espectrometría de masas instrumentación y...

ESI-MS

MALDI-MS

Espectrometría de masasInstrumentación y aplicaciones

Clase 01

Espectrometría de Masa (MS: Mass spectrometry)

la relación masa(m):carga (z); m/z

Espectroscopía o Espectrometría??

Técnica analítica determina la masa molecular de una muestra

Analogía entre un

espectrómetro de

masa y un prisma

Análisis Espectroscópico

Espectrometría de Masa

Espectrometria de Masa (MS: Mass spectrometry)

la relación masa(m):carga (z); m/z

Espectroscopia o Espectrometria??

Técnica analítica determina la masa molecular de una muestra

M M+

Energía

muestra ionizaciónfragmentación

separación m/z

Espectro de

Masa

f1+

f2+

f3+

f4+

M+

f4+

f3+

f2+

f1+



• Espectro de MASA de una molécula,

% de abundancia relativa vs. relación MASA/CARGA

Espectro de Masa de metanol



• Identificación de compuestos desconocidos (masa del compuesto o de

sus fragementos)

biomoléculas grandes, presición de 0.01% (40.000 Da error de

4Da)

moléculas pequeñas, presición de 5 ppm o menores (suficiente

para confirmar la masa molecular de un compuesto)

• determinar la composición isotopica de un elemento en una muestra

• determinar la estructura de un compuesto (patrón de fragmentación)

• “cuantificación” de un compuesto en una mezcla (diseño de método, MS

no e stécnica cuantitativa)


Espectrometria de Masa - Información

• Industrial o Académica (para procesos de rutina o de investigación)

• Campos de aplicación:

Bioquímica-Biotecnología: análisis de proteínas, peptidos, oligonucléotidos

Química farmacéutica: descubrimiento de drogas, química combinatoria,

farmacocinética, metabolismo de drogas

Bioquímica clínica: test de drogas

Analisis Ambientales: calidad de agua, contaminación de alimentos

Geología: composición de hidrocarburos


Espectrometria de Masa - Aplicaciones

1897 J.J. Thomson, primer medida m/q de partículas elementales “corpúsculos”

1918-1919 A. Dempster & F. Aston, primer espectrógrafo de masa

1951 W. Pauli & H. Steinwedel, espectrómetro de masa de cuadrupolo

1959 K. Biemann, MS electroionización aplicada a péptidos

1968-1970 M. Dole, polimeros naturales y sintéticos en fase gaseosa a presión atmosférica

1974 D. Torgerson, plasma desorption MS (fisión de 252Cf)

1974 B. Mamyrin, contribución al desarrollo de TOF MS

1978 N. Commisarow & A. Marshall, adaptación de métodos de transformadas de Fourier a

ICRS, ion cyclotron resonance spectrometry

1981 M. Barber, FAB; fast atom bombardment, masa de Met-Lys-bradykinin M=1318

1984 R. Willoughby & M. Aleksandrov (trabajos independientes) proponen acoplar LC a MS

1988 J. Fenn & M. Yamashita (trabajos independientes) macromoléculas biológicas en fase

gaseosa a presión atmosférica, ESI, electrospray ionization. M. Karas & F. Hillencamp y K.

Tanaka (trabajos independientes) desrrollan MALDI, matrix –assisted laser desorption-

ionization. 2002, K. Tanaka recibe premio Nobel.

1992-1999 Especificidad y Sensibilidad MALDI-MS

2000-presente Desarrollo de MS como técnica analítica en ciencias biológicas


Espectrometria de Masa - Revisión histórica


Espectrometria de Masa - Revisión histórica

What is Mass Spectrometry?

John B. Fenn, the originator of electrospray ionization for biomolecules and the 2002

Nobel Laureate in Chemistry, probably gave the most apt answer to this question:

Mass spectrometry is the art of measuring atoms and molecules to determine

their molecular weight. Such mass or weight information is sometimes sufficient,

frequently necessary, and always useful in determining the identity of a species. To

practice this art one puts charge on the molecules of interest, i.e., the analyte, then

measures how the trajectories of the resulting ions respond in vacuum to various

combinations of electric and magnetic fields.

