estudio químico computacional sobre la formación del intermediario l-thdp en el ciclo catalítico...

Universidad de Concepcin Facultad de Ciencias Qumicas

Departamento de Fsico Qumica Grupo de Qumica Biolgica y Computacional

Estudio qumico computacional sobre la formacin del intermediario LThDP en el

ciclo cataltico de la enzima acetohidroxi sintasa

Tesis para optar al grado acadmico de Licenciado en Qumica y al ttulo profesional de Qumico

Omar Blas Alvarado Carripn

Concepcin, Octubre del 2012

Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin ii

Resumen

El cido acetohidroxi sintasa (AHAS) es una enzima tiamina dependiente que

cataliza los primeros pasos de la ruta biosinttica de los aminocidos de cadena

ramificada valina, leucina e isoleucina. Esta enzima se encuentra en plantas, hongos

y bacterias por lo que es el principal blanco de accin de herbicidas, fungicidas y

agentes antimicrobianos. El ciclo cataltico de la AHAS est constituido por cuatro

pasos principales. En el primer paso el intermediario iluro realiza un ataque

nucleoflico sobre una molcula de piruvato para dar paso a la formacin del

intermediario (2S)2LactilThDP (LThDP). La formacin de este intermediario

necesita adems la presencia de un hidrgeno el cual en la AHAS es de

procedencia desconocida, debido a la inexistencia de grupos ionizables cercanos a

las zonas del sitio activo de la enzima. Por este motivo en la presente tesis se

estudi el mecanismo de reaccin para la formacin del LThDP, postulando que

el grupo encargado de promover la transferencia protnica es el grupo amino del

anillo de pirimidina cuando este se encuentra bajo la forma APH. Para ello se

realiz una exploracin de la superficie de energa potencial (SEP) de la reaccin

considerando a los sustratos aislados en fase gas. Adems se realizaron clculos de

las funciones de Fukui para el sustrato piruvato, para el estado de transicin y para

el intermediario iluro bajo las formas AP y APH con el fin de contrastar la

reactividad de ambas formas tautomericas. Por ltimo se realizaron clculos

termodinmicos utilizando medios de distintas constante dielctrica, con el

propsito de verificar la estabilidad de formacin del intermediario iluro bajo la

forma APH debido a la protonacin del anillo pirimidnico por parte del

aminocido glutamato. Los clculos computacionales se realizaron con el paquete

computacional GAUSSIAN 03, empleando la teora de los funcionales de densidad

(DFT) a nivel B3LYP/631++G(d,p) para la exploracin de la SEP y B3LYP(C

PCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) para los clculos termodinmicos, en

tanto los estudios de reactividad se realizaron con el paquete computacional Jaguar

7.7, empleando B3LYP/631++G(d,p). Los resultados obtenidos indicaron que la

formacin del LThDP ocurre de manera concertada, mostrando una barrera de

activacin de aproximadamente 21 Kcal/mol. Adems se observ que es el iluro

bajo la forma AP quien realiza el ataque nucleoflico sobre la molcula de piruvato.

Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin iiii

Abstract

Acetohydroxy acid synthase (AHAS) is a thiaminedependent enzyme that catalyzes

the first steps in the biosynthetic pathway of branched chain amino acids valine,

leucine and isoleucine. This enzyme is found in plants, fungi and bacteria making it

the main target of action of herbicides, fungicides and antimicrobial agents. The

catalytic cycle of AHAS consists of four main steps. In the first step the

intermediate ylide performs a nucleophilic attack on a molecule of pyruvate to

make way for the formation of the intermediate (2S)2lactylThDP (LThDP). The

formation of this intermediate also needs the presence of a hydrogen which is of

unknown origin in the AHAS, due to the absence of ionizable groups in the active

site of the enzyme. For this reason in this thesis studied the reaction mechanism for

the formation of LThDP, postulating that the group responsible for the

protonation is the amino group of the pyrimidine ring when the form is APH. In

order to validate this hypothesis, the potential energy surface (PES) was explored

considering the reaction between isolated substrates in gaseous phase. Furthermore,

Fukui function calculations were performed for the substrate pyruvate, for the

transition state and for the intermediate ylide under the forms and AP and APHin

order to compare the reactivity of both tautomeric forms. Finally thermodynamic

calculations were performed using different dielectric media, in order to verify the

stability of the intermediate ylide formation under the form APH owing to

protonation of the pyrimidine ring by the amino acid glutamate. The computations

were performed using the GAUSSIAN 03 software package, using the density

functional theory (DFT) at B3LYP/631++G(d,p) for the exploration of the SEP

and B3LYP(CPCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) for thermodynamic

calculations, while reactivity studies were performed using the software package

Jaguar 7.7 employing B3LYP/631++G(d,p). The results obtained indicated that the

formation of LThDP occurs in a concerted way, showing an activation barrier of

approximately 21 Kcal / mol. Also was observed that the ylide in the AP form is

responsible for the nucleophilic attack on the molecule of pyruvate.

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ndice general

CAPITULO 1: Introduccin..1

1.2 Propuestas de investigacin................................................................................... 6

1.3 Propuestas de investigacin................................................................................. 11

1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis ............................................................ 13

1.4.1 Hiptesis .............................................................................................. 13

1.4.2 Objetivos .............................................................................................. 13

CAPITULO 2: Metodologa..................................................................................... 14

2.1 Construccin de la SEP con los sustratos aislados ............................................ 15

2.2 Clculos de reactividad ....................................................................................... 17

2.3 Clculos termodinmicos ................................................................................... 18

2.3.1 Clculos en fase gas ............................................................................. 18

2.3.2 Clculos en solucin ............................................................................ 19

CAPITULO 3: Resultados y discusin .................................................................... 20

3.1 Exploracin de la SEP con los sustratos aislados .............................................. 21

3.1.1 SEP a nivel semiempirico ................................................................... 21

3.1.2 Correccin DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................ 28

3.1.3 Optimizacin de los puntos crticos de SEP DFT al nivel B3LYP/6 31++G(d,p) .................................................................................................... 30

3.2 Estudio de reactividad ........................................................................................ 36

3.3 Anlisis termodinmico ...................................................................................... 39

CAPITULO 4: Conclusiones y proyecciones ......................................................... 41

4.1 Conclusiones ....................................................................................................... 42

4.2 Proyecciones ....................................................................................................... 43

Bibliografa ................................................................................................................ 44

Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin iviv

ndice de figuras

Figura 1: sntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato................... 6

Figura 2: estructura del cofactor tiamina difosfato con diedrosp yT .................. 7

Figura 3: mecanismo de protonacin del cofactor ThDP correspondiente a las

etapas de activacin del cofactor para formacin del intermediario Iluro ................ 8

Figura 4: estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y

el grupo difosfato ......................................................................................................... 9

Figura 5: ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en literatura ..................... 10

Figura 6: mecanismo de formacin del intermediario LThDP en literatura ......... 12

Figura 7: mecanismo postulado para la formacin del intermediario LThDP ............... 12

Figura 8: coordenadas de reaccin para exploracin de SEP en la formacin del

intermediario LThDP............................................................................................... 15

Figura 9: equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1=

CH2CH2OH. ............................................................................................................. 18

Figura 10: ciclo termodinmico para calculo de G del equilibrio en solucin.... 19

Figura 11: representacin 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3....................... 22

Figura 12: representacin bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3..... 22

Figura 13: estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en

fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET1, (C) intermediario I, (D)

estado de transicin ET2, (E) producto LThDP .................................................... 23

Figura 14: estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario

I................................................................................................................................... 24

Figura 15: mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario

LThDP mediante clculos a nivel PM3................................................................... 27

Figura 16: diagrama de energa para SEP a nivel semiemprico PM3..................... 27

Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin vv

Figura 17: representacin 3D de la superficie de energa potencial a nivel DFT ... 28

Figura 18: representacin 2D de la superficie de energa potencial a nivel DFT. .. 29

Figura 19: estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel DFT optimizados en

fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET, (C) producto LThDP......... 30

Figura 20: estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT ..................... 31

Figura 21: estructura del estado de transicin ET con el stretching simultneo de las

coordenadas de reaccin C2C2 y H4O2 .......................................................... 32

Figura 22: esquema de los clculos IRC aplicados al estado de transicin ET....... 32

Figura 23: estabilizacin por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de

protonacin del anillo de aminopirimidina en la forma AP con R igual a 5(2

[hidroxidifosfato]etil)4metil1,3tiazol3io.............................................................. 33

Figura 24: mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario

LThDP mediante clculos a nivel B3LYP/631++G(d,p)....................................... 35

Figura 25: diagrama de energa para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p) .............. 35

Figura 26: funciones de Fukui para el (A) APHIluro, (B) APIluro, (C) estado

de transicin ET y (D) piruvato. Funcin de Fukui para (E) piruvato ............... 36

Figura 27: ndices atmicos de Fukui para APIluro y APHIluro. Con R1=

CH2CH2OH .............................................................................................................. 37

Figura 28: ndices atmicos de Fukui (A) y (B) para la molcula de piruvato

.................................................................................................................................... 37

