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EVALUACIÓN LARVICIDA DEL EXTRACTO ETANOLICO DE LA SEMILLA
DE Carica papaya SOBRE LARVAS DEL IV ESTADIO DE Aedes aegypti
(DIPTERA: CULICIDAE) EN CONDICIONES DE LABORATORIO.
NATALIA ROCÍO GÓMEZ GUTIÉRREZ
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES
TECNOLOGIA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL
BOGOTÁ D.C.
2015
2
EVALUACIÓN LARVICIDA DEL EXTRACTO ETANOLICO DE LA SEMILLA
DE Carica papaya SOBRE LARVAS DEL IV ESTADIO DE Aedes aegypti
(DIPTERA: CULICIDAE) EN CONDICIONES DE LABORATORIO.
NATALIA ROCÍO GÓMEZ GUTIÉRREZ
20112085081
Trabajo en modalidad de investigación presentado como requisito parcial
para optar al título de tecnóloga en saneamiento ambiental.
Director:
DIEGO TOMAS CORRADINE MORA
Médico Veterinario – MSc. en Salud Pública
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES
TECNOLOGIA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL
BOGOTÁ D.C.
2015
3
Nota de aceptación:
______________________________
______________________________
______________________________
______________________________
______________________________
Firma del director
______________________________
Firma del jurado.
Bogotá D.C 2015
4
DEDICATORIA
“El presente proyecto es dedicado a todas las personas que me acompañaron
en el proceso de investigación, a mis padres por el apoyo que me brindaron
durante todo mi formación, a mi hija quién me ha dado las fuerzas para
continuar y realizar los proyectos iniciados en mi vida y en especial a Dios por
permitirme haber llegado aquí a pesar de las dificultades que se presentaron”
.
5
AGRADECIMIENTOS
Agradezco principalmente al director del presente proyecto el profesor y médico
veterinario Diego Tomas Corradine Mora, por acompañarme durante todo el
proceso mediante sus enseñanzas, explicaciones, colaboración y paciencia en
la realización del trabajo investigativo brindándome un gran apoyo para
culminarlo. Igualmente a mis compañeros y docentes que me colaboraron de
alguna manera en la realización del proyecto.
6
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ....................................................................................................... 10
ABSTRACT ...................................................................................................... 11
INTRODUCIÓN ................................................................................................ 12
1. OBJETIVOS ................................................................................................. 14
1.1Objetivo general ................................................................................................. 14
1.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 14
2. MARCO TEORICO ................................................................................................. 15
2.1 Aedes aegypti ....................................................................................................... 15
2.2 Morfología................................................................................................... 15
2.2.1 Características del huevo ........................................................................ 15
2.2.2 Larva ....................................................................................................... 16
2.2.3 Pupa ........................................................................................................ 17
2.2.4 Adulto ...................................................................................................... 17
2.3 Dengue ....................................................................................................... 18
2.3.1 Concepto ................................................................................................. 18
2.3.2 Etapas clínicas enfermedad .................................................................... 19
2.3.4 Cuadro Clínico ......................................................................................... 20
2.4 La Papaya (Carica papaya) ........................................................................ 20
2.4.1 Origen ...................................................................................................... 20
2.4.2 Taxonomía y clasificación ....................................................................... 20
2.4.3 Descripción general ........................................................................................ 21
2.4.4 Composición química ............................................................................... 22
2.4.5 Usos ........................................................................................................ 22
2.5 Bioinsecticidas ............................................................................................ 22
2.6 Antecedentes ............................................................................................. 23
3. METODOLOGIA ........................................................................................... 26
3.1 Crianza de larvas ....................................................................................... 26
7
3.2 Preparación del extracto............................................................................. 26
3.3 Bioensayos ................................................................................................. 27
3.4 Evaluación de mortalidad ........................................................................... 27
3.5 Evaluación del efecto residual del extracto ................................................ 27
3.6 Análisis estadístico ..................................................................................... 28
4. RESULTADOS ............................................................................................. 29
4.1 Bioensayos ................................................................................................. 29
4.1.1 Corrección mortalidad de bioensayos por la ecuación de Abbott ............ 29
4.1.2 Resultados mortalidades obtenidos en los bioensayos ........................... 29
4.2 Bioensayos efecto residual ......................................................................... 31
4.2.1 Corrección mortalidad de bioensayos efecto residual por la ecuación de Abbott ............................................................................................................... 31
4.2.2 Resultados mortalidades obtenidos en los bioensayos efecto residual ... 31
4.3 Análisis de tiempos letales TL50 y TL90 .................................................... 33
5. ANÁLISIS ESTADISTICO ............................................................................ 35
5.1 Análisis de regresión logarítmica, para el cálculo de las concentraciones letales LC50 y LC90 ......................................................................................... 35
5.2 ANOVA de un factor ................................................................................... 36
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS ...................................................................... 38
CONCLUSIONES ............................................................................................. 41
RECOMENDACIONES .................................................................................... 42
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 43
ANEXOS .......................................................................................................... 46
8
INDICE DE TABLAS
Tabla No 1 Corrección mortalidad de bioensayos por la ecuación de Abbott .. 29
Tabla No 2 Corrección mortalidad de bioensayos efecto residual por la
ecuación de Abbott ........................................................................................... 31
Tabla No 3 Estimaciones de los parámetros .................................................... 35
Tabla No 4 Análisis de ANOVA de un factor ................................................. ...37
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A Registro fotográfico ......................................................................... 46
ANEXO B Formato mortalidad de los bioensayos ............................................ 50
ANEXO C Formato mortalidad de los bioensayos efecto residual ................... 51
ANEXO D Tabla límites de confianza ............................................................... 52
9
INDICE DE FIGURAS
Figura 1Ciclo de vida de Aedes aegypti ........................................................... 15
Figura 2 Huevo de Aedes aegypti .................................................................... 16
Figura 3 Estadio larvario de Aedes aegypti ...................................................... 16
Figura 4 Pupa de Aedes aegypti ...................................................................... 17
Figura 5 Adulto de Aedes aegypti .................................................................... 18
Figura 6 Evolución de la enfermedad del dengue ............................................ 19
Figura 7 Fruto, semillas, hoja y flor de Carica papaya ..................................... 21
Figura 8 Ecuación de Abbott ............................................................................ 28
Figura 9 Mortalidades obtenidas en los bioensayos efecto residual ............... 32
Figura 10 Determinación tiempos letales (T50 y TL90), mediante la
comparación de mortalidad de larvas en cada concentración y el tiempo ....... 34
Figura 11 Relación porcentaje mortalidad y dosis utilizadas con línea de
tendencia logarítmica de la ecuación y= 2.609*log (dosis) – 4.405 .................. 36
10
RESUMEN
El presente proyecto tiene como finalidad evaluar el efecto larvicida del extracto
Etanolico de semillas de Carica papaya sobre larvas de IV estadio de Aedes
aegypti en condiciones de laboratorio, para generar alternativas naturales en el
control del vector del Dengue.
En la metodología se llevaron a cabo seis bioensayos con diferentes
concentraciones del extracto Etanolico de semillas de Carica papaya de 50,
100, 250, 500, 750 y 1000 ppm con cuatro repeticiones cada una, con 100
especímenes por bioensayo y un grupo testigo al que solo se le puso agua
declorinada para comparar la mortalidad en las larvas sometidas a los
tratamientos experimentales y la mortalidad natural sin exposición. Se
realizaron lecturas a las 0, 2, 12, 24, 36, y 48 horas post exposición para la
observación de las mortalidades en cada uno de los bioensayos.
Posteriormente se llevó a cabo una evaluación de efecto residual del extracto
de C. papaya con repoblación quincenal de especímenes en las mismas
condiciones iníciales y así determinar la disminución de la toxicidad del extracto
diluido en el agua con el paso del tiempo.
Las mortalidades de los bioensayos de los extractos Etanolico de semillas de
Carica papaya a 50, 100, 250, 500, 750 y 1000 ppm al cabo de 48 horas
fueron de 46%, 87%, 95%, 99%, 100% y 100% respectivamente. Se determinó
por medio del modelo probit la LC50 de 48,8 PPM y LC 90 de 151,2 ppm.
Para los tiempos letales del 50% (TL50) y del 90% (TL90), se encontró que
TL50 fueron entre 5 a 8 horas y TL90 entre 10 a 12 horas, donde disminuye el
tiempo letal al aumentar la concentración. Finalmente se corroboró por medio
del análisis de ANOVA de un factor que las concentraciones sí inciden en las
mortalidad de las larvas de Aedes aegypti y se concluye que el extracto de
Carica papaya tiene una alta efectividad larvicida en concentraciones
superiores a 100 ppm.
