Bol. San. Veg. Plagas, 24: 727-736, 1998

Evaluación de una hipótesis sobre el mecanismo de resistenciaa la transmisión de virus (gen VAT) por Aphis gossypiiGlover en melón

B. MARTÍN, Y. RAHBÉ y A. FERERES

Aphis gossypii es la principal especie vectora de las virosis que afectan a los culti-vos de melón. Pitrat y Lecoq (1980) describieron un gen de resistencia (gen VAT) queinhabilita a este pulgón para la transmisión de virus. Se ha demostrado que esta resis-tencia no está basada en alteraciones del comportamiento de prueba de los pulgones, yaque estos penetran normalmente las plantas resistentes. En este trabajo se evalúa unahipótesis que pretende explicar el mecanismo de acción de la resistencia en base a unproceso mecánico de bloqueo de la salida del estilete del pulgón. Este bloqueo imposi-bilitaría la salida de las partículas virales hacia el exterior del estilete y por lo tanto latransmisión del virus.

Se han llevado a cabo experimentos en los que se permitía a pulgones virulíferosprobar varias secuencias de plantas de melón resistentes y susceptibles. Se ha podidocomprobar que A. gossypii es perfectamente capaz de inocular el virus del mosaico delpepino (CMV) a plantas susceptibles después de haber probado el melón resistente loque indica que la acción del mecanismo de resistencia es reversible. Además, se ha re-gistrado la misma tasa de transmisión (25%) en el melón susceptible para aquellos indi-viduos que provenían directamente de la fuente de CMV y para los que habían probadoantes plantas resistentes, lo que constituye un fuerte indicio de que la hipótesis plantea-da es cierta. Por otra parte se ha comprobado que la especie Myzus persicae es tambiénen cierta medida sensible a la presencia del gen VAT ya que su capacidad de transmi-sión de virus disminuye a medida que prueba repetidamente plantas resistentes.

B. MARTÍN y A. FERERES: Departamento de Protección Vegetal. Centro de Cienciasmedioambientales, CSIC. Serrano, 115 dpdo. 28006-Madrid.Y. RAHBÉ: INSA, Laboratoire de Biologie Appliquée 406, UA-INRA 203, 20, ave. A.Einstein, 69621 Villeurbane, Francia.

Palabras clave: Gen VAT, resistencia, Aphis gossypii, transmisión de virus, CMV

INTRODUCCIÓN

Las virosis transmitidas de forma no per-sistente por los pulgones (MANDAHAR,1989; SYLVESTER, 1989), son responsablescada año de importantes pérdidas de cose-cha en los cultivos de melón tanto al airelibre como protegidos. De entre todos losvirus que afectan al melón en España (LUIS,1994), destacan el virus del mosaico del pe-pino (CMV) y el virus del mosaico de lasandia 2 (WMV-2) por su alta incidencia

anual y por la gravedad de los daños quecausan. La especie Aphis gossypii Glover(Fig. 1), conocida con el nombre de pulgóndel melón o del algodón es el principal vec-tor de estos virus y además una importanteplaga directa del melón.

La lucha contra los virus no persistente esdifícil y se basa principalmente en estrate-gias de control integrado que tratan de com-binar distintas medidas de protección. Entreestas ocupa un papel destacado el uso de va-riedades resistentes a los virus y a sus vecto-

Fig. 1 .-Colonia de Aphis gossypii Glover.

res. En este sentido, en el melón se ha des-crito una resistencia gobernada por un gendominante llamado VAT (Virus AphidTransmission) que confiere a las líneas demelón que lo poseen resistencia al pulgón A.gossypii (PlTRAT y LECOQ, 1980). Los indi-viduos de esta especie exhiben respuestas deantixenosis y de antibiosis en las plantas re-sistentes, y además su capacidad de transmi-tir virus queda anulada (KENNEDY y col,1978; KlSHABA y coi, 1992; LECOQ y coi,1980). De acuerdo con LECOQ y coi (1980)estos tres mecanismos de resistencia actúanespecíficamente frente a A. gossypii mien-tras que otras especies de pulgón comoMyzus persicae Sulzer son perfectamente ca-paces de inocular virus a plantas de melónportadoras de este gen. Otra característica deesta resistencia es que sus mecanismos deacción interfieren unicamente con la trans-misión de virus por A. gossypii ya que se hademostrado que los individuos de esta espe-cie son perfectamente capaces de adquirirvirus en las pruebas que realizan sobre plan-tas resistentes viróticas (LECOQ y coi, 1980).