Figura 29: ndices atmicos de Fukui y , en parntesis, para el estado de

transicin ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.......................................... 38

Figura 30: equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1=

CH2CH2OH .............................................................................................................. 39

f

f +

f

f f +

f f +

Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin vivi

ndice de tablas

Tabla I: valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos diedros p

y T para los puntos crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel

semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3......................................................... 23

Tabla II: valores de longitudes y ngulos de enlace para los puntos crticos de la

SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3

.................................................................................................................................... 24

Tabla III: valores de cargas atmicas tras MPA para los puntos crticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel PM3........................................................................ 24

Tabla IV: valores de longitudes de enlace del anillo pirimidnico para los puntos

crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el

hamiltoniano PM3 ..................................................................................................... 26

Tabla V: ordenes de enlace de Mulliken del anillo pirimidnico para los puntos

crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el

hamiltoniano PM3 ..................................................................................................... 26

Tabla VI: valores de cargas atmicas tras MPA para el anillo pirimidnico del

cofactor ThDP en el mecanismo de reaccin obtenido a nivel PM3..................... 26

Tabla VII: valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y los ngulos diedrosp

yT para los puntos crticos de la SEP en fase gas a con el mtodo DFT a nivel 6

31++G(d,p). ................................................................................................................ 30

Tabla VIII: valores de longitudes de enlace de los puntos crticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31

Tabla IX: valores de ngulos de enlace para los puntos crticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel B3LYP/631++G(d,p) ............................................ 31

Tabla X: valores de ordenes de enlace para los puntos crticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31

Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin viivii

Tabla XI: valores de cargas atmicas tras anlisis NBO para los puntos de crticos

de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................................................................... 33

Tabla XII: valores de longitudes de enlace para el anillo pirimidnico de los puntos

crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............... 34

Tabla XIII: valores de ordenes de enlace NBO para el anillo pirimidnico de los

puntos crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ... 34

Tabla XIV: valores de cargas atmicas del tipo NBO para el anillo pirimidnico del

cofactor ThDP en el mecanismo de reaccin a nivel B3LYP/631++G(d,p) ...... 34

Tabla XV: valores de G para la reaccin acido base entre el residuo altamente

conservado Glu139, simulado con una molcula de acido actico y APIluro....... 39

Capitulo 1: Introduccin

Licenciatura en QumicaQumico Universidad de Concepcin 11

Captulo 1

Introduccin

n este captulo se dar una breve descripcin de lo que son las enzimas y

sus propiedades. Posteriormente, se expondrn aspectos generales de la

enzima AHAS tales como: los organismos en que se encuentra, las

reacciones que cataliza, los cofactores que posee y el ciclo cataltico que hasta el

momento se le ha postulado en literatura. Esto permitir revelar las interrogantes

asociadas a la enzima y as dar paso a la propuesta de trabajo en que est enfocada

esta tesis.

E



1.1 Enzimas.

Las enzimas son protenas globulares, de gran tamao y que funcionan como

catalizadores biolgicos. Estn formadas por largas cadenas de aminocidos unidos

a travs de enlaces peptdicos. Estas cadenas de residuos de aminocidos

presentan una secuencia definida, la cual otorga las propiedades especficas que

posee cada enzima. En este sentido las enzimas pueden presentar diferentes

estructuras de ordenamiento: la primera de ellas corresponde a la secuencia de

aminocidos de la cual est constituida la enzima y es lo que se considera como la

estructura primaria. El siguiente nivel de organizacin abarca a las hlices alfa y a la

conformacin beta plegada, estas dos formas estn determinadas por el tipo de

interaccin entre las cadenas laterales de aminocidos de distintos polipeptidos

dentro de la enzima y son las que componen las estructuras secundarias. La

estructura terciaria corresponde a la disposicin tridimensional de todos los tomos

que componen la protena. Por ltimo se encuentra la estructura cuaternaria, la

cual se compone de complejos de ms de una cadena polipeptdica. Estos tipos de

plegamientos estn regidos por las interacciones entre los enlaces no covalentes

presentes en el ambiente enzimtico. Estas interacciones corresponden a enlaces de

hidrgeno, enlaces inicos y a fuerzas de Van der Waals las cuales ayudan a

mantener la forma de las enzimas. Es as como la distribucin de los

aminocidos polares y no polares orientan la forma en que se pliegan las enzimas.

Las cadenas laterales apolares tienden a agruparse en el interior de la enzima,

mientras que las cadenas laterales polares, tienden por s mismas a disponerse cerca

del exterior. En general una enzima siempre se pliega de tal forma que su

estructura adopte la menor energa libre posible. Las diferencias de plegamientos y

formas, definen las llamadas isoenzimas o isozimas. Estas enzimas corresponden a

enzimas que difieren en su secuencia de aminocidos y por ende en su

ordenamiento estructural. Sin embargo se caracterizan principalmente por catalizar

la misma reaccin qumica que otras enzimas, pero mostrando diferentes

parmetros cinticos.



Cada enzima acta sobre un sustrato especfico y generalmente cataliza

exclusivamente una sola reaccin, aunque esto vara dependiendo de la cantidad de

cofactores que presente cada enzima en su composicin. La regin en que las

enzimas llevan a cabo la reaccin con los sustratos se denomina sitio activo. Las

enzimas en su sitio activo requieren adems de la presencia de molculas no

proteicas para ejercer su actividad cataltica que se denominan cofactores, estas

pueden ser metales divalentes o molculas orgnicas que reciben el nombre de

coenzimas.

En un principio se pensaba que esta interaccin enzimasustrato ocurra bajo el

modelo de llave cerradura, pero sin embargo este modelo falla al intentar explicar

la estabilizacin de los estados de transicin. Por este motivo Daniel Koshland

sugiere en 1958 el modelo de acoplamiento o encaje inducido, en donde se

establece que las enzimas son estructuras bastante flexibles con lo que el sitio activo

podra cambiar su conformacin estructural debido a la interaccin con el sustrato.

Como resultado, las cadenas aminoacdicas que componen el sitio activo

interactan especficamente con los distintos cofactores y sustratos, permitiendo a la

enzima llevar a cabo su funcin cataltica. Existe un tercer modelo, llamado tensin

sobre el sustrato, que es derivado del modelo de Koshland. En este modelo el

sustrato es tensionado hacia la formacin del producto como resultado de una

transicin conformacional inducida por la enzima, la cual deforma los ngulos de

enlace y activa al sustrato.

Una manera de cuantificar la interaccin enzimasustrato es a partir de la constante

de Michaelis (Km), obtenida desde la ecuacin de MichaelisMenten. Esta

constante tiene una gran importancia prctica debido a que es independiente de la

concentracin de la enzima, permite el clculo de la concentracin de sustrato que

conduce a la velocidad correspondiente al 50% de la velocidad mxima de reaccin

y constituye una medida de afinidad de las enzimas por el sustrato. Dentro de este

mbito existen adems otros factores que influyen en la interaccin enzimasustrato

y que estn directamente relacionados con la actividad enzimtica. Entre ellos se

encuentran la temperatura, la cual cuando aumenta tambin lo hace la velocidad

enzimtica, pero si esta aumenta demasiado se produce la desnaturalizacin del

ambiente proteico, con lo que se anula la actividad enzimtica. Otro factor es el

pH, el cual es especfico para la actividad mxima en cada enzima y basta un



pequeo cambio para provocar la desnaturalizacin de esta, que en otras palabras

se refiere a la modificacin de todas las estructuras de la enzima, excepto la

estructura primaria. Los diferentes tipos de cofactores, el efecto de la concentracin

de sustrato y de los productos finales, la existencia de isoenzimas, adems de

modificaciones alostricas y covalentes en la estructura proteica de las enzimas,

tambin provocan variaciones de la actividad enzimtica. Uno de los factores ms

importantes que influyen en la actividad enzimtica y que generan un gran inters

debido a sus aplicaciones, es la presencia de inhibidores. Estos pueden clasificarse

segn la forma en que interactan con las enzimas, la cual puede ser de forma

reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima

para producir una protena que no tiene actividad enzimtica y a partir de la cual es

imposible regenerar la enzima original. En cambio los reversibles se unen

covalentemente a la enzima pero posteriormente puede ser liberado, por lo que se

habla de una unin temporal. Dentro de esta ltima clasificacin estos pueden

subdividirse segn la manera en que intervienen en la reaccin, de forma

competitiva y no competitiva con respecto al sustrato.