En cuanto al efecto residual las mortalidades fueron menores a las iníciales,
siendo 0%, 8%, 11%, 14%, 19% y 23% respectivamente a las concentraciones
ya mencionadas, por lo que se evidencia la degradación del extracto con el
paso del tiempo, asegurando el uso de este en medios acuáticos para el control
de Aedes aegypti.
PALABRAS CLAVE: Control biológico, Carica papaya, bioplaguicida, control
botánico, bioensayo, Aedes aegypti, salud pública.
11
ABSTRACT
The following project aims to evaluate the larvicidal effect of ethanol extract of
Carica papaya seeds on Aedes aegypti larvae of IV stage in laboratory
conditions, to generate natural alternatives on controlling the dengue vector.
In the methodology were conducted six bioassays with different concentrations
of ethanol extract of Carica papaya seeds 50, 100, 250, 500, 750 and 1000
PPM with four repetitions each, using 100 specimens by bioassay and a control
group that only got dechlorinated water to compare mortality in the larvae
subjected to experimental treatments and natural mortality without exposure.
Readings were taken at 0, 2, 12, 24, 36, and 48 hours post exposure for the
observation of mortality in each of the bioassays. Subsequently it conducted an
evaluation of residual effect of C. papaya extract with fortnightly repopulation of
specimens in the same initial conditions and thus determine the toxicity
decrease of the extract diluted in water with the passage of time.
Mortality rates in the bioassays of the ethanolic extracts of Carica papaya seeds
in 50, 100, 250, 500, 750 y 1000 PPM after 48 hours were 46%, 87%, 95%,
99%, 100% y 100% respectively. It was determined by the probit model LC50
48.8 ppm and 151.2 LC 90 PPM.
For lethal times 50% (TL 50) and 90% (TL90), it was found that TL50 was
between 5 to 8 hours and TL90 between 10 to 12 hours , wherein the lethal time
decreases by increasing the concentration. Finally it was corroborated through
ANOVA analysis of a factor that the concentrations affect the mortality of Aedes
aegypti larvae and it is concluded that the extract of Carica papaya has a high
larvicidal effectiveness in concentrations above 100 ppm.
As for the residual effect the mortalities were lower than initial, with 0%, 8%,
11%, 14%, 19% y 23% respectively to the aforementioned concentrations,
therefore the extract degradation is evident with the passage of time, ensuring
the use of this in aquatic environments for control of Aedes aegypti.
Key words: Biological control, Carica papaya, biopesticide, botanical control,
bioassay, Aedes aegypti, public health
12
INTRODUCCIÓN
En las últimas décadas ha aumentado enormemente la incidencia de dengue
en el mundo. Más de 2500 millones de personas- más del 40% de la población
mundial- están en riesgo de contraer el dengue (OMS, 2013).
En Colombia se han notificado en el Sistema de Vigilancia Salud Pública
(SIVIGILA) del Instituto Nacional de Salud, hasta la semana epidemiológica (16
de febrero de 2013): 12882 casos totales de dengue, de los cuales 12549
corresponden a dengue y 333 a dengue grave (Instituto Nacional de Salud,
2013). Por tal motivo se toman acciones nacionales de prevención y control
que impidan la propagación de la enfermedad.
Los procesos que se desarrollan en el país con respecto a lo mencionado
anteriormente, son medidas de control sobre casos y contactos donde
personas infectadas deben ser hospitalizadas y tratadas; medidas vectoriales
donde se utilizan larvicidas en periodos en que se presenta la enfermedad e
insecticidas en situación de pandemia con el fin de controlar el único vector
responsable del dengue que es Aedes aegypti (Instituto Nacional de Salud y
Ministerio de Protección Social, S.F).
Los insecticidas y larvicidas para controlar el dengue son productos
organofosforados y carbamatos muy utilizados por varios países de
Suramérica y Centro América y por supuesto Colombia donde el clima es
propicio para el crecimiento óptimo del mosquito Aedes aegypti. Sin embargo
varios estudios hechos en diferentes zonas tropicales han demostrado que las
colonias de mosquitos son resistentes o susceptibles a varios insecticidas entre
ellos los temefos, uno de los más utilizados en nuestro país para el control de
dengue (Pérez y Molina, 2009). No obstante el control que existe sobre los
vectores son productos químicos que son perjudiciales para el ambiente y van
perdiendo su efectividad, por tal motivo se buscan métodos efectivos que no
generen residuos tóxicos y que estén al alcance.
Estas alternativas de control buscan que sean de origen natural, provenientes
de plantas como lo es la papaya (Carica papaya) una fruta que ha sido utilizada
para investigaciones especialmente la hoja como antimalaria (Kovendan, et al.,
2012) y efecto larvicida (Kovendan, et al., 2013); la semilla que ha sido
utilizado para contrarrestar el crecimiento de algunos especies que dañan los
cultivos con diferentes variedades de semilla de Carica papaya logrando alta
mortalidad de las larvas (Franco, Jimenez, luna y Figueroa, 2006). Y también
se reporta el uso de la semilla por su efecto insecticida que tradicionalmente se
utilizan sobre larvas Culex tarsalis (Villegas, et al., 2013)
13
El presente proyecto buscó alternativas naturales en el control del vector Aedes
aegypti (Díptera: Culicidae) para disminuir y controlar el crecimiento de casos
de personas contagiadas por la enfermedad del Dengue, donde se generó una
evaluación sobre el extracto en la acción larvicida fomentado el avance
biológico para contrarrestar los insecticidas sintéticos utilizados actualmente en
el país; con la utilización del extracto etanolito de la semilla de Carica papaya
siendo amable con el ambiente y de fácil acceso. Proceso que se llevó a cabo
sobre larvas en IV estadio en condiciones de laboratorio.
14
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
Evaluar el efecto larvicida del extracto de semillas de la fruta Carica papaya en
diferentes concentraciones sobre larvas de IV estadio del mosquito Aedes
aegypti (Dipteria: Culicidae) en condiciones de laboratorio.
1.2 Objetivos específicos
1, Evaluar la eficiencia del larvicida biológico del extracto de semillas de
Carica papaya a concentraciones de 50, 100, 250, 500, 750 y 1000 ppm.
2, Evaluar la acción residual del extracto de semillas de Carica papaya en
aguas tratadas con repoblación quincenal.
3, Evaluar la acción larvicida de los extractos de semillas de Carica papaya en
los tiempos 0, 2, 12, 24, 36 y 48 horas para determinar los tiempos letales TL50
y TL95
4. Determinar las concentraciones letales LC50 y LC90 del extracto del extracto
Etanolico de Carica papaya, sobre larvas de Aedes aegypti.
15
2. MARCO TEORICO
Para el proceso de la investigación se tuvo en cuenta información acerca del
vector a tratar, su comportamiento y morfología; los componentes y distribución
del fruto de Carica papaya; concepto, cuadro clínico y etapas de la enfermedad
transmisora del mosquito Aedes aegypti y la enfermedad del dengue.
2.1 Aedes aegypti
El ciclo completo del mosquito Aedes aegypti está comprendido en cuatro
estados de desarrollo: huevo. Larva, pupa y adulto.
Figura 1. Ciclo de vida de Aedes aegypti
Fuente: Almirón, Walter. (2009) Aedes aegypti. Archivo PDF
2.2 Morfología
2.2.1 Características del huevo
La morfología del huevo de Aedes aegypti tiene una forma elíptica, alargada
inicialmente luego de la ovoposición es de color blanca, que luego se oscurece
pasadas unas horas, se caracteriza porque la hembra coloca individualmente
en la paredes del recipiente con agua donde puede durar entre 7 meses a un
año en condiciones de humedad hasta que sea inundable por lo cual es
resistente a la desecación y altas temperaturas. Su tamaño varía entre 0.6 mm
a 0.8 mm de longitud y 0.25 mm en diámetro. El desarrollo como huevo varía
según las condiciones externas como la temperatura (Almirón, 2009)
16
Figura 2 Huevo de Aedes aegypti
Fuente: University of Florida. 2013
2.2.2 Larva
Las larvas son estrictamente acuáticas donde tienen gran movilidad. Su cuerpo
está divido en tres partes: cabeza, tórax y abdomen. La cabeza es rectangular
de color uniforme, presenta en ella antenas y piezas bucales, estas últimas le
permiten alimentase de microorganismos, detritos orgánicos como animales y
vegetales presentes en el agua. Además en la parte terminal del abdomen
tiene los orificios respiratorios ubicados al final del sifón dorsal; el sifón es
perpendicular al eje del cuerpo de la larva (Almirón, 2009)
El tamaño de la larva es de aproximadamente 15 mm de longitud después de
su tercera muda. Su máximo tamaño es de 20 mm la cual depende de la
nutrición de la especie (Almirón, 2009)
La duración en estado larval dura entre 8 a 10 días, tiempo en el cual muda su
exoesqueleto tres veces pasando por cuatro estadios larvarios donde aumenta
su tamaño cada vez que muda, y finalmente cuando la larva muda del cuarto
estadio pasa a pupa (Almirón, 2009)
Figura 3 Estadio larvario de Aedes aegypti
Fuente: Bar, María. S.F, El Aedes aegypti y la transmisión del dengue.