Clearly, the sine qua non of such a method is the conversion of neutral analyte

molecules into ions. For small and simple species the ionization is readily carried

by gas-phase encounters between the neutral molecules and electrons, photons, or

other ions. In recent years, the efforts of many investigators have led to new

techniques for producing ions of species too large and complex to be vaporized

without substantial, even catastrophic, decomposition.



• Desde 1930, MS técnica analítica importante para Biología Estructural

• Producción de iones de alto peso molecular en fase gaseosa (macromoléculas

biológicas)

• Desarrollo de técnicas de ionización como FAB, MALDI, ESI

• Desarrollo de métodos ultrasensibles para caracterización de proteínas basados en

Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTIR-MS), límite de

detección de 30 zmol (30x10-21mol) para proteínas de masa molecular 8 – 20 kDa.

Utilización de MS:

• Determinación precisa de masa molecular de proteínas y ac. nucleícos, amplio rango de masas

• Secuenciación de péptidos y oligonucleótidos

• Identificación de modificaciones post-traduccionales

• Cambios estructurales en proteínas, plegamiento y dinámica

• Identificación de proteínas (cantidades subpicomolares) de 2D-electroforesis

• Identificación de marcado isotópico


Espectrometria de Masa - Aplicaciones Biológicas

ión acelerado por una fuente externa, adquiere E. cinética (Ekin)

Ekin= z * Vacc =mv2

2

Z: carga del ion

Vacc: diferencia de potencial en

región de aceleración

m: masa del ion

v: velocidad del ion

Relación m/zmZ =

B2r2

2Vacc=

F = zvB =mv2

r

partícula cargada, en campo magnético

homogéneo (B), perpendicular a trayectoria,

fuerza de Lorentz F, trayectoria, círculo de

radio r.

Partícula cargada en campo

Eléctrico y Magnético


Espectrometría de Masa - Iones en campos eléctricos

y magnéticos

Ejemplo:

R=1000 (sector magnético), permite separar masas de 1000 y 1001 Da.

R=100000, permite distinguir masas de 100000 y 100001 Da, 10 ppm.

Resolución, R: medida de la

habilidad de un instrumento para

separar iones de masas

similares, m y m+Dm, de igual

intensidad, con superposición de

señal de 10%10%

Dm

m+Dmm

R=m/Dm

Definir la extensión de la superposición de picos adyacentes

• 10% valley definition (2 picos adyacentes contribuyen con 5%)

• Full width, half maximun (FWHM),masa del pico (Da) dividido

el ancho del pico a la mitad de la altura

R (FWHM) aprox. 2 veces R (10%)


Espectrometria de Masa - Resolución de masa

y presición de masa

Figure 2.2. The resolution is determined by the measurement of peak’s

m/z and FWHM , in this case m/z = 500 and the FWHM = 1.Análisis Espectroscópico

Espectrometria de Masa - Resolución de

masa y presición de masa

Presición de la medida de masa molecular es la diferencia entre la

masa medida y la calculada para cierto ión

Expresada como:

% de la masa medida: masa molecular = 10000 ± 0.01%

o

ppm de la masa medida: masa molecular = 10000 ± 100ppm

-Presición en las determinaciones de masa molecular, no requieren alta

resolución

- Factor limitante en la presición de la determinación de masa molecular para

macromoléculas de alta masa es la superposición de picos

Espectrometria de Masa - Resolución de masa

y presición de masa


Error y Precisión según la masa molecular

• Para moléculas pequeñas

Error menores de 5 ppm permiten identificar la formula molecularinequivocamente

Ej: C23H37NO3 Masa esperada 375.27734 uma

C23H37NO3 Masa encontrada 375.27652 uma

Error = [(375.27734- 375.27652)/ 375.27734] * 1E6 = 2.2 ppm =

Diferencia = 0.00082 uma

• Para biomoleculas de alto MW se pueden determinar conalrededor de 0.5 Da

Ej.: PM 50 kDa con 2.2 ppm de error masa encontrada 50000.11 Da

Diferencia = 0.11 uma


1 Da = 1 uma


Resolución de masa y presición de masa, masa promedioEspectrometría de Masa



Espectrometria de Masa - Resolución de masa y presición

de masa, masa promedio.