En la actualidad se conoce un gran nmero de enzimas, las cuales catalizan una

amplia gama de reacciones en los ms diversos organismos. Por este motivo la

Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular ha desarrollado una

nomenclatura para identificar a las enzimas, basada en los denominados nmeros

EC (Enzyme Commission), donde la clasificacin comienza con las letras EC,

seguidas por cuatro nmeros los cuales estn separados por puntos. El primer

nmero indica la clase principal de la enzima y los siguientes son especificaciones

progresivas. Las clases principales se dividen en: 1. Oxidoreductasas: que catalizan

reacciones de oxidorreduccin; 2. Transferasas: que transfieren grupos activos a

otras unidades receptoras, pero no transfieren molculas de agua; 3. Hidrolasas: las

cuales catalizan reacciones de hidrlisis con la consiguiente obtencin de

monmeros a partir de polmeros; 4. Liasas: que catalizan reacciones en las que se

adicionan grupos a dobles enlaces o se forman dobles enlaces a travs de la

eliminacin de grupos H2O, CO2 y NH3; 5. Isomerasas: que transfieren grupos

dentro de la misma molcula para formar ismeros; 6. Ligasas: que catalizan la

degradacin o sntesis de los enlaces CC, CS, CO y CN mediante el

acoplamiento de molculas de alto valor energtico.



Dentro de la clasificacin de las transferasas se encuentra una de las enzimas ms

importantes para la vida de organismos tales como bacterias, hongos y plantas. La

enzima acetohidroxi sintasa, conocida comnmente como AHAS o acetolactato

sintasa se denomina con el nmero EC 2.2.1.6. El primer nmero se debe a que la

AHAS participa en las primeras etapas de la ruta biosinttica de los aminocidos de

cadena ramificada valina, leucina e isoleucina, por lo que sus productos son

transferidos a otras enzimas de la ruta biosinttica, (transferasa). El segundo

nmero, el 2, se debe a que las molculas transferidas poseen al menos un grupo

cetnico en su estructura. En tanto el tercer nmero, el 1, denota que la enzima

corresponde a una transcetolasa (transfiere molculas formadas por la

condensacin de dos tomos de carbono). Por ltimo el numero 6 corresponde

solo a un nmero arbitrario de clasificacin para las transferasas.

La produccin de los aminocidos de cadena ramificada en la que est involucrada

la AHAS es de vital importancia para el desarrollo y crecimiento de los organismos

antes mencionados. La inhibicin de esta enzima y por ende de la produccin de

estos aminocidos conduce a la muerte de los organismos. Con esta caracterstica la

AHAS se ha convertido en el principal blanco de inhibidores, entre los que se

encuentran herbicidas, fungicidas y agentes antimicrobianos. Los herbicidas se

utilizan en las plantaciones para la eliminacin de malezas, las cuales son dainas ya

que compiten directamente con los cultivos por el acceso al agua, al sol y a los

nutrientes. En tanto los agentes antimicrobianos se han desarrollado para la

eliminacin de bacterias responsables de enfermedades tales como la

tuberculosis.



1.2 AHAS.

El acido acetohidroxi sintasa (AHAS; EC 2.2.1.6) es una enzima que se encuentra

en plantas, algas, hongos y bacterias, tal como se mencion anteriormente. Su

funcin es catalizar los primeros pasos comunes que posee la ruta biosinttica de

los aminocidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Las reacciones

que cataliza la AHAS consisten en la condensacin de dos molculas de ceto

cidos, figura 1. En primera instancia cataliza la descarboxilacion, de forma

irreversible y no oxidativa, de una molcula de piruvato.

Figura 1. Sntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato. Los tomos de carbono en negro, los de oxigeno en rojo y los de hidrgenos en blanco.

Posteriormente la enzima puede formar dos tipos de productos, dependiendo de

cul sea el segundoceto cido en reaccionar. Si este corresponde a una segunda

molcula de piruvato, se produce la formacin de (2S)2acetolactato (AL), el cual

es el precursor de los aminocidos de cadena ramificada valina y leucina. Pero si el

segundo sustrato corresponde a una molcula de 2cetobutirato (2CB) se produce

la formacin de (2S)2aceto2hidroxibutirato (AHB) el cual es el precursor del

aminocido de cadena ramificada isoleucina.



N

N

CH2

N+

SNH2CH3

CH3

CH2CH2

OP

O

O

O

P OH

O

O

H

Mg2+

1`

12

3

4

5

2`3`

4`

5`

6` 6

7

7`P

T

La AHAS pertenece a la familia de las enzimas tiamina dependiente, ya que para su

actividad cataltica requiere del cofactor tiamina difosfato (ThDP). Pero adems, la

AHAS requiere de la presencia de otros dos cofactores. El primero corresponde al

metal divalente Mg y el segundo corresponde al cofactor flavina adenina

dinucleotido (FAD).

El cofactor encargado de llevar a cabo las reacciones al interior de la enzima es el

cofactor 3[(4amino2metilpirimidina5il)metil]5(2[hidroxidifosfato]etil)4

metil1,3tiazolio, el cual es el derivado activo de la vitamina B1 y es conocido

comnmente como ThDP. Este cofactor est formado por un anillo tiazolio y por

un anillo pirimidnico. El anillo pirimidnico se encuentra sustituido en la posicin

2 por un grupo metilo y en la posicin 4 por un grupo amino. Ambos anillos estn

enlazados a travs de un carbono puente con el cual forman los ngulos diedrosP

= N3C7C5C4 yT = C2N3C7C5 tal como se muestra en la figura 2. Las

tres conformaciones bsicas que puede adoptar el ThDP debido a la torsin de

estos diedros son: la conformacin tipo F ( 90, 0), la conformacin tipo S (

150, 100) y la conformacin tipo V ( 70, 95), en donde el primer valor

corresponde al diedrop y el segundo al diedroT, respectivamente.

Figura 2. Estructura del cofactor tiamina difosfato con diedrosp yT.

La conformacin tipo V es la que confiere la actividad al ThDP, debido a la

cercana existente entre el grupo imino del anillo pirimidnico y el hidrgeno

enlazado al carbono C2 en el anillo tiazolio, entre los cuales existe una distancia

promedio de 3.0 . Esta cercana permite la abstraccin del hidrgeno enlazado al

carbono C2 por parte del grupo imino, produciendo de esta manera la formacin

de la especie activa conocida como iluro, figura 3. Estas etapas de activacin

consideran un equilibrio tautomerico que comienza con la protonacin del

nitrgeno N1 por parte del aminocido altamente conservado acido glutmico

(Glu139 en la AHAS). Con esto el anillo de aminopirimidina pasa de la forma 4



aminopirimidina (AP) a la forma 4aminopirimidinio (APH). Luego, el grupo

amino cuaternario cede uno de sus protones y el anillo queda en la forma 1,4

iminopirimidina (IP). Por ltimo, el grupo imino del anillo de pirimidina en la

forma IP extrae el tomo de hidrgeno enlazado al carbono C2 formando la

especie altamente reactiva iluro. Se ha postulado que estas etapas de activacin son

comunes para todas las enzimas tiamina dependientes, al igual que los dos

primeros pasos del ciclo cataltico de la AHAS.

Figura 3. Mecanismo de protonacin del cofactor ThDP correspondiente a las etapas de activacin del cofactor (verde) para formacin del intermediario iluro (azul).

Por otra parte en lo que respecta al anillo tiazolio, ste adems de estar unido al

carbono puente, se encuentra enlazado por su otro extremo a un grupo

etilhidroxidifosfato, el cual a su vez esta unido al metal divalente Mg. Este metal

cumple la funcin de anclar al ThDP al sitio activo de la AHAS al interactuar con

dos aminocidos del ambiente enzimtico, los cuales corresponden especficamente

a un cido asprtico y a una asparraguina.

El otro cofactor presente en la AHAS y que no interacciona con sustratos debido a

que la AHAS no lleva a cabo reacciones de oxidoreduccin, es el cofactor flavina

adenina dinucleotido (FAD). Este cofactor est compuesto por una unidad de

riboflavina (vitamina B2), que est unida a un grupo pirofosfato, el cual que est

enlazado a una ribosa, la que a su vez est unida a una adenina, figura 4. Se ha

postulado que el FAD confiere dos propiedades fundamntales a la AHAS, una de

ellas consiste en el aumento de la actividad cataltica de la enzima cuando este



N

N

NN

O

NH2

O

OHOH

OP

O

OOH

P

O

OH

OH

OH

OH

N

NHN

O

O

CH3CH3

cofactor se encuentra presente y la otra es que estimula a la AHAS a adoptar la

conformacin de tetrmero, confiriendo al FAD un rol estructural dentro de la

enzima.

Figura 4. Estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y el grupo difosfato se muestran con los colores: azul, rojo, verde y amarillo, respectivamente.

El ciclo cataltico de la AHAS postulado hasta el momento se muestra en la

figura 5. Consta de cuatro pasos principales, el primero de estos pasos se compone

de un ataque nucleoflico por parte del carbono C2 del intermediario iluro sobre el

carbono carbonlico de una molcula de piruvato, generando al intermediario (2S)

2[(1carboxi1hidroxi)etil]tiaminadifosfato tambin conocido como 2lactil

tiaminadifosfato (LThDP). En el segundo paso el LThDP sufre una

descarboxilacin dando origen al segundo intermediario del ciclo cataltico: el 2(1

hidroxietil)tiaminadifosfato (HEThDP). Una caracterstica importante de este

intermediario es que sus dos estructuras resonantes correspondientes a la forma de

enamina y la forma activa C2carbanin poseen diferente reactividad, siendo ms

estable la forma de enamina. En tanto la forma C2carbanin es la que contina

con el ciclo cataltico de la AHAS, dando origen al tercer paso del ciclo. En este

tercer paso el HEThDP, en su forma aninica, reacciona con el segundo ceto

cido, el cual puede ser una molcula de piruvato o una molcula de 2cetobutirato.