17
2.2.3 Pupa
En estado pupa también es estrictamente acuático, donde se presentan los
cambios de trasformación para llegar a adulto. La pupa no se alimenta por lo
cual su trasformación es gracias a la energía acumulada durante el estadio
larval. Este periodo dura alrededor de 2 a 3 días, luego la pupa flota
extendiendo el abdomen casi paralelo a la superficie donde el adulto emerge
fuera del agua (Almirón, 2009)
Con respecto a su morfología se caracterizan por tener una estructura llamada
cefalotórax donde se encuentran las trompetas respiratorias. Seguido del
abdomen que limitan los movimientos siendo enérgicos y activos; sin embargo
permanece la mayor parte inmóvil (Almirón, 2009)
Figura 4 Pupa de Aedes aegypti
Fuente: University of Florida. 2013
2.2.4 Adulto
La última etapa es la de adulto donde su apariencia es pequeña, delgado y
patas largas. El tamaño de la hembra es mayor que la del macho que oscila
entre 0.5 a 2 cm. La coloración de mosquito es oscura, con franjas plateadas
en las patas y rayas en el dorso. Prefiere los sitios húmedos con poca corriente
de aire donde permanecen en reposo (Almirón, 2009)
18
Durante 24- 48 horas después de salir de la pupa continua completando su
transformación para la adaptación al medio terrestre donde el macho debe
cambiar su rotación genital, después de completado le es posible aparearse.
Los machos se alimentan de sustancias azucaradas como el néctar y exudados
de frutos que les sirve para obtener energía para volar. Mientras que en las
hembras su alimentación es hematófaga durante 2 a 4 días después de
emerger, ya que lo requiere para la ovoposición. La picadura de la hembra
sobre el huésped se realiza primero inyectando saliva para anestesiar la herida
y anticuagular la sangre para luego succionarla, en este suceso ocurre la
transmisión de enfermedades zoonóticas como el dengue y fiebre amarilla
(Almirón, 2009)
Figura 5 Adulto de Aedes aegypti
Fuente: Bar, María. S.F, El Aedes aegypti y la transmisión del dengue.
2.3 Dengue
2.3.1 Concepto
Es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos que se ha propagado
rápidamente en todas las regiones de la OMS en los últimos años. El virus del
dengue se transmite por mosquitos hembra principalmente de la especie Aedes
aegypti y, en menor grado, de A. albopictus. La enfermedad está muy
extendida en los trópicos, con variaciones locales en el riesgo que dependen
en gran medida de las precipitaciones, la temperatura y la urbanización rápida
sin planificar (OMS, 2005)
19
El dengue es ocasionado por cualquiera de cuatro serotipos de virus que no
desencadenan inmunidad cruzada, lo cual significa que una persona puede
infectarse y enfermar hasta cuatro veces. Su período de incubación gira
alrededor de los 7 días. La infección que causa el virus resulta en un amplio
espectro de presentaciones clínicas, que van desde formas asintomáticas y
subclínicas hasta cuadros muy graves con compromiso vascular, afección de
órganos y sistemas que se asocian a mortalidad (Guzmán, 1999, citado en el
Instituto Nacional de salud, 2010)
2.3.2. Etapas clínicas enfermedad
El curso de la enfermedad del dengue tiene tres etapas clínicas:
Etapa febril; la única para la inmensa mayoría de los enfermos.
Etapa crítica.
Etapa de recuperación
Figura 6 Evolución de la enfermedad del dengue
(Instituto Nacional de salud, 2010)
La etapa febril: es variable en su duración y se asocia a la presencia del virus
en sangre (viremia). Como en otras enfermedades, la evolución hacia la
curación pasa por la caída de la fiebre y durante la misma el enfermo va a tener
20
sudoración, astenia o algún decaimiento, toda esta sintomatología es transitoria
(Instituto Nacional de salud y Organización Panamericana de la Salud, 2010)
La caída de la fiebre se asocia al momento en que el paciente se agrava, y la
defervescencia (transición de la etapa febril a la etapa afebril), anuncia el inicio
de la etapa crítica de la enfermedad (Instituto Nacional de salud, 2010)
La etapa crítica coincide con la extravasación de plasma y su manifestación
más grave es el choque, que se evidencia con frialdad de la piel, pulso filiforme,
taquicardia e hipotensión. A veces, con grandes hemorragias digestivas
asociadas, así como alteraciones hepáticas y quizás de otros órganos. El
hematocrito se eleva en esta etapa y las plaquetas que ya venían
descendiendo alcanzan sus valores más bajos. En la etapa de recuperación
generalmente se hace evidente la mejoría del paciente, pero en ocasiones
existe un estado de sobrecarga líquida, así como alguna coinfección bacteriana
(Instituto Nacional de salud, 2010)
2.3.3. Cuadro Clínico
Generalmente la primera manifestación clínica es la fiebre de intensidad
variable, aunque puede ser antecedida por diversos pródromos. La fiebre se
asocia a cefalea, dolor retroocular, artralgias, mialgias que es el cuadro
conocido como dengue sin signos de alarma (Instituto Nacional de salud, 2010)
2.4 Papaya (Carica papaya)
Referido a la descripción general tomado por el trabajo conjunto con el
Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) y Proexport Colombia (Calderón y
Cepeda, 1999)
2.4.1 Origen
Como expone Calderón y Cepeda (1999) la papaya fue descubierta por el
conquistador español Hernán Cortes al sur de los Estados de Tobasco y
Yucatán en el año 1519. Cada vez que se expandían, los dominios y la
influencia española, la papaya fue conocida en otras regiones hasta llegar a
Filipinas, África y Occidente
2.4.2 Taxonomía y clasificación
Es una planta de la familia Caricaceae, compuesta por cuatro géneros a saber:
Carica, Cylicomorpha, Jacaratia y Jarilla. Todas son originarias de los trópicos
americanos, con la excepción del Cylicomorpha, que es originario de África
Ecuatorial. El género Carica es el más importante y entre las 21 especies, C.
papaya es la de mayor importancia económica (Calderón y Cepeda 1999)
21
Figura 7 Fruto, semillas, hoja y flor de Carica papaya
Fuente: Advantages of Paw Paw or Carica papaya on Skin (2012). Essenzzahealth.
2.4.3 Descripción General
La Carica papaya es una planta arbustiva de tronco hueco, que alcanza 8 a 10
metros de altura y rara vez se ramifica. Esta especie es polígama y presenta
formas hembras, machos y hermafroditas. Hay muy pocas especies, tales
como C. goudotiana, de clima templado, que se ramifica libremente y por lo
general son de baja altura (Calderón y Cepeda 1999).
Árbol: la papaya es una planta con un tallo erecto y una corona de hojas
grandes, anchas, palmeadas y lobuladas y de color verdoso. Hay líneas
ocasionales de papayas que producen ramas laterales abundantes. El tallo es
hueco, la corteza es lisa con prominentes cicatrices de las hojas, los peciolos
de las hojas maduras varían aproximadamente entre 45 a70 cm entre una y
otra, según la variedad.
Flores: son producidas en inflorescencia, cimosas modificadas que aparecen
en las axilas de las hojas, el tipo de inflorescencia depende del sexo del árbol y
del tipo de las flores. La estructura de las flores permite la fácil polinización
tanto por el viento como por los insectos (Calderón y Cepeda 1999)
Fruta: se parecen a los melones en sus características superficiales, son
esféricas, periformes, ovaladas y alargadas en su forma. La fruta está
compuesta por cinco carpelos en su presentación parental: los carpelos se
unen para formar la cavidad.