Hasta la fecha se desconocen las causaspor las que A. gossypii es incapaz de trans-mitir virus a las plantas portadoras del genVAT (CHEN y col, 1997; SHINODA, 1993).Un estudio del comoportamiento alimenti-cio de los individuos de A. gossypii en plan-tas resistentes (CHEN y coi, 1997) permitió

demostrar que aunque los pulgones sufrenalteraciones en su comportamiento de prue-ba, estas no son la causa de la resistencia ala transmisión. De acuerdo con este estudiolas pruebas que realizan los pulgones en lasplantas resistentes incluyen varias penetra-ciones de células epidérmicas. Teniendo encuenta que es en estas penetraciones dondetiene lugar la inoculación de virus no persis-tentes (COLLAR y coi, 1997; HARRIS, 1983,1990; HARRIS y coi, 1973; LÓPEZ ABELLÁy col, 1988; PÉREZ v coi, 1996; POWELL,1991; POWELL y coi, 1995), es lógico pen-sar que el mecanismo de resistencia del genVAT actue a un nivel intracelular. Segúnesto se ha planteado una hipótesis que sugi-re la posibilidad de que cuando los indivi-duos virulíferos de A. gossypii penetran unacélula de una planta resistente, se pone enmarcha algún mecanismo cuya acción blo-quea la salida de las partículas virales haciael exterior de los estiletes del pulgón, que-dando retenidas en el interior del canal ali-menticio.

Este trabajo tiene como fin evaluar si estahipótesis es cierta o no mediante ensayosbasados en la transmisión de CMV por A.gossypii y M. persicae a secuencias de 3plantas de melón con distintas combinacio-nes entre plantas resistentes y susceptibles.Los principales objetivos planteados eran,comprobar si los individuos de A. gossypiison capaces de transmitir virus a plantassusceptibles después de haber probado pre-viamente las resistentes y comparar laeficiencia de transmisión obtenida frente ala de individuos que sólo prueban plantassusceptibles. Asimismo también se preten-día evaluar el comportamiento de Myzuspersicae como vector de CMV bajo las mis-mas condiciones experimentales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se llevaron a cabo dos ensayos cuya ideabásica consistía en permitir que unos mis-mos pulgones virulíferos probasen consecu-

tivamente tres plantas de melón (suscepti-bles y/o resistentes) y evaluar la eficienciade inoculación sobre dichas plantas. Entretodas las posibles secuencias de tres, combi-

nando plantas susceptibles (S) y/o resis-tentes (R), se eligieron las siguientes comolas más adecuadas para obtener la informa-ción deseada.

1.a planta 2.a planta 3.a planta1 .a Secuencia2.a Secuencia3.a Secuencia4.a Secuencia

ResistenteResistenteSusceptibleSusceptible

En el primer experimento se ensayaronestas cuatro secuencias y en el segundotodas excepto la primera. Era esencial en eldesarrollo de los ensayos lograr que los pul-gones mantuviesen su capacidad infectivasobre las tres plantas de la secuencia, lo quesin duda iba a ser función del tiempo que seles permitiese probar dichas plantas. Se hi-cieron una serie de pruebas preliminarespara evaluar distintos tiempos de acceso, enbase a las cuales se decidió que los pulgonesprobasen cada planta durante 2 minutos enel primer ensayo y durante 4 en el segundo.