En esta etapa el carbono C2 realiza un ataque nucleoflico sobre el carbono

carbonlico de la segunda molcula de sustrato en cuestin, formando el

intermediario (1S,2S)2[(2carboxi1,2dihidoxi1,2dimetil)etil]tiaminadifosfato,

comnmente conocido como 2acetolactatotiaminadifosfato (ALThDP), cuando

reacciona con una molcula de piruvato, como tambin el intermediario (1S,2S)2

[(2carboxi1,2dihidoxi2etil1metil)etil]tiaminadifosfato que comnmente recibe



el nombre de 2acetohidroxibutiratotiaminadifosfato (AHBThDP) cuando

reacciona con la molcula de 2cetobutirato, respectivamente.

Figura 5. Ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en literatura.

De acuerdo a lo postulado en bibliografa, un punto a destacar en este tercer paso

es que al igual que en el paso nmero uno del ciclo, aqu tambin es necesaria la

presencia de algn residuo cercano al cofactor que posea un grupo ionizable capaz

de protonar al oxgeno carbonlico del segundo ceto cido. Por ltimo, en el paso

nmero cuatro del ciclo cataltico el producto es liberado tras el rompimiento del

enlace C2C2 y el cofactor ThDP es regenerado en la forma de iluro el cual se

reinserta nuevamente en el ciclo. Pero, adems en este cuarto paso, nuevamente es

necesaria la presencia de algn residuo cercano al cofactor que posea un grupo

ionizable, el cual ahora debe promover la extraccin del hidrgeno ubicado en el

primer hidroxilo formado de los intermediarios ALThDP o AHBThDP, segn

sea el caso, con el fin de formar los productos (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2

hidroxibutirato, respectivamente. Sin embargo, a raz de los anlisis de la

estructura cristalina de la AHAS presentados en literatura, los aminocidos

cercanos al sitio activo de la enzima y principalmente aquellos que se encuentran



prximos al grupo amino del anillo pirimidnico y al carbono C2 del anillo tiazolio,

no poseen grupos ionizables capaces de realizar estas funciones. Debido a estas

interrogantes, se ha postulado para los pasos nmero 3 y 4 del ciclo, la posibilidad

de que el mecanismo ocurra intramolecularmente sin la presencia de grupos

ionizables pertenecientes a cadenas laterales cercanas al sitio activo.

1.3 Propuesta de investigacin.

En los ltimos 30 aos se han publicado una gran cantidad de artculos

relacionados con esta enzima, con el fin de comprender en su totalidad los

mecanismos de activacin e inhibicin. Entre los aspectos ms relevantes que se

han publicado se encuentran por ejemplo la obtencin de la estructura cristalina de

la AHAS a partir de extracciones de la enzima realizadas a diversas bacterias, clases

de hongos y tipos de plantas. Adems se han realizado estudios enfocados tanto en

su actividad cataltica, como tambin en la deteccin de los intermediarios

presentes en el ciclo cataltico, para los cuales adems se han determinado las

constantes de velocidad de formacin. Sin embargo, a pesar de esta gran

cantidad de estudios realizados, aun existen interrogantes relacionadas con esta

enzima. Entre estas interrogantes se encuentran aspectos relacionados directamente

con su ciclo cataltico, referentes a la forma en que ocurren los mecanismos de

reaccin que dan paso la formacin de los intermediarios en los distintos pasos del

ciclo cataltico, adems de la ausencia de grupos ionizables cercanos al sitio activo

capaces de promover transferencias protnicas para la formacin de estos

intermediarios. En lo que respecta a estas interrogantes, uno de los pasos del ciclo

cataltico de la AHAS que se ve principalmente afectado por la falta de estos grupos

ionizables y del cual adems se desconoce la forma en que ocurre su mecanismo de

reaccin, es el paso nmero 1 del ciclo cataltico, correspondiente a la formacin

del LThDP. Tal como se describi en la seccin anterior, este paso consta de un

ataque nucleoflico por parte del cofactor tiamina difosfato (ThDP) hacia el primer

sustrato incorporado en el ciclo cataltico de la AHAS correspondiente a una

molcula de piruvato cuando el cofactor ThDP se encuentra bajo la forma de iluro,

figura 6.



Figura 6. Mecanismo de formacin del intermediario LThDP en literatura.

Adems, en este paso se requiere de la protonacin del oxgeno carbonlico de la

molcula de piruvato, para la formacin del intermediario LThDP. Pero, debido

a que en el sitio activo de la enzima no existe la presencia de algn cido o de un

grupo de similares caractersticas, el origen del protn requerido en esta etapa

del ciclo cataltico es desconocido.

Como una posible respuesta a esta interrogante, en la presente tesis se ha propuesto

un mecanismo para la formacin del intermediario LThDP, el cual no requiere de

la presencia de un grupo con carcter cido aledao al sitio activo de la enzima.

Con esto se postula que el origen del hidrgeno requerido en esta etapa del ciclo

cataltico proviene del mismo cofactor ThDP, especficamente del grupo imino

cuaternario presente en el anillo de pirimidina cuando este se encuentra en la

forma de APH, figura 7.

Figura 7. Mecanismo postulado para la formacin del intermediario LThDP.



1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis.

1.4.1 Hiptesis.

La protonacin del oxgeno carbonlico de la molcula de piruvato en la

formacin del intermediario LThDP, se lleva a cabo por el grupo 4imino

del intermediario iluro, cuando este se encuentra con el anillo pirimidnico

bajo la forma de APH.

1.4.2 Objetivos.

Objetivo general: modelar tericamente mediante mtodos mecnico

cunticos el mecanismo de reaccin postulado para la formacin del

intermediario LThDP desde el punto de vista de la cintica, reactividad y

termodinmica.

Objetivos especficos:

1. Cintica: explorar el mecanismo de reaccin y determinar la barrera

de activacin para la formacin del LThDP, considerando los

sustratos aislados en fase gas, mediante la construccin de una

superficie de energa potencial (SEP) con el anillo pirimidnico en la

forma de APH al momento de realizar la trasferencia protnica.

2. Reactividad: calcular las funciones de Fukui y los ndices atmicos

de Fukui para los reactantes y estado de transicin.

3. Termodinmica: calcular los G en fase gas y en solucin para la

reaccin acido base entre el residuo altamente conservado GLU139

y el intermediario iluro bajo las formas AP y APH, utilizando

solventes con distintos valores de constante dielctrica.

Capitulo 2: Metodologa


Capitulo 2

Metodologa

n este captulo se presenta la metodologa empleada para la construccin

de las SEP con los sustratos aislados en fase gas a nivel semiemprico y las

posteriores correcciones energticas para las estructuras obtenidas

empleando la teora de los funcionales de densidad (DFT), adems se indica la

metodologa utilizada para los clculos termodinmicos tanto en fase gas como en

solucin. Tambin se presenta la metodologa empleada para el clculo de las

funciones de Fukui a las distintas molculas de inters.

E



N

N N+ SC

CH3 CH2

N+

H

H

H CH2

OH

CH3

CH3COO

CO2

CH3OR2R1

C2

C1

O2

C2H4`

.

..

.

2.1 Construccin de la SEP con los sustratos aislados.

Para la construccin y exploracin de la superficie de energa potencial (SEP) en

fase gas y con los sustratos aislados, se consideraron dos coordenadas de reaccin

tal como se observa en la figura 8. Una de las coordenadas corresponde al ataque

nucleoflico entre el carbono C2 y el carbono carbonilico C2 (R1) y la otra

corresponde a la transferencia protnica de uno de los hidrogeno enlazados al

grupo 4amino cuaternario hacia el oxgeno carbonilico del piruvato (R2).

Figura 8. Coordenadas de reaccin para exploracin de SEP en la formacin del intermediario LThDP.

Con el propsito de considerar de una manera simple el ambiente apoenzimatico

en la construccin de la SEP se realizaron tres aproximaciones. En primer lugar, en

todos los clculos se consider al cofactor ThDP en la conformacin tipo V con

valores para P de 66 y T de +96, obtenidos de la estructura cristalina de la

AHAS. En segundo lugar, en todos los clculos realizados al intermediario L

ThDP, este siempre se consider con la estructura del enantimero S. Por ltimo,

en todas las estructuras se incluy al residuo altamente conservado glutamato,

debido a la importante interaccin que posee con el tomo N1 del anillo

pirimidnico. Este aminocido fue reemplazado por una molcula de acido

actico, con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxlato del acido

glutmico. Lo mismo se hizo con el grupo hidrxidifosfato, el cual se

reemplazo con un grupo hidroxilo debido a que su rol solo consta en anclar el

ThDP al sitio activo, por lo que no tiene ninguna contribucin en la actividad

cataltica del cofactor. Adems, en ninguno de los clculos se incluye el

metal divalente Mg ya que su rol es coordinar el grupo difosfato del ThDP y

adems no tiene participacin directa en la catlisis.