El peso de la fruta varía desde 250 gramos hasta 7 kilogramos, los colores de
la pulpa de las frutas varían entre amarillo anaranjado pálido y amarillo
22
anaranjado fuerte y rojo. La cavidad varía entre estrellado y redondo”
(Calderón y Cepeda 1999)
2.4.4 Composición Química
La composición que tiene la Carica papaya son por carotenoides siendo los
pigmentos orgánicos que le aportan el color a la planta, papaína (enzima
proteolítica), chimopapaína, pectina, ácidos grasos, bencilisotiocianato entre
otras (Fonnegra y Jiménez, 2007)
2.4.5 Usos
El uso de la papaya es muy utilizado en la medicina tradicional no solo de la
fruta sino también de diferentes partes de la planta. La papaya es muy
conocida principalmente de su fruto el poder digestivo ya que aporta fibra que
favorece el proceso, sin embargo sus usos son también como hipotensor,
antiinflamatorio, antidiarreico y el fruto verde empleado en curación de heridas
(vulnerario), antitusivo, digestivo y vermífugo.
Las raíces se utilizan como diurético. Las hojas y semillas se usan como
antihelmínticas. Siendo las hojas empleadas como antimalárico y antiasmático.
Igualmente las enzimas de la planta se utilizan para curar las heridas y
enfermedades oculares (Fonnegra y Jiménez, 2007)
2.5 Bioinsecticidas
Los insecticidas químicos de síntesis siguen siendo un eficaz medio de lucha
antiparasitaria, en agricultura, en el medio forestal, en el ambiente doméstico y
en los espacios verdes controlados. Como consecuencia de las crecientes
preocupaciones sociales relacionadas con los efectos medioambientales y de
los problemas sanitarios planteados con los insecticidas, y a pesar de los
constantes esfuerzos dedicados a la puesta a punto de nuevas opciones de
defensa, parece claro que los insecticidas químicos permanecerán como piedra
angular en la lucha contra los insectos durante, al menos, un decenio
(Benbrook, 1996. Citado por Regnault, Pilogene y Vincent, 2004)
Las opciones de sustituir los insecticidas sintéticos que están orientadas a
tomar nuevas variedades transgénicas de plantas cultivadas obtenidas por
ingeniería genética, incluir los pesticidas microbianos como (Bacillus
thurigiensis, báculo virus entomopatógenos), las feromonas (alteración del
comportamiento de la cópula, captura y eliminación) y los insecticidas de origen
vegetal. Los insecticidas de origen vegetal (piretrinas, rotenona, nicotina, etc.)
fueron los primeros insecticidas utilizados por los agricultores y existen algunos
artículos publicados hace cientos de años pero que fueron reemplazados
rápidamente por los insecticidas sintéticos por su eficacia, acción prolongada,
persistencia y facilidad de empleo. Sin embargo actualmente se replantea el
23
interés por el descubrimiento, la puesta a punto y la utilización de agentes
naturales en la protección de los cultivos (Regnault, et al., 2004)
2.6 Antecedentes
Se tendrá en cuenta varios artículos científicos para la realización de este
proyecto de investigación en la utilización de la Carica papaya para el control
biológico de diferentes insectos principalmente Aedes aegypti, además el
efecto antimalárico de la misma.
En los siguientes referentes bibliográficos se utilizan las semillas y hojas de la
papaya para su extracción larvicida o insecticida.
En el Articulo “New Bioinsecticide Granules Toxin from Extract of Papaya
(Carica papaya) Seed and leaf Modified Against Aedes aegypti larvae”
realizado por Wahyumi, Dwi en el año 2015, el objetivo es ofrecer tecnología,
identificar la dosis de formulación y toxicidad de un nuevo bioinsecticida con
toxina en gránulos de extracto de la papaya (Carica papaya) modificando las
semillas y hojas para ser usado contra Aedes aegypti. Se realizó preparación
del extracto, por percolación de las semillas con etanol al 70% y de las hojas
con agua-etanol al 70%, luego se preparó la formulación para 300 g de
producto granulado compuesto por sustancias activas de semillas de papaya y
hojas modificadas en un 90%, harina de semilla en un 5% y otros 5%. Los
experimentos se hicieron con 6 grupos de tratamiento, cada grupo contenía 20
larvas de tercer estadio de Aedes aegypti. Las concentraciones de gránulos
son 0, 30, 60, 90. 120, 150 ppm, utilizando Temephos 1% como control
positivo. Los datos se analizaron utilizando Análisis Probit. Teniendo como
resultados del análisis fitoquímico, que contiene compuestos metabolitos
secundarios de saponina, flavonoide y triterpenoide. El efecto tóxico
típicamente se expresa como la concentración que será letal para cincuenta
por ciento de la población de prueba (LC50) y la concentración letal que acaba
con el 90%, expresada como LC90. El LC50 tras un período de tiempo de 48
horas, en este estudio se reporta en 107 ppm y LC90 de 150 ppm. (Wahyumi,
2015)
En el artículo “Antimalarial activity of Carica papaya (Family: Caricaceae) leaf
extract against Plasmodium falciparum”, realizado por Kovendan et al., 2012,
se evaluó la acción de la actividad antipalúdica del extracto etanólico de hoja
de Carica papaya contra Plasmodium falciparum. La hoja de papaya fue
recopilada en los alrededores de la aldea Kalveerampalyam, Coimbatore, Tamil
Nadu, India. La hoja de C. papaya se lavó con agua del grifo y se secó a la
sombra a temperatura ambiente durante varios días. Se usó una batidora
eléctrica para pulverizar los materiales vegetales secos (hojas) hasta obtener
500g de polvo de la hoja y usando un aparato de Soxhlet, se realizó la
extracción utilizando 1,5 L de etanol como disolvente orgánico durante 8 h. El
extracto bruto de las hojas se evaporó a sequedad en el evaporador rotatorio al
24
vacío. Un gramo de residuo de la planta se disolvió en 100 ml de acetona
(solución madre) que se considera como una solución de 1 % stock. A partir de
esta solución madre, se preparan diferentes concentraciones que varían de 2
%, 4 %, 6 %, 8 % y 10 %, respectivamente. La mortalidad del extracto etanólico
de la hoja de C. papaya contra larvas del 1 al 4 estadio y pupas arrojaron
valores de LC50 = 3,65 %, 4,28 %, 5,41 %, 6,70 % y 7,50 %, respectivamente.
Los valores de LC90 fueron de 9,61 %, 11,75 %, 13,53 %, 16,36 %, y 16,92 %,
respectivamente. Los extractos de plantas mostraron moderados a buenos
efectos antiparasitarios. Estas cuatro concentraciones (25, 50,100 y 150 g / ml)
de extractos etanólicos de la hoja mostraron actividad inhibitoria prometedora
contra la cepa sensible CQ con (IC50) evaluado 40.75 %, 36.54 %, 25.30%, y
el 18,0 % y en el CQ resistentes 50,23 %, 32,50 %, 21,45 % y 23,12 % frente a
P. falciparum.
En otro Artículo sobre el “efecto de semillas de cuatro variedades de Carica
papaya en Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae)”, realizado por
Franco y colaboradores en 2006, reportan que se evaluó el efecto tóxico de
semillas de las variedades Mamey, Maradol, Amarilla y Hawaiana de C. papaya
sobre larvas de S. frugiperda. El polvo de las semillas de C. papaya se
incorporó al 10 y 15 % a una dieta artificial. Los resultados mostraron que los
polvos de las cuatro variedades en sus dos concentraciones mataron todas las
larvas pero a diferente tiempo. En los tratamientos al 15 %, todas las
variedades resultaron ser muy tóxicas ya que ocasionaron una mortalidad
corregida de 90% a las 72 horas. Al 10 %, las variedades Mamey, Amarilla y
Maradol produjeron una mortalidad corregida del 90 % a las 96 horas mientras
que en la variedad Hawaiana fue menor al 75 % en el mismo tiempo. La
mortalidad del testigo fue del 3.33% (Franco et al., 2006).