La metodología seguida en los ensayos fuela siguiente. En primer lugar se sometió a unperiodo de ayuno (de 1 a 1,5 horas) a pulgo-nes ápteros y adultos jóvenes (7-9 días deedad) seleccionados a partir de un clon (de A.gossypii o M. persicae) mantenido en cámaraclimática en condiciones de 16:8 h (Luz: Os-curidad) de fotoperiodo y 22:16 °C (Dia:Noche) de temperartura. A continuación conayuda de un pincel se colocaba el pulgónsobre una de las hojas superiores de unaplanta fuente de CMV y se le permitía pro-barla libremente durante 5 minutos. Inmedia-tamente después era transferido a la primeraplanta de la secuencia test y con ayuda deuna lupa se identificaba el momento en elque la posición de las antenas señalaba el ini-cio de la penetración de la planta. A partir deeste instante se le permitía al pulgón probarla planta durante el periodo de tiempo elegi-do (2 minutos en el primer ensayo y 4 en elsegundo). Finalizada la prueba el pulgón era

transferido a la segunda planta de la secuen-cia y repitiendo la misma operación, se le de-jaba moverse libremente y realizar otra prue-ba de 2 ó 4 min. Idem con la tercera plantatest. En el primer ensayo se realizó esta ope-ración completa con tres pulgones virulíferospor cada secuencia test mientras que en el se-gundo ensayo sólo se empleó un pulgón. Asi-mismo el primer ensayo se llevo a cabo conlas especies A. gossypii y M. persicae, y elsegundo unicamente con la primera de estas.En la Fig. 2. se muestra una imagen de laforma en la que se transfería los pulgones alas plantas de ensayo. Las plantas test indivi-dualizadas y perfectamente identificadas,fueron transferidas a una cámara climática encondiciones de 26:18 °C de temperatura y fo-

Fig. 2.-Ejemplo de una transmisión secuencialde pulgones en una serie de tres plantas.

toperiodo de 16:8 h (Luz:Oscuridad). Alcabo de 15 días, se procedió a realizar unaevaluación de los síntomas del virus. Se con-sideraron infectadas todas aquella plantas quemostraban el mosaico característico del virusCMV y todas las restantes plantas (las dudo-sas y las que no mostraron síntomas) fueronsometidas a un test ELISA a fin de verificar,si estaban o no infectadas.

En el primer ensayo se obtuvieron para M.persicae 21 repeticiones por cada uno de lostratamientos (tipos de secuencias). Para A.gossypii se obtuvieron 22 en el primero y 21en el segundo. El análisis de los resultadosse basó en la comparación gráfica y estadís-tica, mediante tablas de contingencia concalculó de %2, de las eficiencias de transmi-sión obtenidas.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos para A. gossypiien el primer ensayo, nos muestran que esta

especie de pulgón inocula eficientemente elvirus CMV después de probar plantas resis-tentes. Esta eficiencia de transmisión resultóser incluso superior a la obtenida para aque-llos pulgones que penetraron sólo plantassusceptibles (primera planta de la secuenciaSSS) inmediatamente después de adquirir elvirus. En la Fig. 3 se pueden ver las tasas deinfección obtenidas para A. gossypii sobrecada una de las plantas de las cuatro secuen-cias test. Se observa que el porcentaje detransmisión obtenido para las primeras plan-tas susceptibles que probaron los pulgones acontinuación de penetrar 1 ó 2 resistentes(secuencias RSS y RRS), resultó ser elmismo, un 54,5%. Esta cifra es ligeramentesuperior a la resultante en las primeras plan-tas susceptibles de la secuencia SSS, quefue un 50%, mientras que la proporción desegundas y terceras plantas infectadas endicha secuencia se incrementó hasta un59%. Las diferencias entre los porcentajesde transmisión correspondientes a las prime-ras plantas susceptibles de las secuencia

Fig. 3.-Porcentaje de plantas infectadas para A. gossypii, en cada una las cuatro secuencias de tres plantastest (n=22), con pruebas de 2 minutos de duración y tres pulgones virulíferos.

