40 en el citosol y mucho

más localizado en las prolongaciones astrocíticas. En (42C) se puede apreciar que PBA se

encuentra fuertemente asociado a la membrana y se observan los cuerpos celulares poco asociados

al marcaje del PBA.

(a) (b) (c)

Figura 42. Imágenes de microscopía confocal mostrando el doble marcaje para PBA 1- 40 1 M (rojo)

y GS (verde) en astrocitos. En la fotografía se observan en (a) astrocitos marcados con GS, (b) PBA 1-40

en rojo y (c) la superposición de las imágenes. Barra 5 m.

En la figura 43 y figura 44 se muestran las imágenes con 5 M y 10 los resultados son

similares a los anteriores. En todas las concentraciones de trabajo es evidente el fuerte marcaje de

PBA 1-40 asociado en membrana, con una señal muy baja a nivel del citosol, por lo tanto no se

108

evidencia co-localización con la enzima. La asociación de PBA 1-40 en las prolongaciones podría

estar relacionada con procesos de endocitosis, posiblemente mediado por vesículas celulares.

(a) (b) (c)

Figura 43. Imágenes de microscopía confocal mostrando el doble marcaje para PBA 1- 40 5 M (rojo)



(a) (b) (c)

Figura 44. Imágenes de microscopía confocal mostrando el doble marcaje para PBA 1- 40 10 M

(rojo) y GS (verde) en astrocitos. En la fotografía se observan en (a) astrocitos marcados con GS, (b)

PBA 1-40 en rojo y (c) la superposición de las imágenes. Barra 5 m.

109

En la figura 45A se observa el marcaje específico de GS con localización citosólica y en

45B se identifica el marcaje para el fragmento PBA 25-35, asociado a la localización citosólica, en

contraste con PBA 1-40. En 45C se muestra la superposición de las imágenes. Se observa la

captación del péptido por parte de los astrocitos, pero no están asociados con un marcaje

membranal. Sin embargo, no se aprecia co-localización GS-PBA 25-35 en este caso tampoco. En

la figura 46 y figura 47 se observan las imágenes para 5 M y 10 M, los resultados son similares al

tratamiento anterior. Marcajes para PBA 25-35, principalmente citosólicos, posiblemente

generados por un mecanismo de transporte del péptido independiente de la endocitosis y por tanto

no asociado a vesículas. Los blancos para los experimentos de inmuno-citoquímica fueron, para los

tres tratamientos células sin péptidos PBA, células con péptidos PBA, pero sin anticuerpo primario

y células con péptidos PBA sin anticuerpo secundario.

(a) (b) (c)

Figura 45. Imágenes de microscopía confocal mostrando el doble marcaje para PBA 25-35 1 M (rojo)



110

(a) (b) (c)




(a) (b) (c)

Figura 47. Imágenes de microscopía confocal mostrando el doble marcaje para PBA 25-35 10 M



111

Los marcajes obtenidos para los PBA 1-40 podrían estar mostrando vacuolas que

contienen el péptido y que se forman por un proceso de “endocitosis” del mismo modo como lo

explica Nuutinen y colaboradores (Nuutinen, T. et al., 2007) en una línea celular de astrocitoma

humano tratada con PBA 1-42 por 24 horas. Este hecho explicaría por qué no se evidencia co-

localización de GS-PBA en los astrocitos, debido a que la enzima es citosólica. En contraste con

PBA 25-35, cuya localización es citosólica y dada su marcada hidrofobicidad, se espera que el

mecanismo de captación a través de la membrana sea favorecido por procesos de difusión en el

lecho lipídico. Otra hipótesis, sugiere que los PBA pueden actuar formando poros en membranas

de células. Esto podría explicar el proceso de transporte del péptido del espacio extracelular al

interior del astrocito.

(a) (b) (c)




Los resultados para el PBA 12-28 se muestran en la figura 48A se observa el marcaje

específico de GS con localización citosólica y en 48B se identifica el marcaje para el fragmento

PBA 12-28. En 48C se muestra la superposición de las imágenes. En este caso se utilizó el

anticuerpo policlonal (Sigma A8326) que presenta débil reactividad cruzada por el fragmento PBA

12-28, por lo cual no se observa claramente el marcaje asociado al péptido, más bien se observa una

fluorescencia de fondo que no se puede asociar claramente a las células. En este caso los resultados

112

no nos permiten identificar localización alguna para PBA 12-28. En las figura 49 y 50 se presentan

las imágenes obtenidas con los tratamientos 5 M y 10 M, en estas se presenta la misma dificultad

expuesta anteriormente.