En la investigación “evaluación del efecto insecticida de extractos vegetales
sobre las larvas de Culex tarsalis (Diptera: Culicidae)” realizado por Villegas y
colaboradores en el año 2013,se desarrolló en laboratorio donde se obtuvieron
los extractos (metanólicos y hexánicos) de semillas de diversas plantas y se
realizaron los bioensayos. Las concentraciones evaluadas fueron: 400, 500,
600, 700, 800, 900 y 1000 ppm y la lectura de muertos fue realizada a las 24,
48 y 72 h después de la aplicación de los tratamientos. Los resultados fueron
analizados en el PC-Probit para la CL50. Los extractos de semillas (Annona
muricata, Carica papaya y Azadirachta) mostraron los mejores resultados al
matar con 1000 ppm más de 80% de la población desde las 24 h. Los extractos
vegetales de Annona muricata, Carica papaya y Azadirachta mostraron ser una
buena alternativa para el control de Cx. tarsalis (Villegas et al., 2013)
En el artículo “Resistencia focal a insecticidas órgano sintéticos en Aedes
aegypti (Linneaus, 1762) (Díptera: Culicidae) de diferentes municipios del
estado Aragua, Venezuela”, realizado por Pérez y Molina en 2009 informan que
fueron determinados los niveles de resistencia a insecticidas en larvas de
25
Aedes aegypti de tres municipios del estado Aragua – Venezuela los
municipios fueron Girardot, Mario Briceño Iragorri y Urdaneta, en comparación
con una cepa susceptible (Rockefeller), a través del método de inmersión de la
OMS. Se evaluaron los insecticidas organofosforados (malatión, pirimifosmetil y
temefos) y el carbamato (propoxur). Se encontró resistencia al malatión en las
tres cepas, con valores de FR50 de 69,50x; 150,6x y 113,52x; para las cepas
Girardot, Mario Briceño Iragorri y Urdaneta, respectivamente; sugiriendo esta
diferencia en los niveles de resistencia a este insecticida, que la naturaleza del
fenómeno es focal. Todas las cepas resultaron susceptibles a los
organofosforados pirimifosmetil, temefos, y al carbamato propoxur. Estudios
con sinergistas PB y DEF demostraron que las enzimas del grupo multifunción
oxidasas están implicadas en el desarrollo de la resistencia al malatión. Los
resultados aportan información referencial, sobre el comportamiento de las
cepas frente a insecticidas durante el periodo de estudio y deben ser tomados
en consideración para la implementación de estrategias para el manejo y
vigilancia de la resistencia a insecticidas a nivel local (Pérez y Molina, 2009)
26
3. METODOLOGIA
En el presente proyecto de investigación que se realiza para la evaluación del
efecto larvicida del extracto etanólico de Carica papaya, sobre larvas de IV
estadio de Aedes aegypti, se llevó a cabo el desarrollo de los siguientes
procesos en el laboratorio se Zoonosis en la Facultad de Medio Ambiente y
Recursos Naturales (FAMARENA) de la Universidad Distrital Francisco José de
Caldas: (Anexo A se observan el registro fotográfico del desarrollo de la
investigación)
3.1. Crianza de larvas
Para iniciar la crianza se utilizaron jaulas entomológicas conteniendo un
número de entre 20 a 30 ejemplares adultos (machos y hembras) de Aedes
aegypti cepa Rockefeller descendientes de ejemplares provenientes del
laboratorio de Entomología del Instituto Nacional de Salud y que se vienen
manejando generación tras generación en el Laboratorio de Zoonosis y Salud
Pública de FAMARENA; los cuales tras realizar hematofagia como fuente
proteica realizan oviposturas (posturas de huevos) en el papel de filtro
previamente colocado recubriendo las paredes de vasijas plásticas conteniendo
un tercio de su volumen en agua a fin de simular las superficies secas
inundables donde el mosquito en la naturaleza realiza la postura de sus
huevos. Los huevos obtenidos se sometieron a proceso de maduración del
embrión durante 24 a 48 horas después de puestos antes de ser desecados
para guardarlos durante algunos días hasta cuando se tenga aprovisionada
suficiente cantidad para poder realizar los bioensayos. Este proceso garantiza
la resistencia a la desecación por periodos de hasta 6 meses y que puedan
servir en otro momento.
Posteriormente al periodo de maduración, los huevos recolectados se
almacenan en el laboratorio a una temperatura de 25-28ºC y una humedad
relativa de 70-80% dentro de bolsas ziplock debidamente rotuladas. Para la
eclosión de los huevos, los mismos se colocaron en agua declorinada (libre de
cloro) a una temperatura de 27-29ºC y dejar en reposo durante un periodo de
entre 24 y 48 horas en el interior de los recipientes totalmente sumergidos
dentro del agua. (Pérez et al., 2004)
El ciclo larval dura 5-7 días, en dependencia de las condiciones del medio
(temperatura, alimento, espacio vital) (Según Gadelha 1985 citado por Pérez et
al., 2004)
3.2. Preparación del extracto
Se hizo recolección de semillas de Carica papaya a las cuales se dejaron secar
a la sombra por 15 días. Luego se trituraron 500 g. en licuadora convencional
27
con 3 litros de etanol al 95% como solvente y la mezcla se dejó en reposo
durante 7 días.
Para la filtración de los sólidos suspendidos se hizo percolación en frio con
equipo de ultrafiltración, utilizando bomba de vacío conectada a un kitasato y
embudo Buchner con papel filtro Whatman No 03. El extracto obtenido se
destiló mediante el equipo rotaevaporador a 100 RPM, con presión reducida de
140 milibares y “baño maría” a una temperatura de 40ºC, a fin de retirar el
etanol de la mezcla.
El extracto puro se almacenó en un frasco de vidrio color ámbar a una
temperatura de 4ºC, para garantizar la estabilidad de los principios activos
presentes sin que se vean afectados por la luz de sol ni variaciones en el
cambio de temperatura ambiente.
3.3. Bioensayos
Los bioensayos se realizaron utilizando diluciones acuosas del extracto frente
a larvas de estadio IV de Aedes aegypti. Se decide utilizar larvas del último
estadio de desarrollo por ser la fase de ejemplares inmaduros que es más
resistente a medios ambientes adversos. Fueron divididas las larvas en seis
grupos experimentales con un solo grupo testigo, a cada uno de los cuales se
le hicieron cuatro repeticiones del proceso, cada una con 25 especímenes
contenidos en vasos plásticos de polipropileno transparente de 9 oz. Las
diluciones del extracto se prepararon a concentración de 50, 100, 250, 500, 750
y 1000 ppm de extracto disuelto en agua declorinada y luego se agregaron los
ejemplares larvarios de cada uno de los grupos de experimentación evitando
agregar agua adicional a la disolución preparada.
3.4. Evaluación de mortalidad
Las lecturas de mortalidad se realizaron en los tiempos de 0, 2, 12, 24, 36, 48
horas. Se consideraron como larvas muertas aquellas que al ser tocadas en la
región cervical con un puntero metálico de punta roma no presentan
movimiento alguno (Duarte, Aguirre, Álvarez, Jiménez y Gallego, 2009), ni
respuesta natatoria al igual que ejemplares moribundos (OMS, 2005) Si en el
tiempo 0 se detectaban ejemplares muertos o moribundos se efectúo su
remplazo por otro ejemplar totalmente sano, considerando que tal condición se
debía a traumas físicos durante la manipulación.
3.5. Evaluación del efecto residual del extracto
Se repoblaron los recipientes conteniendo los extractos en dilución, con un
numero idéntico de larvas de IV estadio (25 por vaso) a los 15 días post
aplicación de extracto de Carica papaya, realizando nuevamente conteos
seriados en todos los tratamientos a las 0, 2, 12, 24, 36, 48 horas sin realizar
nuevas diluciones. Con el procedimiento se evaluó el efecto residual del
28
larvicida con el paso del tiempo (Palomino, 2006 citado por Martínez y Zamora,
2012)
3.6. Análisis estadístico
Para el análisis, se realizó el cálculo de los porcentajes de las mortalidades
con respecto al tiempo de exposición al tratamiento en cada concentración,
mediante la herramienta de Excel. Luego se realizó los cálculos de la
mortalidad corregida por medio de la ecuación de Abbott mediante la ecuación
de la figura 8 para conocer la mortalidad causada por el estímulo de
tratamiento y no por causas naturales como lo expresan Lagunes y Vázquez
(1994) y así realizar el análisis estadístico.
Figura 8 Ecuación de Abbott
Fuente: Lagunes y Vázquez (1994)
Donde:
M. tratamiento: Mortalidad acumulada del tratamiento
M. testigo: Mortalidad acumulada del testigo
MC: Mortalidad corregida.
Luego con los datos tabulados y corregidos se graficó en Excel las
mortalidades obtenidas con respecto al tiempo, para la determinación de
tiempos letales TL50 y TL 90 de cada concentración. La herramienta de Excel
también fue utilizada para realización de las tablas y gráficas.
Para el análisis de regresión logarítmica para el cálculo de las concentraciones
letales LC50 y LC90, y el análisis de varianza ANOVA se utilizó el software
estadístico SPSS, que permite evaluar la acción larvicida el extracto de Carica
papaya y verificar si existen diferencias significativas entre los tratamientos
experimentales y entre estos y el testigo.