Posteriormente esta estructura se optimiz utilizando el hamiltoniano PM3

(Parameterized Model number 3) con el programa MOPAC 2009. Una vez

optimizada la molcula se restringi la longitud de enlace C1C2a una distancia

de 1.55 y se optimiz nuevamente. A continuacin, con este resultado se

generaron 73 estructuras diferentes, las cuales se obtuvieron al cambiar la distancia

de la coordenada de reaccin R1 desde 1.40 hasta 5.00 con intervalos de 0.05

. En cada una de estas estructuras se restringieron longitudes de enlaces, ngulos

de enlaces y ngulos diedros con la finalidad de resaltar solo lo cambios de energa

producidos nicamente por las coordenadas de reaccin en estudio y adems para

reproducir de cierta forma la rigidez del cofactor en el sitio activo de la enzima.

Luego, en cada una de estas estructuras la coordenada R2 fue variada entre 3.70

y 0.9 con intervalos de 0.034 , asegurando de esta manera que ambas

coordenadas de reaccin, tanto R1 como R2, tuviesen un total de 72 pasos cada

una. A continuacin la energa de cada una de las 5300 estructuras se grafic en

funcin de la coordenadas R1 y R2 con el programa SigmaPlot 10.0,

construyendo de esta manera la SEP a nivel semiemprico utilizando el

hamiltoniano PM3. Para encontrar los estados de transicin en esta superficie se

seleccionaron estructuras representativas correspondientes a la regin de los puntos

de silla de la superficie y se procedi a su optimizacin y posteriores clculos de

frecuencia con el programa MOPAC 2009.

Sin embargo, debido a las conocidas limitaciones que presenta el mtodo

PM3, la SEP PM3 fue corregida utilizando Density Functional Theory

(DFT) a nivel B3LYP/631++g(d,p). Para esto con el software GAUSSIAN

03se realizaron clculos single points de las estructuras optimizadas a nivel PM3.

Posteriormente estas energas corregidas se graficaron versus las coordenadas de

reaccin R1 y R2 para obtener la SEP corregida a nivel DFT. A las estructuras

optimizadas al nivel B3LYP/631++g(d,p) de los posibles estados de transicin de la

SEP se les realiz un clculo IRC(Intrinsic Reaction Coordinate) al mismo nivel

de teora, con la finalidad de confirmar el estado de transicin correspondiente a la

reaccin de inters. Este clculo condujo hacia reactantes y producto, y sus

resultados fueron comparados con las estructuras optimizadas a nivel B3LYP/6

31++g(d,p) del sistema reactantes y del producto obtenidas a partir de la SEP DFT.



2.2 Clculos de reactividad.

Para los estudios de reactividad se calcularon las funciones de Fukui y los ndices

atmicos de Fukui y . Estas funciones e ndices atmicos permitieron

visualizar y cuantificar respectivamente, la reactividad de las distintas especies

involucradas en la reaccin de formacin del LThDP. La funcin (r)refleja la

reactividad global de la molcula respecto a un centro electroflico. En tanto la

funcin (r) refleja la reactividad hacia un eventual ataque nucleoflico. Estas

funciones estn definidas por las ecuaciones 1 y 2.

( ( ) ( )) /N Nf r r + + = (1)

( ( ) ( )) /N Nf r r = (2)

Con estas ecuaciones las funciones de Fukui fueron calculadas mediante una

aproximacin de diferencias finitas, donde N es el nmero de electrones, es la

densidad electrnica de cierto tomo(r) yes una fraccin de un electrn, donde

el valor utilizado fue de 0.01. En tanto para el anlisis de los ndices atmicos de

Fukui, estos se calcularon simultneamente con los de las funciones de

Fukui mediante la metodologa implementada en el paquete computacional Jaguar

7.7y con la ayuda de la interfaz grafica Maestro 9.1.

Los resultados de las funciones de Fukui fueron entregados y visualizados como

isosuperficies, mientras las funciones atmicas de Fukui, tambin conocidas como

las funciones condesadas de Fukui, se obtuvieron por el clculo descrito en las

ecuaciones 1 y 2, correspondientes al cambio de densidad electrnica entre las

molculas neutras y sus especies radicales, donde se registr la poblacin

electrnica sobre los tomos de las molculas analizadas. Para la obtencin

de las poblaciones atmicas se realizaron clculos del tipo MPA (Mulliken

Population Analysis), anlisis implementado en la metodologa de Jaguar 7.7 para

el clculo de funciones de Fukui.

f + f

f

f +



2.3 Clculos termodinmicos.

2.3.1 Clculos en fase gas.

Las estructuras que se muestran en la figura 9, fueron optimizadas en fase gas con

el software GAUSSIAN 03 y utilizando la teora de los funcionales de densidad al

nivel B3LYP/631++G(d,p). Posteriormente sobre las estructuras optimizadas se

realizaron clculos de frecuencia al nivel de teora a B3LYP/6311G.

Figura 9. Equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1= CH2CH2OH.

Los resultados de las funciones termodinmicas entregadas por los clculos de

frecuencia fueron obtenidos de acuerdo a las ecuaciones 3, 4 y 5. Donde ESCF es la

energa potencial (SelfConsistent Field Energy), ZPE es la energa del punto cero

(Zero Point Energy), kB es la constante de boltzmann, T la temperatura y EInt es la

suma de las energas trasnacional, rotacional, vibracional. Con el valor de la

energa libre de las molculas de la figura 9 se calcul el valor del G para

reaccin acido base entre en residuo y los tautmeros APIluro y APHIluro.

tot SCF IntE E ZPE E = + + (3)

corr tot BH E k T = + (4)

corr corr totG H TS = (5)



2.3.2 Clculos en solucin.

Las estructuras de la figura 9 fueron optimizadas en fase gas. Los efectos de

solvatacin implcita fueron modelados de acuerdo al modelo CPCM (Conductor

Polarizable Continuum Model), tal como est implementado en Gaussian 03.

Las constantes dielctricas de los medios considerados fueron 2.01 y 32.63,

como paradigmas de medios apolares y polares respectivamente, con el fin de

resaltar el efecto del ambiente enzimtico, tratando de simular en primer lugar las

estabilizaciones producidas por las fuerzas de Van der Waals que otorgan los

residuos cercanos al sitio activo y que generan un ambiente hidrofbico de una

constante dielctrica con valores entre 2 y 4. Para el segundo caso se intento

simular el ambiente enzimtico en el interior de la enzima, pero ahora

considerando las estabilizaciones de carcter electrosttico por parte de

aminocidos que presentan grupos ionizados. Adems todos los clculos

fueron hechos considerando al residuo altamente conservado glutamato

interactuando con el tomo N1 como una forma simple de considerar el ambiente

apoenzimatico. Este residuo fue reemplazado por una molcula de acido actico,

con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxlato del acido glutmico.

Las energas libres en solucin fueron calculadas a nivel B3LYP(CPCM)/6

311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p), mediante el empleo del ciclo termodinmico,

que se muestra en la figura 10, tomando la diferencia entre elG del equilibrio en

fase gas y los valores deG de solvatacin obtenidos de los clculos single points

en solucin de las molculas involucradas (ecuacin 6).

Figura 10. Ciclo termodinmico para calculo deG del equilibrio en solucin.

0 0 0 0solucion gas solvB solvAG G G G = + (6)

Capitulo 3: resultados y discusin


Capitulo 3

Resultados y discusin

n este captulo se presenta la SEP con los sustratos aislados en fase gas

realizada a nivel semiemprico PM3 y su posterior refinamiento con el

mtodo DFT a nivel 631++G(d,p). Tambin se presenta el resultado de

los ndices de reactividades correspondientes a las funciones de Fukui para el iluro

con el anillo pirimidnico en la forma AP y APH, para la molcula de piruvato y

para el estado de transicin. Adems, se presentan los valores del cambio de la

energa libre en condiciones estndar obtenido del anlisis termodinmico

realizado para la reaccin acido base entre el residuo altamente conservado

GLU139 y APIluro.

E



3.1 Exploracin de la SEP con los sustratos aislados.

3.1.1 SEP a nivel semiemprico PM3.

La exploracin de la SEP a nivel semiemprico con el hamiltoniano PM3, figuras

11 y 12, muestran que el mecanismo de reaccin para la formacin del LThDP

presenta la formacin de un intermediario y la presencia de dos estados de

transicin. La primera etapa del mecanismo consiste en el desplazamiento de la

molcula de piruvato hacia el cofactor ThDP, promoviendo el ataque nucleoflico

por parte del carbono C2 hacia el carbono carbonlico C2 de la molcula de

piruvato, alcanzando de esta forma el primer estado de transicin ET1. Este estado

de transicin est caracterizado con solo una frecuencia imaginaria de 407 cmy

que corresponde al stretching de la coordenada C2C2.La barrera de activacin

observada, calculada a nivel PM3, es aproximadamente de 29 Kcal/mol. Durante

esta etapa no se observa transferencia protnica. A continuacin, el ataque

nucleoflico se completa formando el intermediario I, con una longitud de enlace

C2C2de aproximadamente 1.55 , que corresponde a la longitud promedio de

un enlace simple carbonocarbono. Luego, una vez formado este intermediario, se

produce la transferencia protnica desde el grupo 4NH2 al oxgeno carbonilico

O2, formando finalmente el producto LThDP, va el estado de transicin ET2.