RRS, RSS y SSS, así como a las segundasde RSS y SSS no fueron en absoluto signifi-cativas (x2 = 0,122; p = 0,941 y %2 = 0,82;p = 0,3652 respectivamente). Por otro lado,se observa que la inhibición a la transmisiónde virus sobre las plantas portadoras del genVAT es total y ninguna de las plantas resis-tentes resultó infectada.

En cuanto a M. persicae, los resultadosobtenidos nos muestran que esta especie escapaz de inocular el virus CMV tanto aplantas suceptibles como a resistentes, pero

se han observado ciertas diferencias en lastasas de transmisión obtenidas entre las dis-tintas combinaciones de plantas. En la Fig. 4se indican las eficiencias de transmisión res-pecto del número total de repeticiones y laseficiencias de transmisión con respecto delnúmero de respeticiones en las que hubo ad-quisición positiva del virus, esto es, cuandoalguna de las tres plantas resultó infectada.Comparando estadísticamente (Cuadro 1)las tasas de inoculación obtenidas en fun-ción de la posición dentro de la secuencia

Cuadro 1 .-Valores obtenidos en las tablas de contingencia donde se compara para Myzus persicaelos porcentajes de transmisión obtenidos en función de la posición de la planta dentro de la secuencia

Fig. 4.-Porcentaje de plantas infectadas para M. persicae en cada una las cuatro secuencias test, con pruebasde 2 minutos de duración y tres pulgones virulíferos: A) con respecto del total de secuencias testadas (n=21)

y B)con respecto del total de secuencias por tratamiento en las que tuvo lugar adquisición de CMV.

(primera planta, segunda y tercera) no seobtuvieron diferencias significativas. Noobstante se observa que entre las primerasplantas de cada secuencia el porcentaje deinfección total más bajo se corresponde conla susceptible de la combinación SSS quefue de un 19%, mientras que en las otras se-cuencias en las que esta primera planta queera resistente (RRR, RRS, RSS) se obtuvie-ron un 50%, 29% y 33% de infección res-pectivamente. Como se puede ver en la fig.4, estas diferencias se incrementan (40% vs.83%, 58% y 60%) si consideramos los por-centajes de infección respecto de las secuen-cias con adquisición positiva. En la segundaplanta de cada secuencia ocurre el fenóme-no contrario, es decir, los porcentajes de in-fección totales obtenidos son muy superio-res en las plantas susceptibles frente a lasresistentes (10% en RRR y 5% en RRS, vs.29% en RSS y 24% en SSS) e igualmente seincrementan las diferencias si consideramosla tasa de transmisión con respecto de la ad-quisición positiva, aunque desde ninguno de

los dos puntos de vista el valor de P fue sig-nificativo (nivel de significación al 5%). Encambio si son significativamente diferentes{ya - 4,748; P = 0,0293) cuando se compa-ran conjuntamente los porcentajes de infec-ción de las segundas plantas resistentes(RRR y RRS) frente a las segundas suscep-tibles (RSS y SSS). Esta tendencia a dismi-nuir la eficiencia de la transmisión en lasplantas resistentes e incrementarse en lassuscptibles es aún mas acusada en las terce-ras plantas de la secuencia, donde no resultóinfectada ninguna resistente de la RRR,mientras que se obtuvieron altos porcentajesde infección en las restantes que eran sus-ceptibles (19% en RRS, 24% en RSS y 24%en SSS).

En el segundo ensayo llevado a cabo conA. gossypii (fig. 5.) el porcentaje de infec-ción obtenido para las primeras plantas sus-ceptibles de la secuencia SSS resultó seridéntico (25%) al obtenido cuando los pul-gones habían probado previamente dosplantas resistentes (secuencia RRS) y una

Fig. 5.-Porcentaje de plantas infectadas para A. gossypii en cada una las tres secuencias de plantas test (n=21),con pruebas de 4 minutos de duración y un pulgón virulífero por secuencia.

sola (secuencia RSS). Esta coincidencia devalores se da también en las segundas plan-tas susceptibles de las secuencias RSS ySSS, donde el 15% de las plantas resultaroninfectadas. El porcentaje de transmisión enlas terceras plantas de esta última secuenciase mantuvo en el mismo nivel del 15%.