(a) (b) (c)




(a) (b) (c)




113

6.4. Discusión final

El desarrollo y la progresión de las enfermedades neurodegenerativas están determinados

por el balance entre la destrucción neuronal, la neuro-protección y la regeneración. En este

contexto, las células gliales están involucradas fuertemente en la neuropatología (Giaume, C. et al.,

2007; Panickar, K.S. & Norenberg, M.D. 2005). Los astrocitos en concordancia con sus funciones

homeostáticas, están profundamente implicados en las enfermedades neuronales. La astroglía

forma la primera línea de defensa del cerebro controlando el volumen, la composición del espacio

extracelular y el exceso de potasio para lograr el mantenimiento de la excitabilidad neuronal

(Kofuji, P. & Newman, E.A. 2004). Los astrocitos regulan las concentraciones de glutamato y de

esta forma limitan la excitotoxicidad inducida por este neurotransmisor (Danbolt, N.C. 2001),

además, regulan los movimientos de los fluidos y proveen de los principales sistemas antioxidantes

en el cerebro (Dringen, R. 2000). Pero al mismo tiempo las células gliales pueden contribuir al

daño neuronal, cuando la lesión compromete el metabolismo glíal, lo cual genera despolarización y

desregulación del sistema captador del glutamato, liberando glutamato adicional, exacerbando así el

daño.

Las lesiones agudas y crónicas en el cerebro desencadenan unas reacciones glíales

específicas, conocidas como astrogliosis reactiva, en las que se presenta una remodelación

compleja a nivel morfofuncional de los astrocitos (Pekny, M. & Nilsson, M. 2005). La astrogliosis

reactiva constituye una reacción defensiva del cerebro que tiene principalmente tres objetivos; el

aislamiento de la zona dañada del resto del tejido del SNC, la reconstrucción de la barrera

hematoencefálica y la facilitación de la remodelación de los circuitos cerebrales en zonas aledañas a

las regiones lesionadas (Butt, A.M. et al., 2005; Pekny, M. et al., 2007). En consecuencia la

astrogliosis se presenta en diferentes formas: los astrocitos circundantes a la lesión son sometidos a

una hipertrofia robusta y a proliferación, presentándose astrogliosis anisomorfa (sin preservación de

la morfología), que finalmente termina en la sustitución completa de las células lesionadas

existentes en la arquitectura del tejido constituyéndose una cicatriz glíal permanente. En los

astrocitos más distales a la lesión, los cambios reactivos son mucho más leves y aunque las células

astrogliales modifican su aspecto y se someten a múltiples cambios bioquímicos e inmunológicos,

estos no distorsionan la arquitectura normal del tejido nervioso central, sino más bien permiten el

crecimiento de las neuritas y la sinaptogénesis, lo que facilita la remodelación de las redes

114

neuronales. En este tipo de astrocitos la reacción se define como astrogliosis isomorfa (con la

preservación de la morfología) (Hamby, M.E. & Sofroniew, M.V. 2010).

El papel patológico de la astroglía en las demencias ha empezado a ser explorado

recientemente, sin embargo, algunas generalizaciones ya se han elaborado. En primer lugar, tanto la

astrogliosis como la distrofia astroglial se manifiestan en los diferentes tipos de demencia y ambos

procesos pueden desarrollarse paralelamente en función de la forma o la etapa de la enfermedad

misma. Por ejemplo en la demencia fronto-temporal, el grado de pérdida astroglial se correlaciona

directamente con la severidad de la demencia (Broe, M. et al., 2004). Otros estudios, utilizando

tejidos post-mortem a partir del 21 casos de demencia fronto-temporal, se encontraron procesos de

astrogliosis en la corteza frontal y temporal en las primeras etapas de la enfermedad, con aumento

de la densidad de los astrocitos por 4-5 veces de la control (Kersaitis, C. et al., 2004). Se ha

reportado también astrogliosis en demencia talámica en donde se presentan numerosas alteraciones

del protoplasma de los astrocitos, que se manifiestan por la proliferación altamente localizada de

procesos astrogliales perivasculares y perineuronales, lo que puede estar representando un cambio

patológico primario, facilitador de demencia severa, incluso sin pérdida neuronal (Potts, R. &

Leech, R.W. 2005). Del mismo modo, en la demencia asociada a la infección por el virus de

inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), se reconoce una significativa hipertrofia astroglial y el

aumento de la expresión de GFAP en la corteza entorrinal y el hipocampo (Vanzani, M.C. et al.,

2006). Por otra parte, hay indicios de que astrocitos reactivos infectados por el VIH-1, pueden

activar las células de microglia, y esto podría constituir la causa principal de daño neuronal, a través

de la liberación de deferentes factores pro inflamatorios (Deshpande, M. et al., 2005; Nardacci, R.

et al., 2005).