29
4. RESULTADOS
Para cada concentración utilizada se determinó el porcentaje de mortalidad en
cada una de las lecturas realizadas de las cuatro repeticiones, hasta obtener el
porcentaje acumulado a las 48 horas y el promedio de ellas, que se registraron
en la tabla del Anexo B; igualmente se registró los datos de los bioensayos de
efecto residual en la tabla del Anexo C.
4.1 Bioensayos
4.1.1 Corrección mortalidad de bioensayos por la ecuación de Abbott
Los bioensayos se realizaron con un grupo testigo para comparar la mortalidad
de larvas sometidas con el tratamiento y sin él, los porcentajes obtenidos en
cada uno de ellos fueron corregidos con respecto a los grupos testigos
mediante la ecuación de Abbott, resultados que se observan en la siguiente
tabla.
Tabla No 1 Corrección mortalidad de bioensayos por la ecuación de
Abbott
CORRECIÓN MORTALIDAD DE BIOENSAYOSPOR LA ECUACIÓN DE ABBOTT
TRATAMIENTOS (DOSIS PPM)
% M. TRATAMIENTO*
% M. TESTIGO*
% M. CORREGIDA
50 47 1.33 46
100 87 1.33 87
250 95 1.33 95
500 99 1.33 99
750 100 1.33 100
1000 100 1.33 100
Fuente: Autor
* Porcentajes de mortalidad promedio obtenidas en los tratamientos y del grupo
testigo realizadas en los bioensayos véase en Anexo B
4.1.2 Resultados mortalidades obtenidos en los bioensayos
En todos los bioensayos realizados se observó que en tiempos de 0 y 2 horas
no había mortalidad (véase en figura 10), de donde se deduce que los
principios activos del extracto de papaya no actúan como un tóxico agudo, sino
que requiere de un tiempo prudencial para dejar sentir su acción tóxica a
mediano o largo plazo. En casi todas las concentraciones evaluadas la lectura
de larvas muertas empezaba a registrarse a partir de las 12 horas de iniciada la
exposición. Además la mortalidad final era mayor a concentraciones altas y
30
disminuía en concentraciones más bajas como se observa en anexo B, sin
embargo se tiene en cuenta mortalidad final corregida de la tabla no 1
Bioensayo 50 ppm
Se observa en la figura 10 que la mortalidad a las 12 horas fue de un 23%,
luego continuó ascendiendo hasta las 48 horas presentando una mortalidad
final de 46%, siendo el porcentaje de mortalidad más bajo con respecto a los
demás bioensayos.
Bioensayo100 ppm
En el bioensayo número dos se obtiene a las 12 horas una mortalidad de más
de la mitad de la población (73 %), que va aumentando al transcurrir el tiempo,
hasta llegar a las 48 horas a un 87% de mortalidad final que nos permite inferir
un alto porcentaje de mortalidad, muy cercano al 90%,a una concentración
bastante baja (figura 10).
Bioensayo 250 ppm
Para esta concentración se observa en la figura 10 que la mortalidad de
individuos a las 12 horas fue de un 90 % que aumenta a las 24 horas al 93% y
a las 36 horas alcanza un nivel máximo del 95% que no varía al final de las 48
horas.
Bioensayo 500 ppm
En la figura 10 en el bioensayo número cuatro se evidencia la mayor mortalidad
a las 12 horas con un 93%, después pocos individuos murieron a las siguientes
horas llegando al final del bioensayo a una mortalidad del 99% tras 48 horas
de seguimiento.
Bioensayo 750 ppm
Se observó en la figura 10 para el quinto bioensayo una mortalidad del 96% a
las 12 horas y por lo tanto a las 24 horas se obtiene una mortalidad del 100%,
siendo un resultado sumamente satisfactorio.
Bioensayo 1000ppm
En la figura 10 se observa que para el último bioensayo a las 12 horas la
mortalidad del 100% de la población, la cual es bastante satisfactoria al ser la
concentración más alta utilizada en el proyecto y por llegar a una mortalidad
total en menor tiempo con respecto a la concentración anterior de 750 ppm y a
innumerables estudios realizados con otros principios activos a esta
concentración.
31
Bioensayos de los grupos testigos.
Cada bioensayo realizado en el presente proyecto de investigación estuvo
acompañado de un grupo testigo con el fin de encontrar la mortalidad de las
larvas, cuando no han sido sometidas a los tratamientos ni a condiciones que
puedan alterar el aumento de su mortalidad. En Anexo B se observa que los
grupos testigos tuvieron una mortalidad muy baja siendo de 1.33%, donde
ocurrió una muerte a las 36 horas y otra a las 48 horas.
4.2 Bioensayo efecto residual
4.2.1 Corrección mortalidad de bioensayos efecto residual por la ecuación
de Abbott
Los bioensayos de efecto residual fueron igualmente realizados con grupo
testigo cada uno, para comparar la mortalidad de larvas sometidas con el
tratamiento 15 días después de la aplicación y larvas en condiciones sin
alteración. Donde los porcentajes obtenidos en cada uno de ellos deben ser
corregidos con respecto a los grupos testigos mediante la ecuación de Abbott
que se observan en la tabla No 2.
Tabla No 2 Corrección mortalidad de bioensayos efecto residual por la
ecuación de Abbott
CORRECIÓN PORCENTAJES DE MORTALIDAD EFECTO RESIDUAL POR LA ECUACIÓN DE ABBOTT
TRATAMIENTOS (DOSIS PPM)
% M. TRATAMIENTO *
% M. TESTIGO *
% M. CORREGIDA
50 1 1.33 0
100 9 1.33 8
250 12 1.33 11
500 15 1.33 14
750 20 1.33 19
1000 24 1.33 23
Fuente: Autor.
* Porcentajes de mortalidad promedio obtenidas en los tratamientos y del grupo
testigo realizadas en los bioensayos véase en Anexo C
4.2.2 Resultados mortalidades obtenidos en los bioensayos efecto
residual
Como ocurrió en la aplicación inicial de los tratamientos, los bioensayos de
efecto residual tuvieron mortalidad a partir de las 12 horas de contacto con el
tratamiento como se expone en el Anexo C, de igual manera se tiene en
32
cuenta mortalidad final corregida de la tabla no 2. Sin embargo la mortalidad
del efecto residual del extracto de C. papaya en ninguno de los tratamientos
experimentales supera el 25 % como se observa en la figura 9.
Figura 9 Mortalidades obtenidas en los bioensayos efecto residual
Fuente: Autor
Bioensayo efecto residual 50 ppm
En la concentración de 50 ppm realizada, el efecto residual fue baja, dado que
se observó una mortalidad de 1% alcanzada a las 24 h, como se expone en la
tabla No 1, sin embargo en la corrección hecha con la ecuación de Abbott, la
mortalidad es nula (figura 9) ya que el grupo testigo tuvo un porcentaje similar
a la de la concentración de 50 ppm y lo que refiere a una muerte por efecto
natural y no por el tratamiento al que se sometió.
0
5
10
15
20
25
0 2 12 24 36 48
Mo
rtalid
ad
%
Tiempo (Horas)
Concentración 50 ppm
Concentración 100 ppm
Concentración 250 ppm
Concentración 500 ppm
Concentración 750 ppm
Concentración 1000 ppm
33
Bioensayo efecto residual 100 ppm
La mortalidad encontrada fue de 2% a las 12 h aumentando muy poco hasta
las 36 h con 8% como se representa en la figura 9, donde el porcentaje se
mantuvo hasta la última lectura.
Bioensayo efecto residual 250 ppm
En el tercer bioensayo como se evidencia en la figura 9, el efecto residual a las
12 horas se registró una mortalidad de 4 %, aumentando en la siguiente lectura
en la misma proporción con una mortalidad acumulada de 8 %; después a las
36 y 48 horas el porcentaje incrementó muy poco para llegar a una mortalidad
final de 11 %.
Bioensayo efecto residual 500 ppm
Se observa en la figura 9 en concentración de 500 ppm efecto residual una
mortalidad a las 12 y 24 horas con 8% y 6% respectivamente, con un total de
14% lo cual no cambia en el transcurso de las siguientes horas.
Bioensayo efecto residual 750 ppm
En esta concentración en la figura 9 se observa una mortalidad igual a las 12 y
24 horas al anterior bioensayo de efecto residual de 500 ppm con 14%, sin
embargo a las siguientes horas aumenta la mortalidad hasta 19 %.
Bioensayo efecto residual 1000ppm
Finalmente la mortalidad encontrada en el bioensayo de pos aplicación de la
concentración mayor empezó a las 12 horas con 6 %, aumentando en el
transcurso del tiempo alcanzando una mortalidad a las 48 horas de 23 %(
figura 9).