Este estado de transicin tambin esta caracterizado con una sola frecuencia

imaginaria igual a 2004 cm,correspondiente al stretching H4O2. La barrera

de activacin observada, calculada a nivel PM3, para esta ltima etapa es

aproximadamente de 5 Kcal/mol.

Cabe destacar que estas barreras de activacin se obtuvieron a partir de las

estructuras de los puntos crticos de la reaccin que fueron optimizadas en fase gas

sin restricciones, una vez construida la SEP. Ya que no corresponden a las

estructuras con las que se construyo la superficie, las cuales fueron restringidas en

algunas variables tales como longitudes de enlaces, ngulos de enlaces y ngulos

diedros. Estas nuevas optimizaciones se realizaron utilizando el hamiltoniano PM3

en MOPAC 2009.



Figura 11. Representacin 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3.

Figura 12. Representacin bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3.

Los valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos diedrosp y

T para los diferentes puntos crticos de la SEP optimizados sin restriccin de

variables se presentan en la tabla I. Para la regin de los reactantes, del

intermediario y del producto se tomaron las estructuras de menor energa

encontradas en la SEP. Mientras que para los estados de transicin se tomaron las

estructuras encontradas en las zonas de puntos de silla de la superficie.



En la figura 13 se muestran los resultados de las estructuras optimizadas en fase gas

de los puntos crticos de esta SEP. Adems, para resaltar los cambios estructurales

ocurridos durante el transcurso de la reaccin, en la tabla II se presentan los valores

de algunas longitudes y ngulos de enlace, pertenecientes principalmente a la

molcula de piruvato y al grupo imino del anillo pirimidnico. Por otro lado en la

tabla III, se presentan las cargas atmicas obtenidas del anlisis poblacional de

Mulliken (MPA) para los tomos ms relevantes involucrados en el ataque

nucleoflico y en la transferencia protnica. En esta ltima tabla y con el fin de

comparar la variacin de la carga sobre los nitrgenos N4, figura 14, tambin se

presentan las cargas atmicas del nitrgeno N3.

Figura 13. Estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET1, (C) intermediario I, (D) estado de transicin

ET2, (E) producto LThDP.



Figura 14. Estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario I.

En el sistema de reactantes la molcula de piruvato presenta una geometra trigonal

plana, con valores de algunos de enlaces cercanos a los 120. En esta regin de la

SEP, el piruvato se encuentra a una distancia de 4.05 del intermediario iluro,

orientando su grupo carbonilo hacia el grupo imino cuaternario del anillo

pirimidnico. Por su parte el nitrgeno N4 en esta regin registra la mayor

densidad de carga positiva, en comparacin a los dems puntos crticos de la SEP,

ya que a medida que avanza la reaccin la carga atmica del nitrgeno N4 adopta

valores negativos, especficamente en el segundo estado de transicin y en el

producto. Adems, el enlace N4C4 muestra una longitud de enlace de 1.33 ,la

cual es menor que el valor de longitud de enlace promedio para un enlace doble

carbononitrgeno, correspondiente a 1.38 . As, el anillo pirimidnico se

encuentra bajo la forma de APH, acorde a lo postulado en literaturapara otras

enzimas ThDP dependientes.



A medida que la reaccin avanza y se sita en la regin del primer estado de

transicin ET1, los valores de los ngulos de enlaces de la molcula de piruvato

comienzan a sufrir modificaciones. Claro ejemplo de esto es la disminucin del

valor del ngulo de enlace C1C2O2 desde 122 a 114.Esto da cuenta del

cambio de geometra que sufre el piruvato, pasando de una geometra trigonal plana

a una geometra tetradrica, producto del ataque nucleoflico realizado por el

carbono C2. Adems como consecuencia de lo ocurrido en esta etapa de la

reaccin, la densidad de carga negativa sobre el carbono C2 disminuye,

produciendo una variacin en la carga atmica de 0.220 a 0.359 desde los

reactantes hasta el intermediario I. En tanto la longitud del enlace C2O2

aumenta de 1.21 a 1.34 , aumentando tambin la carga negativa sobre el

oxgeno O2.

Una vez en la regin del intermediario I, la molcula de piruvato se encuentra

enlazada al cofactor ThDP, adoptando una geometra tetradrica con ngulos de

enlace cercanos a los 109. Sin embrago la orientacin del oxgeno carbonilico O2

de la molcula de piruvato no ha sufrido modificaciones con respecto a la que

presentaba en el sistema de reactantes. Esto se debe principalmente a que el

cofactor ThDP no ha perdido su conformacin tipo V, la cual se mantiene durante

todo el transcurso de la reaccin, al igual que el ngulo de enlace H4N4C4.

Como consecuencia, la transferencia protnica desde el grupo imino cuaternario

del anillo pirimidnico hacia el oxgeno carbonilico O2se encuentra favorecida,

quedando el oxgeno O2 a una distancia de 1.68 con respecto al hidrgeno

H4. Finalmente, el aumento de la densidad de carga negativa sobre el nitrgeno

N4 al atravesar la zona del segundo estado de transicin ET2 y posteriormente al

llegar a la formacin del intermediario LThDP, indica que el anillo pirimidnico

queda bajo la forma de IP, acorde a los postulado en bibliografa para otras

enzimas ThDP dependientes. Con un valor de 1.31 para la longitud del

enlace N4C4 y una carga atmica sobre el nitrgeno N4 de 0.276.

En lo que respecta al anillo pirimidnico, tanto los valores de las longitudes de

enlace, tabla IV, como los valores de los rdenes de enlace, tabla V, ambos

obtenidos por MPA, muestran que desde el sistema de reactantes y hasta la zona

del intermediario I, los enlace del anillo se encuentran deslocalizados.



A medida que la reaccin avanza y pasa desde el intermediario I hasta la formacin

del producto LThDP, las longitudes de los enlaces C4C5 y C4N3 aumentan,

disminuyendo sus ordenes de enlace y formando enlaces simple carbonocarbono y

carbononitrgeno, respectivamente. Esto provoca que la densidad de carga

negativa sobre el carbono C4 disminuya, tabla VI. Lo mismo ocurre con los

enlaces C6N1 y N1C2, los cuales tambin sufren un aumento en sus longitudes

de enlaces en estas etapas de la reaccin, disminuyendo sus ordenes de enlace y

provocando un aumento en la densidad de carga negativa sobre el nitrgeno N1

(tabla III). A pesar de esto, el nitrgeno N1 se mantiene con una carga parcial

positiva durante toda la reaccin. En cuanto a los enlaces C5C6 y C2N3, estos

mantienen sus ordenes de enlaces constantes durante toda la reaccin, con valores

correspondientes a rdenes de enlaces intermedios entre un enlace simple y un

enlace doble.



De acuerdo a los resultados obtenidos de la exploracin de la SEP utilizando el

hamiltoniano PM3, se propone el siguiente mecanismo para la formacin de

intermediario LThDP, figura 15.

Figura 15. Mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario LThDP mediante clculos a nivel PM3.

Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energa que se muestra

en la figura 16. La barrera de activacin, en trminos de energa electrnica, para

este mecanismo de reaccin es de 32.65 Kcal/mol, considerando la barrera

energtica del estado de transicin ET2 con respecto al sistema de reactantes,

debido a que la etapa limitante de la reaccin corresponde a la segunda etapa del

mecanismo.

Figura 16. Diagrama de energa para SEP a nivel semiemprico PM3.



3.1.2 Correccin DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p).

La correccin DFT de la SEP fue necesaria debido a las conocidas limitaciones del

mtodo PM3, a causa de las simplificaciones en la descripcin electrnica de este

mtodo, como por ejemplo considerar solo a los electrones de valencia y la

utilizacin de un mnimo de funciones bases. Estas simplificaciones traen como

consecuencia valores errneos de las cargas sobre los tomos de nitrgeno y una

sobre estimacin de las barreras de activacin. Sin embargo, los mtodos

semiempricos siguen siendo una buena alternativa para una exploracin preliminar

de la superficie de energa potencial para un posterior refinamiento a nivel DFT.

Figura 17. Representacin 3D de la superficie de energa potencial a nivel DFT.

La correccin de la SEP se llev a cabo de acuerdo a la metodologa descrita en la

seccin 2.1. Los resultados de esta correccin se muestran en las figuras 17 y 18.