Una nueva conceptualización funcional y estructural de los astrocitos ha surgido en los

últimos 10 años. Así, se reconoce hoy que estos están organizados en dominios que no se

superponen (Wilhelmsson, U. et al., 2006). Aunque la importancia fisiológica de la organización de

dominio no se entiende todavía en detalle, este se puede definir como una unidad funcional que

integra la actividad de un conjunto amplio contiguo a las sinapsis. Algunas de las características

más importantes de los astrocitos como expresar receptores de glutamato, de GABA y la mayoría de

neuromoduladores respondiendo en una escala de tiempo a estos estímulos y a su vez, la capacidad

de las células para liberar gliotransmisores como ATP, D-serina y el glutamato, modulando la

transmisión sináptica. Son solo algunas de las funciones que hoy se entienden en el contexto de este

nivel de organización superior. Por tanto, los cambios en la estructura de los astrocitos y la pérdida

de la organización de los dominios son paralelos a los cambios funcionales y se dan en la

115

astrogliosis. Estudios en humanos y roedores han mostrado que los astrocitos reactivos regulan a la

baja del transportador de glutamato GLT-1, así como la glutamina sintetasa en la epilepsia

(Mathern, G.W. et al, 1999; Samuelsson, C. et al., 2000; Maragakis, N.J. & Rothstein, J.D. 2004).

Esto puede conducir a un aumento de glutamato en astrocitos que resulta en su liberación excesiva,

provocando la despolarización sincronizada de grupos de neuronas, o los cambios de la

despolarización paroxística (Tian, F. et al., 2005).

Las secuencias PBA 1-40 y PBA 1-42 corresponden a una parte de la región hidrofóbica de

la proteína precursora amiliode (PPA672-712 y 672-714) y constituyen los péptidos encontrados en las

lesiones características en la EA. Mucho se ha discutido sobre la capacidad que tienen los

astrocitos de internalizar el PBA. Sin embargo, se sabe que en este proceso podrían estar

implicados los receptores de lipoproteínas de baja densidad y la proteína relacionada con receptores

de lipoproteínas de baja densidad (LDLR/LRP1) en un proceso de endocitosis mediada por receptor

(Koistinaho, M. et al., 2004). Otros estudios muestran que la acumulación de PBA fibrilar se asocia

con vesículas citoplasmáticas en los astrocitos humanos y con el aumento de ApoJ / clusterina

(Nuutinen, T. et al., 2007), involucrando una vía de endocitosis que favorece fagocitosis del PBA

fibrilar (Bartl, M.M. et al., 2000). Sin embargo, el papel de los astrocitos podría estar relacionado

con la degradación de PBA, posiblemente por la actividad de metaloproteasas (Yin, K.J. et al.,

2006). En este trabajo se explora la hipótesis de que la glutamina sintetasa astrocítica interactúa con

el PBA en cultivo primario de astrocitos. Previamente se ha mostrado dicha interacción entre estas

dos especies moleculares utilizando diferentes métodos. Se inmovilizó el PBA a un soporte de

sepharosa NHS y se logró purificar la enzima de una mezcla de proteínas, obteniéndose una banda

correspondiente al peso molecular del monómero de la enzima. Adicionalmente se hizo interactuar

la enzima purificada con el péptido y se identificó la formación de agregados detectados en ensayos

fluorométricos. Se hizo inmunoprecipitación de estos complejos y se caracterizaron. Sin embargo,

estos resultados cobran importancia cuando se dimensiona la función que tiene la enzima en la

compartimentalización del sistema glutamato-glutamina. Diversas observaciones sugieren que la

actividad de la GS empieza a disminuir a principios de EA (durante la fase de deterioro cognitivo

leve), con la resultante elevación de los niveles de amoniaco extracelular, lo que provoca estrés

oxidativo e inflamación, disminuyendo aún más la actividad de la GS y amplificando la cascada de

neurodegeneración. Se ha descrito también que PBA actúa sobre proteínas causando nitrosilación,

induciendo estrés nitrosativo (Häussinger, D. et al., 2005). El tratamiento con N-acetilcisteína, un

antioxidante y precursor del glutatión, reduce el estrés oxidativo en el cerebro por lo tanto muchos

de sus efectos neurotóxicos son relacionados con una alteración de las funciones que normalmente

son dependientes de potasio, tales como el potencial de reposo celular (Bosoi, C.R. & Rose, C.F.,

116

2009). Debido a que las membranas plasmáticas de astrocitos contienen una densidad mucho mayor

de canales de potasio que las membranas de las neuronas, los astrocitos son el principal sitio de

absorción de amonio, y en circunstancias normales protegen a las neuronas de la toxicidad del

amonio, como se ha demostrado en cocultivos (Rama Rao, K.V. et al., 2010).