Bioensayos de los grupos testigos.
Como se realizó con los bioensayos iníciales, los bioensayos de efecto residual
estuvieron acompañados de grupos testigo. En Anexo C se observa que los
grupos testigos tuvieron una mortalidad muy baja siendo de 1.33% promedio,
donde ocurrió dos muertes a las 48 horas.
4.3 Análisis de tiempos letales TL50 y TL90
Para evaluar el efecto larvicida del extracto de semillas de Carica papaya en
los tiempos de lectura de los bioensayos realizados, se utilizó la figura 9 para
determinar los tiempos letales TL50 y TL90 de las concentraciones utilizadas
en el proyecto.
34
Figura 10 Determinación tiempos letales (TL50 Y TL90), mediante la
comparación de mortalidad de larvas en cada concentración y el tiempo.
Fuente: Autor
En la figura 10 se observa que en concentración de 50 PPM no alcanza una
mortalidad acumulada del 50%, lo que indica que para este tratamiento no se
encontró los tiempos letales 50 y 90 (TL50 y TL90).
El tiempo letal 50 se puede determinar en las demás concentraciones ya que
superan el 50% de mortalidad acumulada en el tiempo del tratamiento, en la
figura 10 la concentración de 100 PPM presenta TL50 a las 8 horas; para las
concentraciones de 250 y 500 PPM a las 6 horas y para las concentraciones
750 y 1000 PPM aproximadamente 5 horas.
El tiempo letal 90 lo alcanzan solo cuatro concentraciones, la concentración de
250 PPM se presenta a las 12 horas; en concentraciones 500 y 750 PPM son a
las 11 horas y la última concentración de 1000 PPM es a las 10 horas.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 12 24 36 48
Mo
rtal
idad
%
Tiempo (horas)
Concentración 50 ppm
Concentración 100 ppm
Concentración 250 ppm
Concentración 500 ppm
Concentración 750 ppm
Concentración 1000 ppm
35
5. ANÁLISIS ESTADISTICO
5.1 Análisis de regresión logarítmica, para el cálculo de las
concentraciones letales LC50 y LC90
Para la determinación de las concentraciones letales se utilizó el modelo de
probit mediante el programa SPSS statistics para el análisis de regresión
logarítmica, la cual permite conocer qué nivel de estímulo es necesaria para
obtener una mortalidad de los individuos tratados, concentración letal media LC
50 y concentración letal LC 90 en un tiempo de 48 horas al cual se sometieron
las larvas de Aedes aegypti en cada tratamiento.
Al realizar el análisis en el modelo probit, se muestran en la tabla de límites de
confianza (Anexo D), los valores de la concentración para obtener la dosis letal
LC50, siendo una estimación de 48.791, con limite desde 16.754 a 88.42 y la
estimación de la concentración para alcanzar la dosis letal LC90 de 151.196
con límite desde 81.871 a 231.39. Las dosis letales 50 y 90 son comparadas
con trabajos realizados en la utilización de C. papaya como larvicida sobre
mosquitos de interés público, y la comparación con distintos trabajos realizados
con efecto larvicida de otras plantas sobre Aedes aegypti, véase más adelante
en los análisis de resultados.
Las estimaciones de la tabla del Anexo D se encuentran dadas a partir de la
ecuación de regresión y= 2.609*log (dosis) – 4.405, que es suministrada en
análisis del modelo de probit de la tabla No 3, ecuación que permite realizar
una curva logarítmica para la mortalidad, que aumenta, cada vez que aumenta
la concentración ( figura 11).
Tabla No 3 Estimaciones de los parámetros
Fuente: Programa SPSS statistics, Modelo de probit
36
Figura 11 Relación porcentaje mortalidad y dosis utilizadas con línea de
tendencia logarítmica de la ecuación y= 2.609*log (dosis) – 4.405.
Fuente: Autor
En la Figura 11, se muestran las mortalidades en el eje y, en modo de
probabilidad, de igual manera se observa la curvatura que muestra el
comportamiento de las mortalidades, al aumentar la concentración de los
tratamientos; curva realizada a partir de la ecuación que se ve en la derecha de
la figura en la parte de leyenda.
5.2 ANOVA de un factor
El análisis de varianza de ANOVA de un factor se realizó mediante la
comparación de los promedios entre los tratamientos realizados, por medio de
dos hipótesis, una hipótesis nula (Ho) y una hipótesis alternativa (H₁).
Hipótesis nula (Ho): Es aquella que al hacer las comparaciones entre los
promedios de mortalidad de los seis tratamientos no difieren significativamente
Hipótesis alternativa (H₁): Se refiere que de los promedios de mortalidad de los
tratamientos por lo menos un par tienen diferencia significativa.
Por lo anterior la hipótesis nula (Ho) es rechazada cuando al obtener los datos
de significancia en el análisis este sea menor a P-valor< 0.05 y por lo tanto
significaría que las concentraciones de los tratamientos sí inciden en el
porcentaje de mortalidad de las larvas, mientras que si la hipótesis alternativa
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
MO
RTA
LID
AD
CONCENTRACIÓN
Series1
y= 2.609*log (dosis) – 4.405
37
(H₁) el valor es mayor que P-valor 0.05 se rechaza, lo cual concluye que la
concentración de los tratamientos no tiene variabilidad significativa para los
resultados de mortalidad. Se determina el valor de P mediante el programa
SPSS statistics en opciones de análisis de ANOVA de un factor, valor que se
encuentra en la siguiente tabla y que es proporcionada por el programa.
Tabla No 4 Análisis de ANOVA de un factor
Fuente: Programa SPSS statistics, Análisis de ANOVA de un factor
En la tabla No 4 se observa que el valor de significancia es P-valor = 0.000 <
0.05, lo que indica el rechazo de la hipótesis nula (Ho), a lo que refiere que las
concentraciones de los tratamientos sí inciden en el porcentaje de mortalidad
de las larvas.
38
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Con referencia a la evaluación del extracto Etanolico de semillas de Carica
papaya sobre larvas de IV estadio de Aedes aegypti se toma en cuenta los
datos de mortalidades corregidas, que permite conocer la muerte de larvas por
la exposición al tratamiento y no por razones naturales. Por lo cual en la tabla
No 1 muestra la mortalidad acumulada al final de cada tratamiento,
demostrando la alta efectividad de extracto utilizado, donde el primer bioensayo
de concentración 50 ppm se encontró con una mortalidad de 46%, que
aumenta significativamente en el siguiente bioensayo de 100 ppm a un 87%,
con una diferencia entre las dos de un 39%. Los siguientes bioensayos
muestran una mortalidad en aumento de un 8% a 250 ppm y de 4% en 500
ppm, este último alcanza ya un 99% de mortalidad final lo que indica la
efectividad larvicida del extracto en concentración media a las utilizadas en el
presente proyecto es alta; por lo cual los siguientes bioensayos de 750 y 1000
ppm tienen una mortalidad del 100 %.
A diferencia de la evaluación de efecto residual realizado quince días después
de los tratamientos iníciales, y con base a la mortalidad corregida, se observa
en la tabla No 2 una baja mortalidad de larvas por el efecto del extracto en
todas las concentraciones. Donde la mortalidad en la mayor concentración de
1000 PPM fue de 23%, siendo un 77% menos que en el tratamiento inicial, de
igual manera en concentraciones de 750 ppm disminuyó un 81%; de 500 ppm
un 85%; 250 ppm un 84%; de 100 ppm un 79% y en 50 ppm disminuyó 46%
del tratamiento inicial ya que no hubo muerte de ninguna larva. Lo cual indica
que ocurre biodegradación disminuyendo el efecto toxico del extracto con el
paso del tiempo, lo que le confiere gran seguridad al uso de este extracto en
ambientes naturales con poca persistencia del tóxico con el paso del tiempo.
Los tiempos letales media TL50 como se muestra en la figura 10 se
encontraron en cinco concentraciones utilizadas en tiempos entre 5 a 8 horas,
siendo TL50 en 100 PPM un tiempo de 8 horas, en 250 y 500 PPM a las 6
horas y para 750 y 1000 PPM aproximadamente 5 horas, donde se observa
que los tiempos letales media se presentan en un menor tiempo cuando
aumentan las concentraciones. El TL90 se alcanzó para cuatro
concentraciones en tiempos de 10 y 12 horas, siendo 250 PPM en 12 horas; en
concentraciones 500 y 750 PPM a las 11 horas y de 1000 PPM a las 10 horas,
por lo cual como se expone anteriormente a mayor concentración menor
tiempo para alcanzar TL90.