Esta nueva superficie de energa potencial muestra diferencias importantes en su

topologa con respecto a aquella obtenida a nivel PM3. La zona correspondiente al

intermediario I, ya no presenta la estabilidad energtica descrita por el mtodo

PM3. Como consecuencia, las zonas de los puntos de silla correspondientes a los

estados de transicin ET1 y ET2 han desaparecido. Ahora en esta nueva SEP, es

posible observar que la reaccin ocurre mediante un mecanismo concertado, va un

estado de transicin asncrono, donde la coordenada de reaccin R1,

correspondiente al ataque nucleoflico del carbono C2 sobre el carbono carbonilico



C2, se adelanta a la coordenada de reaccin R2. De esta manera, se observa que a

medida que se acerca la molcula de piruvato hacia el cofactor ThDP, se comienza

a producir el ataque nucleoflico. Mientras esto ocurre, la distancia entre el oxgeno

O2 y el hidrgeno H4 disminuye paulatinamente. Ya en la zona del estado de

transicin ET y hasta la formacin del producto LThDP, se lleva a cabo la

transferencia protnica, rompindose el enlace entre el hidrgeno H4 y el

nitrgeno N4 y formndose el enlace O2H4, mientras el ataque nucleoflico se

completa.

Figura 18. Representacin 2D de la superficie de energa potencial a nivel DFT.

Debido a que la metodologa implementada para corregir la SEP a nivel DFT solo

consisti en realizar clculos single points sobre estructuras optimizadas a nivel

PM3, fue necesario realizar optimizaciones al nivel B3LYP/631++G(d,p) para los

puntos crticos de la SEP DFT. Para las regiones correspondientes al sistema de

reactantes y al producto LThDP, se tomaron las estructuras de menor energa

encontradas en la superficie. En tanto, para la identificacin del estado de

transicin ET se tomaron varias estructuras aproximadas, pertenecientes a la regin

de punto de silla de la SEP. A todas las estructuras optimizadas se les realizaron

clculos de frecuencia, para cuantificar la barrera energtica del mecanismo en

trminos del cambio de energa libre.



3.1.3 Optimizacin de los puntos crticos de SEP DFT al nivel

B3LYP/631++G(d,p).

Los valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos diedrosp y

T para los diferentes puntos crticos de la SEP DFT, optimizados al nivel

B3LYP/631++G(d,p), se presentan en la tabla VII. Adems, en la figura 19 se

muestran los resultados de las estructuras optimizadas de los puntos crticos de la

SEP.

Figura 19. Estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel DFT optimizados en fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET, (C) producto LThDP.



En las tablas VIII y IX, se presentan los valores de algunas longitudes y ngulos de

enlace de los puntos crticos, pertenecientes principalmente a las molculas de

piruvato, acido actico y al grupo imino del anillo pirimidnico, figura 20. En tanto,

en la tabla X se muestran algunos rdenes de enlace, obtenidos del clculo NBO

(Natural Bond Orbital). Clculo que realiza un anlisis de los rdenes de enlaces y

de las hibridaciones basado en la poblacin electrnica obtenida del anlisis NPA

(Natural Population Analysis), anlisis incorporado en el clculo NBO.

Figura 20. Estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT.



La optimizacin y caracterizacin del estado de transicin calculado al nivel

B3LYP/631++G(d,p) mostr como resultado una nica frecuencia imaginaria de

222 cm,correspondiente al stretching simultaneo de las coordenadas de reaccin

C2C2 yH4O2, como se muestra en la figura 21.

Figura 21. Estructura del estado de transicin ET con el stretching simultneo de las coordenadas de reaccin C2C2y H4O2.

Con la finalidad de corroborar que el estado de transicin encontrado corresponde

a la reaccin de inters, se llev a cabo un clculo IRC. El resultado condujo al

producto y al sistema de los reactantes previamente optimizados, tal como se

muestra en la figura 22.

Figura 22. Esquema de los clculos IRC aplicados al estado de transicin ET.



CH3

OO

H

N

N R1

NH2CH3

CH3

OO

H

N

N R1

NH2+

CH3

1.57

:

.. ..

:

1.33

..

De acuerdo a los resultados, se observa que en la zona de los reactantes el piruvato

se encuentra a 4.96 de distancia de la molcula iluro y a 3.51 de distancia con

respecto a la coordenada de reaccin R2, orientando su grupo carboxlato hacia el

grupo 4NH2. A medida que la molcula de piruvato se acerca al carbono C2 del

iluro, sta cambia su orientacin y es el oxigeno O2quien queda ms prximo al

grupo 4NH2, otorgando la configuracin tipo S presente en el LThDP. Una vez

que la reaccin cruza la zona del estado de transicin y hasta la formacin del L

ThDP, la longitud de enlace entre el carbono C4 del anillo pirimidnico y el

nitrgeno N4 del grupo imino disminuye, debido a la transferencia protnica

desde el grupo 4NH2 hacia el oxigeno O2. Como consecuencia, la densidad de

carga negativa sobre el N4 aumenta en la formacin del LThDP, tabla XI. De

igual forma, la distancia del enlace de hidrgeno formado entre el residuo y el

nitrgeno N1, disminuye desde 1.57 a 1.43 , sin producirse transferencia

protnica, quedando el anillo de pirimidnico en la forma de 4iminopirimidina.

Adems, estructuralmente se observa que durante toda la reaccin el sitio

preferencial de protonacin del anillo de pirimidina, correspondiente al nitrgeno

N1, se encuentra desprotonado, figura 23, al igual que en la estructura cristalina de

la AHAS. Mostrando que el grupo imino cuaternario puede formarse debido a la

estabilizacin de la carga negativa sobre el nitrgeno N1 por parte del enlace de

hidrgeno formado con el residuo, el cual esta a una distancia de 1.57 del

nitrgeno N1 en la zona de los reactantes y en el estado de transicin ET.

Figura 23. Estabilizacin por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de protonacin del anillo de aminopirimidina en la forma AP con R igual a 5(2[hidroxidifosfato]etil)4metil

1,3tiazol3io.



Adicionalmente, el anillo pirimidnico durante la reaccin se encuentra con sus

enlace deslocalizados, segn las longitudes y rdenes de enlace que muestra el

anillo, tablas XII y XIII, respectivamente. En tanto, las cargas parciales para los

tomos de anillo pirimidnico, obtenidas del anlisis NBO, se presentan en la XIV.

As, las principales diferencias que ha otorgado el refinamiento de la SEP a nivel

B3LYP/631++G(d,p) en comparacin a la construida con el mtodo PM3, recaen

principalmente en que el mecanismo de reaccin ocurre de manera concertada y

no por etapas y que para la formacin del grupo imino del anillo pirimidnico no

necesaria la protonacin del nitrgeno N1. De esta manera, segn los resultados

obtenidos es posible que el anillo pirimidnico no se encuentre bajo la forma de

APH al momento de realizar tanto el ataque nucleoflico sobre el carbono

carbonlico C2, como la transferencia protnica hacia el oxigeno carbonilico O2.



En virtud de los resultados obtenidos de la SEP corregida a nivel DFT, se propone

el siguiente mecanismo, figura 24, para la formacin del intermediario LThDP.

Figura 24. Mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario LThDP mediante clculos a nivel B3LYP/631++G(d,p).

Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energa que se muestra

en la figura 25. La barrera de activacin observada para la formacin del

intermediario LThDP es de aproximadamente 21 Kcal/mol. El valor de esta

barrera de activacin est por debajo de la barrera de activacin terica informada

en otros estudios, la cual tiene un valor de 35.83 Kcal/mol segn clculos realizados

en fase gas y con los sustratos aislados a nivel DFT. La barrera de activacin

experimental es de 16.21 Kcal/mol.

Figura 25. Diagrama de energa para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p).



3.2 Estudio de reactividad.

Con el fin de complementar los resultados anteriores se realiz un estudio de

reactividad en trminos de las funciones de Fukui y de las diferentes especies

participantes en la reaccin. Las funciones y se calcularon de acuerdo a la

metodologa implementada en Jaguar 7.7 y los resultados se muestran en la

figura 26, en la cual las funciones se visualizan como isosuperficies. Para las

molculas de APIluro, APHIluro y para el estado de transicin ET obtenido de

la SEP DFT se calcul la funcin . En tanto, para la molcula de piruvato se

calcularon las funciones y . Las zonas azules de la funcin corresponden a

regiones que pierden densidad electrnica, cuando la molcula se somete a un

ataque electroflico o cuando la molcula acta como un nuclefilo. Por otro lado,

las zonas rojas de la funcin corresponden a regiones que ganan densidad

electrnica cuando la molcula sufre un ataque nucleoflico o cuando la molcula

acta como un electrfilo.

Figura 26. Funciones de Fukui para el (A) APHIluro, (B) APIluro, (C) estado de transicin ET y (D) piruvato. Funcin de Fukui para (E) piruvato.

f + f

f + f

f

f +

f

f f

f +

f +



Los tomos que no poseen regiones coloreadas no presentan reactividad. En este

sentido, en la estructura del iluro en la forma APH se puede apreciar que los

centros nucleoflicos ms importantes corresponden a los oxgenos carboxlicos del

residuo, en cambio el carcter nucleoflico del carbono C2 del anillo de tiazolio es

muy bajo. Sin embargo, en el caso del iluro bajo la forma AP se observa que el

tomo con mayor carcter nucleoflico corresponde al carbono C2, como es de

esperar para que se produzca el ataque nucleoflico a la molcula de piruvato. Por

otro lado, los ndices atmicos de Fukui calculados sobre el carbono C2,

resultan ser 0.34 y 0.00 para las formas AP y APH, respectivamente, figura 27.