DISCUSIÓN

En el primero de los ensayos, donde sepermitía a los pulgones probar las plantasdurante 2 minutos, se demuestra que los in-dividuos de A. gossypii son perfectamentecapaces de transmitir virus a plantas suscep-tibles después de probar las resistentes. Estonos indica que los mecanismos de acción dela resistencia no inactivan las partículas vi-rales, ni son tóxicos o dañinos para el pul-gón ya que este supera rápidamente el efec-to inhibidor del gen VAT una vez que aban-dona la planta resistente. Esta conclusión esválida tanto para los pulgones que probaronuna sola planta resistente, como dos, previa-mente a la susceptible, luego tampoco seobserva ningún efecto aditivo en la acciónde la resistencia y los pulgones recuperan sucapacidad transmisora independientementedel tiempo de exposición a plantas resis-tentes. A pesar de lo anterior, las tasas detransmisión obtenidas en las tres plantas dela secuencia de susceptibles es comparable alas tasas resultantes después de la exposi-ción a las plantas resistentes luego en base aesto no se puede afirmar que la hipótesisque se pretende demostrar sea la verdadera.En este caso, la ausencia total de transmi-sión observada en las plantas resistentes, po-dría ser explicada tanto por un efecto debloqueo de la salida de las partículas haciael exterior del estilete (hipótesis planteada)como por una posterior inactivación deaquellas en el citoplasma de la célula comoconsecuencia de una reacción específica dela planta a algún compuesto de la saliva delpulgón. En cambio, los resultados del se-gundo ensayo en el que se alargó a 4 minu-tos el tiempo de exposición de los pulgones

a las plantas, muestran que las tasas detransmisión sobre las plantas susceptiblesque penetraron los pulgones a continuaciónde dos o una resistentes (RRS y RSS) sonun 10% superiores a las de aquellas suscep-tibles cuya posición era la equivalente en lasecuencia SSS (SSS y SSS respectivamen-te). Esto parece indicar que las partículas deCMV permanecieron retenidas en el interiordel estilete durante las pruebas a plantas re-sistentes (WANG y col., 1996a, 1996b;ZEYEN y BERGER, 1990).

Mirándolo desde otro punto de vista, elporcentaje de infección sobre la primeraplanta susceptible de la secuencia SSS esexactamente el mismo que el obtenido en laprimera planta susceptible que sigue a las re-sistentes (RRS y RSS), luego en estas, pareceser que no tuvo lugar liberación de partículasde CMV. Por lo tanto parece existir eviden-cia de que la hipótesis sugerida es cierta, loque no obstante habrá de ser verificado me-diante experimentos basados en otras técni-cas tales como microscopía electrónica.

Los resultados obtenidos para M. persicaeno están exentos de interés. Indican que estaespecie no escapa a la acción de los meca-nismos de resistencia del gen VAT, lo queya ha sido demostrado en el caso de su com-portamiento alimenticio (CHEN y col, 1997).Aunque se observa que este pulgón es capazde inocular virus a las plantas resistentes elcomportamiento de transmisión mostradosobre estas plantas es muy distinto del regis-trado sobre las susceptibles. Las primeras di-ferencias se encuentran en los niveles de in-fección alcanzados en las primeras plantasde las secuencias que fueron sensiblementesuperiores en todas las resistentes (RRR,RRS y RSS) con respecto de la primera sus-ceptible de la secuencia SSS. Luego la pre-sencia del gen VAT parece haber favorecidola transmisión de CMV en este caso. Unaposible explicación a este hecho podría serque el pulgón al penetrar una célula, reaccio-na frente a algún elemento adverso aumen-tando la secreción de saliva, lo que causariaun incremento del volumen de partículas vi-rales inoculadas de acuerdo con la hipótesis

que sostiene que la inyección de saliva en elinterior del citoplasma celular es la vía parala inoculación de virus del tipo no persisten-te. (MARTÍN y col, 1997).