Espectrómetro de Masa – Tratamiento de la muestra

• INYECCIÓN de la muestra, directa o con tratamiento previo (sample injector)

•IONIZACIÓN de la muestra (ion source)

• SEPARACIÓN de los iones con diferentes m/z (mass analyzer)

• DETECCIÓN del número de iones producidos (detector)

• COLECCIÓN de datos, generación del espectro de masa



Muestra

Fuente de

ionización

Analizador

de masas

DETECTOR

Análisis

de Datos

Primer espectrómetro de masa: 1913, J.J. Thomson

Campos eléctricos y magnéticos fijos para separar isótopos de Ne, por

diferencia de comportamiento de partículas cargadas (diferentes momentos y

energías) en un campo electromagnético.


Espectrometria de Masa – Electrón

SAMPLE

ION

SOURCE

MASS

ANALYZERDETECTOR

DATA

ANALYSIS

3 partes básicas,

alto vacio (no

siempre)

Muestra – ionización- analizador de masa, separación de acuerdo a su relación

m/z – detección – señal enviada a sistema de análisis de datos (abundacia en

función de m/z)

Generación del Espectro de masa, % abundancia relativa vs. m/z


Espectrómetro de Masa

Figure 1.2. Components of a mass spectrometer. Note that the ion source does not

have to be within the vacuum of the mass spectrometer. For instance, ESI and APCI

are at atmospheric pressure and are known as atmospheric pressure ionization (API)

sources. http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php#Basics



http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php

Fuente de

ionizacion

Muestra

+

_

Analizador

de masas

Detector


Espectrómetro de Masa

Métodos deionizacion

- Impactoelectrónico

- IonizacionQuímica

- MALDI

- Electrospray

- APCI

Análizadores

de masas

– Cuadrupolo

– Tiempo de vuelo

– Trampa de iones

– Orbitrap

– Ciclotrón

– En tandem

Generación

iones

Separacion

de ionesDetección

de iones

• Espectro de masas

• Análisis en bases de datos

QqQ / QTof /

Tof-Tof / IT-Tof


Espectrómetro de Masa – Instrumentación

• Impacto electrónico (EI - Hard method)– Moleculas pequeñas, 1-1000 Daltons

• Fast Atom Bombardment (FAB – Semi-hard)– peptidos, azucares, hasta 6000 Daltons

• Electrospray Ionization (ESI - Soft)– peptidos, proteinas, hasta 200,000 Daltons

• Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI-Soft)– peptidos, proteinas, DNA, hasta 500 kD


Espectrómetro de Masa - Métodos de Ionización

Impacto Electrónico

• Renombrado como ionización electrónica

• Calentamiento electrodo, produce e-

• Energía electrón: l = h/mn

• Dualidad onda-párticula


Espectrómetro de Masa - Métodos de Ionización


Espectrómetro de Masa - Ionización electrónica

• Aproximadamente UN ión por cada 1000 moléculas ( 70eV)

• 10 eV – energía necesaria para ionizar una molécula. Exceso de energía ??

I = NpiV

I = número de iónes producidos

N= constante, p= presión, i=corriente



• En lugar de “bombardear” las moléculas con electrones se usan moléculas cargadas.

• Fuente de ionización mixtas, pueden usar ionización química y electrónica.




Espectrómetro de Masa - Ionización química

Reacciones en ionización química

Dependiente de las características de la molécula a ionizar, (heteroátomos, aceptores protón)

GH+ transfiere un protón a la muestra

GH+ + M G + MH+



1) Formación de aductos

2) Reacciones de transferencia de carga

Se usan gases utilizados



Metano – Reacciones

CH4 + e -----> CH4+. + 2e ------> CH3

+ + H.

CH4+. + CH4 -----> CH5

+ +CH3.

CH4+. + CH4 -----> C2H5

+ + H2 + H.



• Isobutano

Reacciones

i-C4H10 + e -----> i-C4H10+. + 2e

i-C4H10+. + i-C4H10 ------> i-C4H9+ + C4H9 +H2



• Amoníaco

• Reacciones

NH3 + e -----> NH3+. + 2e

NH3 +. + NH3 ------> NH4+ + NH2

.

NH4+ + NH3 --------->N2H7

+




Espectrómetro de Masa – Comparación gases de ionización

espectrometría de masas instrumentación y...

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