Estos resultados sugieren que el ataque nucleoflico del iluro sobre el piruvato

requiere al iluro en su forma AP (APIluro).

Figura 27. ndices atmicos de Fukui para APIluro y APHIluro. Con R1= CH2CH2OH.

En lo que respecta al sustrato, la molcula de piruvato, muestra un importante

carcter nucleoflico sobre todos los tomos de oxgenos y el carbono C2muestra

caractersticas de electrfilo. Los ndices de Fukui atmicos para el carbono C2y

el oxigeno carbonilico son = 0.51 y el oo = 0.24, figura 28. Estas caractersticas

complementarias entre APIluro y el piruvato sugieren que la reaccin de

formacin del LThDP ocurra mediante el mecanismo postulado a nivel DFT.

Figura 28. ndices atmicos de Fukui (A) y (B) para la molcula de piruvato.

2Cf

2Cf +

2Of

f

f f +



En el estado de transicin ET se puede observar que las funciones de Fukui antes

mencionadas se mantienen y los lbulos estn dirigidos en la orientacin correcta.

Es decir el lbulo del tomo C2 est orientado hacia el carbono C2y el lbulo del

oxigeno carbonilico est orientado hacia el hidrgeno del grupo 4NH2. En este

estado de transicin postulado, el ndice local de Fukui sobre el oxigeno carbonilico

de la molcula de piruvato alcanza el valor mximo de 0.27, figura 29, que

comparado con su respectivo valor en la molcula de piruvato aislada de 0.24,

indica el aumento en el carcter nucleoflico de este oxigeno como consecuencia

del ataque del iluro sobre el carbono C2.

Figura 29. ndices atmicos de Fukui y , en parntesis, para el estado de transicin

ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.

En la figura 29, la funcin condensada de Fukui se muestra entre parntesis.

Aqu se observa que otra de las variaciones presentes en el estado de transicin ET,

es la disminucin de los ndices de Fukui para los nitrgenos N1, N4 y para el

carbono C2. La funcin condensada de Fukui para el carbono C2 tambin

disminuye en esta etapa de la reaccin.

En definitiva, estos resultados complementan el mecanismo de reaccin postulado

a nivel DFT. La nula reactividad del carbanion C2 cuando el anillo pirimidnico se

encuentra bajo la forma del APHdeja en evidencia que al momento del ataque

nucleoflico el anillo pirimidnico se encuentra con la forma de AP.

f f +

f

f +

f +



3.3 Anlisistermodinmico.

Los resultados de la exploracin de la SEP y de la optimizacin del estado de

transicin a nivel DFT sugieren que durante el ataque nucleoflico del iluro, a la

molcula de piruvato, el anillo pirimidnico se encuentra con el nitrgeno N1

desprotonado y el nitrgeno N4 en su forma imino. Adems, los clculos IRC

indican que el producto LThDP se encuentra tambin con el nitrgeno N1

desprotonado y el nitrgeno N4 se encuentra en su forma imino, a diferencia de lo

reportado para enzimas ThDP dependientes.

Con la finalidad de corroborar estos resultados y determinar el estado de

protonacin del nitrgeno N1 del anillo pirimidnico durante la reaccin, desde el

punto de vista termodinmico se ha estudiado el equilibrio acido base entre el

residuo altamente conservado GLU139, simulado con una molcula de acido

actico y las formas AP y APH del iluro, figura 30, considerando medios de

diferente constante dielctrica. En la tabla XV, se presentan los valores de losG

para cada uno de los medios y en la figura 30 se muestran algunas longitudes de

enlace () y cargas parciales del tipo NBO para algunos de los tomos ms

relevantes de la reaccin.

Figura 30. Equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1= CH2CH2OH.



En este sentido, el equilibrio involucra directamente la estabilidad de las bases

conjugadas formadas, contrastando la factibilidad de la protonacin del nitrgeno

N1 del anillo pirimidnico por parte del residuo GLU139. Los resultados que se

muestran en la tabla XV indican que en los tres medios considerados la especie

termodinmicamente favorecida es el iluro con el nitrgeno N1 desprotonado, la

forma APIluro. Este resultado est en concordancia con los resultados descritos en

las secciones anteriores, es decir, durante el ataque nucleoflico el anillo

pirimidnico se encuentra con el nitrgeno N1 desprotonado al igual que el

producto LThDP formado. Una mayor estabilizacin de la base conjugada de la

forma APHdebido a la deslocalizacin de la carga negativa del nitrgeno N1 en

el anillo pirimidnico, permite que la forma AP sea energticamente ms estable.

En comparacin, la base conjugada del acido actico posee una menor cantidad de

estructuras resonantes capaces de estabilizar la carga negativa sobre el oxigeno O1.

Estos resultados adems, presentan una concordancia con el estado de protonacin

del residuo GLU139 encontrado en las diferentes estructuras cristalinas obtenidas

de la AHASy con los clculos de los pKa experimentales del nitrgeno N1

y del grupo carboxlato del residuo GLU139, que tiene valores de 7.0 y 9.1,

respectivamente, donde el rango de pH de mayor actividad cataltica que presenta

la AHAS es de 7.5, aproximadamente. Sin embargo, tambin se observa una

fuerte dependencia del valor de G con el medio, lo que sugiere la posibilidad que

en el sitio activo de la enzima la forma APH pueda existir debido a

estabilizaciones producidas por los residuos aminoacdicos y que por ende es

posible que la forma APHpueda participar en otras etapas del ciclo cataltico de la

AHAS.

Capitulo 4: Conclusiones y proyecciones


Capitulo 4

Conclusiones y proyecciones

n este captulo se presentan las conclusiones referentes a los resultados

obtenidos en la presente tesis. Entre ellas se encuentran la determinacin

del mecanismo de reaccin para la formacin del intermediario LThDP,

la limitacin del anlisis energtico de la reaccin al trabajar en fase gas y con los

sustratos asilados y la disyuntiva existente entre cual es la forma del anillo de

pirimidina en el intermediario iluro a la hora de llevar a cabo el primer paso del

ciclo cataltico. Adems se presentan las posibles proyecciones necesarias para

complementar las hiptesis investigadas.

E



4.1 Conclusiones

Los resultados de la presente tesis permiten concluir lo siguiente:

1. La reaccin de formacin del intermediario LThDP ocurre va un

mecanismo concertado, es decir la carboligacion C2C2y la transferencia

protnica desde el grupo 4NH2 hacia el oxigeno carbonilico O2 de la

molcula de piruvato ocurren de forma simultnea.

2. Durante la reaccin el tomo N1 del anillo pirimidnico esta desprotonado.

3. En todo momento el cofactor ThDP se encuentra estabilizado a travs de

un fuerte enlace de hidrogeno formado entre el anillo pirimidnico y el

grupo carboxlico del residuo acido glutmico, a 1.57 , estabilizando la

eventual carga negativa sobre el tomo N1.

4. La estructura optimizada del estado de transicin muestra valores mximos

de los ndices atmicos de Fukui sobre el oxigeno carbonilico de 0.27

comparado con el valor de 0.24 del piruvato aislado, indicando el aumento

de su carcter nucleoflico como consecuencia del ataque del tomo C2 del

iluro sobre el carbono C2de la molcula de piruvato. Tambin se observa

que la funcin de Fukui sobre el tomo C2 est orientada hacia el tomo

C2del piruvato evidenciando el ataque nucleoflico en curso.

5. La barrera de activacin observada es de 21.87 Kcal/mol en

correspondencia al valor reportado en literatura de 16.21 Kcal/mol.

6. La estructura optimizada del producto LThDP muestra que el tomo N4

est en su forma imino mientras que el nitrgeno N1 esta desprotonado.

7. Los resultados adems indican que en los tres medios considerados la

especie termodinmicamente favorecida es el iluro con el nitrgeno N1

desprotonado.

8. La participacin del anillo pirimidnico en la forma APH durante la

reaccin entre el piruvato y el iluro no est avalada por los clculos

qumicos cunticos de esta tesis.



4.2 Proyecciones

Con el fin de corroborar el mecanismo de reaccin obtenido, cuantificar la

estabilizacin otorgada por el ambiente enzimtico en la reaccin y

principalmente para determinar cul de las dos formas tautomericas del anillo

de pirimidina es la involucrada en la formacin del intermediario LThDP, para

el presente trabajo de tesis se proponen como proyecciones:

Realizar simulaciones de dinmica molecular, para encontrar una

estructura representativa del sitio activo de la enzima. Con los resultados

de las simulaciones determinar aquellos aminocidos que aporten

mayor estabilidad al cofactor y a la molcula de piruvato, mediante

clculos de energas de interaccin.

Con el resultado de la simulacin de dinmica molecular realizar la

exploracin de la superficie de energa potencial, mediante clculos

hbridos QM/MM, con la finalidad de incorporar el ambiente

enzimtico en la formacin del LThDP y cuantificar su efecto sobre el

mecanismo de reaccin propuesto.

Bibliografa


Bibliografa

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