Curiosamente, en la segunda planta re-sistente (RRR y RRS) que probaron los in-dividuos de M. persicae la situación se in-vierte y el porcentaje de infección resultaser muy inferior (diferencias significativas)al de las plantas susceptibles (RSS y SSS).Esta tendencia se acusa aún más en las ter-ceras plantas resistentes de la secuenciaRRR donde no se registró infección alguna.Esto evidencia que los mecanismos de resis-tencia reducen progresivamente la capaci-dad de transmisión de M. persicae hastaanularla por completo, luego cuanto mayores el tiempo de exposición a las plantas re-sistentes menor es la eficiencia de inocula-ción. Al igual que A. gossypii esta especierecupera su capacidad transmisora cuandolos individuos abandonan la plantas resis-tentes, lo que se deduce de las altos porcen-tajes de infección obtenidos para las plantassusceptibles que probaron a continuación deuna o dos resistentes.

LECOQ y col. (1980) pensaron que los me-canismos de acción del gen VAT son espe-cíficos para A. gossypii. Se ha demostrado

que esto no es cierto ya que la capacidadtransmisora de M. persicae también se vedisminuida cuando prueban repetidamenteplantas resistentes (portadoras del genVAT). Esto concuerda con los resultadosobtenidos por estos autores en un trabajo an-terior (LECOQ y col, 1979) en el que detec-taron una resistencia parcial a la transmisiónde virus por M. persicae en líneas portado-ras del gen VAT. De acuerdo con esto es ló-gico pensar que no existe una reacción espe-cífica en las plantas frente a A. gossypii sinoque simplemente esta especie es más sensi-ble a los mecanismos de resistencia. Es pro-bable que esto sea debido al hecho de que elmelón es huésped habitual de A. gossypii y ala gran plasticidad de M. persicae paraadaptarse a un gran número de especies ve-getales. Por otra parte, las coincidencias ob-servadas en las respuestas de ambas espe-cies frente al gen VAT, parecen corroborarla hipótesis de que algún tipo de barrera físi-ca bloquea la salida de partículas viraleshacia el exterior del estilete. Restaría expli-car por qué M. persicae es capaz de venceren las primeras pruebas este bloqueo aunquesimplemente diferencias en la anatomía ocaracterísticas fisiológicas de los estiletespodrían ser la causa de ello.

ABSTRACT

MARTÍN, B.; RAHBÉ, Y. y FERERES, A., 1998: Evaluación de una hipótesis sobre elmecanismo de resistencia a la transmisión de virus (gen VAT) por Aphis gossypii Glo-ver en el melón. Bol. San. Veg. Plagas, 24(4): 727-736 .

Aphis gossypii is the main virus vector in melon crops. Pitrat and Lecoq (1980) des-cribed a resistance gene (VAT gene) that suppresses the ability of this aphid species totransmit viruses. This resistance is not based upon the disruption of the probing beha-viour of the aphids because they are able to penetrate regularly on the resistant plants. Inthis work we assessed an hypothesis that explains the mechanism of this resistance bymeans of a mechanical blockage of the tip of the aphid's stylet. This blockage would pre-vent the release of the virus particles from the stylet, and therefore the virus transmission.

Here we describe two experiments where viruliferus aphids were allowed to penetra-te sequences of resistant and/or susceptible melon plants. The results obtained showedthat Aphis gossypii transmitted cucumber mosaic virus (CMV) to susceptible plants afterprobing on resistant ones, indicating that the resistance mechanism is reversible. Furt-hermore, aphids coming directly from the CMV source transmitted the virus on suscep-tible plants with the same efficiency (25%) than those aphids that previously probed onresistant plants, suggesting that the hypothesis proposed is correct. On the other hand,Myzus persicae reacted to the VAT gene, because the transmission efficiency by thisspecies was reduced as the aphids repeatedly penetrated on the resistant plants.

Key words: VAT gene, resistance, Aphis gossypii, virus transmission, CMV.

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