Con respecto a la regresión logarítmica para el cálculo de las concentraciones
letales LC50 y LC90 realizado en modelo probit, se obtuvo los valores de las
concentraciones cuando se obtiene letalidad del 50% de la población en
48.791, con limite desde 16.754 a 88.42 y 90% de la población en 151.196
con límite desde 81.871 a 231.399 como se observa en el anexo D. Que
39
ratifica los resultados experimentales hechos en los bioensayos, y que indican
que ya en concentración de 250 ppm se ha obtenido una letalidad mayor del
90%.
Las estimaciones de las dosis letales están dadas por la ecuación de regresión
y= 2.609*log (dosis) – 4.405 suministrada por la tabla No 3, que además fue
utilizada para realizar la curva logarítmica de los resultados obtenidos en los
bioensayos, identificando el aumento de la mortalidad al utilizar
concentraciones más altas (figura 11).
Finalmente el análisis de varianza ANOVA de un factor mediante el software
estadístico SPSS, que realiza la comparación de los promedios entre los
tratamientos realizados, determinó mediante en la tabla No 4 donde el valor de
significancia fue menor de 0.05 lo que indica el rechazo de la hipótesis nula y
por lo tanto significaría que las concentraciones de los tratamientos si inciden
en el porcentaje de mortalidad de las larvas. En lo que infiere que a mayor
concentración del tratamiento, mayor mortalidad de larvas de Aedes aegypti,
como igualmente se ha ratificado en los análisis anteriores.
Al comparar los resultados obtenidos del presente proyecto y los resultados de
artículos realizados con extracto de C. papaya, tenemos que con la
investigación hecha por Wahyumi, Dwi (2015) sobre larvas de Aedes aegypti
usando semillas y hojas modificas de Carica papaya, se tiene que el extracto
modificado presenta dosis letal LC50 en 107 PPM a las 48 horas, a diferencia
del extracto Etanolico de semillas de C. papaya, donde la LC50 se obtuvo a
una concentración menor aproximadamente de 49 ppm. Sin embargo para las
dosis letal 90 (LC90) de los dos proyecto, se presenta resultados similares de
150 ppm aproximadamente. Por lo anterior se evidencia que utilizando
únicamente semillas de C. papaya se obtiene una mayor eficacia en menores
concentraciones. Y con respecto a la evaluación del efecto insecticida de
extractos vegetales sobre las larvas de Culex tarsalis de Villegas, et al. (2013),
se obtuvo que el extracto de semillas de C. papaya mataron más de 80% de la
población en concentración de 1000 ppm desde las 24 horas, muy distinto al
presente proyecto donde los resultados de mortalidad a esa misma
concentración fueron del 100% aproximadamente antes de las 12 horas.;
ratificando un alto efecto larvicida del extracto de semillas de Carica papaya
sobre larvas de Aedes aegypti .Como última investigación en la utilización de
Carica papaya, Murugesan y Thilagavathy (2008) analizaron el efecto larvicida
de extractos de éter de petróleo de 63 variedades de especies de plantas ,
incluyendo 37 variedades de hojas, 14 variedades de semillas, 10 variedades
de flores y 2 variedades de frutas sobre las larvas de tercer estadio de
mosquitos: Culex quinquefasciatus , Anopheles stephensiand y Aedes aegypti,
obteniendo a las 24 horas que seis extractos de plantas , Acacia nilotica ,
Argemone mexicana (hojas y semillas) , Citrullus colocynthis , Jatropha curcas
y Withania somnifera fueron tóxico, con un valor CL50 inferior a 100 ppm en
40
contra de los tres vectores mosquito. Carica papaya L. (hoja) LC50 mas de 200
ppm. De igual manera se observa que la utilización de semillas de C.papaya
del presente proyecto fue más toxico obteniendo LC50 en 48.8 ppm
De igual manera se hace comparación de resultados de proyectos que
realizaron la evaluación de efecto larvicida e insecticida de diferentes plantas
sobre Aedes aegypti; primero la investigación de Parra, García y Cotes (2007)
en la cual se hizo una evaluación de extractos vegetales sobre Aedes aegypti,
obteniendo valores de LC50 (concentración letal media) de: A. muricata, 900
ppm (CI 95%: 380-1300); M.azedarach, 1800 ppm (CI 95%:150-2100); R.
communis, 860 ppm (CI95%: 451-1500), se observa que a diferencia de los
resultados del presente proyecto LC50 de C. papaya se encuentran en
concentración mucho más baja siendo de 48.8 ppm. Con referencia al trabajo
de Rozo, Zapata y Bello (2008) en la evaluación del efecto toxico de extracto
de Eupatorium microphyllum L.F. sobre larvas de A. aegypti mediante extractos
acuosos en concentraciones de 500 mg L-1, 1.500 mg L - 1 y 2.500 mg L-1 y
acetónicos en concentraciones de 10 mg L-1, 20 mg L-1, 30 mg L-1, 40 mg L-1 y
50 mg L-1.Los extractos acuosos mostraron acción moderadamente baja en la
mortalidad de larvas, menor del 20%. Por el contrario, la acción de los extractos
acetónicos se observó a 10 y 20 mg L-1, con 15% de mortalidad, mientras que
a 30 y 40 mg L-1 se registraron 22 al 38% de mortalidad, en tanto que a 50 mg
L-1 la mortalidad fue del 95,4%. Por lo tanto al comparar con extracto etanólico
de C. papaya en concentración de 50 ppm siendo la más baja utilizada tuvo un
46% de mortalidad mucho menor que la registrada por Rozo con extracto
acetónico.
41
CONCLUSIONES
El extracto Etanolico de semillas de Carica papaya tiene un alto efecto
tóxico sobre larvas de IV estadio de Aedes aegypti
Se determina que el efecto residual del extracto realizado con
repoblación quincenal baja significativamente a diferencia de los
tratamientos iníciales. Demostrando que ocurre biodegradación del
extracto con el paso del tiempo y poca persistencia del tóxico en el
medio.
Mediante el análisis de modelo probit, la dosis letal LC50 es de 48.791
ppm, y la dosis letal LC90 es de 151.196 ppm.
Los tiempos letales TL 50 están entre 5 a 8 horas y TL90 entre 10 a 12
horas, en la cual se presentan letalidades en un menor tiempo cuando
aumentan las concentraciones.
En todas las concentraciones utilizadas en el presente proyecto ninguno
presentó mortalidad de 0 a 2 horas, debido a que al extracto utilizado no
resulta tan agresivo ni es un tóxico agudo sino crónico, para las larvas
de IV estadio.
Se encontró una mortalidad cercana a 100% a partir de una
concentración de 500 ppm.
Por medio del análisis de varianza ANOVA de un factor se concluye que
las concentraciones del extracto etanólico de semillas de C. papaya, si
inciden en la mortalidad de larvas Aedes aegypti, por lo cual a mayor
concentración mayor es la mortalidad.
Se observó con los datos obtenidos en los bioensayos realizados que
del extracto etanólico de semillas de C. papaya se pueden utilizar
concentraciones bajas para tener un porcentaje alto de mortalidad.
42
RECOMENDACIONES
Para futuros proyecto se recomienda utilizar concentraciones más bajas
de las utilizadas en el presente proyecto y cercanas para observar con
mayor exactitud dosis letales y tiempos letales óptimos.
Se recomienda utilizar los huevos de Aedes aegypti lo más pronto
posible después de las posturas de las hembras para una eclosión
efectiva y total de estos.
Se sugiere que al final de la elaboración del extracto Etanolico de
semillas de C. papaya, filtrar nuevamente o utilizar un papel filtro de
menor graduación para que no quede pequeñas partículas en
suspensión que se observaron durante la realización de los bioensayos.
Como se hace referencia en artículos científicos es una buena opción
para próximas investigaciones utilizar para el extracto las hojas de C.
papaya o en su defecto combinar semillas y hojas para evaluar el efecto
larvicida.
De igual manera por fuente bibliográfica se recomienda utilizar el
extracto de C. papaya en otras especies de zancudos para comparar y
evaluar la toxicidad sobre larvas.
43
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46
ANEXOS
Anexo A Registro fotográfico
Crianza de Aedes aegypti
Semillas de Carica papaya licuado con etanol.
47
Filtrado de extracto licuado
48
Destilación en remoción de etanol en Rotaevaporador
Bioensayos con cada concentración
49
Bioensayo efecto residual
50
ANEXO B Formato mortalidad de los bioensayos
51
ANEXO C Formato mortalidad de los bioensayos efecto residual
52
ANEXO D Tabla límites de confianza