Dos consecuencias del aumento de la concentración de amonio son: en primer lugar,

numerosos estudios en cultivo celular y en modelos animales de insuficiencia hepática aguda han

permitido establecer que los niveles elevados de amonio activan la microglía y aumentan la

producción de citoquinas inflamatorias, en particular la expresión de TNF , IL-6 e IL-1

(Mandrekar, S. et al., 2009). Además, el tratamiento con agentes anti-inflamatorios, como la

indometacina y la minociclina, ayuda a proteger a las células de la toxicidad por amonio (Rama

Rao, K.V. et al. 2010). En segundo lugar, estos modelos también han demostrado que el aumento de

la concentración de amonio, favorece la peroxidación en los lípidos y un agotamiento de las

reservas de glutatión reducido (GSH). El estrés oxidativo se asocia con el aumento de la

producción de superóxido y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (Rama Rao, K.V. et al. 2010).

Proteínas como GS se han encontrado nitrosiladas e inactivadas, lo que indica que los astrocitos son

un blanco principal del amonio, induciendo estrés nitrosativo (Kruczek, C. et al., 2002). Otros

estudios utilizando cultivo primario de astrocitos de rata tratados con PBA 1-40 y PBA 1-42

mostraron una significativa reducción de la actividad de captación de glutamato y aspartato,

ocasionada por los péptidos directamente, o sus productos; es decir, por especies reactivas de

oxigeno (ERO) que pueden actuar a través de un sitio alostérico de los transportadores, modificando

su estructura, configuración y actividad o por modulación de las rutas de señalización por proteínas

quinasas activadas por mitógenos (Matos, M. et al., 2008).

Nuestros resultados no solamente corroboran las evidencias de la interacción de GS y PBA.

En este trabajo reportamos que la secuencia PBA 25-35 podría ser la responsable de la interacción

entre las dos especies moleculares. Adicionalmente logramos emular en condiciones

experimentales de los primeros cambios morfológicos que están asociados con el proceso de

activación astroglial y que fueron evidentes en las imágenes de microscopia óptica. Dando como

consecuencia cambios funcionales potenciados por el PBA. Estas observaciones sugieren que existe

una relación entre la interacción de la enzima con PBA y la formación de la placa amiloide.

Aunque no se realizaron las pruebas de actividad enzimática de las células en los distintos

tratamientos, es posible que PBA induzca inactivación de la enzima. Esto podría evidenciarse con el

compromiso en la toxicidad por glutamato y amonio.

117

7. Conclusiones

1. En este trabajo se hizo la estandarización de un nuevo protocolo de purificación de la enzima

glutamina sintetasa de cerebro de rata.

2. Se demostró la interacción de la enzima purificada con dos fragmentos del péptido beta amiloide

correspondientes a las secuencias PBA 1-40 y PBA 25-35. Dados nuestros resultados podemos

afirmar que en los dos casos la secuencia responsable de esta interacción es la PBA 25-35.

3. Nuestros resultados permiten afirmar que todos los fragmentos utilizados presentan capacidad de

auto-agregación. Adicionalmente PBA1-40 y PBA 25-35 pueden favorecer interacciones con GS

purificada y potenciar mecanismos de co-agregación.

4. A nivel celular el modelo no nos permite identificar co-localización de las dos especies

moleculares.

118

8. Recomendaciones

Estan direccionadas a robustecer el trabajo a nivel celular a fin de poder llegar a entender las

implicaciones fisiológicas de esta interacción. Así, proponemos las siguientes recomendaciones a

favor de continuar la línea de trabajo:

1. Identificar por medio de un de marcador molecular específio de vesículas la presencia del PBA a

nivel intravesicular.

2. Realizar ensayos de actividad en presencia de PBA a fin de verificar su actividad de la enzima en

estas condiciones experimentales.

3. Utilizar un modelo celular que pueda sobre expresar el PBA, la GS de forma controlada y medir

otros indicadores, por ejemplo daño mitocondrial, estrés oxidativo y cambios en proteínas o lípidos.

119

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